專利名稱：嗜中性白細(xì)胞因子α的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的細(xì)胞因子，其是由嗜中性白細(xì)胞表達(dá)的，由此被稱為嗜中性白細(xì)胞因子(Neutrokine)α蛋白質(zhì)(″嗜中性白細(xì)胞因子α″)。具體地說，本發(fā)明提供了編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的分離的核酸分子。本發(fā)明也提供了嗜中性白細(xì)胞因子α多肽、產(chǎn)生該多肽的載體、宿主細(xì)胞以及重組方法。
背景技術(shù)：
人腫瘤壞死因子(TNF-α)和(TNF-β，或淋巴毒素)是廣泛類別的多肽調(diào)節(jié)物的相關(guān)成員，這些成員包括干擾素，白介素以及生長因子，統(tǒng)稱為細(xì)胞因子(Beutler，B.和Cerami，A.，Annu.Ret，.Immunol.，7625-655(1989))。細(xì)胞因子受體的序列分析確定了膜蛋白的幾個亞族(1)Ig超家族，(2)血細(xì)胞生成素(細(xì)胞因子受體超家族)，(3)腫瘤壞死因子(TNF)/神經(jīng)生長因子(NGF)受體超家族(對于TNF超家族的綜述，參見Gruss和Dower，血液85(12)3378-3404(1995)和Agganval和Natarajan，Eur.Cytokine Netw.，7(2)93-124(1996))。TNF/NGF受體超家族含有至少10種不同的蛋白質(zhì)。Gruss和Dower，同上。這些受體的配體已被鑒別，它們屬于至少兩個細(xì)胞因子超家族。Gruss和Dower，同上。
腫瘤壞死因子(TNF-α和TNF-β的混合物)最初由于其抗腫瘤活性被發(fā)現(xiàn)，然而，現(xiàn)在它們被認(rèn)為是具有許多生物學(xué)活性的多效細(xì)胞因子，包括使一些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞出現(xiàn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞活化和增殖，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥中也起著重要的作用。
迄今，已知的TNF-配體超家族的成員包括TNF-α，TNF-β(淋巴毒素)，LT-β，OX40L，F(xiàn)as配體，CD30L，CD27L，CD40L和4-IBBL。TNF配體超家族的配體是酸性的，在胞外結(jié)構(gòu)域具有約20％(范圍，12％--36％)的序列同源性并且僅作為具有生物學(xué)活性形式的膜結(jié)合形式存在的類TNF分子是三聚多聚體復(fù)合物。迄今為止，TNF配體超家族的可溶性形式僅僅鑒別了TNF，LT P，以及Fas配體(一般性綜述，參見Gruss，H.和Dower，S.K.，血液，85(12)3378-3404(1995)，本文以其整體一并參考)。這些蛋白質(zhì)涉及到細(xì)胞增殖，活化，以及分化的調(diào)節(jié)，包括通過編程性細(xì)胞死亡或細(xì)胞毒性控制細(xì)胞生存或死亡(Armitage，R.J.，Curr.Opin.Immunol.6407(1994)和Smith，C.A.，細(xì)胞75959(1994))。
腫瘤壞死因子-α(TNFα；也稱為惡液質(zhì)素；下文中稱為″TNF″)作為17kD蛋白質(zhì)亞單位的可溶性同源三體主要由響應(yīng)內(nèi)毒素或其它刺激的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌(Smith，R.A.等，生物化學(xué)雜志2626951-6954(1987))。TNF的26kD膜-結(jié)合前體形式也有人描述(Kriegler，M.等，細(xì)胞5345-53(1988))。
累積的證據(jù)表明TNF是具有多效生物活性的調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。這些活性包括脂蛋白脂肪酶合成(″惡液質(zhì)素″活性)的抑制(Beutler，B.等，自然316552(1985))，多形核白細(xì)胞的活化(Klebanoff，S.J.等，免疫學(xué)雜志1364220(1986)；Perussia，B.，等，免疫學(xué)雜志138765(1987))，細(xì)胞生長的抑制或細(xì)胞生長的刺激(Vilcek，J.等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志163632(1986)；Sugarman，B.J.等，科學(xué)230943(1985)；Lachman，L.B.等，免疫學(xué)雜志1382913(1987))，對某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞類型的細(xì)胞毒性作用(Lachman，L.B.等，supra；Darzynkiewicz，Z.等，Cane.Res.4483(1984))，抗病毒活性(Kohase，M.等，細(xì)胞45659(1986)；Wong，G.H.W.et al，自然323819(1986))，骨吸收的刺激(Bertolini，D.R.等，自然319516(1986)；Saklatvala，J.，自然322547(1986))，膠原酶和前列腺素E2產(chǎn)生的刺激(Dayer，J.-M.等.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1622163(1985))；和免疫調(diào)節(jié)作用，包括T細(xì)胞(Kehrl，J.H.等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志166786(1987))，單核細(xì)胞(Philip，R.等，自然32386(1986))，胸腺細(xì)胞(Ranges，G.E.等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1671472(1988))活化，以及主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類和II類分子細(xì)胞-表面表達(dá)的刺激(Collins，T.等，美國國家科學(xué)院院報(bào)83446(1986)；Pujol-Borrel，R等，自然326304(1987))。
TNF由于其導(dǎo)致組織損傷的前發(fā)炎作用受到注意，所說的作用例如在脈管內(nèi)皮細(xì)胞上誘導(dǎo)促凝血活性(Pober，J.S等，免疫學(xué)雜志1361680(1986))，增加中性白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的粘著(Pober，J.S.等，免疫學(xué)雜志1383319(1987))，以及從巨噬細(xì)胞，中性白細(xì)胞以及脈管內(nèi)皮細(xì)胞刺激血小板激活因子釋放(Camussi，G等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志166.1390(1987))。
最近的證明說明TNF在許多感染(Cerami，A.等，現(xiàn)代免疫學(xué)928(1988))，免疫疾病，瘤形成的病理中涉及到，例如，在伴隨一些惡性腫瘤的惡病質(zhì)(Cliff，A等，細(xì)胞50555(1987))和在自身免疫病理學(xué)和移植物對宿主的病理學(xué)中(Piguet，P.-F.等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1661280(1987))。TNF與癌和傳染性病理的聯(lián)系經(jīng)常與宿主的分解代謝狀態(tài)有關(guān)。在癌患者中的一個主要問題是體重減輕，通常與食欲減退有關(guān)。其引起的較強(qiáng)的消瘦被稱為″惡病質(zhì)”(Kern，K.A.等J.Parent.Enter.Nutl12286-298(1988))。惡病質(zhì)包括進(jìn)行性體重減輕，食欲減退，以及響應(yīng)惡性生長的體重持久消耗。這樣，惡病質(zhì)狀態(tài)與主要的發(fā)病相聯(lián)系，并且對大多數(shù)的癌死亡起作用。一些研究曾提出TNF在癌中是惡病質(zhì)，傳染病，以及其它分解代謝狀態(tài)的一個重要的介體。
TNF被認(rèn)為在革蘭氏-陰性膿毒和內(nèi)毒性休克的病理生理學(xué)結(jié)果(包括發(fā)熱，不舒服，厭食，以及惡病質(zhì))中起著中心作用(Michie，H.R.等，Br.J.Surg.76670-671(1989)；Debets，J.M.H.等，Second YiennaShock Forum，p.463-466(1989)；Simpson，S.Q.等，Crit.Care Clin.527-47(1989))。內(nèi)毒素是一種刺激TNF和其它細(xì)胞因子產(chǎn)生和分泌的有力的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞激活物(Kornbluth，S.K.等，免疫學(xué)雜志1372585-2591(1986))。因?yàn)門NF能模擬許多內(nèi)毒素的生物作用，所以得出的結(jié)論是其是對臨床類毒素相關(guān)疾病的出現(xiàn)的中心介體。TNF和其它單核細(xì)胞來源的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)對內(nèi)毒素的代謝和神經(jīng)激素反應(yīng)(Michie，H.R.等，N.Eng.J.Med.3181481-1486(1988))。對人志愿者施用內(nèi)毒素產(chǎn)生具有類似流感癥狀的急性疾病，包括發(fā)熱，心動過速，增加代謝速率和釋放應(yīng)激激素(Revhaug，A.等，Arch.Surg.123162-170(1988))。提高的循環(huán)TNF水平也在患有革蘭氏-陰性膿毒病的患者中檢測到(Waage，A.等，Lancet 1355-357(1987)；Hammerle，A.F.等，Second Yienna Shock Forum p.715-718(1989)；Debets，J.M.H.等，Crit.Care Med.17489-497(1989)；Calandra，T.等，傳染病學(xué)雜志161982-987(1990))。
基于在以上討論的這些病理學(xué)狀態(tài)中增加的TNF產(chǎn)生和提高的TNF水平，針對中和TNF的被動免疫治療在革蘭氏-陰性膿毒和內(nèi)毒血癥中可以具有有益的作用。Cerami等(EPO專利出版物0,212,489，1987年3月4日)公開了針對″調(diào)節(jié)物″物質(zhì)的抗體，所說的物質(zhì)被定性為惡液質(zhì)素(后來發(fā)現(xiàn)與TNF相同。這樣的抗體被認(rèn)為在診斷性免疫測定中和在細(xì)菌感染的休克的治療中有用。Rubin等(EPO專利出版物0,218,868，1987年4月22日)公開了人TNF的單克隆抗體，分泌這種抗體的雜交瘤，產(chǎn)生這種抗體的方法和這些抗體在TNF免疫測定中的用途。Yone等(EPO專利出版物0,288,088，1998年10月26日)公開了抗TNF抗體，包括mAbs，以及它們在病理學(xué)免疫測定診斷中，特別是在Kawasaki疾病和細(xì)菌感染中的效用?；加蠯awasaki疾病的患者的體液(嬰兒急性發(fā)熱粘膜皮膚淋巴結(jié)綜合征；Kawasaki，T.，變態(tài)反應(yīng)16178(1967)；Kawasaki，T.，Shonica(兒科學(xué))26935(1985))被認(rèn)為含有提高的TNF水平，其與疾病進(jìn)程相關(guān)(Yone等，同上)。
其它研究者曾描述了對具有體外中和活性的重組人類TNF特異性的mAbs(Liang，C-M.等生物化學(xué)生物物理研究通訊1 37847-854(1986)；Meager，A.等，雜交瘤6305-311(1987)；Fendly等，雜交瘤6359-369(1987)；Bringman，T S等，雜交瘤6489-507(1987)；Hirai，M.等，免疫學(xué)方法雜志.9657-62(1987)；Moiler，A.等(細(xì)胞因子2162-169(1990))。某些這樣的mAbs被用于作圖人TNF的表位，以及開發(fā)酶免疫測定法(Fendly等，同上；Hirai等，同上；Moiler等，同上)，并且?guī)椭亟MTNF純化(Bringman等同上)。然而，由于免疫原性，缺乏特異性和/或藥物適應(yīng)性，這些研究不提供產(chǎn)生能夠用于人類體內(nèi)診斷和治療用途的TNF中和抗體的基礎(chǔ)。
針對TNF的中和抗血清或mAbs在非人哺乳動物中顯示出消除不利的生理變化，并且在實(shí)驗(yàn)性內(nèi)毒血癥和菌血癥中在致死性激發(fā)后阻止死亡。這一作用已在例如嚙齒動物致死性測定和靈長類病理學(xué)模型系統(tǒng)中得到說明(Mathison，J.C.等，臨床研究雜志811925-1937(1988)；Beutler，B.等，科學(xué)229869-871(1985)；Tracey，K.J.等，自然330662-664(LS)t(7)，Shlmamoto，Y.等，免疫學(xué)通訊，17311-318(1988)；Silva，A.T.等，傳染病雜志.162421-427(1990)；Opal，S.M等，傳染病雜志.1611148-1152(1990)；Hinshaw，L.B.等，Circ.Shock 30279-292(1990))。
迄今為止，在人類中用抗TNF mAb治療的經(jīng)驗(yàn)是有限的，但是顯示了有益的治療結(jié)果，例如，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和膿毒中。參見，例如，Elliott，M.J.等，Baillieres Clin.Rharmatol.9633-52(1995)；Feldmann M，等.，Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 766272-8(1995)；van derPoll，T.等，休克31-12(1995)；Wherry等，Grit.Care.Med.21S436-40(1993)；Tracey K.J.，等，Grit.Care Med.21S415-22(1993)。
哺乳動物的發(fā)育取決于細(xì)胞的增殖和分化，以及經(jīng)編程性細(xì)胞死亡發(fā)生的程序細(xì)胞死亡(Walker，等，Methods Achiev.Exp.Pathol.1318(1988)。編程性細(xì)胞死亡在識別自身抗原的免疫胸腺細(xì)胞的破壞中起著作用的作用。這一正常的消除過程的失敗在自身免疫疾病中可以起作用(Gammon等，現(xiàn)代免疫學(xué)，12193(1991)。
Itoh等(細(xì)胞66233(1991))描述了細(xì)胞表面抗原Fas CD23，其調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡和牽涉到T-細(xì)胞的克隆缺失。Fas在活化的T-細(xì)胞，B-細(xì)胞，中性白細(xì)胞和以及成年小鼠(除活化的T-細(xì)胞，B-細(xì)胞，中性白細(xì)胞之外)的胸腺，肝，心臟和肺臟，卵巢(Watanabe-Fukunaga等，免疫學(xué)雜志1481274(1992))中表達(dá)。在單克隆抗體與Fas交聯(lián)的實(shí)驗(yàn)中，編程性細(xì)胞死亡被誘導(dǎo)(Yonehara等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1691747(1989)；Trauth等.，科學(xué)245301(1989))。此外，有這樣的例子，單克隆抗體對Fas的結(jié)合對T-細(xì)胞是刺激性的(Alderson等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1782231(1993))。
Fas抗原是相對分子量為45Kd的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。Fas的人和鼠基因兩者曾由Watanabe-Fukunaga等(免疫學(xué)雜志1481274(1992))和Itoh等(細(xì)胞66233(1991))克隆。由這些基因表面的蛋白質(zhì)兩者都是跨膜蛋白質(zhì)，具有與神經(jīng)生長因子/腫瘤壞死因子受體超家族的結(jié)構(gòu)同源性，其包括兩種TNF受體，低親和性神經(jīng)生長因子受體和CD40，CD27，CD30，以及OX40。
前不久，有人描述了Fas配體(Suda等，細(xì)胞751169(1993))。氨基酸序列表明Fas配體是II類跨膜蛋白質(zhì)，屬于TNF家族。這樣，F(xiàn)as配體多肽包含三個主要結(jié)構(gòu)域在氨基末端的一個短的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，在羧基末端的一個長的胞外結(jié)構(gòu)域，靠疏水跨膜結(jié)構(gòu)域連接。Fas配體在脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中表達(dá)，與T-細(xì)胞調(diào)節(jié)的細(xì)胞毒性一致。純化的Fas配體具有40kD的分子量。
前不久，有人指出在T-細(xì)胞活化后，F(xiàn)as配體相互作用對編程性細(xì)胞死亡是所需的(Ju等，自然373444(1995)；Brunner等，自然373441(1995))。T-細(xì)胞的活化誘導(dǎo)細(xì)胞表面的兩種蛋白質(zhì)。配體和受體之間爾后的相互作用導(dǎo)致細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡。這一事實(shí)支持了這種結(jié)論在正常的免疫應(yīng)答期間，編程性細(xì)胞死亡的可能的調(diào)節(jié)作用由Fas配體相互作用誘導(dǎo)。
因此，需要提供在病理狀態(tài)中所牽涉的類似于TNF的細(xì)胞因子。這樣的新細(xì)胞因子可以用來制備結(jié)合這些類TNF的細(xì)胞因子的新的抗體或其它拮抗劑，供治療與TNF-細(xì)胞因子相關(guān)的疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼細(xì)胞因子的多核苷酸，所說的細(xì)胞因子在結(jié)構(gòu)上類似于TNF和相關(guān)細(xì)胞因子，并且被認(rèn)為具有類似的生物學(xué)作用和活性。這一細(xì)胞因子被命名嗜中性白細(xì)胞因子α，并且本發(fā)明包括嗜中性白細(xì)胞因子α多肽，這些多肽具有圖1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列或1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆編碼的氨基酸序列的至少一部分。圖1(SEQ ID NO2)所示的由測序保藏的嗜中性白細(xì)胞因子α克隆確定的核苷酸序列含有編碼285個氨基酸殘基的完整的多肽的開放讀框，包括一個N-末端甲硫氨酸，一個約46個氨基酸殘基的預(yù)測的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，一個約26個氨基酸的預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域，一個約213個氨基酸的預(yù)測的胞外結(jié)構(gòu)域，推定的完全蛋白質(zhì)的分子量約31kDa。對其它II類跨膜蛋白質(zhì)，可溶性形式的嗜中性白細(xì)胞因子α從跨膜結(jié)構(gòu)域裂解的胞外結(jié)構(gòu)域的全部或部分，包含完整的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域(即與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接的胞外結(jié)構(gòu)域)的多肽。
這樣，本發(fā)明的一個方面提供了分離的核酸分子，該分子包含具有選自下組的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼一種全長嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的核苷酸序列，所說的多肽具有圖1(SEQ ID NO2)的完整的氨基酸序列或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆編碼；(b)編碼一種嗜中性白細(xì)胞因子α多肽預(yù)期的胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，所說的多肽具有圖1(SEQ ID NO2)的73-285位氨基酸序列或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆編碼；(c)編碼一種多肽的核苷酸序列，所說的多肽包含嗜中性白細(xì)胞因子α多肽胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(圖1(SEQ ID NO2)中從約1到約46位氨基酸)或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆編碼；(d)編碼一種多肽的核苷酸序列，所說的多肽包含嗜中性白細(xì)胞因子α多肽跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1(SEQ ID NO2)中從約47到約72位氨基酸)或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆編碼；(e)編碼一種可溶性嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的核苷酸序列，所說的多肽包含胞外與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，但是缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域；和(f)互補(bǔ)于以上(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中核苷酸序列之任一的核苷酸序列。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括這樣的分離的核酸分子，其包含一種多核苷酸，所說的多核苷酸具有至少90％，優(yōu)選地至少95％，96％，97％，98％或99％等同于以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)之任一的序列的核苷酸序列，或者所說的多核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下與以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中的多核苷酸雜交，這一雜交的多核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下不與具有僅由A殘基或僅由T殘基組成的核苷酸序列的多核苷酸雜交。本發(fā)明的另外的核酸實(shí)施方案涉及這樣的分離的核酸分子，其包含編碼嗜中性白細(xì)胞因子α多肽表位-攜帶部分之氨基酸序列的多核苷酸，所說的多肽具有以上(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中的氨基酸序列。
本發(fā)明也與涉及包含本發(fā)明的分離的核酸分子的重組載體，包含該重組載體的宿主細(xì)胞，以及制造這樣的載體和宿主細(xì)胞和使用它們經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生嗜中性白細(xì)胞因子α多肽或肽的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了分離的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽，其包含選自下組的氨基酸序列(a)一種全長嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的氨基酸序列，所說的多肽具有圖1(SEQ ID NO2)的完整的氨基酸序列或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆編碼；(b)一種嗜中性白細(xì)胞因子α多肽預(yù)期的胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，所說的多肽具有圖1(SEQ ID NO2)的73-285位氨基酸序列或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆編碼；(c)一種多肽的氨基酸序列，所說的多肽包含嗜中性白細(xì)胞因子α多肽胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(圖1(SEQ ID NO2)中從約1到約46位氨基酸)或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆編碼；(d)一種多肽的氨基酸序列，所說的多肽包含嗜中性白細(xì)胞因子α多肽跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1(SEQ ID NO2)中從約47到約72位氨基酸)或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆編碼；(e)一種可溶性嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的氨基酸序列，所說的多肽包含胞外與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，但是缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域的每一種是以上所定義的。
