專利名稱：小麥高光效和抗逆相關的蘋果酸脫氫酶、其編碼基因及培育抗逆植物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及與小麥高光效和抗逆相關的蘋果酸脫氫酶、編碼該酶的基因和含有該基因的表達載體。
背景技術：
蘋果酸脫氫酶負責催化草酰乙酸和蘋果酸之間的相互轉(zhuǎn)換，它普遍存在于各種動物、植物和大多數(shù)細菌中，在多種代謝過程中起重要作用。在植物細胞中根據(jù)其輔酶的特異性和在細胞內(nèi)的分布通?？梢詤^(qū)分出五個類型(Gietl，C.，1992，Biochim.Biophys.Acta，1100217-234)(1)依賴于NADP的葉綠體MDH(EC 1.1.1.82)，此種類型的酶是蘋果酸穿梭循環(huán)的一部分，它在保持細胞質(zhì)和基粒之間還原力的平衡方面起重要作用。在C4植物中它還參與向葉鞘細胞葉綠體中富集CO2。(2)依賴于NAD的線粒體MDH，它是三羧酸循環(huán)的一部分，在所有的真核細胞中普遍存在，在植物中它還參與光呼吸和C4植物葉鞘細胞中對CO2的富集作用。(3)依賴于NAD的微體MDH，它存在于乙醛酸循環(huán)體和過氧化物體中，在乙醛酸循環(huán)和蘋果酸-天門冬酸穿梭過程中起重要作用，同時也參與到光呼吸中。(4)依賴于NAD的葉綠體MDH，這種酶研究的較少，只在少數(shù)幾種植物中如冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)(Winter，K.等，1982，Plant Physiol，69300-307)，紅葉藜(Chenopodium rubrum)(Amino，S.，1992，Z Naturforsch，47545-552)和單細胞綠藻(Chlamydomonas reinhardtii)(Willeford，K.O.and Gibbs.M.，1989，Plant Physiol，90788-791)中發(fā)現(xiàn)有此種酶活性的存在，但是直到最近才在擬南芥菜的cDNA找到其確切存在的證據(jù)(Berkemeyer.M.等，1998，J Biol Chem，27327927-27933)。但是其生物學作用尚不清楚。(5)依賴于NAD的細胞質(zhì)MDH(cyMDH)。
在植物中對依賴于NADP的葉綠體MDH，依賴于NAD的線粒體MDH和依賴于NAD的微體MDH都已經(jīng)有了廣泛的研究，但是對其他類型的MDH卻知之甚少，特別是依賴于NAD的細胞質(zhì)MDH(cyMDH)。cyMDH(EC 1.1.1.37)通常認為在細胞質(zhì)和細胞器之間進行有關底物和還原力交換的各種穿梭循環(huán)中發(fā)揮作用。在具有景天酸代謝循環(huán)的景天科植物中，植物在晚上涼爽和濕潤的環(huán)境下利用MDH合成蘋果酸，儲存CO2，而在白天干旱和高溫的情況下，氣孔關閉，CO2從蘋果酸中脫羧釋放出來，供給植物進行光合作用的需要，從而保證了植物對干旱環(huán)境的適應(Borland，A.M.，等，1998，Planta 205342-351)。在水稻中的研究表明，耐鹽品種的耐鹽適應性與其細胞質(zhì)中的MDH活性有關(RitambharaG.等，2000，Plant Science 15623-34)。芹菜葉片受到高鹽條件的刺激能明顯增加細胞質(zhì)中的MDH活性(Aloni，B.等，1981，Plant Science Letters，20239-250)。這表明細胞質(zhì)中的蘋果酸代謝及其相關的蘋果酸脫氫酶在提高植物的光合效率、適應干旱和鹽堿等不良環(huán)境中具有重要作用，因而在植物基因工程技術領域中具有廣泛的應用潛力。
對植物中cyMDH在基因水平的研究工作開展的較少。阿根廷科學家從菠蘿葉片中純化出一種蛋白質(zhì)，并證明它屬于cyMDH(Cuevas andPodesta，2000，Physiol Plant，108240-248)。德國科學家從景天科植物冰葉日中花(Mesembryanthemum crystallinum)中分離到一種編碼cyMDH的cDNA，但是對其生化特性未做研究(Ocheretina and Scheibe，1997，Gene，199145-148)。美國科學家從苜蓿中分離到的另外一個cyMDH的cDNA，并在大腸桿菌中表達出相關的蛋白質(zhì)，證明其表現(xiàn)出對NAD+高的還原活性和對NDAH高的氧化活性(Miller，S.S.等，1998，Plant J，15173-184)。至今，在國內(nèi)外尚未見有關在小麥中有蘋果酸脫氫酶基因研究的報道。