本發(fā)明的多肽也包括與以上(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中描述的哪些具有至少90％的類似性，更優(yōu)選地至少95％的類似性的多肽，以及具有至少80％等同于，較優(yōu)選地至少90％等同于，更優(yōu)選地95％，96％，97％，98％或99％等同于以上哪些的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的這一方面的另一實(shí)施方案涉及這樣的肽或多肽，其具有嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的表位-攜帶部分的氨基酸序列，所說的多肽具有以上(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中描述的氨基酸序列。本發(fā)明的具有嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的表位-攜帶本部分的氨基酸序列的肽或多肽包括這樣的多肽的部分，該多肽具有至少六或七個，優(yōu)選地至少九個，更優(yōu)選地至少約30個到約50個氨基酸，盡管任何長度(直到并包括以上描述的本發(fā)明的多肽的全部氨基酸序列)的表位-攜帶多肽也包括在本發(fā)明內(nèi)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的抗體，其特異性地結(jié)合具有上述的(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中描述的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供分離抗體的方法，所述抗體特異性地結(jié)合具有本文描述的氨基酸序列的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽。如下所述，這些抗體在診斷和治療上是有用的。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含可溶性的嗜中性白細(xì)胞因子α或多肽，特別是人嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的藥物組合物，這些藥物組合物可以用來治療，例如，腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移，細(xì)菌，病毒，和其它寄生蟲感染，免疫缺陷病，炎癥性疾病，淋巴結(jié)病，自身免疫疾病，移植物排斥宿主病，用來刺激外周耐受性，消除一些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，調(diào)節(jié)細(xì)胞活化和增殖，并且作為免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)物是功能性結(jié)合的。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了用來施用到體外細(xì)胞，來自體內(nèi)的細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞或者多細(xì)胞有機(jī)體的包括嗜中性白細(xì)胞因子α多核苷酸或嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的組合物。在本發(fā)明的這一方面的一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所說的組合物包含用來表達(dá)在宿主有機(jī)體中治療疾病的嗜中性白細(xì)胞因子α的嗜中性白細(xì)胞因子α多核苷酸。在這一點(diǎn)上特別優(yōu)選的是在人患者中表達(dá)，以治療與嗜中性白細(xì)胞因子α基因的異常內(nèi)源性活性相聯(lián)系的功能異常。
本發(fā)明也提供了用于鑒別能夠提高或抑制由嗜中性白細(xì)胞因子α誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)的化合物的篩選方法，該方法包括使表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α的細(xì)胞和候選化合物接觸，測定細(xì)胞反應(yīng)，將細(xì)胞反應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞反應(yīng)(標(biāo)準(zhǔn)的是在缺乏候選化合物的情況下接觸所測定的)比較。由此，超過標(biāo)準(zhǔn)的增加的細(xì)胞反應(yīng)表明所說的化合物是激動劑，低于標(biāo)準(zhǔn)的降低的細(xì)胞反應(yīng)表明化合物是拮抗劑。
另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒別嗜中性白細(xì)胞因子α受體以及利用這樣的受體篩選測定激動劑和拮抗劑的方法。這一測定涉及到確定候選化合物在結(jié)合到嗜中性白細(xì)胞因子α受體上的嗜中性白細(xì)胞因子α上的作用。更具體地說，所說的方法包括使嗜中性白細(xì)胞因子α受體與嗜中性白細(xì)胞因子α多肽和候選化合物接觸，并且測定因候選化合物的存在嗜中性白細(xì)胞因子α受體結(jié)合到嗜中性白細(xì)胞因子α多肽上是否增加或減少。所說的拮抗劑可以用來預(yù)防腐敗性休克，發(fā)炎，腦部瘧疾，HIV病毒，移植物-宿主排斥，骨吸收，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及惡病質(zhì)(消瘦或營養(yǎng)不良)。
本發(fā)明的發(fā)明人曾發(fā)現(xiàn)嗜中性白細(xì)胞因子α不僅在中性白細(xì)胞中表達(dá)，而且在腎，肺臟，外周白細(xì)胞，骨髓，T細(xì)胞淋巴瘤，B細(xì)胞淋巴瘤，活化的T細(xì)胞，胃部癌，平滑肌，巨噬細(xì)胞，索帶血液組織中表達(dá)。對這些組織與細(xì)胞的一些疾病，如腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移，細(xì)菌，病毒以及其它寄生蟲感染，免疫缺陷病，腐敗性休克，發(fā)炎，腦部瘧疾，HIV病毒，移植物-宿主排斥，骨吸收，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及惡病質(zhì)(消瘦或營養(yǎng)不良)，人們相信，相對于″標(biāo)準(zhǔn)的″嗜中性白細(xì)胞因子α基因的表達(dá)水平，即在采自不具有所述疾病之個體的組織和體液中嗜中性白細(xì)胞因子α的表達(dá)水平，明顯高或低水平的嗜中性白細(xì)胞因子α基因表達(dá)在一些采自患有這樣的疾病之個體的組織(例如，骨髓)或體液(例如，血清，血漿，尿，滑液)中可以檢測到。這樣，本發(fā)明提供了一種在疾病診斷期間有用的診斷方法，該方法包括(a)測定嗜中性白細(xì)胞因子α基因在個體細(xì)胞或體液中的表達(dá)水平；(2)將該嗜中性白細(xì)胞因子α基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)的嗜中性白細(xì)胞因子α基因表達(dá)水平比較，由此，與標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)水平比較，所測定的嗜中性白細(xì)胞因子α基因表達(dá)水平的增加或減少便是疾病的指示。
本發(fā)明的另一方面涉及治療體內(nèi)需要增加的嗜中性白細(xì)胞因子α活性之個體的方法，該方法包括對這種個體施用包含治療有效量的本發(fā)明的分離的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽或者其激動劑的組合物。
本發(fā)明的還一方面涉及治療體內(nèi)需要減少的嗜中性白細(xì)胞因子α活性之個體的方法，該方法包括對這種個體施用包含治療有效量的嗜中性白細(xì)胞因子α拮抗劑的組合物。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的拮抗劑是嗜中性白細(xì)胞因子α-特異性抗體。


圖1顯示嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的核苷酸(SEQ ID NO1)和推定的氨基酸(SEQ ID NO2)序列。1至46位氨基酸代表胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，47至72位氨基酸代表跨膜結(jié)構(gòu)域(下劃線的序列)，73至285位氨基酸代表胞外結(jié)構(gòu)域(余下的序列)。
圖2顯示由″Megalign”程序(這種程序是稱為″DNAStar”的計(jì)算機(jī)程序的一部分)測定的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)與TNF-α(SEQ IDNO3)，TNF-β(淋巴毒素)(SEQ ID NO4)和FAS配體(SEQ ID NO5)氨基酸序列之間的等同區(qū)域。圖中涂黑的實(shí)心方塊中是與共有序列完全配對的殘基。
圖3顯示嗜中性白細(xì)胞因子α的氨基酸序列分析。顯示了α，β，轉(zhuǎn)角以及螺旋區(qū)；親水性和疏水性；兩親性區(qū)；柔性區(qū)；抗原指數(shù)和表面概率。在抗原指數(shù)-Jameson-Wolf圖中，指示了嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的高抗原區(qū)(即從此可以獲得本發(fā)明的表位-攜帶肽的區(qū))的位置。
圖4顯示了從1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的人cDNA測定的嗜中性白細(xì)胞因子α核苷酸序列與本發(fā)明的相關(guān)人類cDNA克隆的序列對比，本發(fā)明的相關(guān)人類cDNA克隆已被命名為HSOAD55R(SEQ ID NO7)，HSLAH84R(SEQ ID NO8)和HLTBM08R(SEQ ID NO9)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一些分離的核酸分子，這些分子包含編碼具有圖1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的多核苷酸，所說的序列是通過測序克隆的cDNA嗜中性白細(xì)胞因子α確定的。圖1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列是通過測序HNEDU15克隆獲得的，該克隆于1996年10月22日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852)。該保藏的克隆包含在pBluescript SK(-)質(zhì)粒(Stratagene，La Jolla，CA)中。
本發(fā)明的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)與TNF-α，TNF-β和Fas配體的人mRNAs的翻譯產(chǎn)物具有序列同源性(圖2)。如上所述，TNF-α被認(rèn)為是一種在細(xì)胞毒性，壞死，編程性細(xì)胞死亡，costimulation，增殖，淋巴結(jié)形成，免疫球蛋白類別開關(guān)，分化，抗病毒活性，粘著分子和其它細(xì)胞因子和生長因子的調(diào)節(jié)中起作用的細(xì)胞因子。
核酸分子除非有其它說明，本發(fā)明通過測序DNA分子確定的所有核苷酸序列都是采用自動DNA測序儀(如來自Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA的373型)測定的。并且由本發(fā)明測定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列都是通過以上所確定的DNA序列翻譯預(yù)測的。因此，如同本領(lǐng)域?qū)τ蛇@一自動方法測定的任何DNA序列所知的，本發(fā)明所測定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯誤。通過自動化測定的核苷酸序列典型地至少約90％等同于，更典型地至少約95％到約至少99.9％等同于所測序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列。實(shí)際序列可以通過其它方法(包括本領(lǐng)域已知的手工DNA測序方法)更精確地測定。也如本領(lǐng)域已知的，與實(shí)際序列比較，在測定的核苷酸序列中的單一插入或缺失會導(dǎo)致核苷酸序列翻譯中的讀框移位，使得在這樣的插入或缺失點(diǎn)開始時，由測定的核苷酸序列編碼的預(yù)測的氨基酸序列完全不同于由測序的DNA分子實(shí)際編碼的氨基酸序列。
核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列″，對DNA分子或多核苷酸而言，意指脫氧核糖核苷酸序列，對RNA分子或多核苷酸而言，意指核糖核苷酸(A，G，C和U)相應(yīng)的序列，其中在特定的脫氧核糖核苷酸序列中的每一胸苷脫氧核糖核苷酸(T)由核糖核苷酸尿苷(U)代替。
利用本文提供的信息，如圖1中的核苷酸序列，本發(fā)明的編碼嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的核酸分子可以利用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選方法獲得，例如利用mRNA作為起始物質(zhì)克隆cDNA的那些方法。對本發(fā)明為說明性的圖1(SEQ ID NO1)中描述的核酸分子從嗜中性白細(xì)胞來源的cDNA文庫檢測到。在嗜中性白細(xì)胞中也檢測到相應(yīng)于嗜中性白細(xì)胞因子αcDNA部分的已表達(dá)的序列標(biāo)志。
嗜中性白細(xì)胞因子α基因含有編碼285個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放讀框，一個約46個氨基酸殘基(圖1(SEQ ID NO2)的約1到約46位氨基酸殘基)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，一個約26個氨基酸(圖1(SEQ ID NO2)的約47到約72位氨基酸殘基)的跨膜結(jié)構(gòu)域，一個約213個氨基酸(圖1(SEQ ID NO2)的約73到約285位氨基酸殘基)的胞外結(jié)構(gòu)域，推定的分子量約31kDa。圖1(SEQ ID NO2)中顯示嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)約20％類似于和約10％等同于人TNF-α，后者可以以登記號339764從GenBank找到。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的，因?yàn)橐陨纤懻摰臏y序錯誤的可能性，由保藏的cDNA編碼的實(shí)際的完整嗜中性白細(xì)胞因子α多肽(其包含約285個氨基酸)可能要短一些。具體地說，測定的嗜中性白細(xì)胞因子α編碼序列含有第二個甲硫氨酸密碼子，其可以作為開放讀框翻譯的可替起始密碼子(在圖1(SEQ ID NO1)中210-213位核苷酸上)。更一般地，實(shí)際開放讀框可以在從圖1(SEQ ID NO1)所顯示的N-末端開始的第一或第二甲硫氨酸密碼子預(yù)測的±20個氨基酸范圍內(nèi)，更可能在±10個氨基酸范圍內(nèi)的任何位置。人們還清楚的是，取決于用于鑒別各種功能結(jié)構(gòu)域的分析標(biāo)準(zhǔn)，嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的胞外，胞內(nèi)以及跨膜結(jié)構(gòu)域的確切的″地址″可以稍有不同。例如，取決于用來確定結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)，圖1(SEQ ID NO2)中的嗜中性白細(xì)胞因子α胞外結(jié)構(gòu)域的確切位置可能稍有變化(例如，地址可以“移位”約1到約20個殘基，更可能“移位”約1到約5個殘基。在這種情況下，基于鑒定以上指明的位置的疏水氨基酸序列預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域的末端和胞外結(jié)構(gòu)域的開端顯示在圖3中。在任何情況下，如以下進(jìn)一步討論的，本發(fā)明還提供了這樣的多肽，其具有從完整多肽缺失的各種殘基，包括本文描述的胞外結(jié)構(gòu)域N-末端一個或多個氨基酸的多肽，其構(gòu)成嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的可溶形式的胞外結(jié)構(gòu)域。
如所說明的，本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式的，如mRNA，和DNA形式的，包括，例如，cDNA和基因組的DNA(由克隆獲得的或由合成產(chǎn)生的)。DNA可以是雙鏈的或單鏈的。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈(也被稱為有義鏈)或是非編碼鏈(也被稱為反義鏈)。“分離的″核酸分子意指核酸分子，DNA或RNA，其已從其天然環(huán)境分離出來。例如，在載體中包含的重組DNA分子對本發(fā)明的目的而言被認(rèn)為是分離的。分離的DNA分子的其它例子包括保持在異源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子或者純化的(部分或?qū)嵸|(zhì)上)DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明的DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸分子還包括合成產(chǎn)生的這樣的分子。
本發(fā)明的分離的核酸分子包括這樣的DNA分子，其包含具有在圖1(SEQ ID NO1)中顯示的核苷酸序列的147-149位上的起始密碼子的開放讀框(ORF)。此外，本發(fā)明的分離的核酸分子包括這樣的DNA分子，其包含實(shí)質(zhì)上不同于以上描述的哪些序列的序列，但由于遺傳密碼的簡并性，仍然編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)。當(dāng)然，遺傳密碼是本領(lǐng)域已知的。這樣，產(chǎn)生以上所述的簡并變體是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)工作。另一方面，本發(fā)明提供了編碼嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的分離的核酸分子，所說的多肽具有由1996年10月22日保藏的質(zhì)粒中包含的cDNA克隆編碼的氨基酸序列。優(yōu)選地，這一核酸分子包含編碼由以上描述的保藏的cDNA克隆編碼的多肽的胞外結(jié)構(gòu)域的序列。
本發(fā)明還提供了具有圖1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列或包含在以上描述的保藏的克隆的嗜中性白細(xì)胞因子αcDNA的核苷酸序列的分離的核酸分子，或者具有互補(bǔ)于以上序列之任一的序列的核酸分子。這樣的分離的分子，特別是DNA分子，作為基因作圖(用染色體的原位雜交)的探針以及在檢測嗜中性白細(xì)胞因子α基因在人組織中的表達(dá)(例如，經(jīng)Northern印跡分析)上是有用的。
本發(fā)明還涉及編碼以上描述的核苷酸序列的部分的核酸分子以及本文描述的分離的核酸分子的片段。具體地說，本發(fā)明提供了具有代表SEQ ID NO1的部分的核苷酸序列的多核苷酸(其由SEQ ID NO1的1-1001組成)。
此外，本發(fā)明包括這樣的多核苷酸，其包含至少95％等同于圖1(SEQ ID NO1)中1位核苷酸到809位核苷酸的序列的至少約30個鄰接的核苷酸，優(yōu)選地至少約50個核苷酸的部分的序列。
更一般地，具有保藏的cDNA的核苷酸序列或圖1(SEQ ID NO1)中顯示核苷酸序列的分離的核酸分子的片段意指長度至少約15nt，優(yōu)選地至少約20nt，更優(yōu)選地至少約30nt，最優(yōu)選地至少約40nt的片段，其作為診斷探針和引物是有用的，如本文所討論的。當(dāng)然，按照本發(fā)明，長度為50-300nt的較大的片段也是有用的，其相應(yīng)于大多數(shù)(如果不是全部的話)保藏的cDNA或圖1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列。例如，長度至少20nt的片段意指包括保藏的cDNA的核苷酸序列或圖1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列的20個或更多個鄰接的堿基的片段。本發(fā)明的優(yōu)選的核酸片段包括編碼嗜中性白細(xì)胞因子α多肽表位-攜帶部分(圖1中所限定的和以下詳細(xì)描述的)的核酸分子。
另一方面，本發(fā)明提供了包含在嚴(yán)格雜交條件下與以上描述的本發(fā)明的核酸分子的多核苷酸的部分雜交的多核苷酸的分離的核酸分子，例如1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆?！鍑?yán)格雜交條件″意指于42℃下在包含50％甲酰胺，5xSSC(750mMNaCl，75mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉pH7.6)，5x Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性剪切鮭精DNA的溶液中過夜溫育，接著在約65℃下在在0.1xSSC中洗滌濾膜。
雜交到多核苷酸的″部分″上的多核苷酸意指雜交到參照序列的至少約15個核苷酸(nt)，優(yōu)選地至少約20nt，更優(yōu)選地至少約30nt，和最優(yōu)選地約30-70(例如，50)nt上的多核苷酸(DNA或RNA)。這些作為診斷探針和引物是有用的，如上所述和以下詳述的。
“長度至少20nt”的多核苷酸的部分意指，例如參照多核苷酸(保藏的cDNA或圖1(SEQ ID NO1)中顯示的核苷酸序列)的核苷酸序列的20個或更多個鄰接核苷酸。當(dāng)然，僅與poly A(例如，圖1(SEQID NO1)中顯示的嗜中性白細(xì)胞因子αcDNA的3’末端poly(A)片段)序列或與T(或U)殘基互補(bǔ)骨架雜交的多核苷酸將不包括在用于雜交到本發(fā)明的核酸的部分上的多核苷酸內(nèi)，因?yàn)檫@樣的多核苷酸會雜交到含有poly(A)骨架或其補(bǔ)體(例如實(shí)際上任何雙鏈cDNA克隆)的任何核酸分子上。
如所說明的，本發(fā)明的編碼嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的核酸分子可以包括但不限于自身編碼所說多肽胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的那些；所說多肽胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和附加序列的編碼序列，例如編碼胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域序列或前-，原-或前原-蛋白質(zhì)序列的那些；有或沒有以前提到的附加編碼序列的所說多肽胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的編碼序列。
也由本發(fā)明的核酸以及附加的非編碼序列編碼的是以上蛋白質(zhì)序列，所說的附加的非編碼序列編碼包括但不限于例如，內(nèi)含子和非編碼5’和3’序列，如在轉(zhuǎn)錄和mRNA加工中起作用的轉(zhuǎn)錄的非翻譯的序列，包括剪接和聚腺苷酸化信號，例如，核糖體結(jié)合和穩(wěn)定性mRNA；編碼附加氨基酸的附加編碼序列，如提供附加功能基的那些。
因此，編碼多肽的序列可以融合到標(biāo)記序列中去，例如編碼有利于融合多肽純化的多肽的序列。在本發(fā)明的這一方面的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所說的標(biāo)記氨基酸序列是六組氨酸多肽，例如pQE載體(QIAGEN公司，9259Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)提供的標(biāo)記，其中許多是市售的。如Gentz等，美國國家科學(xué)院院報(bào)86821-824(1989)所描述的，例如，六組氨酸給蛋白質(zhì)純化提供方便。“HA”是對純化有用的另一種多肽，其相應(yīng)于得自流感血凝素蛋白質(zhì)的表位，該蛋白質(zhì)已由Wilson等，細(xì)胞37767(1984)所描述。如以下所討論的，其它這樣的融合蛋白質(zhì)包括在N-或C-末端融合到Fc上的嗜中性白細(xì)胞因子α。
變體和突變多核苷酸本發(fā)明還涉及本發(fā)明的核酸分子的變體，其編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的部分，類似物或衍生物。所說的變體可以是天然存在的，如天然等位基因變體?！宓任换蜃凅w″意指具有在有機(jī)體的染色體上的給定的基因座的基因的幾個可替的形式之一?；騃I，Lewin，B.，ed.，John Wiley & Sons，紐約(1985)。采用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)，可以產(chǎn)生非天然存在的變體。