無論在中國還是在世界范圍內(nèi)，小麥都是最重要的農(nóng)作物之一。它也是適應性最廣的作物，其產(chǎn)量在包括玉米、水稻和馬鈴薯在內(nèi)的重要農(nóng)作物中位居第一。但是小麥屬于C3植物，其光合效率低于C4植物，如玉米，同時在生產(chǎn)實踐中，由于環(huán)境逆境如干旱、鹽堿所造成的損失十分巨大。利用小麥的蘋果酸脫氫酶基因，通過基因工程手段，調(diào)節(jié)基因的表達活性，改善蘋果酸代謝，獲得高光效和抗逆境的小麥新品系有著十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過提供在小麥中一種胞質(zhì)型的蘋果酸脫氫酶基因和由其編碼的蛋白質(zhì)，達到調(diào)節(jié)小麥中的蘋果酸代謝，并進一步調(diào)節(jié)小麥的光合效率和抗逆性，增強小麥抵御外界逆境如干旱和鹽堿的目的。本發(fā)明的另一個目的是提供可將上述基因翻譯成活性蛋白質(zhì)的表達質(zhì)粒。
本發(fā)明的一個目的是提供一種小麥中胞質(zhì)型的蘋果酸脫氫酶。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種編碼小麥胞質(zhì)型的蘋果酸脫氫酶的基因。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種含有本發(fā)明的基因并將基因翻譯成活性蛋白質(zhì)的表達質(zhì)粒，以及可以轉(zhuǎn)化植物細胞的植物表達載體。
本發(fā)明提供了一種編碼小麥胞質(zhì)型的蘋果酸脫氫酶的DNA序列，它選自下組(1)、編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的DNA序列或(2)、與(1)的序列能夠雜交，并能夠編碼具有活性的胞質(zhì)型的蘋果酸脫氫酶的DNA序列。
所述的雜交條件是指，將雜交膜置于預雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，7％SDS)中，65℃預雜交30min；棄預雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，7％SDS，同位素標記的核苷酸片段)，65℃雜交12hr；棄雜交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min。
本發(fā)明的DNA序列可以具有SEQ ID NO1所示的序列。此序列為編碼小麥胞質(zhì)型的蘋果酸脫氫酶基因(cyMDH)的全長cDNA，命名為TaMDH。該序列共由1340個堿基組成，其中，5’端未翻譯區(qū)包括44個堿基，3’端未翻譯區(qū)包括294個堿基(其中包括51個堿基組成的PolyA)，編碼區(qū)由1002個堿基(從45位到1046位)組成，其中A占23.35％(234個)，C占22.55％(226個)，G占27.54％(276個)，T占26.55％(266個)，A+T占49.90％(500個)，C+G占50.10％(502個)。在國際基因序列數(shù)據(jù)庫(GenBank\EMBL\DDBJ)中的基因同源性分析表明，TaMDH基因是小麥中未曾報道的新基因，它與從冰葉日中花(Mesembryanthemum crystallinum)和苜蓿(Medicago sativa)中分離出的胞質(zhì)型蘋果酸脫氫酶基因具有同源性。
本發(fā)明還提供了一種由上述的DNA序列編碼的氨基酸序列。這種氨基酸序列最好具有SEQ ID NO2所示的序列。該蛋白質(zhì)序列包括333個氨基酸，如SEQ ID NO2所示。在該蛋白質(zhì)序列中，疏水氨基酸占134個，親水氨基酸占74個，堿性氨基酸占31個，酸性氨基酸占36個，該蛋白質(zhì)的分子量為35.5 KD，等電點為5.9。該蛋白質(zhì)是國際上未曾報道的新蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種含有上述DNA序列的表達載體，以及另外一種植物表達載體。它可以是含有上述的DNA序列的表達載體pET-28a，或者用于植物細胞轉(zhuǎn)化的含有actin啟動子和Bar選擇基因標記的載體。這兩種表達載體的構(gòu)建過程如下在TaMDH基因編碼區(qū)兩側(cè)合成引物，并分別引入BamHI及NotI酶切位點，其引物序列分別為5’-引物5’-CGGGATCCATGGCTGCGAAGGAACCGATG-3’3’-引物5’ATAAGAATGCGGCCGCTTACGCCAGGCATGAGTAGG-3’。