這樣的變體包括由核苷酸取代，缺失或添加產(chǎn)生的那些。取代，缺失或添加可以包括一個或多個核苷酸。變體可以在編碼區(qū)，非編碼區(qū)，或它們兩者中改變。在編碼區(qū)中的改變可以產(chǎn)生保守或非保守的氨基酸取代，缺失或添加。在這些中間，特別優(yōu)選的是沉默取代，添加和缺失，其不改變嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)或其部分的性質(zhì)與活性。在這一點(diǎn)上，特別優(yōu)選的是保守取代。
最優(yōu)選的是這樣的核酸分子，其編碼具有圖1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，或者編碼由保藏的cDNA克隆編碼的嗜中性白細(xì)胞因子α氨基酸序列的胞外結(jié)構(gòu)域。其它實(shí)施方案包括這樣的分離的核酸分子，其包含一種多核苷酸，所說的多核苷酸具有至少90％，優(yōu)選地至少95％，96％，97％，98％或99％等同于選自下組的多核苷酸的核苷酸序列(a)編碼一種嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的核苷酸序列，所說的多肽具有圖1(SEQ ID NO2)的完整的氨基酸序列；(b)編碼一種嗜中性白細(xì)胞因子α多肽預(yù)期的胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，所說的多肽具有圖1(SEQ ID NO2)的73-285位氨基酸序列；(c)編碼一種嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的核苷酸序列，所說的多肽具有由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆編碼的完整的氨基酸序列；(d)編碼一種嗜中性白細(xì)胞因子α多肽預(yù)期的胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，所說的多肽具有由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆編碼的氨基酸序列；和(e)互補(bǔ)于以上(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中核苷酸序列之任一的核苷酸序列。
具有至少例如95％“等同于”編碼嗜中性白細(xì)胞因子0多肽的參照核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸意指除了所說的多核苷酸序列可以包括編碼嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的參照核苷酸序列的每100個核苷酸中最多5個點(diǎn)的突變以外，所說多核苷酸的核苷酸序列等同于參照序列。換句話說，為了獲得具有至少95％等同于參照核苷酸序列之核苷酸序列的多核苷酸，參照序列中的最多5％的核苷酸可以被缺失或由其它核苷酸取代，或者數(shù)量為參照序列總核苷酸5％的核苷酸可以插入到參照序列中。參照序列的這些突變可以發(fā)生在參照核苷酸序列的5’或3’末端位置上，或者這兩種末端位置之間的任何位置上，單個散布在參照序列的核苷酸序列中或者以一個或多個鄰接的組散布在參照序列內(nèi)。
實(shí)際上，不論任何特定的核酸分子是否至少90％，95％，96％，97％，98％或99％等同于，例如，圖1所示的核苷酸序列或者保藏的cDNA克隆的核苷酸序列，其都可以采用已知的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行常規(guī)測定，所說的計(jì)算機(jī)程序例如Bestfit程序(威斯康星序列分析軟件包，Unix版本8，遺傳計(jì)算機(jī)組，大學(xué)研究院，575 Science Drive，Madison，WI 53711)。Bestfit利用Smith和Waterman應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展482-489(1981)的局部同源性算法，發(fā)現(xiàn)兩種序列之間的最好的節(jié)段同源性。當(dāng)利用Bestfit或任何其它序列對比程序來鑒別是否某一特定的序列例如95％等同于按照本發(fā)明的參照序列時，當(dāng)然應(yīng)當(dāng)設(shè)定參數(shù)，以便從完整參照核苷酸序列計(jì)算等同性百分比，允許參照序列核苷酸總數(shù)量最多5％的同源性缺口。
本申請涉及至少90％，95％，96％，97％，98％或99％等同于圖1(SEQ ID NO1)中所顯示的核酸序列或保藏的cDNA的核酸序列的核酸分子，而不論它們是否編碼具有嗜中性白細(xì)胞因子α活性的多肽。這是因?yàn)榧词鼓骋惶囟ǖ暮怂岱肿硬痪幋a具有嗜中性白細(xì)胞因子α活性的多肽，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍然知道如何使用所說的核酸分子，例如，作為雜交探針或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物。不編碼具有嗜中性白細(xì)胞因子α活性的多肽的本發(fā)明的核酸分子的用途特別是，(1)在cDNA文庫中分離嗜中性白細(xì)胞因子α基因或其等位基因變體；(2)中期染色體原位雜交(例如“FISH”)，以提供嗜中性白細(xì)胞因子α具有的精確的染色體位置，如Verma等人染色體基本技術(shù)手冊，pergamon出版社，紐約(1988)所描述的；和Northern印跡分析檢測在特定組織中嗜中性白細(xì)胞因子αmRNA的表達(dá)。
然而，優(yōu)選的是這樣的核酸分子，其具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％等同于圖1(SEQ ID NO1)中所顯示的核酸序列或保藏的cDNA的序列，并且其確實(shí)編碼具有嗜中性白細(xì)胞因子α活性的多肽?！熬哂惺戎行园准?xì)胞因子α活性的多肽”意指這樣的多肽，當(dāng)在特定的生物學(xué)試驗(yàn)中測定時，其顯示出類似于(但不必等同于)本發(fā)明的胞外結(jié)構(gòu)域或全長嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的活性。例如，本發(fā)明的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡。用于測定某些細(xì)胞上的蛋白質(zhì)的作用的細(xì)胞增殖，細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡測定可以通過采用本領(lǐng)域熟知的和市售的用于檢測細(xì)胞復(fù)制和/或死亡的試劑進(jìn)行。例如，在本說明書以上的背景部分的參考文獻(xiàn)中描述了許多用于TNF-相關(guān)蛋白質(zhì)活性的這樣的測定法。簡言之，這樣的測定包括收集人或動物(例如，小鼠)細(xì)胞，并且與下列(1)包含嗜中性白細(xì)胞因子α的轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞-上清液(或候選多肽)或2)非轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞-上清液對照混合，并且在培養(yǎng)一定的時間后，測定對細(xì)胞數(shù)量和生存力的作用。在這種類型測定中可以測量的這樣的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)活性對治療腫瘤，腫瘤轉(zhuǎn)移，傳染，自身免疫疾病，炎癥和其它免疫-相關(guān)疾病是有用的。
在以上描述的測定中，嗜中性白細(xì)胞因子α以劑量-依賴性方式調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化。這樣，″具有嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)活性的多肽″包括這樣的多肽，在以上描述的測定中，其也顯示出劑量-依賴性方式的任何相同的細(xì)胞調(diào)節(jié)(特別是免疫調(diào)節(jié))活性。雖然劑量-依賴性活性的程度不必等同于嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)，但優(yōu)選地，與嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)相比，″具有嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)活性的多肽″在給定的活性上顯示出實(shí)質(zhì)上類似的劑量-依賴性(即，相對于參照的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)而言，候選多肽顯示出更大的活性或不多于約25倍，優(yōu)選地，不多于約10倍的活性)。
如同其它TNF家族的成員一樣，嗜中性白細(xì)胞因子α對白細(xì)胞(包括例如單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和中性白細(xì)胞)顯示出活性。因此，嗜中性白細(xì)胞因子α在指導(dǎo)這些細(xì)胞類型的增殖，分化以及遷移上是活性的。這樣的活性對的免疫增強(qiáng)或抑制，脊髓保護(hù)，干細(xì)胞固定，急性及慢性炎癥的控制和白血病的治療來說是有用的。測量這樣的活性的試驗(yàn)方法是本領(lǐng)域已知的。例如，參見Peters等，現(xiàn)代免疫學(xué)，17273(1996)；Yong等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1821111(1995)；Caux等，自然390258(1992)；和Santiago-Schwarz等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物學(xué)進(jìn)展3787(1995)。
當(dāng)然，因?yàn)檫z傳密碼的簡并性，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將立即認(rèn)識到具有至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％等同于保藏的cDNA的核酸序列或圖1(SEQ ID NO1)中顯示的核酸序列之序列的核酸分子均編碼“具有嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)活性”的多肽。事實(shí)上，因?yàn)檫@些核苷酸序列的簡并變體均編碼相同的多肽，所以，即使沒有進(jìn)行以上描述的比較試驗(yàn)，專業(yè)技術(shù)人員也清楚這一點(diǎn)。本領(lǐng)域還會認(rèn)識到，對不是簡并變體的這樣的核酸分子而言，合理數(shù)量的分子也將編碼具有嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)活性的多肽。這是因?yàn)閷I(yè)技術(shù)人員完全清楚不太可能或不可能明顯影響蛋白質(zhì)功能的氨基酸取代(例如，用第二脂肪族氨基酸代替第一脂肪族氨基酸)，如以下進(jìn)一步描述的。
載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的分離的DNA分子的載體，用所說的重組載體經(jīng)遺傳工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及通過重組技術(shù)產(chǎn)生嗜中性白細(xì)胞因子α多肽或其片段的方法。載體可以是例如，噬菌體，質(zhì)粒，病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能可以是復(fù)制感受態(tài)的或復(fù)制缺損的。在后一種情況下，病毒的增殖一般僅在互補(bǔ)的宿主細(xì)胞中發(fā)生。所說的多核苷酸可以連接到包含在宿主中增殖的選擇性標(biāo)記的載體上。一般地，質(zhì)粒載體被引入到沉淀(如磷酸鈣沉淀)或荷脂復(fù)合物中。如果載體是病毒，它可以用合適的包裝細(xì)胞系體外包裝，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞。
DNA插入物應(yīng)該有效連接到適當(dāng)?shù)膯幼由希f的啟動子可以提及的幾個如噬菌體λPL啟動子，大腸桿菌lac，trp，phoA以及tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs啟動子，其它合適的啟動子是專業(yè)技術(shù)人員已知的。所說的表達(dá)構(gòu)建體還進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄起始，終止位點(diǎn)，并且在轉(zhuǎn)錄區(qū)中含有翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由構(gòu)建體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的胞外結(jié)構(gòu)域的編碼部分優(yōu)選地包括在起始和終止密碼子(UAA，UGA或UAG)上的翻譯起始位點(diǎn)，所說的密碼子合適地位于被翻譯的多肽的末端。
如所闡述的，所說的表達(dá)載體優(yōu)選地包括至少一個選擇性標(biāo)記。這樣的標(biāo)記包括用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的二氫葉酸還原酶，G418或新霉素抗性，和用于培養(yǎng)大腸桿菌和其它細(xì)菌的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。適當(dāng)?shù)乃拗鞯拇硇岳影ǖ幌抻诩?xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，鏈霉菌以及鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞如果蠅屬S2和Spodoptera Sf9細(xì)胞；動物細(xì)胞如CHO，COS，293和Bowes黑素瘤細(xì)胞；和植物細(xì)胞。以上所述的宿主細(xì)胞的合適的培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。
載體中，用于細(xì)菌的優(yōu)選的包括由QIAGEN Inc.，同上提供的pQE70，pQE60和pQE9；由Stratagene提供的pBS載體，Phagescript載體，Bluescript載體，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A；和由Pharmacia提供的ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。優(yōu)選的真核載體是由Stratagene提供的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXTI以及pSG；和由Pharmacia提供的pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL。其它合適的載體對專業(yè)技術(shù)人員是顯而易見的。
可以通過以下方法將構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞中磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，陽離子脂質(zhì)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔法，轉(zhuǎn)導(dǎo)，感染以及其它方法。這樣的方法在許多標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊中有描述，例如Davis等，分子生物學(xué)的基本方法(1986)。
所說的多肽可以以修飾的形式(如融合蛋白質(zhì))表達(dá)，并且可以不僅包括分泌信號，而且包括附加的異源功能區(qū)。例如，附加的氨基酸區(qū)，特別是荷電氨基酸，可以添加至多肽的N-末端，以改善純化期間，或爾后的處理和存儲期間在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和恒定性。此外，肽部分可以添加至多肽上，以便有利于純化。這樣的區(qū)可以在多肽的最后制備之前除去。肽部分添加到多肽上(引起分泌或排泄，改進(jìn)穩(wěn)定性，并且有利于純化等)在本領(lǐng)域中是熟知的和常規(guī)的技術(shù)。優(yōu)選的融合蛋白質(zhì)包含對穩(wěn)定和純化蛋白質(zhì)有用的免疫球蛋白的異源區(qū)。例如，EP-A-O 464 533(加拿大同族2045869)公開了這樣的融合蛋白質(zhì)，其包含免疫球蛋白分子以及另一個人蛋白質(zhì)或其部分的恒定區(qū)的各種部分。在許多情況之下，在融合蛋白質(zhì)中的Fc部分用于治療和診斷是完全有利的，并且由此導(dǎo)致例如，改進(jìn)的藥代動力學(xué)性質(zhì)(EP-A0232 262)。另一方面，對于某些應(yīng)用，理想的是在融合蛋白質(zhì)以以上描述的方式表達(dá)，檢測和純化后可以缺失Fc部分。當(dāng)Fc部分被證明障礙在治療和診斷中利用時就是這種情況，例如，當(dāng)融合蛋白質(zhì)被用作免疫抗原時。在藥物尋找中，例如，為高-通過量篩選測定的目的，人蛋白質(zhì)(如hIL-5)與Fc部分融合，以便鑒別hIL-5拮抗劑，參見，D.Bennett等，分子識別雜志852-58(1995)和K.Johanson等，生物化學(xué)雜志2709459-9471(1995)。
嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)可以用眾所周知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，所說的方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸抽提，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水相互作用層析，親和性層析，羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選地，高效液態(tài)層析(HPLC)用于純化中。本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物，化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，以及由原核或真核宿主用重組技術(shù)產(chǎn)生的產(chǎn)物，所說的宿主包括，例如，細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲以及哺乳動物細(xì)胞。取決于用于重組產(chǎn)生方法中的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。此外，本發(fā)明的多肽也可以包括起始修飾的甲硫氨酸殘基，在某些情況下是宿主-介導(dǎo)的過程的結(jié)果。
嗜中性白細(xì)胞因子α多肽和片段本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列或圖1(SEQ ID NO2)中的氨基酸序列的分離的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽，或包含上述多肽的部分的肽或多肽。
變體和突變多肽為了改進(jìn)或改變嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的特征，可以使用蛋白質(zhì)工程。為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的重組DNA技術(shù)可以用來創(chuàng)造新的突變蛋白質(zhì)或包括單一或若干氨基酸取代，缺失，添加的突變蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)。這樣修飾的多肽可以顯示例如，提高的活性或增加的穩(wěn)定性。此外，它們可以是以較高的產(chǎn)率純化的，并且顯示出比對應(yīng)的天然多肽更好的溶解性，至少在某些純化和存儲條件下是如此。
N-末端和C-末端缺失突變體例如，對于許多蛋白質(zhì)，包括分泌蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或成熟形式，本領(lǐng)域已知，一個或多個氨基酸可以從N-末端或C-末端缺失而不實(shí)質(zhì)上喪失生物學(xué)功能。例如Ron等，生物化學(xué)雜志，2652984-2988(1993)報(bào)道了這樣的修飾的蛋白質(zhì)，即使是3，8，或27個氨基-末端氨基酸殘基被缺失，其仍具有肝素結(jié)合活性。
在這種情況下，因?yàn)楸景l(fā)明的蛋白質(zhì)是TNF多肽家族的成員，所以缺失圖1(SEQ ID NO2)中至在191位的Gly(G)殘基的N-末端氨基酸仍可保持某些生物學(xué)活性，例如針對合適的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性。具有進(jìn)一步的N-末端缺失(包括Gly(G)殘基)的多肽預(yù)計(jì)不再保持這樣的生物學(xué)活性，因?yàn)橐阎赥NF-相關(guān)肽中的這一殘基在生物學(xué)活性所需的保守結(jié)構(gòu)域的起始位點(diǎn)中。然而，即使從蛋白質(zhì)N-末端起始一個或多個氨基酸導(dǎo)致喪失蛋白質(zhì)一種或多種生物學(xué)功能的修飾，其它生物活性仍然可以保持。這樣，但從N-末端除去蛋白質(zhì)的不多于大多數(shù)的完全或胞外結(jié)構(gòu)域的殘基時，縮短的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)和/或結(jié)合抗體(這些抗體識別蛋白質(zhì)的全部或胞外結(jié)構(gòu)域)的能力一般會被保持。缺乏完整蛋白質(zhì)N-末端殘基的特定多肽是否保持這樣的免疫學(xué)活性可以容易地用本文描述的常規(guī)方法和本領(lǐng)域已知的其它方法確定。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有從圖1(SEQ ID NO2)顯示的嗜中性白細(xì)胞因子α的氨基酸序列的氨基末端到從氨基末端數(shù)起的Gly191殘基的一個或多個殘基的多肽和編碼這種多肽的多核苷酸。具體地說，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO2的殘基n-285的氨基酸序列的多肽，其中n是2-190范圍內(nèi)的整數(shù)，191是完整的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽(SEQ ID NO2中顯示的)的N-末端第一個殘基的位置，該殘基被認(rèn)為是對嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)活性所需的。更具體地說，本發(fā)明提供了編碼具有SEQ ID NO2的以下殘基的氨基酸序列之多肽的多核苷酸2-285，3-285，4-285，5-285，6-285，7-285，8-285，9-285，10-285，11-285，12-285，13-285，14-285，15-285，16-285，17-285，18-285，19-285，20-285，21-285，22-285，23-285，24-28 285，27-285，28-285，29-285，30-285，31-285，32-285，33-285，34-285，35-285，36-285，37-285，38-285，39-285，40-285，4 285，45-285，46-285，47-285，48-285，49-285，50-285，51-285，52-285，53-285，54-285，55-285，56-285，57-285，58-285，59-285，66-285，61-285，62-285，63-285，64-285，65-285，66-285，67-285，68-285，69-285，70-285，71-285，72-285，73-285，74-285，75-285，76-285，77-285，78-285，79-285，80-285，，81-285，82-285，83-285，84-285，85-285，86-285，87-285，88-285，89-285，90-285，91-285，92-285，93-285，94-285，95-285，96-285，97-285，98-285，99-285，100-285，101-285，102-285，103-285，104-285，105-285，106-285，107-285，108-285，109-285，110-285，111-285，112-285，113-285，114-285，115-285，116-285，117-285，118-285，119-285，120-285，121-285，122-285，123-285，124-285，125-285，126-285，127-285，128-285，129-285，130-285，131-285，132-285，133-285，134-285，135-285，136-285，137-285，138-285，139-285，140-285，141-285，142-285，143-285，144-285，145-285，146-285，147-285，148-285，149-285，150-285，151-285，152-285，153-285，154-285，155-285，156-285，157-285，158-285，159-285，160-285，161-285，162-285，163-285，164-285，165-285，166-285，167-285，168-285，169-285，170-285，171-285，172-285，173-285，174-285，175-285，176-285，177-285，178-285，179-285，180-285，181-285，182-285，183-285，184-285，185-285，186-285，187-285，188-285，189-285，190-285。本發(fā)明也提供了這些多核苷酸編碼的多肽。
同樣地，已知生物學(xué)功能性C-末端缺失突變蛋白質(zhì)的許多例子。例如，干擾素γ通過從蛋白質(zhì)的羧基末端缺失8-10個氨基酸殘基顯示出多達(dá)高出十倍的活性(Dabeli等，生物技術(shù)雜志7199-216(1988)。因?yàn)楸景l(fā)明的蛋白質(zhì)是TNF多肽家族的成員，至在284位的Leu的C-末端氨基酸缺失預(yù)期保持大多數(shù)(如果不是所有的)生物學(xué)活性，如受體結(jié)合和細(xì)胞復(fù)制調(diào)節(jié)。具有達(dá)到約10個附加C-末端殘基缺失的多肽也保持某些活性(即達(dá)到在273位的Gly殘基)，如受體結(jié)合，雖然這樣的多肽會缺乏在約Leu 284的保守TNF結(jié)構(gòu)域起始部分。然而，即使蛋白質(zhì)C-末端的一個或多個氨基酸的缺失導(dǎo)致蛋白質(zhì)一種或多種生物功能的改變，其它生物活性仍然可以保持。這樣，從C-末端除去不多于大多數(shù)的全部或成熟蛋白質(zhì)的殘基時，縮短的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別完整或成熟蛋白質(zhì)的抗體的能力一般將被保持。缺乏完整蛋白質(zhì)C-末端殘基的特定多肽是否保持這樣的免疫學(xué)活性可以容易地用本文描述的常規(guī)方法和本領(lǐng)域已知的其它方法確定。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有從圖1(SEQ ID NO2)顯示的嗜中性白細(xì)胞因子α的氨基酸序列的羧基末端到從羧基末端數(shù)起的Gly274殘基的一個或多個殘基的多肽和編碼這種多肽的多核苷酸。具體地說，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO2的殘基1-m的氨基酸序列的多肽，其中m是274-284范圍內(nèi)的整數(shù)，更具體地說，本發(fā)明提供了編碼具有SEQ ID NO2的以下殘基的氨基酸序列之多肽的多核苷酸1-274，1-275，1-276，1-277，1-278，1-279，1-280，1-281，1-282，1-283和1-284。本發(fā)明也提供了這些多核苷酸編碼的多肽。
本發(fā)明也提供了具有從氨基和羧基末端缺失的一個或多個氨基酸的多肽，其可以被描述為具有SEQ ID NO2的n-m殘基，其中n和m是以上描述的整數(shù)。也包括在本發(fā)明中的是編碼一種多肽的核苷酸序列，所說的多肽由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆所編碼的完整的嗜中性白細(xì)胞因子α氨基酸序列的部分組成，這一部分從保藏的克隆中的cDNA克隆編碼的完整的氨基酸序列(或這些N-末端和C-末端的任何組合)的氨基末端數(shù)起的1-190位氨基酸或C-末端數(shù)起的1-11位氨基酸中排除。本發(fā)明也提供了編碼以上使用缺失多肽的多核苷酸。
其它突變體除以上討論的蛋白質(zhì)的末端缺失形式之外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認(rèn)識到，一些嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的氨基酸序列可以變化，而不對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生重要影響。如果考慮序列中的這種差異，則應(yīng)該牢記在蛋白質(zhì)上會有決定活性的關(guān)鍵區(qū)域。
這樣，本發(fā)明還包括嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的變體，其實(shí)質(zhì)上顯示嗜中性白細(xì)胞因子α多肽活性或包括嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的區(qū)，如以下討論的蛋白質(zhì)的部分。這樣的突變體包括缺失，插入，反轉(zhuǎn)，重復(fù)和按照本領(lǐng)域已知的一般規(guī)則選擇的類型取代(以便對活性產(chǎn)生小的影響)。例如，Bowie J.U.等，″譯解蛋白質(zhì)序列中的信息對氨基酸取代的耐受性″，科學(xué)2471306-1310(1990)中提供了對怎樣進(jìn)行表型沉默氨基酸取代的指導(dǎo)。其中作者指出，研究氨基酸序列改變有兩種主要方法，第一種方法依賴于進(jìn)化的過程，其中突變由天然選擇是接受還是不接受。第二種方法利用基因工程在克隆化基因特異性位置引入氨基酸變化，并且選擇或篩選以鑒別保持功能的序列。
如作者所陳述的，這些研究已經(jīng)揭示蛋白質(zhì)驚人地耐受氨基酸取代。作者還指出一個氨基酸變化很可能在蛋白質(zhì)的一定位置是允許的。例如，大多數(shù)隱藏的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而極少側(cè)鏈表面特性一般是保守的。這樣的表型沉默取代在Bowie J.U.等，同上中有描述，本文引用來作為參考。所見的保守取代典型地是在脂肪族氨基酸Ala，Val，Leu和Ile中間的一個替代另外一個；羥基殘基Ser和Thr的相互交換，酸性殘基Asp與Glu的交換，酰胺殘基Asn和Gln之間的取代，堿性殘基Lys和Arg的交換和在芳香族殘基Phe，Tyr之間的替代。
這樣，圖1(SEQ ID NO2)的或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段，衍生物或類似物，可以是(i)其中一個或多個氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選地是保守氨基酸殘基)取代的一種，這種取代的氨基酸殘基可以也可以不是由遺傳密碼所編碼的；或(ii)其中一個或多個氨基酸殘基包含取代基的一種；或(iii)其中多肽的胞外結(jié)構(gòu)域與另一個化合物融合的一種，所述的化合物例如增加多肽的半衰期的化合物(如，聚乙二醇)；或(iv)其中附加的氨基酸融合到多肽的胞外結(jié)構(gòu)域上的一種，所說的結(jié)構(gòu)域例如IgG Fc融合區(qū)肽或前導(dǎo)或分泌序列，以及用于純化多肽或原蛋白質(zhì)序列的胞外結(jié)構(gòu)域的序列。通過本發(fā)明的教導(dǎo)，這樣的片段，衍生物以及類似物被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
這樣，本發(fā)明的嗜中性白細(xì)胞因子α可以包括一個或多個氨基酸取代，缺失或添加，而不論來自天然突變或人工操作。如所說明的，變化優(yōu)選地是較小性質(zhì)的改變，例如，不明顯影響蛋白質(zhì)的折疊或活性的保守氨基酸取代(參見表1)。
表1.保守氨基酸取代芳香族的苯丙氨酸色氨酸酪氨酸疏水的 亮氨酸異亮氨酸纈氨酸極性的 谷氨酰胺天冬酰胺堿性的 精氨酸賴氨酸組氨酸酸性的 天冬氨酸谷氨酸小的丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸甘氨酸對功能來說十分重要的本發(fā)明的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的氨基酸可以用本領(lǐng)域已知的的方法鑒別，如位點(diǎn)-定向誘變或丙氨酸-掃描誘變(Cunningham和Well，科學(xué)2441081-1085(1989))。后一方法在分子中的所有殘基上引入單一丙氨酸突變。然后試驗(yàn)所形成的突變分子的生物學(xué)活性，如受體結(jié)合或者體外或體外增殖活性。
特別有益的是用其它荷電氨基酸或中性氨基酸取代荷電氨基酸，其可以產(chǎn)生具有非常合乎需要的改進(jìn)的特征，例如較少聚集。聚集作用不僅可以減少活性而且在制備藥物制劑時成問題，因?yàn)榫酆象w可以是免疫原性的(Pinckard等，臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)2331-340(1967)；Robbins等，糖尿病36838-845；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic Drug CarrierSystems 10307-377(1993)。
氨基酸的取代也可以改變配體結(jié)合細(xì)胞表面受體的選擇性。例如，Ostade等，自然361266-268(1993)描述了某些突變導(dǎo)致TNF-α僅選擇性地結(jié)合兩種已知類型的TNF受體之一。因?yàn)槭戎行园准?xì)胞因子α是TNF多肽家族的成員，所以類似于TNF-α中的那些突變在嗜中性白細(xì)胞因子α中很可能有類似的作用。
可以通過結(jié)構(gòu)分析測定配體-受體結(jié)合的關(guān)鍵性位點(diǎn)，所說的結(jié)構(gòu)分析方法如結(jié)晶，核磁共振或光親和標(biāo)記(Smith等，分子生物學(xué)雜志224899-904(1992)和Vos等，科學(xué)255306-312(1992))。因嗜中性白細(xì)胞因子α是TNF-相關(guān)蛋白質(zhì)家族的成員，為了調(diào)節(jié)而非完全消除嗜中性白細(xì)胞因子α的生物學(xué)活性，優(yōu)選地在編碼TNF保守結(jié)構(gòu)域中氨基酸(即圖1(SEQ ID NO2)的191-284位)的序列中進(jìn)行突變，更優(yōu)選地在所有TGF家族成員中非保守的區(qū)中的殘基中進(jìn)行突變。通過在相關(guān)TNFs中通常發(fā)現(xiàn)這種保守氨基酸的位置在嗜中性白細(xì)胞因子α中制造特定的突變，嗜中性白細(xì)胞因子α?xí)鸬睫卓箘┑淖饔?，由此具有拮抗活性。因此，本發(fā)明的多肽包括嗜中性白細(xì)胞因子α突變體。這樣的嗜中性白細(xì)胞因子α突變體由圖1(SEQ ID NO2)中所示的嗜中性白細(xì)胞因子α氨基酸序列的全長或胞外結(jié)構(gòu)域(優(yōu)選地)組成。也形成本發(fā)明的一部分的是包含編碼上述嗜中性白細(xì)胞因子α突變體之核酸序列的分離的多核苷酸。
本發(fā)明的多肽最好是以分離的形式，優(yōu)選地以實(shí)質(zhì)上純化的形式提供。嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的重組產(chǎn)生的形式可以通過Smith和Johnson基因6731-40(1988)中所描述的一步法實(shí)質(zhì)上純化。
本發(fā)明的多肽包括由保藏的cDNA編碼的完整的多肽，包括由保藏的cDNA編碼的多肽的胞內(nèi)，跨膜和胞外結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域減胞內(nèi)和跨膜結(jié)構(gòu)域，圖1(SEQ ID NO2)的完整的多肽，圖1(SEQ ID NO2)的胞外結(jié)構(gòu)域減胞內(nèi)和跨膜結(jié)構(gòu)域，以及與以上所描述的那些具有至少90％，優(yōu)選地至少95％，更優(yōu)選地至少96％，97％，98％或99％類似性的多肽。
本發(fā)明的還包括至少80％等同于，優(yōu)選地至少90％或95％更優(yōu)選地至少96％，97％，98％或99％等同于由保藏的cDNA編碼的多肽或圖1(SEQ ID NO2)的多肽，也包括具有至少30個氨基酸，更優(yōu)選地至少50個氨基酸的這樣的多肽的部分。
兩種多肽的百分類似性意指通過利用Bestfit程序(威斯康星序列分析軟件包，Unix版本8，遺傳計(jì)算機(jī)組，大學(xué)研究院，575 ScienceDrive，Madison，WI 53711)。比較兩多肽的序列比較兩種多肽的氨基酸序列和測定類似性的設(shè)定值標(biāo)度(default setting)所產(chǎn)生的相似性得分。Bestfit利用Smith和Waterman應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展482-489(1981)的局部同源性算法，發(fā)現(xiàn)兩種序列之間的最好的節(jié)段同源性。
具有至少例如95％“等同于”嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的參照氨基酸序列的氨基酸序列的多肽意指除了所說的多肽可以包括嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的參照氨基酸序列的每100個氨基酸中最多5個氨基酸改變以外，所說多肽的氨基酸序列等同于參照序列。換句話說，為了獲得具有至少95％等同于參照氨基酸序列之氨基酸序列的多肽，參照序列中的最多5％的氨基酸殘基可以被缺失或由其它氨基酸取代，或者數(shù)量為參照序列總殘基5％的氨基酸可以插入到參照序列中。參照序列的這些改變可以發(fā)生在參照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置上，或者這兩種末端位置之間的任何位置上，單個散布在參照序列的氨基酸序列中或者以一個或多個鄰接的組散布在參照序列內(nèi)。
實(shí)際上，不論任何特定的多肽是否至少90％，95％，96％，97％，98％或99％等同于，例如，圖1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列或者保藏的cDNA克隆編碼的氨基酸序列，其都可以采用已知的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行常規(guī)測定，所說的計(jì)算機(jī)程序例如Bestfit程序(威斯康星序列分析軟件包，Unix版本8，遺傳計(jì)算機(jī)組，大學(xué)研究院，575 ScienceDrive，Madison，WI 53711)。當(dāng)利用Bestfit或任何其它序列對比程序來鑒別是否某一特定的序列例如95％等同于按照本發(fā)明的參照序列時，當(dāng)然應(yīng)當(dāng)設(shè)定參數(shù)，以便從完整參照氨基酸序列計(jì)算等同性百分比，允許參照序列氨基酸總數(shù)量最多5％的同源性缺口。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員意指的方法，本發(fā)明的多肽可以用作SDS-PAGE凝膠或分子篩凝膠過濾柱上的分子量標(biāo)記。
如以下詳盡描述的，本發(fā)明的多肽也可以用來產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體，其在如下所述的檢測嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)表達(dá)的試驗(yàn)中或者作為能夠增強(qiáng)或抑制嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)功能的激動劑和拮抗劑是有用的。此外，這樣的多肽可以用于酵母兩-雜種系統(tǒng)中，“俘獲”嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白，其也是按照本發(fā)明的候選激動劑和拮抗劑。Fields和Song，自然340245-246(1989)中描述了酵母兩-雜種系統(tǒng)。
表位-攜帶部分另一方面，本發(fā)明提供了包含表位-攜帶本發(fā)明的多肽的部分的肽或多肽。這一多肽部分的表位是本發(fā)明的多肽的免疫原性或抗原性表位?！迕庖咴员砦弧灞欢x為蛋白質(zhì)的一部分，當(dāng)整個蛋白質(zhì)是免疫原時，其引發(fā)抗體反應(yīng)。另一方面，抗體可以結(jié)合的蛋白質(zhì)分子的區(qū)被定義為″抗原性表位″。蛋白質(zhì)免疫原性表位的數(shù)量一般少于抗原性表位的數(shù)量。參見，例如，Geysen等，美國國家科學(xué)院院報(bào)813998-4002(1983)。
對攜帶抗原表位(即，含有抗體可以結(jié)合的蛋白質(zhì)分子的區(qū))的肽或多肽的選擇而言，本領(lǐng)域已知模擬蛋白質(zhì)序列部分的相對較短的合成肽通?？梢砸l(fā)與部分模擬蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗血清。參見例如Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learner，R.A.(1983)″與蛋白質(zhì)上預(yù)定的位點(diǎn)反應(yīng)的抗體″，科學(xué)，219660-666。能夠引發(fā)蛋白質(zhì)反應(yīng)性血清的肽通常由蛋白質(zhì)的一級序列表示，可以由一組簡單的化學(xué)性質(zhì)表征既不局限于完整蛋白質(zhì)的優(yōu)勢免疫區(qū)(即免疫原性表位)，也不局限于氨基或羧基末端。因此，本發(fā)明的抗原性表位-攜帶肽和多肽對產(chǎn)生抗體，包括單克隆抗體是有用的，所說的抗體特異性地結(jié)合本發(fā)明的多肽。參見Wilson等，細(xì)胞37767-778(1984)，p777。
優(yōu)選地本發(fā)明的抗原性表位-攜帶肽和多肽較好地含有本發(fā)明的多肽的氨基酸序列內(nèi)所包含的至少七個，優(yōu)選地至少九個，更優(yōu)選地約15個到約30個之間的氨基酸?？梢杂脕懋a(chǎn)生嗜中性白細(xì)胞因子α特異性抗體的抗原性多肽或肽的非限制例子包括包含從圖1(SEQID NO2)的約Phe 115-約Leu 147的氨基酸殘基的多肽；包含從圖1(SEQ ID NO2)的約Ile 150-約Tyr163的氨基酸殘基的多肽；包含從圖1(SEQ ID NO2)的約Ser171-約Phe194的氨基酸殘基的多肽；包含從圖1(SEQ ID NO2)的約Glu223-約Tyr247的氨基酸殘基的多肽；包含從圖1(SEQ ID NO2)的約Ser271-約Phe278的氨基酸殘基的多肽；通過Jameson-Wolf抗原指數(shù)分析，已經(jīng)確定這些多肽片段攜帶嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的抗原表位，如圖3所示。
本發(fā)明的表位-攜帶肽和多肽可以用任何常規(guī)方法產(chǎn)生。參見，例如，Houghten，R.A.(1985)，用于迅速大量合成肽的固相方法在單個氨基酸水平上抗原-抗體相互作用的特異性，美國國家科學(xué)院院報(bào)825131 5135；在Houghten等(1986)的美國專利4,631,211中進(jìn)一步描述了這一“同時多種肽合成(SMPS)”方法。
本發(fā)明的表位-攜帶肽和多肽用來根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法誘導(dǎo)抗體。參見，例如，Sutcliffe等，同上；Wilson等，同上；Chow，M.等，美國國家科學(xué)院院報(bào)82910 914；和Bittle，F(xiàn).J.等，J.Gen.Virol.662347-2354(1985)。本發(fā)明的免疫原性表位-攜帶肽，即，當(dāng)整個蛋白質(zhì)是免疫原時，根據(jù)本領(lǐng)域已知的的方法鑒別引發(fā)抗體反應(yīng)的那些蛋白質(zhì)部分。參見，例如，Geysen等，同上。此外，Geysen(1990)的美國專利5,194,392描述了檢測或測定單體(氨基酸或其它化合物)序列的一般性方法，所說的單體是拓?fù)鋵W(xué)上等同的表位(即″mimotope”)，其互補(bǔ)于興趣抗體的特定互補(bǔ)位(抗原結(jié)合位點(diǎn))。更一般地，Geysen(1989)的美國專利4,433,092描述了檢測或測定單體序列的方法，這些單體是拓?fù)鋵W(xué)上等同的配體，其互補(bǔ)于特定興趣受體的配體結(jié)合位點(diǎn)。同樣地，Houghten，R.A.等(1996)的美國專利5,480,971在過度烷基化的(Peralkylated)寡肽混合物中公開了線型C1-C7-烷基過度烷基化的寡肽和這樣的肽的組和文庫，以及利用這樣的寡肽組和文庫測定優(yōu)先結(jié)合到興趣受體分子上的過度烷基化的寡肽的方法。這樣，本發(fā)明的表位-攜帶肽的非肽類似物也可以通過這些方法常規(guī)制備。
融合蛋白質(zhì)本領(lǐng)域技術(shù)人員會清楚，以上描述的本發(fā)明的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽，其表位-攜帶片段可以與免疫球蛋白(IgG)的恒定結(jié)合域的部分組合，形成嵌合多肽。這些融合蛋白質(zhì)有利于純化，并且顯示出增加的體內(nèi)半衰期，對由人CD4-多肽的頭兩個結(jié)構(gòu)域及哺乳動物免疫球蛋白的重或輕鏈恒定區(qū)的各種結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白質(zhì)已經(jīng)顯示出這一點(diǎn)(EP 394,827；Traunecker等，自然33184-86(1988))。由于IgG部分，具有二硫鍵-連接的二聚結(jié)構(gòu)的融合蛋白質(zhì)也可以比單體嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)或單獨(dú)的蛋白質(zhì)片段更有效地結(jié)合或中和其它分子(Fountoulakis等，生物化學(xué)雜志2703958-3964(1995))。
免疫系統(tǒng)-相關(guān)疾病的診斷本發(fā)明的發(fā)明人曾檢測了嗜中性白細(xì)胞因子α在各種組織，特別是中性白細(xì)胞中的表達(dá)。相對″標(biāo)準(zhǔn)的″嗜中性白細(xì)胞因子α基因的表達(dá)水平，即，在來自未患有免疫系統(tǒng)疾病的個體的免疫系統(tǒng)組織或體液中嗜中性白細(xì)胞因子α表達(dá)水平而言，對于一些與免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾病，實(shí)質(zhì)上改變(增加或減少)水平的嗜中性白細(xì)胞因子α基因表達(dá)在從這種疾病的個體采取的免疫系統(tǒng)組織或其它細(xì)胞或體液(例如，血清，血漿，尿，滑液，以及脊柱液)中可以檢測到。這樣，本發(fā)明提供了一種在系統(tǒng)疾病的診斷期間有用的診斷方法，該方法包括檢測得自個體的免疫系統(tǒng)組織或其它細(xì)胞或體液中編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)水平，并且把所測量的基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)的嗜中性白細(xì)胞因子α基因表達(dá)水平比較，由此，與標(biāo)準(zhǔn)比較，基因表達(dá)水平上的增加或減少就是免疫系統(tǒng)疾病的指示。
尤其是，人們相信，當(dāng)與相應(yīng)的″標(biāo)準(zhǔn)″水平比較時，在患有癌癥的的哺乳動物中，明顯表達(dá)增加或降低水平的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)和編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的mRNA。此外，人們相信，當(dāng)與來自相同物種而不患有癌癥的哺乳動物血清相比時，在患有這種癌癥的哺乳動物的某些體液(例如，血清，血漿，尿，以及脊液)中可以檢測到增加或降低水平的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)。
這樣，在免疫系統(tǒng)疾病(包括這一系統(tǒng)的癌癥)的診斷期間，本發(fā)明提供了一種有用的診斷方法，該方法包括檢測得自個體的免疫系統(tǒng)組織或其它細(xì)胞或體液中編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)水平，并且把所測量的基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)的嗜中性白細(xì)胞因子α基因表達(dá)水平比較，由此，與標(biāo)準(zhǔn)比較，基因表達(dá)水平上的增加或減少就是免疫系統(tǒng)疾病的指示。
在根據(jù)常規(guī)方法已經(jīng)存在免疫系統(tǒng)疾病的診斷(包括腫瘤診斷)方法時，本發(fā)明作為預(yù)測指示是有用的，由此，與接近標(biāo)準(zhǔn)水平表達(dá)基因的患者比較，顯示出增加的或降低的嗜中性白細(xì)胞因子α基因表達(dá)的患者將得到一個最壞的臨床結(jié)論。
“測定編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)水平″意指直接(例如，通過測定或估計(jì)絕對蛋白質(zhì)水平或mRNA水平)或相對(例如，通過與第二生物樣品中的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)水平或mRNA水平比較)地定性或定量測定或估計(jì)第一生物樣品中嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的水平或編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的mRNA的水平。優(yōu)選地，測定或估計(jì)第一生物樣品中的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)水平或mRNA水平，并且與標(biāo)準(zhǔn)的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)水平或mRNA水平比較，所說的標(biāo)準(zhǔn)是從由不患有疾病的個體獲得的第二生物樣品采集的，并且是從不患有免疫系統(tǒng)疾病之個體群體的平均水平確定的。本領(lǐng)域清楚的是，一旦標(biāo)準(zhǔn)的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)水平或mRNA水平已知，就可以以它作為比較標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)使用。