經(jīng)過PCR擴增出TaMDH基因的全長編碼區(qū)，以BamHI與NotI雙酶切下，連接到表達載體pET-28a的相應酶切位點上(見

圖1)，通過酶切和序列分析證明此表達載體的完整性和正確性。將表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌1477菌株，經(jīng)過IPTG誘導后，將大腸桿菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，證明TaMDH基因已在大腸桿菌中翻譯出正確的蛋白質(zhì)。將上述大腸桿菌菌株經(jīng)過37℃培養(yǎng)和IPTG誘導后，進行菌體裂解，分離菌體蛋白質(zhì)，并對該蛋白質(zhì)進行蘋果酸脫氫酶活性分析，所用底物為蘋果酸，得到其酶活性為121.4μmol-1min-1mg protein-1，證明此蛋白質(zhì)具有蘋果酸脫氫酶的催化活性。
經(jīng)過PCR擴增出TaMDH基因的全長編碼區(qū)，以BamHI與NotI雙酶切下，連接到含有Actin啟動子和Bar選擇基因標記的載體(見圖2)，通過酶切分析證明此表達載體的完整性和正確性。此植物表達載體可以通過基因槍法或花粉管通道轉(zhuǎn)化植物細胞，從而改善植物的蘋果酸代謝，提高其光合效率和抗逆性。
分別從小麥的根、莖、葉組織中提取總RNA，經(jīng)過電泳后用毛細管法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與小麥MDH基因探針雜交，放射自顯影檢測雜交結(jié)果，以rRNA探針為對照使雜交信號標準化。以此方法檢測TaMDH基因在小麥不同部位的表達。得到的結(jié)果表明該基因在小麥根、莖和葉等營養(yǎng)生長組織中均有表達。
本發(fā)明提供了與小麥高光效和抗逆相關的蘋果酸脫氫酶基因和與其相關的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。應當指出的是，在本發(fā)明技術領域的一般技術人員應用本發(fā)明的TaMDH基因或其TaMDH基因表達質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)基因生物技術，構(gòu)建植物表達載體，用構(gòu)建的植物表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞和將轉(zhuǎn)化的植物細胞培育成植株，轉(zhuǎn)化是通過農(nóng)桿菌介導、基因槍法或花粉管通道是能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的，可開發(fā)出具有高光效和抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物，例如，培育出以調(diào)控小麥營養(yǎng)生長組織中的蘋果酸代謝，從而改變小麥的光合效率，并增加抵御外界不良環(huán)境能力的轉(zhuǎn)基因小麥或其它的抗逆轉(zhuǎn)基因植株。正如本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例所表明的那樣，利用轉(zhuǎn)基因獲得小麥新品系，增加小麥營養(yǎng)生長組織中的蘋果酸合成，改善抵御外界不良環(huán)境的能力。
為此，本發(fā)明的最后的一個重要目的是提供一種應用本發(fā)明的TaMDH基因構(gòu)建的植物表達質(zhì)粒，通過植物轉(zhuǎn)基因生物技術，培育具有高光效和抗逆相關的轉(zhuǎn)基因植株的方法。
說明附圖圖1表示TaMDH基因表達質(zhì)粒。
圖2表示TaMDH基因的植物表達載體
具體實施例方式