“生物樣品″意指任何從個體獲得的生物樣品，體液，細(xì)胞系，組織培養(yǎng)物，或含有嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)或mRNA的其它來源。如所指出的，生物樣品包括含有嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的游離胞外結(jié)構(gòu)域的體液(如血清，血漿，尿，滑液和脊液)，免疫系統(tǒng)組織，以及發(fā)現(xiàn)表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α或嗜中性白細(xì)胞因子α受體的完整的或游離的胞外結(jié)構(gòu)域的其它組織來源。用于從哺乳動物獲得組織活檢樣品和體液的方法是本領(lǐng)域已知的。這里生物樣品包括mRNA，組織活檢樣品是優(yōu)選的來源。
本發(fā)明對在哺乳動物(優(yōu)選地是人類)中診斷或治療各種免疫系統(tǒng)-相關(guān)疾病來說是有用的。這樣的疾病包括但不限于腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移，感染，病毒和其它寄生蟲細(xì)菌，免疫缺陷病，炎癥性疾病，淋巴結(jié)病，自身免疫疾病，以及移植物排斥宿主的疾病。
總細(xì)胞RNA可以利用任何合適的技術(shù)從生物樣品分離，利用在Chomczynski和Sacchi，分析生物化學(xué)162156-159(1987)中所描述的單-步硫氰酸胍-苯酚-三氯甲烷法。然后用任何合適的方法測定編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的mRNA的水平。這些包括Northen印跡分析，S1核酸酶作圖，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，與聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)，以及與連接酶鏈反應(yīng)結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄(RT-LCR)。
可以利用基于抗體的技術(shù)在生物樣品中測定嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)水平。例如，嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)在組織中的表達(dá)可以用經(jīng)典的免疫組織學(xué)方法研究(Jalkanen，M.，等，細(xì)胞生物學(xué)雜志101976-985(1985)；Jalkanen，M.，等，細(xì)胞生物學(xué)雜志1053087-3096(1987))。對于檢測嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)基因表達(dá)有用的其它基于抗體的方法包括免疫測定，如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。合適的抗體測定標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的，包括放射性同位素，如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，銦(112In)，锝(99mTc)，和熒光標(biāo)記，如熒光素和羅丹明，以及生物素。
除測定從個體獲得的生物樣品中的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)之外，可以通過造影體內(nèi)檢測嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)。嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)體內(nèi)造影的抗體標(biāo)記或標(biāo)志包括可由X-放射顯影法，NMR或ESR檢測的那些。對于X-放射顯影法，合適的標(biāo)記包括放射性同位素，如鋇或銫，其發(fā)射可檢測的輻射但對受治療者無害。NMR和ESR的合適的標(biāo)記包括具有可檢測的特征旋轉(zhuǎn)的那些，如氘，這可以通過標(biāo)記相關(guān)雜交瘤營養(yǎng)物摻入到抗體中。
將嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)-特異性抗體或抗體片段引入(例如，腸胃外，皮下，腹膜內(nèi))到待檢測免疫系統(tǒng)疾病的哺乳動物中，所說的抗體或抗體片段已經(jīng)用適當(dāng)?shù)目蓹z測造影組分標(biāo)記，所述組分如放射性同位素(如，131I，112I，99mTc)，不透射線物質(zhì)，或核磁共振可檢測的材料。本領(lǐng)域會理解的是，受治療者的大小和所利用的造影系統(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷音像所需的造影組分的數(shù)量。在用于人受治療者的放射性同位素組分的情況下，注入的放射性的量通常在約5-20毫居里99mTc的范圍內(nèi)。然后標(biāo)記的抗體或抗體片段優(yōu)先在含有嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的細(xì)胞的位置積累。在S.W.Burchiel等，″放射性標(biāo)記的抗體和其片段的免疫藥動學(xué)″(腫瘤造影中第13章癌的放射化學(xué)檢測，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes，編，Masson出版公司.(1982))中描述了體內(nèi)腫瘤造影。
抗體用于本發(fā)明的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)-特異性抗體可以由抗完整的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)或者其抗原性多肽片段產(chǎn)生，其可以與載體蛋白質(zhì)一起存在，所述載體蛋白質(zhì)如動物系統(tǒng)(如兔或小鼠)的白蛋白；如果其長度足夠(至少約25個氨基酸)，則沒有載體。
如本文所使用的，術(shù)語″抗體″(Ab)或″單克隆抗體″(Mab)意指包括完整的分子以及能夠特異性地結(jié)合嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的抗體片段(如，F(xiàn)ab和F(ab’)2片段)。Fab和F(ab’)2片段缺乏完整的抗體的Fc片段，明顯更迅速循環(huán)，并且可以具有完整抗體的更少的非特異性組織結(jié)合(Wahl等，核醫(yī)學(xué)雜志，24316-325(1983))。這樣，這些片段是優(yōu)選的。
本發(fā)明的抗體可以用多種方法的任何一種制備。例如，可以將表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)或其抗原片段的細(xì)胞施用給動物，以便誘導(dǎo)產(chǎn)生包含多克隆抗體的血清。在優(yōu)選的方法中，制備嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)，使其實(shí)質(zhì)上不含有天然污染物。然后將這種制劑引入到動物中，以產(chǎn)生特異性更大的多克隆抗血清。
在大多數(shù)優(yōu)選的方法中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體(或其嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)結(jié)合片段)。這樣的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)(Kijhler等，自然256495(1975)；Kiihler等，歐洲免疫學(xué)雜志6511(1976)；Khlei等，歐洲免疫學(xué)雜志6292(1976)；Hammerling等，單克隆抗體和T-細(xì)胞雜交瘤，Elsevier，N.Y.，(1981)pp.563-681)制備。一般來說，這樣的方法涉及以嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)抗原或，更優(yōu)選地，用表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的細(xì)胞免疫動物(優(yōu)選地是小鼠)。合適的細(xì)胞可以通過其結(jié)合抗嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)抗體的能力識別。這樣的細(xì)胞可以在任何合適的組織培養(yǎng)機(jī)中培養(yǎng)；然而，優(yōu)選的是在補(bǔ)充有10％胎牛血清(在約56℃滅活)，并且補(bǔ)充有約10g/l非必需氨基酸，約1,000U/ml青霉素，以及約100μg/ml鏈霉素的Earle’s改進(jìn)的Eagle’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。抽提這樣的小鼠的脾細(xì)胞，與合適的骨髓瘤細(xì)胞系融合。依據(jù)本發(fā)明，任何合適的骨髓瘤細(xì)胞系都可以使用；然而，更優(yōu)選的是使用親本骨髓瘤細(xì)胞系(SP20)，可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，Virginia)獲得。融合之后，形成的雜交瘤細(xì)胞有選擇地保持在HAT培養(yǎng)基中，然后按照Wands等(胃腸病學(xué)80225-232(1981))所述經(jīng)有限稀釋克隆。然后檢測通過這種選擇獲得的雜交瘤細(xì)胞，以鑒別分泌能夠結(jié)合嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)抗原的抗體的克隆。
此外，可以通過使用抗獨(dú)特型抗體的兩步方法產(chǎn)生能夠結(jié)合嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)可以的附加抗體。這樣一種方法利用這樣一種事實(shí)，即抗體是自身抗原，并且，因此，有可能獲得結(jié)合第二抗體的抗體。依據(jù)這一方法，嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)特異性抗體用于免疫動物，優(yōu)選地是小鼠。然后這樣的動物的脾細(xì)胞用來產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，篩選雜交瘤細(xì)胞，以鑒別產(chǎn)生抗體的克隆，所述抗體結(jié)合嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)特異性抗體的能力可以由嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)抗原阻斷。這樣的抗體包括針對嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)特異性抗體的抗獨(dú)特型抗體，并且可以用來免疫動物，誘導(dǎo)形成其它嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)特異性抗體。
應(yīng)當(dāng)清楚的是，按照本文所公開的方法，可以使用Fab和F(ab’)2和本發(fā)明的抗體的其它片段。這樣的片段典型地是采用酶，例如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生(Fab’)2片段)經(jīng)蛋白水解切割產(chǎn)生的。此外，通過應(yīng)用重組DNA技術(shù)或合成化學(xué)可以產(chǎn)生嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)-結(jié)合片段。
在人類診斷中使用體內(nèi)造影檢測提高水平的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)時，可能更優(yōu)選的是利用″人源化″嵌合的單克隆抗體。這樣的抗體可以由使用來源于產(chǎn)生以上描述的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的遺傳構(gòu)建體產(chǎn)生。用于產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。綜述參見，Morrison，科學(xué)2291202(1985)；Oi等，生物技術(shù)4214(1986)；Cabilly等，美國專利.4,816,567；Taniguchi等，EP 171496；Morrison等，EP 173494；Neuberger等，WO 8601533；Robinson等，WO 8702671；Boulianne等，自然312643(1984)；Neuberger等，自然314268(1985)。
免疫系統(tǒng)-相關(guān)疾病的治療如上所述，嗜中性白細(xì)胞因子α多核苷酸和多肽對牽涉到嗜中性白細(xì)胞因子α活性異常高或低的表達(dá)的疾病的診斷來說是有用的。在表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α并且活性由嗜中性白細(xì)胞因子α調(diào)節(jié)的細(xì)胞和組織的情況下，容易明白地是，與標(biāo)準(zhǔn)或″正常的″水平相比，個體中嗜中性白細(xì)胞因子α表達(dá)水平的實(shí)質(zhì)性改變(增加或降低)導(dǎo)致與其中嗜中性白細(xì)胞因子α被表達(dá)和/或是活性的體系統(tǒng)相關(guān)的病理狀態(tài)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也清楚的是，由于本發(fā)明的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)是TNF家族的成員，蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域可以以可溶性形式從細(xì)胞釋放，這些細(xì)胞經(jīng)蛋白水解切割表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α，因此，當(dāng)從外源添加至細(xì)胞，組織，以及個體的身體時，嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)(特別是可溶形式的胞外結(jié)構(gòu)域)將對個體的任何靶細(xì)胞發(fā)揮其調(diào)節(jié)活性。此外，表達(dá)II型跨膜蛋白質(zhì)的細(xì)胞可以添加至細(xì)胞，組織或個體的身體，由此，添加的細(xì)胞將結(jié)合表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α受體的細(xì)胞，從而表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α的細(xì)胞可以對攜帶受體的靶細(xì)胞發(fā)揮作用(例如細(xì)胞毒性)。
因此，應(yīng)當(dāng)清楚的是，由降低個體中嗜中性白細(xì)胞因子α活性的標(biāo)準(zhǔn)或正常水平引起的疾病，特別是免疫系統(tǒng)疾病，可以通過施用嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)(以可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的形式或表達(dá)完整蛋白質(zhì)的細(xì)胞)來治療。這樣，本發(fā)明也提供了治療需要增加的嗜中性白細(xì)胞因子α活性水平的個體的方法，該方法包括對這樣的個體施用藥物組合物，該藥物組合物包含在這樣的個體中有效增加嗜中性白細(xì)胞因子α活性水平有效量的本發(fā)明的分離的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽。
因?yàn)槭戎行园准?xì)胞因子α屬于TNF超家族，其也應(yīng)該調(diào)節(jié)血管生成。此外，因?yàn)槭戎行园准?xì)胞因子α抑制免疫細(xì)胞功能，它將有各種抗炎性活性。嗜中性白細(xì)胞因子α可以用作抗新血管形成(neovascularizing)劑，以便通過刺激宿主防衛(wèi)細(xì)胞(例如，細(xì)胞毒性T細(xì)胞，以及巨噬細(xì)胞)的侵染與活化和通過抑制血管生成，來治療實(shí)體腫瘤。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到其它非癌指示，其中血管增殖不是所需的。它們也可以用于提高宿主防御力，抵抗慢性和急性感染，例如，經(jīng)由吸引和活化殺微生物的白細(xì)胞抵抗肌細(xì)菌感染。嗜中性白細(xì)胞因子α也可以用于通過抑制IL-2的生物合成抑制T-細(xì)胞增殖，以治療T-細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病和淋巴細(xì)胞白血病。嗜中性白細(xì)胞因子α也可以用來刺激創(chuàng)傷治愈，兩者都經(jīng)由碎片清除和接連組織促進(jìn)炎性細(xì)胞。以這一相同的方式，嗜中性白細(xì)胞因子α也可以用來治療其它纖維變性疾病，包括肝硬化，骨關(guān)節(jié)炎和肺纖維化。嗜中性白細(xì)胞因子α也增加嗜曙紅細(xì)胞的存在，其具有殺死如同在血吸蟲病，旋毛蟲病和蛔蟲病中的侵染組織的寄生蟲幼蟲的明顯功能。它也可以用來調(diào)節(jié)血細(xì)胞生成，通過調(diào)節(jié)各種造血祖細(xì)胞的活化與分化，例如，化療后從骨髓釋放成熟的白細(xì)胞，即，在干細(xì)胞活化上。嗜中性白細(xì)胞因子α也可以用來治療膿毒。
制劑嗜中性白細(xì)胞因子α多肽組合物(優(yōu)選地包含多肽，其是可溶形式的胞外結(jié)構(gòu)域)以與良好的醫(yī)學(xué)實(shí)踐一致的方式來配制和用藥，考慮個體患者的臨床狀況(尤其是單獨(dú)以嗜中性白細(xì)胞因子α多肽治療的副作用)，嗜中性白細(xì)胞因子α多肽組合物的送遞位點(diǎn)，施用方法，施用的時間進(jìn)程，以及醫(yī)生所知道的其它因素。為了本文所說的目的的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的″有效量″由這些考慮所確定。
作為一個一般的規(guī)則，腸胃外每劑施用的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的藥學(xué)有效量按患者體重在約1μg/kg/天到10μg/kg/天，雖然如上所述，這將經(jīng)由治療判斷。更優(yōu)選地，這一劑量是至少0.01μg/kg/天，對人類患者最優(yōu)選地是在約0.01和1μg/kg/天之間的激素。如果繼續(xù)給藥，則典型地是以約1μg/kg/小時到約50μg/kg/小時的劑量速率施用嗜中性白細(xì)胞因子α多肽，以每天1-4次注射或連續(xù)皮下灌輸，例如，利用小型-泵。靜脈內(nèi)袋溶液也可以使用。觀察改變所需的治療長度和治療后出現(xiàn)反應(yīng)的間隔似乎隨所需的作用而變化。
包含本發(fā)明的嗜中性白細(xì)胞因子α的藥物組合物可以經(jīng)口頭，直腸，腸胃外，腦池內(nèi)，陰道內(nèi)，腹膜內(nèi)，局部(典型地以粉末，軟膏，液滴或眼膜片)，口腔服用，或用作口頭或鼻噴射劑?！逅帉W(xué)上可接受的載體″意指非毒固體，半固體或液態(tài)充填劑，稀釋劑，裝入膠囊的材料或任何類型的輔助制劑。如本文所使用的術(shù)語″腸胃外″涉及到的施用方式包括靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，胸骨內(nèi)，皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。
嗜中性白細(xì)胞因子α多肽是適于經(jīng)緩釋系統(tǒng)施用。緩釋組合物合適的例子包括以有形顆粒形式的半滲透聚合物基質(zhì)，例如，膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)包括聚交酯(美國專利.3,773,919，EP 58,481)，L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯的異分子聚合物(Sidman，U.等，生物聚合物22547-556(1983))，聚(2-羥乙基異丁烯酸酯)(R.Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15167-277(1981)，和R.Langer，化學(xué)工程1298-105(1982))，乙酸乙烯基酯(R.Langer等，同上)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。緩釋嗜中性白細(xì)胞因子α多肽組合物也包括脂質(zhì)截留的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽。包含嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的脂質(zhì)體由以前已知的方法制備DE 3,218,121；Epstein等，美國國家科學(xué)院院報(bào)823688-3692(1985)；Hwang等，美國國家科學(xué)院院報(bào)7740304034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP142,641；日本專利申請83-118008；美國專利.4,485,045和4,544,545；和EP 102,324。通常，脂質(zhì)體是小(約200-800埃)層狀型的，其中脂質(zhì)含量大于約30mol百分膽固醇，為了最佳化嗜中性白細(xì)胞因子α多肽治療，調(diào)整所選擇的比例。
在一個實(shí)施方案中，對于腸胃外施用，嗜中性白細(xì)胞因子α多肽一般通過將其(以所需程度的純度，單位劑量可注射形式(溶液、懸液或乳液))與藥學(xué)上的可接受的載體混合配制，所說的載體在所使用的劑量和濃度下對接受者無毒，并且與制劑的其它組分相容。例如，制劑優(yōu)選地不包括氧化劑和其它對多肽有害的其它化合物。
一般地，通過把嗜中性白細(xì)胞因子α多肽均勻一致地和緊密地與液態(tài)載體或細(xì)分的固相載體或者兩者混合來制備所說的制劑。然后，如果必要，將產(chǎn)物制成所需的制劑形式。優(yōu)選地，載體是腸胃外載體，更優(yōu)選地是受體血液等滲的溶液。這樣的載體的例子包括水，鹽水，Ringer’溶液，以及葡萄糖溶液。非含水載體(如固定的油和油酸乙酯)以及脂質(zhì)體這里也有用。
載體適合含有小量的添加劑，如提高等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這樣的物種在所使用的劑量和濃度下對接受者無毒，并包括緩沖液，如磷酸，檸檬酸，琥珀酸，乙酸，以及其它有機(jī)酸或它們的鹽；抗氧劑，如抗壞血酸；低分子量(少于大約十個殘基)多肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；其它碳水化合物，包括纖維素或它的衍生物，葡萄糖，manose，或糊精；螯合劑，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；反離子，如鈉；和/或非離子表面活性劑，如聚山梨酸酯，泊咯沙姆，或PEG。
嗜中性白細(xì)胞因子α多肽典型地以約0.1mg/ml-100mg/ml的濃度，優(yōu)選地以1-10mg/ml的濃度，在約3-8的pH下配制到這樣的載體中。會被理解的是，某些前述賦形劑，載體，或穩(wěn)定劑的使用將導(dǎo)致嗜中性白細(xì)胞因子α多肽鹽的形成。
用于治療性施用的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽必須是無菌的。通過經(jīng)無菌濾膜(例如，0.2微米膜)過濾容易達(dá)到無菌。治療性嗜中性白細(xì)胞因子α多肽組合物一般地置入到有無菌存取端口的容器中，例如，靜脈內(nèi)液袋或具有皮下注射針可穿透的塞子的小瓶。
嗜中性白細(xì)胞因子α多肽通常以單劑或多劑容器貯存，例如，以水溶液或供再配制的凍干制劑密封的安瓿或藥瓶。作為凍干制劑的例子，10ml藥瓶裝入5ml無菌過濾的1％(W/V)含水嗜中性白細(xì)胞因子α多肽溶液，將形成的混合物凍干。通過利用注射用水再配制凍干嗜中性白細(xì)胞因子α多肽制備輸注溶液。
本發(fā)明也提供了包含一個或多個容器的藥物包或試劑盒，所說的容器中充填有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種組分。與這種容器相關(guān)的一些事項(xiàng)可以按照管理樣品和生物制品的制造，使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式注明，這樣的注解反映得到了人類用藥制造，使用或銷售管理機(jī)構(gòu)的許可。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它治療化合物結(jié)合。
激動劑和拮抗劑-測定和分子本發(fā)明也提供了篩選化合物，以鑒別增強(qiáng)或阻斷嗜中性白細(xì)胞因子α對細(xì)胞的作用(如其與嗜中性白細(xì)胞因子α結(jié)合分子(如受體分子)相互作用)的那些化合物的方法。激動劑是增加嗜中性白細(xì)胞因子α天然的生物功能或以類似于嗜中性白細(xì)胞因子α的方式起作用的化合物，而拮抗劑降低或消除這樣的功能。
本發(fā)明的這一實(shí)施方案的另一方面提供了用于鑒別受體蛋白質(zhì)或其它配體-結(jié)合蛋白(其特異性地結(jié)合嗜中性白細(xì)胞因子α多肽)的方法，例如，細(xì)胞區(qū)室(如膜或其制劑)可以從表達(dá)結(jié)合嗜中性白細(xì)胞因子α的分子的細(xì)胞制備。將該制劑與標(biāo)記的嗜中性白細(xì)胞因子α一起溫育，分離嗜中性白細(xì)胞因子α結(jié)合受體或其它結(jié)合蛋白的復(fù)合物，并且根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法確定特征。此外，嗜中性白細(xì)胞因子α多肽可以結(jié)合到固相支持體上，以便來自細(xì)胞的可溶的結(jié)合分子結(jié)合到柱上，然后按照常規(guī)方法洗脫和確定特征。
在本發(fā)明的激動劑或拮抗劑測定中，細(xì)胞區(qū)室(如膜或其制劑)可以從表達(dá)結(jié)合嗜中性白細(xì)胞因子α的分子的細(xì)胞制備，所說的分子例如由嗜中性白細(xì)胞因子α調(diào)節(jié)的信號途徑或調(diào)節(jié)途徑的分子。在有或沒有可能是嗜中性白細(xì)胞因子α子激動劑或拮抗劑的候選分子存在下，將該制劑與標(biāo)記的嗜中性白細(xì)胞因子α一起溫育。候選分子結(jié)合到結(jié)合分子上的能力由降低標(biāo)記配體的結(jié)合反映。無理由結(jié)合，即，沒有誘導(dǎo)嗜中性白細(xì)胞因子α對結(jié)合嗜中性白細(xì)胞因子α結(jié)合分子的作用的分子很可能是好的拮抗劑。結(jié)合良好并且引發(fā)類似于嗜中性白細(xì)胞因子α或與嗜中性白細(xì)胞因子α密切相關(guān)的作用的分子是激動劑。
潛在的激動劑和拮抗劑的類嗜中性白細(xì)胞因子α作用可以通過例如以下方法測定在候選分子與細(xì)胞或適當(dāng)?shù)募?xì)胞制劑相互作用后，測定第二信使系統(tǒng)的活性，將該作用與嗜中性白細(xì)胞因子α或引發(fā)與嗜中性白細(xì)胞因子α相同的作用的分子的比較。在這一點(diǎn)上可能有用的第二信使系統(tǒng)，包括AMP鳥苷酸環(huán)化酶，離子通道或磷酸肌醇水解第二信使系統(tǒng)。
另一個嗜中性白細(xì)胞因子α拮抗劑的測定的例子是競爭性測定，該測定是在競爭性抑制測定的合適的條件下，將嗜中性白細(xì)胞因子α和潛在的拮抗劑與膜-結(jié)合受體分子或重組嗜中性白細(xì)胞因子α受體分子組合在一起。嗜中性白細(xì)胞因子α可以是標(biāo)記的(例如經(jīng)放射性標(biāo)記的)，以便結(jié)合到受體分子上的嗜中性白細(xì)胞因子α分子的數(shù)量可以精確地被測量，估價潛在的拮抗劑的有效性。
潛在的拮抗劑包括結(jié)合到本發(fā)明的多肽上并由此抑制或消除其活性的有機(jī)小分子，肽，多肽以及抗體。潛在的拮抗劑也可以小的有機(jī)分子，肽，多肽，如密切相關(guān)的蛋白質(zhì)或抗體，其在結(jié)合分子(如受體分子)上結(jié)合相同的位點(diǎn)，不誘導(dǎo)嗜中性白細(xì)胞因子α所誘導(dǎo)的活性，由此，通過將嗜中性白細(xì)胞因子α排除在結(jié)合之外，抑制嗜中性白細(xì)胞因子α的作用。
其它潛在的拮抗劑包括反義分子。通過反義DNA或RNA或三-螺旋形成，反義技術(shù)可以用來控制基因表達(dá)，反義技術(shù)在例如Okano，神經(jīng)化學(xué)雜志.56560(1991)；″寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的抑制劑，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L(1988)中討論過。三-螺旋形成在例如Lee等，核酸研究63073(1979)；Gooney等，科學(xué)241456(1988)；和Dervan等，科學(xué)2511360(1991)中討論過。該方法基于將多核苷酸結(jié)合到互補(bǔ)DNA或RNA上。例如，編碼本發(fā)明的多肽的胞外結(jié)構(gòu)域的RNA的多核苷酸的5’編碼部分可以用來從長約10-40堿基對的寡核苷酸設(shè)計(jì)反義RNA。DNA寡核苷酸設(shè)計(jì)得互補(bǔ)于轉(zhuǎn)錄中涉及的基因的區(qū)，以便阻止轉(zhuǎn)錄和嗜中性白細(xì)胞因子α的產(chǎn)生。反義RNA寡核苷酸體內(nèi)雜交到mRNA上，并且抑制mRNA分子翻譯成嗜中性白細(xì)胞因子α多肽。以上所描述的寡核苷酸也可以被傳遞到細(xì)胞中，以使反義RNA或DNA體內(nèi)表達(dá)，抑制嗜中性白細(xì)胞因子α的產(chǎn)生。
激動劑與拮抗劑可以與藥學(xué)上可接受的載體一起用于組合物，例如，如前所述。
在某些自動-免疫和慢性炎癥和傳染性疾病中，拮抗劑可以用來例如抑制嗜中性白細(xì)胞因子α，巨噬細(xì)胞和它們的前體的趨化與活化，以及中性白細(xì)胞，嗜堿細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞和一些T-細(xì)胞子集，如活化的和CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞和天然的殺傷細(xì)胞的趨化與活化。自動-免疫疾病的例子包括多發(fā)性硬化癥，以及胰島素-依賴性糖尿病。拮抗劑也可以用來通過阻止嗜曙紅細(xì)胞和單核噬菌細(xì)胞活化，治療包括矽肺，肉樣瘤病，自發(fā)性肺纖維化在內(nèi)的傳染病。它們也可以用來通過抑制嗜曙紅細(xì)胞的產(chǎn)生和遷移治療自發(fā)性過嗜曙紅綜合征。內(nèi)毒素休克也可以由拮抗劑通過抑制巨噬細(xì)胞的遷移以及它們產(chǎn)生本發(fā)明的人趨化因子多肽來治療。拮抗劑也可以用來治療粥樣硬化，其通過在動脈壁中抑制單核細(xì)胞滲入。拮抗劑也可以用來通過趨化因子-誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫粒和釋放組胺，治療組胺-調(diào)節(jié)的過敏反應(yīng)和免疫學(xué)疾病(包括晚期過敏反應(yīng))，慢性蕁麻疹，以及特應(yīng)性皮炎。IgE-調(diào)節(jié)的過敏反應(yīng)，如變應(yīng)性氣喘，鼻炎，和濕疹也可以被治療。拮抗劑也可以用來通過抑制吸引單核細(xì)胞到創(chuàng)傷區(qū)域治療慢性和急性炎癥。它們也可以用來調(diào)節(jié)正常的肺部巨噬細(xì)胞群，這是因?yàn)槁院图毙匝装Y性肺部疾病與肺臟中隔離單核噬菌細(xì)胞相聯(lián)系。拮抗劑也可以用來通過抑制吸引單核細(xì)胞進(jìn)入患者關(guān)節(jié)中的滑液治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。單核細(xì)胞流入和活化在變性和炎癥性關(guān)節(jié)病的病理中起著重要的作用。拮抗劑可以用來干擾主要?dú)w因于IL-1和TNF的有害級聯(lián)，其抑制其它炎癥性細(xì)胞因子的生物合成。按這一方法，拮抗劑可以用來抑制炎癥。拮抗劑也可以用來抑制由化學(xué)促進(jìn)因子(chemokines)誘導(dǎo)的前列腺素-不依賴性發(fā)熱。拮抗劑也可以用來治療骨髓衰竭的病例，例如，再生障礙性貧血和脊髓發(fā)育不良綜合征。拮抗劑也可以用來通過在肺臟中抑制嗜伊紅性粒細(xì)胞積累治療氣喘和變態(tài)反應(yīng)。拮抗劑也可以用來治療上皮下基底膜纖維化，它是患哮喘癥的肺臟的一個顯著特征。
針對嗜中性白細(xì)胞因子α的抗體可以用來結(jié)合和抑制嗜中性白細(xì)胞因子α活性來治療ARDS，其是通過在損傷后抑制中性白細(xì)胞侵入肺臟。拮抗劑可以與藥學(xué)上可接受的載體一起用于組合物中，如下文所描述的。
染色體測定本發(fā)明的核酸分子對染色體鑒定也有價值。特異性地導(dǎo)向序列，其可以與個體人類染色體上的特定位置雜交。此外，目前需要鑒別在染色體上特定的位點(diǎn)。極少基于實(shí)際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)識試劑目前可用來標(biāo)識染色體位置。在關(guān)聯(lián)那些序列與和疾病相關(guān)的基因上，根據(jù)本發(fā)明的DNA對染色體作圖是重要的第一步。
在這一點(diǎn)上的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本文公開的cDNA用于克隆嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)基因的基因組DNA。這可以利用各種已知的技術(shù)和文庫完成，所說的文庫一般是市售的。然后，采用已知的方法，為此目的將基因組DNA用于原位染色體作圖。
此外，在某些情況下，通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選地15-25bp)，序列可以對染色體作圖。計(jì)算機(jī)分析基因的3’非翻譯區(qū)用來迅速選擇引物，其在基因組DNA中不跨越一個以上的外顯子，這樣使擴(kuò)增過程變得復(fù)雜。然后這些引物用于PCR篩選包含個體人類染色體的體細(xì)胞雜種。在一個步驟中，cDNA克隆對中期染色體帶的熒光原位雜交(“FISH”)可以用于提供精確的染色體位置。這一技術(shù)可以與短至50或60bp的來自cDNA的探針一起使用。這一技術(shù)的綜述參見Verma等，人類染色體基本技術(shù)手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列被精確地作圖到染色體位置，在染色體上的序列的物理位置就可以與遺傳圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這樣的數(shù)據(jù)可以在V.McKusick，人的孟德爾法則遺傳(可通過Johns Hopkins大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)圖書館聯(lián)機(jī)獲得)中找到。然后，基因和已作圖到相同染色體區(qū)的疾病之間的相互關(guān)系通過連鎖分析(物理鄰近基因的共遺傳)鑒別。
其次，有必要確定受影響的和不受影響的個體之間的cDNA或基因組序列上的區(qū)別。如果一種突變在一些或所有的受影響的個體中觀察到，但不在任何正常個體中觀察到，則所說的突變很可能是疾病病因。
已經(jīng)一般性地描述了本發(fā)明，參照下列實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，下列實(shí)施例為列舉的目的而提供，無意于用來限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1a“His-標(biāo)記的”嗜中性白細(xì)胞因子α在大腸桿菌中的表達(dá)和純化細(xì)菌表達(dá)載體pQE9(pD10)在這一實(shí)施例中用于細(xì)菌表達(dá)(QIAGEN公司，同上)。pQE9編碼氨芐青霉素抗生素抗性(“Ampr”)，并含有細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)(“ori”)，IPTG誘導(dǎo)型啟動子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)(“RBS”)，編碼組氨酸殘基的六個密碼子(其使得可以進(jìn)行采用鎳-次氨基-三-乙酸(“鎳-NTA”)親和性樹脂(QIAGEN公司出售，同上)的親和性純化)和合適的單一限制酶切割位點(diǎn)。這些元件排列得使編碼多肽的插入的DNA片段得以表達(dá)，該多肽具有共價連接于其氨基末端上的6個組氨酸殘基(即“6×His標(biāo)記”)。
利用PCR寡核苷酸引物從保藏的cDNA克隆擴(kuò)增編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)所需部分(包含胞外結(jié)構(gòu)域序列)的DNA序列，所說的引物退火到嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)所需部分的氨基末端序列上和退火到保藏的構(gòu)建體cDNA編碼序列3’序列上。含有在pQE9載體中有利于克隆的限制酶切位點(diǎn)的附加核苷酸分別添加至5’和3‘引物序列上。
對于克隆蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域，5’引物具有序列5’GTGGGATCCAGCCTCCGGGCAGAGCTG 3’(SEQ ID NO10)，其包含下劃線的BamHI限制位點(diǎn)，其后為圖1中嗜中性白細(xì)胞因子α序列的胞外結(jié)構(gòu)域的氨基端編碼序列的18個核苷酸。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員清楚，在蛋白質(zhì)編碼序列中，5’引物的起始點(diǎn)可以變化，以擴(kuò)增比所述形式的胞外結(jié)構(gòu)域更短或更長的編碼任何完整的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的所需部分的DNA節(jié)段。引物3’具有序列5’GTGAAGCTTTTATTACAGCAGTTTCAATGCACC 3’(SEQ ID NO11)，其包含下劃線的HindIII限制酶切位點(diǎn)，其后為兩個終止密碼子和互補(bǔ)于圖1中嗜中性白細(xì)胞因子α DNA序列的編碼序列3’末端的18個核苷酸。
用BamHI和HindIII消化所擴(kuò)增的嗜中性白細(xì)胞因子αDNA片段和載體pQE9，然后將所消化的DNA連接起來。嗜中性白細(xì)胞因子αDNA向限制性消化的pQE9載體的插入使得嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)編碼區(qū)置于IPTG-誘導(dǎo)型啟動子的下游和在具有起始AUG和6個組氨酸密碼子的讀框中。
采用標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌，所說的方法例如在Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY(1989)中所描述的。大腸桿菌菌株M15/rep4包含質(zhì)粒pREP4的多拷貝(其表達(dá)lac阻抑物，并且賦予卡那霉素抗性(“Kan”)，其被用于實(shí)施本文描述的說明性的實(shí)施例。這一菌株僅僅是許多適于表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的許多菌株中的一株，可以從QIAGEN公司(同上)獲得。通過它們在氨芐青霉素和卡那霉素存在下在LB平板上的生長能力鑒別轉(zhuǎn)化體。從抗性菌落分離質(zhì)粒DNA，由限制酶切分析，PCR和DNA測序確認(rèn)克隆的DNA的等同性。包含所需構(gòu)建體的克隆在液態(tài)培養(yǎng)中在LB培養(yǎng)基上生長過夜(″O/N″)，所說的培養(yǎng)基補(bǔ)充有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)。O/N培養(yǎng)用來接種大量培養(yǎng)物，以大約1∶25至1∶250稀釋度。使細(xì)胞生長至在600nm(“OD600”)的0.4和0.6之間的光密度。然后添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(“IPTG”)至1mM的終濃度，以通過滅活lacI阻抑物從lac阻抑物敏感啟動子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。隨后進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時。然后通過離心收獲細(xì)胞。
然后在6M鹽酸胍(pH8)中于4℃攪拌細(xì)胞3-4小時。細(xì)胞碎片由離心除去，將包含嗜中性白細(xì)胞因子α的上清液裝載到鎳-次氨基-三-乙酸(“鎳-NTA”)(由QIAGEN公司，同上提供)親和性樹脂柱上。具有6XHis標(biāo)記的蛋白質(zhì)以高的親和性結(jié)合到鎳-NTA樹脂上，并且可以用最簡單的一步純化法純化(詳細(xì)內(nèi)容參見QIAexpressionist，1995，QIAGEN公司，同上)。簡言之，上清液用6M鹽酸胍(pH8)裝載到柱上，首先以10倍體積的6M鹽酸胍(pH6)洗滌，最后用6M鹽酸胍(pH5)洗脫嗜中性白細(xì)胞因子α。
然后通過對磷酸-緩沖鹽水(PBS)或50mM乙酸鈉(pH6)緩沖液加200mM NaCl透析使純化的蛋白質(zhì)復(fù)性。此外，當(dāng)固定化在鎳-NTA柱上時，蛋白質(zhì)可以成功地折疊。所推薦的條件如下采用線性6M-1M脲梯度(在500mM NaCl，20％甘油，20mM Tris/HCl pH7.4，含有蛋白酶抑制劑)復(fù)性。復(fù)性應(yīng)該進(jìn)行1.5小時或更長。在復(fù)性之后，蛋白質(zhì)可以通過加入250mM immidazole洗脫。Immidazole通過最后對加200mM NaCl的PBS或50mM乙酸鈉(pH6)緩沖液的透析步驟除去。純化蛋白質(zhì)在4℃下貯存或凍結(jié)在-80℃下。
實(shí)施例1b嗜中性白細(xì)胞因子α在大腸桿菌中的表達(dá)和純化細(xì)菌表達(dá)載體pQE60在這一實(shí)施例中用于細(xì)菌表達(dá)(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE60編碼氨芐青霉素抗生素抗性(“Ampr”)，并含有細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)(“ori”)，IPTG誘導(dǎo)型啟動子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)(“RBS”)，編碼組氨酸殘基的六個密碼子(其使得可以進(jìn)行采用鎳-次氨基-三-乙酸(“鎳-NTA”)親和性樹脂(QIAGEN公司出售，同上)的親和性純化)和合適的單一限制酶切割位點(diǎn)。這些元件排列得使編碼多肽的DNA片段可以以這樣的方式插入，即產(chǎn)生具有共價連接于其羧基末端上的6個組氨酸殘基(即“6×His標(biāo)記”)的多肽。然而，在這一實(shí)施例中，多肽編碼序列的插入方式是使得六個組氨酸密碼子的翻譯受到抑制，因此，產(chǎn)生的多肽不具有6×His標(biāo)記。
利用PCR寡核苷酸引物從保藏的cDNA克隆擴(kuò)增編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)所需部分(包含胞外結(jié)構(gòu)域序列)的DNA序列，所說的引物退火到嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)所需部分的氨基末端序列上和退火到保藏的構(gòu)建體cDNA編碼序列3’序列上。含有在pQE60載體中有利于克隆的限制酶切位點(diǎn)的附加核苷酸分別添加至5’和3‘引物序列上。
對于克隆蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域，5’引物具有序列5’GTGTCATGAGCCTCCGGGCAGAGCTG 3’(SEQ ID NO12)，其包含下劃線的BspH限制位點(diǎn)，其后為圖1中嗜中性白細(xì)胞因子α序列的胞外結(jié)構(gòu)域的氨基端編碼序列的17個核苷酸。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員清楚，在蛋白質(zhì)編碼序列中，5’引物的起始點(diǎn)可以變化，以擴(kuò)增比所述形式的胞外結(jié)構(gòu)域更短或更長的完整蛋白質(zhì)的所需部分。
引物3’具有序列5’GTGAAGCTTTTATTACAGCAGTTTCAATGCACC 3’(SEQ ID NO13)，其包含下劃線的HindIII限制酶切位點(diǎn)，其后為兩個終止密碼子和互補(bǔ)于圖1中嗜中性白細(xì)胞因子αDNA序列的編碼序列3’末端的18個核苷酸。
用BspHI和HindIII消化所擴(kuò)增的嗜中性白細(xì)胞因子αDNA片段和載體pQE60，然后將所消化的DNA連接起來。嗜中性白細(xì)胞因子αDNA向限制性消化的pQE60載體的插入使得包含其相關(guān)終止密碼子的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)編碼區(qū)置于IPTG-誘導(dǎo)型啟動子的下游和在具有起始AUG的讀框中。
采用標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌，所說的方法例如在Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY(1989)中所描述的。大腸桿菌菌株M15/rep4包含質(zhì)粒pREP4的多拷貝(其表達(dá)lac阻抑物，并且賦予卡那霉素抗性(“Kan”)，其被用于實(shí)施本文描述的說明性的實(shí)施例。這一菌株僅僅是許多適于表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的許多菌株中的一株，可以從QIAGEN公司(同上)獲得。通過它們在氨芐青霉素和卡那霉素存在下在LB平板上的生長能力鑒別轉(zhuǎn)化體。從抗性菌落分離質(zhì)粒DNA，由限制酶切分析，PCR和DNA測序確認(rèn)克隆的DNA的等同性。
包含所需構(gòu)建體的克隆在液態(tài)培養(yǎng)中在LB培養(yǎng)基上生長過夜(″O/N″)，所說的培養(yǎng)基補(bǔ)充有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)。O/N培養(yǎng)用來接種大量培養(yǎng)物，以大約1∶25至1∶250稀釋度。使細(xì)胞生長至在600nm(“OD600”)的0.4和0.6之間的光密度。然后添加異丙基-b-D-硫代吡喃半乳糖苷(“IPTG”)至1mM的終濃度，以通過滅活lacI阻抑物從lac阻抑物敏感啟動子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。隨后進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時。然后通過離心收獲細(xì)胞。
然后在6M鹽酸胍(pH8)中于4℃攪拌細(xì)胞3-4小時。細(xì)胞碎片由離心除去，將包含嗜中性白細(xì)胞因子α的上清液對50mM乙酸鈉(pH6)緩沖液(補(bǔ)充有200mM NaCl透析)。此外，通過對含有蛋白酶抑制劑的500mM NaCl，20％甘油，25mM Tris/HCl(pH7.4)透析，蛋白質(zhì)可以成功地折疊。在復(fù)性之后，蛋白質(zhì)可以通過離子交換、疏水性相互作用和篩析色譜純化。此外，親和性色譜步驟(例如抗體柱)也可以用于獲得純化的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)。純化蛋白質(zhì)在4℃下貯存或凍結(jié)在-80℃下。
實(shí)施例2嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的克隆和表達(dá)在這一說明性的實(shí)施例中，質(zhì)粒穿梭載體pA2 GP用于利用桿狀病毒和如Summers等，桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)方法手冊，得克薩斯農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站公報(bào)1555號(1987)中所描述的標(biāo)準(zhǔn)方法，將克隆的DNA(其編碼蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域，缺乏其天然胞內(nèi)和跨膜序列)插入到桿狀病毒中，以表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α的胞外結(jié)構(gòu)域。這一表達(dá)載體含有Autographa californica核型多角體病毒(AcMNPV)的強(qiáng)多角體蛋白啟動子，其后為桿狀病毒gp67蛋白質(zhì)的分泌信號肽(前導(dǎo)序列)與方便的限制酶切位點(diǎn)，如BamHI，XbaI以及Asp718。猴病毒(“SV40”)的聚腺苷酸化位點(diǎn)用于有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組病毒，質(zhì)粒含有大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因，其在相同取向的弱果蠅屬啟動子控制下，其后為多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。所插入的基因的兩測是細(xì)胞-介導(dǎo)的與野生型病毒DNA同源重組(產(chǎn)生表達(dá)克隆的多核苷酸的可以生存的病毒)的病毒序列。