實施例一、小麥蘋果酸脫氫酶基因探針的分離及序列分析將小麥(Triticum aestivum L)種植于溫室中，正常澆水和施肥，至生長到2-3個節(jié)間，采集根、莖、葉組織，用TRI試劑(Molecular Research Center，Inc，Cincinnati，USA)提取總RNA，用PolyAT tractmRNA Isolation試劑盒(Promega公司，Madison，USA)分離Poly(A)+RNA，用紫外分光光度計分析RNA的含量和純度。
反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈的條件為Poly(A)+RNA 1ug，5μmol/L引物5’-GACTCGAGTCGACATCGA(T)17-3’，0.5mmol/L dNTP，50單位RNasin，65℃保溫10分鐘，在冰上冷卻后，加入200 U SuperScriptTMIIRNase H--Reverse Transcriptase(Gibco)，42℃保溫1小時，加EDTA至終濃度10mM，并于95℃保溫10分鐘，在冰上冷卻。
第一輪PCR的引物為M15’-GACTCGAGTCGACATCG-3’，M25’-ATGAThGCnmGnGGnrT-3’，條件為3μL cDNA反應液，1μmol/L引物，0.4mmol/L dNTP，2.5 U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)，于95℃變性5分鐘，50℃復性2分鐘，72℃延伸40分鐘，然后進行40個循環(huán)(95℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃3分鐘)，最后72℃延伸10分鐘。
第二輪PCR引物為M35’-ATGyTnGGnsCnrAyCArCC-3’，M45’-TCnykdATrTGrTCrCAnGC-3’，條件為使用1μL第一輪PCR反應液，于95℃變性5分鐘，其它反應同第一輪。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳，采用GlassMAXDNA Isolation試劑盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)純化電泳產(chǎn)物。純化后連接在pGEM-T Easy載體上(Promega公司，Madison，USA)。連接條件為16℃12小時。轉(zhuǎn)化受體菌為E.coli DH5α，感受態(tài)細胞的制備采用CaCl2處理方法(Sambrook，J.等(eds)，Molecular cloning:A laboratory manual，2nded.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘，42℃熱激90秒，加入LB液體培養(yǎng)基，37℃保溫45分鐘，涂布在含氨芐青霉素(100ug/ml)和X-Gal(20ug/ml)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。白色克隆接種于LB液體培養(yǎng)基上(含氨芐青霉素100ug/ml)，37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，進行酶切分析后，以ABI 377 DNA序列分析儀進行序列分析，確定小麥的MDH探針。
序列分析的結(jié)果表明，所分離的探針具有683個核苷酸，與冰葉日中花(Mesembryanthemum crystallinum)和苜蓿(Medicago sativa)中分離出的胞質(zhì)型蘋果酸脫氫酶基因具有同源性。并且，其編碼的蛋白質(zhì)具有蘋果酸脫氫酶的催化活性中心IWGNH。
實施例二、小麥蘋果酸脫氫酶基因的篩選和序列分析以小麥莖Poly(A)+RNA為模板，以ZAP載體(Stratagene公司，LaJolla，CA，USA)合成cDNA，經(jīng)過體外包裝，構(gòu)建成小麥莖的cDNA文庫。取50ng探針DNA，加50uCi32P-dCTP進行標記，37℃保溫1小時，加EDTA至終濃度10mM終止反應。探針通過Sephadex G-50柱后，于100℃煮沸10分鐘，立即在冰上冷卻，進行雜交。
取50000 pfu鋪平板，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，于0.5MNaOH加1.5M NaCl變性2分鐘，1.5M NaCl加0.5M Tris-HCl(pH8.0)復性5分鐘，0.2M Tris-HCl(pH7.5)加2×SSC漂洗30秒，將膜夾在兩層Whatman濾紙中，80℃真空烘烤2小時，之后加入雜交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，100μg/mL魚精DNA，50％甲酰胺)，42℃保溫2小時，加入標記的探針，42℃雜交過夜，經(jīng)過6×SSC加0.1％SDS室溫下洗兩次，每次30分鐘，再用0.1×SSC加0.1％SDS于65℃洗兩次，每次20分鐘，之后于-80℃下放射自顯影，確定陽性克隆后，將噬菌斑取下，于SM溶液中4℃提取過夜，再按同樣的程序進行兩輪篩選。
對于獲得的陽性噬菌斑，按Stratagene公司提供的方法將其轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒DNA，經(jīng)過酶切分析后，采用ABI 377 DNA序列分析儀進行序列分析。
測得的DNA序列如SEQ ID NO 1所示，將其命名為TaMDH。它是小麥中胞質(zhì)型的蘋果酸脫氫酶基因，是迄今尚未報道的新基因。
實施例三、小麥蘋果酸脫氫酶基因編碼蛋白質(zhì)的翻譯人工合成一對引物
5’-引物5’-CGGGATCCATGGCTGCGAAGGAACCGATG-3’3’-引物5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTACGCCAGGCATGAGTAGG-3’在引物兩端分別引入BamHI及NotI酶切位點，以TaMDH基因為模板，進行PCR擴增，擴增條件10ng DNA，1μmol/L引物，0.4mmol/LdNTP，2.5 U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)。于95℃變性5分鐘，然后進行30個循環(huán)(95℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1.5分鐘)，最后72℃延伸10分鐘。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳，采用GlassMAXDNA Isolation試劑盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)純化電泳產(chǎn)物，用BamHI及NotI雙酶切后，連接在載體pET-28a(Novagen Company，USA；Cat No.69872-3)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌1477感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化細胞冰浴30分鐘后，42℃熱激50秒，加入LB液體培養(yǎng)基，37℃保溫45分鐘，涂布在含卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上。將抗性菌落于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50ug/ml)中37℃震蕩培養(yǎng)過夜，再進行1/100稀釋后，37℃震蕩培養(yǎng)2小時，加入IPTG至終濃度1mM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，12000g離心10分鐘，收集菌體，菌體加入100ul裂解液(50mM Tris-HCl pH6.8，100mM二硫蘇糖醇，2％SDS，0.1％溴酚藍，10％甘油)，100℃煮沸5分鐘，菌體蛋白按常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳(凝膠濃度12％)，結(jié)果顯示在細菌中有小麥蘋果酸脫氫酶蛋白質(zhì)的表達，其結(jié)構(gòu)如SEQ ID NO2所示。
實施例四、蘋果酸脫氫酶活性的測定將IPTG誘導后的大腸桿菌50ml于4000g離心10分鐘，加入4ml菌體裂解液(20mMTris-HCl pH7.5，1mM PMSF，2mM二硫蘇糖醇，100ug/ml溶菌酶)，30℃保溫15分鐘，用超聲波處理20次，4000g離心10分鐘，取上清液進行酶活測定。酶活測定反應液包括100mM甘氨酸緩沖液(pH10)，2.5mM NAD，85mM蘋果酸，1ul蛋白溶液，總體積500ul，在30℃下測定A340的增加來計算蘋果酸脫氫酶的活性。蛋白質(zhì)含量按Bio-Rad公司的方法(Bradford，M.M，1976，Anal.Biochem.，72248-254)測定。