許多其它桿狀病毒載體可以用來替代以上載體，如pAc373，pVL941和pAcIM1，如本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解的，只要構(gòu)建體提供轉(zhuǎn)錄，翻譯，分泌等的適當(dāng)?shù)亩ㄎ恍盘?，如果需要，包括信號肽和讀框中的AUG。這樣的載體在例如Ldckow等，病毒學(xué)17031-39(1989)中有描述。
在保藏的克隆中編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA序列，缺乏AUG起始密碼子和圖1所顯示的天然相關(guān)的胞內(nèi)和跨膜結(jié)構(gòu)域序列(SEQ ID NO2)，利用相應(yīng)于基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增。5’引物具有序列5’GTGGGATCCCCGGGCAGAGCTGCAGGGC 3’(SEQ ID NO14)，其包含下劃線的BamHI限制酶位點(diǎn)，其后為圖1所示的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域序列的18個核苷酸，起始于所示的蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域的N-端。引物3’具有序列5’GTGGGATCCTTATTACAGCAGTTTCAATGCACC 3’(SEQ ID NO15)，其包含下劃線的BamHI限制酶切位點(diǎn)，其后為兩個終止密碼子和互補(bǔ)于圖1中3’編碼序列的18個核苷酸。
所擴(kuò)增的片段利用市售的試劑盒(″Geneclean，″BIO 101 Inc.，LaJolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離。然后用BamHI消化片段，并且再一次在1％瓊脂糖凝膠上純化。這一片段在本文中命名為F1。
質(zhì)粒以限制酶BamHI消化，可以也可以不用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法以牛腸磷酸酶脫磷酸化。然后市售的試劑盒(″Geneclean，″BIO101 Inc.，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離DNA。這一載體DNA在本文中命名為″V1”。
用T4 DNA連接酶將片段F1和脫磷酸化的質(zhì)粒V1連接起來。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101或其它合適的大腸桿菌宿主，例如XL-1 Blue(Statagene克隆系統(tǒng)，La Jolla，CA)細(xì)胞，并且在培養(yǎng)平板上增殖。通過用BamHI從單個菌落消化DNA，然后用凝膠電泳分析消化產(chǎn)物來鑒別含有人嗜中性白細(xì)胞因子α基因的質(zhì)粒的細(xì)菌?？寺〉钠蔚男蛄型ㄟ^DNA測序確認(rèn)。這一質(zhì)粒在本文中命名為pA2GP嗜中性白細(xì)胞因子α。
采用由Felgner等，美國國家科學(xué)院院報(bào)847413-7417(1987)所描述的脂轉(zhuǎn)染法用1.0μg市售的線性化桿狀病毒DNA(″BacuioGoldTM桿狀病毒DNA″，Pharmingen，San Diego，CA)共轉(zhuǎn)染5μg質(zhì)粒pA2GP嗜中性白細(xì)胞因子α。將1微克BacuioGoldTM病毒DNA和5微克質(zhì)粒pA2GP嗜中性白細(xì)胞因子α在含50微升無血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的微量滴定板的孔中混合。此后，加入10微升脂(質(zhì))轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectin)和90微升Grace’s培養(yǎng)基，混合并在室溫下溫育15分鐘。然后，將2滴轉(zhuǎn)染混合物加入到Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL 1711)上，該昆蟲細(xì)胞接種在35mM組織培養(yǎng)平板中，其中具有1ml無血清的Grace’s培養(yǎng)基。然后于27℃培養(yǎng)平板5小時。然后從平板除去轉(zhuǎn)染溶液，并添加1毫升補(bǔ)充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基。然后在27℃繼續(xù)培養(yǎng)四天。
四天之后收集上清液，如Summers和Smith，同上的描述進(jìn)行噬斑測定。具有″Blue Gal″(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)的瓊脂糖凝膠用于使產(chǎn)生藍(lán)色嗜斑的gal-表達(dá)克隆易于鑒別和分離(這一類型的“嗜斑測定”的詳細(xì)描述也可以在Life Technologies Inc.，Gaithersburg提供的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒生物學(xué)用戶指南中找到，p9-10)。在合適的培養(yǎng)期后，藍(lán)色的嗜斑用微量移液管(例如，Eppendorf)的尖端挑取。然后將包含重組病毒的瓊脂懸浮在包含200微升Grace’s培養(yǎng)基的微量離心機(jī)管中，包含重組桿狀病毒的懸液用于感染在35mM皿中接種的Sf9細(xì)胞。四天后收集這些培養(yǎng)皿的上清液，然后在4℃下貯存它們。該重組病毒被稱為V-嗜中性白細(xì)胞因子α。
為了證實(shí)嗜中性白細(xì)胞因子α基因的表達(dá)，將Sf9細(xì)胞在補(bǔ)充有10％熱滅活的FBS的Grace’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以約2的感染多重性(″MOI″)用重組桿狀病毒V-嗜中性白細(xì)胞因子α感染細(xì)胞。如果需要放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)，6小時后，除去培養(yǎng)基，并以SF900 II培養(yǎng)基(減甲硫氨酸和半胱氨酸)(由Technologies Inc.，Rockville，MD提供)代替。在42小時之后，加入5μCi35S-甲硫氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(由Amersham提供)。將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)16小時，然后由離心收獲。上清液中的蛋白質(zhì)以及胞內(nèi)蛋白質(zhì)由SDS-PAGE分析，其后由放射自顯影(如果放射性標(biāo)記)分析。
純化的蛋白質(zhì)的氨基末端的氨基酸序列的微測序可以用來測定蛋白質(zhì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基端序列，由此測定分泌信號肽的切割位點(diǎn)與長度。
實(shí)施例3嗜中性白細(xì)胞因子α在哺乳動物細(xì)胞中的克隆和表達(dá)典型的哺乳動物表達(dá)載體含有啟動子元件，其調(diào)節(jié)mRNA，蛋白質(zhì)編碼序列，以及(轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物聚腺苷酸化所需的)一些信號的轉(zhuǎn)錄起始。附加元件包括增強(qiáng)子，Kozak序列和插入序列(側(cè)翼于RNA剪接的供體和受體位點(diǎn))。借助SV40早和晚期啟動子，逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)序列(LTRs)(例如，RSV，HTLVI，HIVI)以及巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動子可以達(dá)到高效轉(zhuǎn)錄。然而，也可以使用細(xì)胞元件(例如，人肌動蛋白啟動子)。用于本發(fā)明的實(shí)踐的合適的表達(dá)載體包括，例如，載體如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，瑞典)，pRSVcat(ATCC 37152)，pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)。可以被利用的哺乳動物宿主細(xì)胞包括人Hela，293，H9和Jurkat細(xì)胞，小鼠NIH3T3和C127細(xì)胞，Cosl，Cos7和CV1，quailQC1-3細(xì)胞，小鼠L細(xì)胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
此外，可以在穩(wěn)定的細(xì)胞系中表達(dá)所說的基因，這些細(xì)胞系含有整合進(jìn)染色體的基因。用選擇性標(biāo)記(如dhfr，gpt，新霉素，潮霉素)的共轉(zhuǎn)染使得可以鑒定與分離轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
也可以擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的基因，以表達(dá)大量的編碼蛋白質(zhì)。DHFR(二氫葉酸還原酶)標(biāo)記對開發(fā)攜帶幾百或甚至幾千個目的基因的拷貝的細(xì)胞系是有用的。另一個有用的選擇標(biāo)記是酶谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，生物化學(xué)雜志227277-279(1991)；Bebbington等，生物技術(shù)10169-175)。利用這些標(biāo)記，將哺乳動物細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并選擇具有最高抗性的細(xì)胞。這些細(xì)胞系含有所擴(kuò)增的整合進(jìn)染色體的基因。中國倉鼠卵巢(CHO)和NSO細(xì)胞經(jīng)常用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
表達(dá)載體pC1與pC4含有Rous肉瘤病毒的強(qiáng)啟動子(LTR)(Cullen等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，438-447(1985年3月))加CMV-增強(qiáng)子片段(Boshart等，細(xì)胞41521-530(1985))。多克隆位點(diǎn)，例如，限制酶切割位點(diǎn)BamHI，XbaI和Asp718，有利于目的基因的克隆。此外，載體還含有3個內(nèi)含子，大鼠前胰島素原基因的聚腺苷酸化和終止信號。
實(shí)施例3(a)在COS細(xì)胞中的克隆和表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒pNeutrokineαHA由將編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域的保藏的cDNA的部分克隆進(jìn)表達(dá)載體pcDNAI/Amp或pcDNAIII(可以從Invitrogen公司獲得)制備的。為了產(chǎn)生多肽的可溶性分泌形式，將胞外結(jié)構(gòu)域融合進(jìn)人IL-6基因的分泌前導(dǎo)序列。
表達(dá)載體pcDNAI/amp含有(1)對增殖大腸桿菌和其它原核細(xì)胞有效的復(fù)制起點(diǎn)；(2)供選擇含質(zhì)粒的原核細(xì)胞的氨芐青霉素抗性基因；(3)用于在真核細(xì)胞中增殖的SV40復(fù)制起點(diǎn)；(4)CMV啟動子，多接頭，SV40內(nèi)含子；(5)編碼血凝素片段(即，有利于純化的″HA”標(biāo)記)，其后為終止密碼子和聚腺苷酸化信號，它們的排列方式使得cDNA可以方便地置于CMV啟動子的表達(dá)控制下，并且借助于多接頭中的限制酶切位點(diǎn)可操作地連接到SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號上。HA標(biāo)記相應(yīng)于由Wilson等，細(xì)胞37767(1984)描述的流感血凝素蛋白質(zhì)來源的表位。HA標(biāo)記與靶蛋白質(zhì)的融合使得可以用識別HA表位的抗體容易地檢測和回收重組蛋白質(zhì)。此外，pcDNAIII含有可選擇的新霉素標(biāo)記。
將編碼嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段克隆進(jìn)載體的多接頭區(qū)，以便重組蛋白質(zhì)的表達(dá)由CMV啟動子指導(dǎo)。質(zhì)粒構(gòu)建策略如下。采用含有方便的限制酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增保藏的克隆的嗜中性白細(xì)胞因子αcDNA，非常類似以上有關(guān)構(gòu)建供大腸桿菌中表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α的載體的描述。用于這一實(shí)施例的合適的引物包括下列，5’引物，包含下劃線的BamHI位點(diǎn)，Kozak序列，AUG起始密碼子，編碼人IL-6基因分泌前導(dǎo)肽的序列，嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)胞外結(jié)構(gòu)域的5’編碼區(qū)，具有下列序列5’GCGGGATCCGCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTG CCTTCCCTGCCCCAGTTGTGAGACAAGGGGACCTGGCCAG3’(SEQ ID NO16)。3’引物，包含下劃線的BamHI限制酶切位點(diǎn)和就在終止密碼子之前的互補(bǔ)于3’編碼序列的18個核苷酸，具有有下列序列5’GTGGGATCCTTACAGCAGTTTCAATGCACC 3’(SEQ ID NO17)。
以Bam HI消化PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp，然后連接。將連接混合物整合進(jìn)大腸桿菌菌株SURE(可以從StratageneCloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037獲得)，將轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物平板接種到氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上，然后培養(yǎng)該平板使氨芐青霉素抗性菌落生長。從抗性菌落分離質(zhì)粒DNA，并且經(jīng)限制性分析和其它方法檢測編碼嗜中性白細(xì)胞因子α胞外結(jié)構(gòu)域的片段的存在。
為了表達(dá)重組嗜中性白細(xì)胞因子α，采用例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY(1989)中所描述的DEAE-DEXTRAN，以如上所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。在由載體表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
采用例如Harlow等，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1988)冷泉港，紐約中所描述的方法，經(jīng)放射性標(biāo)記和免疫沉淀法檢測嗜中性白細(xì)胞因子αHA融合蛋白的表達(dá)。到轉(zhuǎn)染之后的兩天結(jié)束，細(xì)胞由在包含35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時所標(biāo)記。收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞，用如以上引證的Wilson等所描述的含去污劑的RIPA緩沖液裂解150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOG，50mM TRIS，pH7.5。采用HA-特異性單克隆抗體從細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基沉淀蛋白質(zhì)。然后經(jīng)SDS-PAGE和放射自顯影術(shù)分析所沉淀的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞裂解物中可見預(yù)期大小的表達(dá)產(chǎn)物，在陰性對照中沒有見到。
實(shí)施例3(b)在CHO細(xì)胞中克隆和表達(dá)載體pC4用于表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)。質(zhì)粒pC4是質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC登記號37146)的衍生物。為了產(chǎn)生嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的可溶性分泌形式，將編碼胞外結(jié)構(gòu)域的保藏的cDNA的部分融合進(jìn)人IL-6基因的分泌前導(dǎo)序列。載體質(zhì)粒含有SV40早期啟動子控制之下的小鼠DHFR基因。中國倉鼠卵巢細(xì)胞或缺乏二氫葉酸活性的其它細(xì)胞(已經(jīng)用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)可以通過在選擇培養(yǎng)基(α減MEM，Life Technologies)上生長選擇，所說的培養(yǎng)基補(bǔ)充有化療劑氨甲蝶呤。在對氨甲蝶呤(MTX)有抗性細(xì)胞中的DHFR基因的擴(kuò)增已有文獻(xiàn)充分記載(參見，例如，Alt，F(xiàn).W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.，和Schimke，R.T.，1978，生物化學(xué)雜志2531357-1370，Hamlin，J.L.和Ma，C.1990，生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)，1097107-143，Page，M.J.和Sydenham，M.A.1991，生物技術(shù)964-68)。由于DHFR基因的擴(kuò)增，在增加濃度的MTX中培養(yǎng)的細(xì)胞通過過量產(chǎn)生靶酶DHFR產(chǎn)生了對藥物的抗性。如果第二基因連接到DHFR基因上，它通常被共擴(kuò)增和過份表達(dá)，本領(lǐng)域已知這一方法可以用來開發(fā)攜帶超過1000個擴(kuò)增基因拷貝的細(xì)胞系。其后，當(dāng)氨甲蝶呤撤走時，獲得含有整合到一個或多個宿主細(xì)胞的染色體中的擴(kuò)增基因的細(xì)胞系。
用于表達(dá)目的基因的質(zhì)粒pC4含有Rouse肉瘤病毒長末端重復(fù)序列(LTR)的強(qiáng)啟動子(Cullen等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，三月1985438-447)以及從人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因增強(qiáng)子分離的片段(Boshart等，細(xì)胞41521-530(1985))。啟動子的下游是下列使得基因可以整合的單一限制酶切割位點(diǎn)BamHI，XbaI，以及Asp718。在這些克隆位點(diǎn)后面，質(zhì)粒含有3’內(nèi)含子和大鼠前胰島素原基因的聚腺苷酸化位點(diǎn)。其它高效啟動子也可以用于表達(dá)，例如，人β-肌動蛋白啟動子，SV40早或晚期啟動子或其它逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)序列，例如，HIV和HTLVI。Clontech的Tet-Off以及Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)和類似的系統(tǒng)可以用來在哺乳動物中以調(diào)節(jié)的方式表達(dá)嗜中性白細(xì)胞因子α(Gossen，M.，& Bujard，H.1992，美國國家科學(xué)院院報(bào)895547-5551)。對于mRNA其它信號的聚腺苷酸化，例如，人生長激素或珠蛋白基因也可以利用。攜帶有整合到染色體的興趣基因的合適的細(xì)胞系也可以基于用選擇性標(biāo)記(如gpt，G418或潮霉素)共轉(zhuǎn)染來選擇。在起始時利用一個以上的選擇性標(biāo)記是有利的，例如，G418加氨甲蝶呤。
按本領(lǐng)域已知的方法，以限制酶BamHI限制性消化質(zhì)粒pC4，然后利用牛腸磷酸鹽脫磷酸化接著從1％瓊脂糖凝膠分離載體。
利用與基因5’和3’序列對應(yīng)的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增編碼嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)胞外結(jié)構(gòu)域的DNA序列。5’引物，包含下劃線的BamHI位點(diǎn)，Kozak序列，AUG起始密碼子，編碼人IL-6基因分泌前導(dǎo)肽的序列，嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)胞外結(jié)構(gòu)域的5’編碼區(qū)，具有下列序列5’GCGGGATCCGCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTG CCTTCCCTGCCCCAGTTGTGAGACAAGGGGACCTGGCCAG3’(SEQ ID NO16)。3’引物，包含下劃線的BamHI限制酶切位點(diǎn)和就在終止密碼子之前的互補(bǔ)于3’編碼序列的18個核苷酸，具有有下列序列5’GTGGGATCCTTACAGCAGTTTCAATGCACC 3’(SEQ ID NO17)。
以內(nèi)切核酸酶BamHI消化擴(kuò)增的片段，然后在1％瓊脂糖凝膠上再次純化。用T4 DNA連接酶連接分離的片段和脫磷酸化的載體。接著轉(zhuǎn)化大腸桿菌或XL-1 Blue細(xì)胞。采用例如，限制酶分析鑒別含有插入到質(zhì)粒pC4中的片段的細(xì)菌。
將缺乏活性DHFR基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑(Felgner等，同上)將5微克表達(dá)質(zhì)粒pC4與0.5微克質(zhì)粒pSVneo共轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒pSV2-neo含有顯性選擇標(biāo)記，Tn5的neo基因(其編碼賦予對抗生素基團(tuán)的抗性的酶，包括G418)。將細(xì)胞接種在補(bǔ)充有1mg/ml G418的α減MEM中。2天之后，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，并接種在雜交瘤克隆平板(Greiner，德國)上，該平板具有補(bǔ)充了10，25或50ng/ml metothrexate加1mg/ml G418的α減MEM。在約10-14天后，使單一克隆胰酶消化，然后利用不同濃度的氨甲蝶呤(50nM，100nM，200nM，400nM，800nM)將其接種在6孔培養(yǎng)皿或10毫升燒瓶中。然后，將最高濃度的氨甲蝶呤中生長的克隆轉(zhuǎn)移到新的含有更高濃度的氨甲蝶呤(1μM，2μM，5μM，10mM，20mM)的平板上。重復(fù)相同的方法，直到獲得在100-200μM濃度下生長的克隆。通過SDS-PAGE和Western印跡或通過反相HPLC分析分析所需基因產(chǎn)物的表達(dá)。
實(shí)施例4嗜中性白細(xì)胞因子αmRNA表達(dá)的組織分布采用例如ambrook等，以上引用的文獻(xiàn)中的描述進(jìn)行Northern印跡分析，以檢測嗜中性白細(xì)胞因子α基因在人組織中的表達(dá)。按照制造商的說明，采用rediprimeTMDNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham LifeScience)以32P標(biāo)記包含嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)的整個核苷酸序列(SEQ ID NO1)的cDNA的探針。標(biāo)記之后，按照制造商的PT1200-1號方案利用CHROMA SPIN-100TM柱(Clontech Laboratories，Inc.)純化探針。然后將純化的標(biāo)記的探針用來就嗜中性白細(xì)胞因子αmRNA檢查各種人類組織。
從Clontech獲得包含各種人類組織(H)或人免疫系統(tǒng)組織(IM)的多組織Northern(MTN)印跡，并且根據(jù)制造商的PT1190-1號方案，利用ExpressHybTM雜交溶液(Clontech)用標(biāo)記的探針檢查。雜交和洗滌后，安裝好印跡并且于-70℃下對膠片曝光一夜，按照標(biāo)準(zhǔn)方法使膠片顯影。
會清楚看到的是，本發(fā)明可以用與以上描述部分和實(shí)施例所描述的方式不同的方式實(shí)施。在以上說明的教導(dǎo)下，進(jìn)行本發(fā)明的許多修改和變化是可能的，由此這些變化和修改在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本文引證了所有出版物(包括專利、專利申請、期刊論文、實(shí)驗(yàn)室手冊、書籍或其它文件)的全部公開內(nèi)容，并且一并參考。
序列表(1)一般信息(i)申請人YU，GUO-LIANGEBNER，REINHARDNL，JLAN(ii)發(fā)明名稱嗜中性白細(xì)胞因子α(iii)序列數(shù)17(iv)通訊地址(A)收信人HUMAN GENOME SCIENCES.INC.