結(jié)果顯示，以蘋果酸為底物，其酶活性為121.4μmol-1min-1mgprotein-1，證明此蛋白質(zhì)具有蘋果酸脫氫酶的催化活性。這表明TaMDH基因所編碼的蛋白質(zhì)具有催化蘋果酸脫氫的功能，因而能夠控制小麥組織中的蘋果酸代謝。
實施例五、小麥組織中TaMDH基因表達產(chǎn)物的檢測采用Northern blot雜交檢測小麥不同組織中的TaMDH基因的表達產(chǎn)物，從不同小麥組織中分離的總RNA樣品，按常規(guī)方法在1.4％瓊脂糖/甲醛變性凝膠電泳上分離，以20×SSC按毛細管法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(轉(zhuǎn)移時間12小時)，尼龍膜夾在兩層Whatman濾紙中，80℃真空烘烤2小時，將膜放在雜交瓶中，之后加入雜交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，100μg/mL魚精DNA，50％甲酰胺)10ml，42℃預雜交2小時，加入標記的蘋果酸脫氫酶基因探針，42℃雜交過夜，經(jīng)過6×SSC加0.1％SDS室溫下洗兩次，每次30分鐘，再用0.1×SSC加0.1％SDS于65℃洗兩次，每次10分鐘，于-80℃下放射自顯影一周。顯影后的膜加入0.1×SSC加0.1％SDS于95℃洗兩次，每次15分鐘，之后加入含有18S rRNA探針的雜交液，42℃雜交過夜。將膜取出，按相同的程序洗膜，于-80℃下放射自顯影1小時。
對雜交的信號經(jīng)過Phosphor Image掃描，并與rRNA信號標準化，得到小麥不同組織中TaMDH相對表達量，如表1所示表1.小麥不同組織中TaMDH基因的表達量(以葉為100)

結(jié)果表明，小麥蘋果酸脫氫酶基因TaMDH在營養(yǎng)生長組織中表達均有明顯的表達。在根中的表達量稍低于莖和葉中的表達。
實施例六、TaMDH蛋白在蘋果酸代謝中的催化特性蘋果酸脫氫酶可以催化草酰乙酸和蘋果酸之間的相互轉(zhuǎn)換，但是不同功能的蘋果酸脫氫酶在反應的方向性上有很大的不同，從而在不同程度上影響了蘋果酸的代謝，并進一步影響到其生物學功能。將小麥的蘋果酸脫氫酶TaMDH在大腸桿菌中表達，用1mM IPTG誘導大腸桿菌100ml菌液，于4000g離心10分鐘，加入10ml菌體裂解液(50mMTris-HCl pH8.5，500mM NaCl，10％甘油，1％Triton X-100，1mMPMSF，20mM二硫蘇糖醇，100ug/ml溶菌酶)，30℃保溫15分鐘，用超聲波處理20次，4000g離心10分鐘，取上清液，過Ni-NTA His-BindResins親和層析柱(Novagen，USA)，得到純化的TaMDH蛋白，以此蛋白質(zhì)分別測定其催化草酰乙酸還原和蘋果酸氧化的活性。草酰乙酸還原的測定采用100mM Tris緩沖液(pH7.5)，0.225mM NADH，0.06-1.2mM草酰乙酸，1ul蛋白溶液，總體積1000ul，在30℃下測定A340的降低來計算酶的活性。蘋果酸氧化的測定采用100mM甘氨酸緩沖液(pH10)，2.5mM NAD，1-50mM蘋果酸，1ul蛋白溶液，總體積500ul，在30℃下測定A340的增加來計算酶的活性。采用雙倒數(shù)法計算Km，Vmax，kcat，以及kcat/Km等酶動力學常數(shù)，結(jié)果如表2所示。
表2.TaMDH對蘋果酸氧化和草酰乙酸還原的催化特性

結(jié)果表明，TaMDH催化草酰乙酸還原的活性明顯大于蘋果酸氧化，其比值可以達到28.1(草酰乙酸還原/蘋果酸氧化)。因此此種蘋果酸脫氫酶可以富集CO2，從而改善小麥的光合效率，并在增加抵御外界不良環(huán)境(如干旱)中具有重要的作用。
序列表<110>中國科學院植物所<120>小麥高光效和抗逆相關的蘋果酸脫氫酶、其編碼基因及培育抗逆植物的方法<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1340<212>DNA<213>wheat，Triticum aestivum L.