(B)街道9410 KEY WEST AVENUE(C)城市ROCKVILLE(D)州MD(E)國家美國(F)ZIP20850(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(vi)當(dāng)前的申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(viii)律師/代理人信息(A)姓名BENSON，ROBERT H(B)登記號30,446
(C)證書號PF343(ix)電訊信息(A)電話(301)309-8504(B)傳真(301)309-8512(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1100個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置147..1001(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞sig_肽(B)位置285..381(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat_肽(B)位置147..1001(xi)序列描述SEQ ID NO1AAATTCAGGA TAACTCTCCT GAGGGGTGAG CCAAGCCCTG CCATGTAGTG CACGCAGGAC 60ATCAACAAAC ACAGATAACA GGAAATGATC CATTCCCTGT GGTCACTTAT TCTAAAGGCC 120CCAACCTTCA AAGTTCAAGT AGTGAT ATG GAT GAC TCC ACA GAA AGG GAG CAG 173Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln1 5TCA CGC CTT ACT TCT TGC CTT AAG AAA AGA GAA GAA ATG AAA CTG AAG 221Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys10 15 20 25
GAG TGT GTT TCC ATC CTC CCA CGG AAG GAA AGC CCC TCT GTC CGA TCC269Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser30 35 40TCC AAA GAC GGA AAG CTG CTG GCT GCA ACC TTG CTG CTG GCA CTG CTG317Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu45 50 55TCT TGC TGC CTC ACG GTG GTG TCT TTC TAC CAG GTG GCC GCC CTG CAA365Ser Cys Cys Leu Thr Val Val Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln60 65 70GGG GAC CTG GCC AGC CTC CGG GCA GAG CTG CAG GGC CAC CAC GCG GAG413Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu75 80 85AAG CTG CCA GCA GGA GCA GGA GCC CCC AAG GCC GGC CTG GAG GAA GCT461Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala90 95 100 105CCA GCT GTC ACC GCG GGA CTG AAA ATC TTT GAA CCA CCA GCT CCA GGA509Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly110 115 120GAA GGC AAC TCC AGT CAG AAC AGC AGA AAT AAG CGT GCC GTT CAG GGT557Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly125 130 135CCA GAA GAA ACA GTC ACT CAA GAC TGC TTG CAA CTG ATT GCA GAC AGT605Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser140 145 150GAA ACA CCA ACT ATA CAA AAA GGA TCT TAC ACA TTT GTT CCA TGG CTT653Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu155 160 165CTC AGC TTT AAA AGG GGA AGT GCC CTA GAA GAA AAA GAG AAT AAA ATA701Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile170 175 180 185TTG GTC AAA GAA ACT GGT TAC TTT TTT ATA TAT GGT CAG GTT TTA TAT749Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr190 195 200ACT GAT AAG ACC TAC GCC ATG GGA CAT CTA ATT CAG AGG AAG AAG GTC797Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val205 210 215CAT GTC TTT GGG GAT GAA TTG AGT CTG GTG ACT TTG TTT CGA TGT ATT845His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile220 225 230CAA AAT ATG CCT GAA ACA CTA CCC AAT AAT TCC TGC TAT TCA GCT GGC893Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly235 240 245ATT GCA AAA CTG GAA GAA GGA GAT GAA CTC CAA CTT GCA ATA CCA AGA941Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg250 255 260 265
GAA AAT GCA CAA ATA TCA CTG GAT GGA GAT GTC ACA TTT TTT GGT GCA 989Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala270 275 280TTG AAA CTG CTG TGACCTACTT ACACCATGTC TGTAGCTATT TTCCTCCCTT 1041Leu Lys Leu Leu285TCTCTGTACC TCTAAGAAGA AAGAATCTAA CTGAAAATAC AAA AAAA 1100(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度285個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu1 5 10 15Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro20 25 30Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu35 40 45Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val50 55 60Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg65 70 75 80Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly85 90 95Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu100 105 110Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn115 120 125Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln130 135 140Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys145 150 155 160Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser165 170 175
Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr180 185 190Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met195 200 205Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu210 215 220Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu225 230 235 240Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly245 250 255Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu260 265 270Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu275 280 285(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度233個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala1 5 10 15Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe20 25 30Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe35 40 45Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Ser Pro50 55 60Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser65 70 75 80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro85 90 95Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu100 105 110Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser115 120 125Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly130 135 140Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala145 150 155 160Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro165 170 175Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu180 185 190Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu195 200 205Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly210 215 220Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu225 230(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度205個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4
Met Thr Pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg Val Cys Gly Thr Thr1 5 10 15Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala20 25 30Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala35 40 45Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala50 55 60Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg65 70 75 80Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn85 90 95Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln100 105 110Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Pro Ser Ser Pro115 120 125Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe130 135 140His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln145 150 155 160Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr165 170 175Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val180 185 190Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu195 200 205
(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度244個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Gly Ala Leu Gly Leu Glu Gly Arg Gly Gly Arg Leu Gln Gly Arg1 5 10 15Gly Ser Leu Leu Leu Ala Val Ala Gly Ala Thr Ser Leu Val Thr Leu20 25 30Leu Leu Ala Val Pro Ile Thr Val Leu Ala Val Leu Ala Leu Val Pro35 40 45Gln Asp Gln Gly Gly Leu Val Thr Glu Thr Ala Asp Pro Gly Ala Gln50 55 60Ala Gln Gln Gly Leu Gly Phe Gln Lys Leu Pro Glu Glu Glu Pro Glu65 70 75 80Thr Asp Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Ala Pro85 90 95Leu Lys Gly Gln Gly Leu Gly Trp Glu Thr Thr Lys Glu Gln Ala Phe100 105 110Leu Thr Ser Gly Thr Gln Phe Ser Asp Ala Glu Gly Leu Ala Leu Pro115 120 125Gln Asp Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Leu Val Gly Tyr Arg Gly Arg130 135 140Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gln Gly Arg Ser Val Thr Leu Arg145 150 155 160Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Thr Pro Glu165 170 175Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr Val Thr Pro Val Leu Asp Pro Ala180 185 190Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr Ser Val Gly Phe Gly195 200 205
Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Tyr Val Asn Ile Ser210 215 220His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe Phe Gly Ala225 230 235 240Val Met Val Gly(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度281個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp1 5 10 15Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys20 25 30Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro35 40 45Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro50 55 60Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly65 70 75 80Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly85 90 95Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala100 105 110Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu115 120 125
Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg130 135 140Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu145 150 155 160Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr165 170 175Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr180 185 190Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser195 200 205His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met210 215 220Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala225 230 235 240Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His245 250 255Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser260 265 270Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu275 280(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度338個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO7
AGGNTAACTC TCCTGAGGGG TGAGCCAAGC CCTGCCATGT AGTGCACGCA GGACATCANC 60AAACACANNN NNCAGGAAAT AATCCATTCC CTGTGGTCAC TTATTCTAAA GGCCCCAACC120TTCAAAGTTC AAGTAGTGAT ATGGATGACT CCACAGAAAG GGAGCAGTCA CGCCTTACTT180CTTGCCTTAA GAAAAGAGAA GAAATGAAAC TGNAAGGAGT GTGTTTCCAT CCTCCCACGG240AAGGAAAGCC CCTCTNTCCG ATCCTCCAAA GACGGAAAGC TGCTGGCTGC AACCTTGNTG300NTGGCATTGT GTTCTTGCTG NCTCAAGGTG GTGTTNTT338(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度509個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO8AATTCGGCAN AGNAAACTGG TTACTTTTTT ATATATGGTC AGGTTTTATA TACTGATAAG 60ACCTACGCCA TGGGACATCT AGTTCAGAGG AAGAAGGTCC ATGTCTTTGG GGATGAATTG120AGTCTGGTGA CTTTGTTTCG ATGTATTCAA AATATGCCTG AAACACTACC CAATAATTCC180TGCTATTCAG CTGGCATTGC AAAACTGGNA GGAAGGAGAT GAACTCCAAC TTGCAATACC240AGGGGAAAAT GCACAATTAT CACTGGGATG GAGATGTTCA CATTTTTTGG GTGCCATTGA300AACTGCTGTG ACCTNCTTAC ANCANGTGCT GTTNGCTATT TTNCCTNCCT NTTCTNTGGT360AACCTCTTAG GAAGGAAGGA TTCTTAACTG GGAAATAACC CAAAAAAANN TTAAANGGGT420ANGNGNNANA NGNGGGGNNG TTNNCNNGNN GNNTTTTNGG NNTATNTTNT NNTNGGGNNN480NGTAAAAATG GGGCCNANGG GGGNTTTTT 509(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度497個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ii)序列描述SEQ ID NO9AATTCGGCAC GAGCAAGGCC GGCCTGGAGG AAGCTCCAGC TGTCACCGCG GGACTGAAAA 60TCTTTGAACC ACCAGCTCCA GGAGAAGGCA ACTCCAGTCA GAACAGCAGA AATAAGCGTG 120CCGTTCAGGG TCCAGAAGAA ACAGTCACTC AAGACTGCTT GCAACTGNTT GCAGACAGTG 180AAACACCAAC TATACAAAAA GGCTCCCTTC TGNTGCCACA TTTGGGCCAA GGAATGGAGA 240GATTTCTTCG TCTGGAAACA TTTTGCCAAA CTCTTCAGAT ACTCTTTNCT CTCTGGGAAT 300CAAAGGAAAA TCTCTACTTA GATTNACACA TTTGTTCCCA TGGGTNTCTT AAGTTTTAAA 360AGGGGAGTGC CCTTAGGAGG AAAAGGGGAT AAATATTGGC CAAGGNACTG GTTANTTTNT 420AAATATGGTC AGGTTTNTAT ANCTGGTAGG CCTCGCCATG GGCATTNATT CANGGNGAGG 480NCNNTCTTTT GGGNTGA 497(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性[ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ TD NO10GTGGGATCCA GCCTCCGGGC AGAGCTG 27(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO11GTGAAGCTTT TATTACAGCA GTTTCAATGC ACC 33(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO12GTGTCATGAG CCTCCGGGCA GAGCTG 26(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO13
GTGAAGCTTT TATTACAGCA GTTTCAATGC ACC 33(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO14GTGGGATCCC CGGGCAGAGC TGCAGGGC 28(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO15GTGGGATCCT TATTACAGCA GTTTCAATGC ACC33(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度129個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO16GCGGGATCCG CCACCATGAA CTCCTTCTCC ACAAGCGCCT TCGGTCCAGT TGCCTTCTCC 60CTGGGGCTGC TCCTGGTGTT GCCTGCTGCC TTCCCTGCCC CAGTTGTGAG ACAAGGGGAC 120CTGGCCAGC 129(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO17GTGGGATCCT TACAGCAGTT TCAATGCACC 30
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其包含一種選自如下一組的多核苷酸序列(a)一種與選自如下一組的一種多核苷酸序列具有至少90％相同性的多核苷酸序列(i)編碼SEQ ID NO2的第1-285位氨基酸殘基的多核苷酸序列；(ii)編碼SEQ ID NO2的第73-285位氨基酸殘基的多核苷酸序列；(iii)編碼SEQ ID NO2的第n-285位、第1-m位或者第n-m位氨基酸殘基的多核苷酸序列，其中n是2-190之間的整數(shù)，m是274-284之間的整數(shù)，且其中所述多核苷酸序列編碼一種能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖、分化或存活的多肽；(iv)編碼SEQ ID NO2的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的片段的多核苷酸序列，其中所述多肽片段的長度至少為30個氨基酸殘基并且能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖、分化或存活；(v)編碼由ATCC保藏號97768中包含的cDNA克隆編碼的全長嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的多核苷酸序列；(vi)編碼由ATCC保藏號97768中包含的cDNA克隆編碼的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽胞外結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列；(vii)編碼由ATCC保藏號97768中包含的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列的一部分的多核苷酸序列，其中所述的部分不包括所述完整氨基酸序列氨基末端起的至多190個連續(xù)氨基酸殘基、或者所述完整氨基酸序列羧基末端起的至多11個連續(xù)氨基酸殘基、或者所述完整氨基酸序列氨基末端起的至多190個連續(xù)氨基酸殘基和所說完整氨基酸序列C末端起的至多11個連續(xù)氨基酸殘基，其中所述多核苷酸序列編碼一種能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖、分化或存活的多肽；(viii)編碼由ATCC保藏號97768中包含的cDNA克隆編碼的嗜中性白細(xì)胞因子α多肽的片段的多核苷酸序列，其中所述的多肽片段的長度至少為30個氨基酸殘基并且能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖、分化或存活；和(b)一種多核苷酸序列，其互補(bǔ)序列與(i)-(viii)中任一種多核苷酸雜交且編碼具有嗜中性白細(xì)胞因子α活性的多肽，其中所述雜交在如下條件下發(fā)生在由50％甲酰胺、5×SSC、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性的剪切的鮭精DNA組成的溶液中于42℃雜交，并在0.1×SSC溶液中于65℃洗滌。
2.權(quán)利要求1的核酸分子，該分子包含編碼一種多肽的多核苷酸序列，該多肽與包含SEQ ID NO2的第134-285位氨基酸殘基的多肽具有至少90％的相同性。
3.一種藥物組合物，該組合物包含權(quán)利要求1或2的核酸分子、由權(quán)利要求1或2的核酸分子編碼的多肽，或與權(quán)利要求1或2的核酸分子編碼的多肽特異性結(jié)合的抗體，和任選地，藥學(xué)上可接受的載體。
4.權(quán)利要求1或2的核酸分子、由權(quán)利要求1或2的核酸分子編碼的多肽或與權(quán)利要求1或2的核酸分子編碼的多肽特異性結(jié)合的抗體在制備治療免疫系統(tǒng)疾病或失調(diào)的藥物組合物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述的免疫系統(tǒng)疾病或失調(diào)是炎性疾病或感染性疾病。
6.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述的免疫系統(tǒng)疾病或失調(diào)是免疫缺陷。
7.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述的免疫系統(tǒng)疾病或失調(diào)是自身免疫疾病。
8.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述的自身免疫疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
9.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述的免疫系統(tǒng)疾病或失調(diào)是腫瘤、轉(zhuǎn)移性腫瘤或白血病。
10.與權(quán)利要求1或2的核酸分子編碼的多肽特異性結(jié)合的抗體在制備用于抑制嗜中性白細(xì)胞因子α介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖、分化或存活的藥物組合物中的應(yīng)用。
11.一種體外診斷免疫系統(tǒng)疾病或失調(diào)的方法，包括(a)將來自一測試個體的生物學(xué)樣品與權(quán)利要求1或2的核酸分子，或與權(quán)利要求1或2的核酸分子編碼的多肽特異性結(jié)合的抗體接觸；(b)分析所述生物學(xué)樣品中嗜中性白細(xì)胞因子α多核苷酸或多肽的水平；和(c)將生物學(xué)樣品中的嗜中性白細(xì)胞因子α多核苷酸或多肽水平與標(biāo)準(zhǔn)嗜中性白細(xì)胞因子α多核苷酸或多肽水平比較；其中與標(biāo)準(zhǔn)嗜中性白細(xì)胞因子α多核苷酸或多肽水平相比嗜中性白細(xì)胞因子α多核苷酸或多肽的水平的升高或降低是免疫系統(tǒng)疾病或失調(diào)的指征。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫系統(tǒng)疾病或失調(diào)是炎性疾病或感染性疾病。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫系統(tǒng)疾病或失調(diào)是免疫缺陷。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫系統(tǒng)疾病或失調(diào)是自身免疫疾病。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述自身免疫疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
16.權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫系統(tǒng)疾病或失調(diào)是腫瘤、轉(zhuǎn)移性腫瘤或白血病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是TNF蛋白質(zhì)家族的成員。更具體地說，本發(fā)明提供了一些分離的核酸分子，這些核酸分子編碼包括可溶形式的胞外結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的人嗜中性白細(xì)胞因子α蛋白質(zhì)。本發(fā)明也提供了嗜中性白細(xì)胞因子α多肽，產(chǎn)生該多肽的載體、宿主細(xì)胞和重組方法。本發(fā)明還涉及用于鑒別嗜中性白細(xì)胞因子α活性的激動劑和拮抗劑的篩選方法。本發(fā)明還提供了用于檢測與免疫系統(tǒng)有關(guān)的疾病的診斷方法以及用于治療與免疫系統(tǒng)有關(guān)的疾病的治療方法。
文檔編號C12N1/21GK1539970SQ20041000553
公開日2004年10月27日 申請日期1996年10月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月25日
發(fā)明者余國良, 賴因哈德·埃布納, 倪健, 德 埃布納 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司