<400>1ccactctccc tatccccgtg tccagaatct accccccggc tccaatggcg gcgaaggaac60cgatgcgcgt gctcgtcacc ggcgccgcag gacaaatcgg atatgctctt gttcccatga120ttgccagggg agttatgctt ggtgcagacc agcctgttat tctgcatatg ctggatattg180aatttgctgc tgaagctctt aaaggcgtca agatggagtt gatcgatgcc gcatttccac240ttctcaaggg agttgttgca acaactgatg ttgttgaggc ttgcactggt gtgaatgttg300cggttatggt tggtggattc cccaggaagg aaggaatgga aaggaaggat gttatgacga360aaaatgtttc aatctacaaa gctcaagcat ctgctcttga agctcatgca gcccccaatt420gcaaggtttt ggttgttgcc aacccagcaa acaccaatgc tctcatcctg aaggagtttg480ctccatctat ccctgagaag aacatcagtt gtttgacccg cctagaccac aacagggcac540tcggtcagat ttctgagaga cttggtgtcc aagtttctga cgttaagaat gctattatct600ggggtaatca ctcgtccagt cagtatcctg atgttaacca tgccactgtg aagactccca660gtggagagaa gcctgttcgt gaacttgttc aagatgatga atggctaaat ggggagttca720
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<400>2Met Ala Ala Lys Glu Pro Met Arg Val Leu Val Thr Gly Ala Ala Gly1 5 10 15Gln Ile Gly Tyr Ala Leu Val Pro Met Ile Ala Arg Gly Val Met Leu20 25 30Gly Ala Asp Gln Pro Val Ile Leu His Met Leu Asp Ile Glu Phe Ala35 40 45Ala Glu Ala Leu Lys Gly Val Lys Met Glu Leu Ile Asp Ala Ala Phe50 55 60Pro Leu Leu Lys Gly Val Val Ala Thr Thr Asp Val Val Glu Ala Cys
65 70 75 80Thr Gly Val Asn Val Ala Val Met Val Gly Gly Phe Pro Arg Lys Glu85 90 95Gly Met Glu Arg Lys Asp Val Met Thr Lys Asn Val Ser Ile Tyr Lys100 105 110Ala Gln Ala Ser Ala Leu Glu Ala His Ala Ala Pro Asn Cys Lys Val115 120 125Leu Val Val Ala Asn Pro Ala Asn Thr Asn Ala Leu Ile Leu Lys Glu130 135 140Phe Ala Pro Ser Ile Pro Glu Lys Asn Ile Ser Cys Leu Thr Arg Leu145 150 155 160Asp His Asn Arg Ala Leu Gly Gln Ile Ser Glu Arg Leu Gly Val Gln165 170 175Val Ser Asp Val Lys Asn Ala Ile Ile Trp Gly Asn His Ser Ser Ser180 185 190Gln Tyr Pro Asp Val Asn His Ala Thr Val Lys Thr Pro Ser Gly Glu195 200 205Lys Pro Val Arg Glu Leu Val Gln Asp Asp Glu Trp Leu Asn Gly Glu210 215 220Phe Ile Ala Thr Val Gln Gln Arg Gly Ala Ala Ile Ile Lys Ala Arg225 230 235 240Lys Leu Ser Ser Ala Leu Ser Ala Ala Ser Ser Ala Cys Asp His Ile245 250 255Arg Asp Trp Val Leu Gly Thr Ala Glu Gly Thr Phe Val Ser Met Gly260 265 270Val Tyr Ser Asp Gly Ser Tyr Gly Val Pro Ala Gly Leu Ile Tyr Ser275 280 285Phe Pro Val Thr Cys Ser Gly Gly Glu Trp Thr Ile Val Gln Gly Leu290 295 300Pro Ile Asp Glu Phe Ser Arg Lys Lys Met Asp Ala Thr Ala Gln Glu
305 310 315 320Leu Ser Glu Glu Lys Ala Leu Ala Tyr Ser Cys Leu Ala325 330
權利要求
1.一種編碼蘋果酸脫氫酶的DNA序列，其特征在于具有(1)編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的DNA序列或(2)與(1)的DNA序列能夠雜交，并能夠編碼具有活性的蘋果酸脫氫酶的DNA序列。
2.按照權利要求1所述的DNA序列，它具有SEQ ID NO1所示的序列。
3.一種由權利要求1所述的DNA序列編碼的氨基酸序列。
4.按照權利要求3所述的氨基酸序列，它具有SEQ ID NO2所示的序列。
5.一種含有權利要求1或2所述的DNA序列的表達載體。
6.按照權利要求5所述的表達載體，它是一種植物表達載體。
7.按照權利要求5所述的表達載體，它是含有權利要求1或2所述的DNA序列的表達載體pET-28a。
8.一種培育高光效和抗逆性的轉(zhuǎn)基因植株的方法，包括用權利要求1或2所述的DNA序列構(gòu)建植物表達載體；用構(gòu)建的植物表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細胞培育成植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種與小麥高光效和抗逆相關的蘋果酸脫氫酶、編碼該酶的基因和含有該基因的植物表達載體。本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明的基因培育高光效和抗逆性的轉(zhuǎn)基因植株的方法。
文檔編號C12N15/63GK1661016SQ200410005919
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月24日 優(yōu)先權日2004年2月24日
發(fā)明者馬慶虎, 丁郁 申請人:中國科學院植物研究所