專利名稱：鑒定與血管生成有關的基因和開發(fā)用于鑒定具有受損的血管生成的患者的血管生成診斷芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了用于鑒定和分離與血管生成有關的遺傳因子的組合物和方法，還涉及含有分離的遺傳因子的陣列的產(chǎn)生和用途。
背景技術：
冠狀動脈疾病和外周血管疾病是西方社會的常發(fā)病。在這些疾病中，為心肌或者腿提供血液的動脈由于動脈內(nèi)部脂肪的、纖維狀或者鈣化物質(zhì)的沉積而變窄。這些沉積物的積累稱為動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化減少了到達心臟或者腿部肌肉的血流，這導致肌肉缺少氧氣，從而如果疾病與動脈為心臟供氧有關，則導致心絞痛(胸痛)、心肌梗死(心臟病發(fā)作)，和充血性心力衰竭，如果疾病與動脈為腿供氧有關，那么導致腿中疼痛(跛行)或者腿潰瘍。
機體具有天然機制，通過所述機制，新血管(稱作側(cè)枝)生長而繞過動脈堵塞，盡管這些側(cè)枝很少足夠使血流恢復正常。通常存在小窄側(cè)枝血管，其與攜帶大量血流的大血管連接，但是太窄而不能在正常條件下攜帶大量血流。然而，當側(cè)枝連接的大血管被動脈粥樣硬化斑堵塞后，側(cè)枝可以擴大，從而它們能夠?qū)⒀哼f送到最初由現(xiàn)在被堵塞的血管供血的組織。
使用重組基因或者生長因子增強心肌側(cè)枝血管功能代表了治療心血管疾病的新方法。Kornowski，R.，等人，“治療性心肌血管生成的遞送策略”Circulation 2000；101454-458。已經(jīng)在心肌局部缺血的動物模型中闡明了概念證據(jù)，并且正在進行臨床試驗。Unger，E.F.，等人，“堿性成纖維細胞生長因子增強貓模型中心肌側(cè)枝流”，Am JPhysiol 1994；266H1588-1595；Banai，S.等人，“在狗中通過血管內(nèi)皮生長因子血管生成誘導側(cè)枝血流向局部缺血心肌的增強”，Circulation 1994；83-2189；Lazarous，D.F.，等人，“慢性全身性施用堿性成纖維細胞生長因子對貓心臟中側(cè)枝發(fā)育的影響”，Circulation 1995；91145-153；Lazarous，D.F.，等人，“基本發(fā)育和對損傷的動脈應答的比較效果”，Circulation1996；941074-1082；Giordano，F(xiàn).J.等人，“成纖維細胞生長因子-5的冠狀內(nèi)基因轉(zhuǎn)移增加心臟的局部缺血區(qū)域中血流和收縮功能”，Nature Med 1996；2534-9。
盡管治療性血管生成作為患有冠狀動脈疾病的患者的新的模式具有有希望的前景，但是很明顯非常希望新的策略用以最適地促進臨床上相關的治療性血管生成應答。具體地，非常希望新的改進的血管生產(chǎn)策略，該策略可以導致流向受侵襲的組織的血流的相關改善。
發(fā)明概述本發(fā)明克服了與當前策略和設計有關的問題和缺點并且提供了用于確定個體患者的“血管型”以預測給定個體是否將天然地發(fā)生好對差的側(cè)枝的可能性的試劑盒、組合物和方法。
一些動物研究表明可能存在干擾側(cè)枝生長的因素，這些因素包括糖尿病和高膽固醇血癥。存在冠狀動脈疾病患者的亞組，他們具有差的側(cè)枝，而其他亞組具有極好的側(cè)枝。在應答動脈阻塞性疾病，或者應答血管生成干擾發(fā)生的受損側(cè)枝發(fā)育很大程度上由遺傳因素(如特定遺傳多態(tài)性)，和/或通過改變編碼血管生成因子的基因表達的后生因素(如DNA甲基化模式)確定。因為產(chǎn)生側(cè)枝的能力存在顯著個體差異，而且因為這些個體差異大部分基于患者間的遺傳和后生差異，所以重要的是能夠診斷是否1)給定個體可能天然產(chǎn)生好或壞側(cè)枝，和2)給定個體可能應答特異治療性血管生成策略。因為這些個體差異，血管生成治療可以最終根據(jù)個體患者進行調(diào)整。因此，本發(fā)明允許通過使用DNA芯片或者類似技術確定DNA和/和蛋白質(zhì)表達圖，診斷性確定個體患者的“血管型”以預測給定個體是否將天然地或者應答特定血管生成治療而發(fā)生好對差的側(cè)枝可能性。
本發(fā)明的一個實施方案涉及確定個體患者的“血管型”以預測給定個體是否將天然發(fā)生好對差的側(cè)枝的可能性。因此，這可以包括得到和提供與側(cè)枝發(fā)育有關的基因列表。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及確定個體患者的“血管型”以預測是否給定個體在應答特定血管生成治療中發(fā)育好對差的側(cè)枝的可能性。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及檢測好對差側(cè)枝的方法，該方法包括檢測基因陣列的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，所述基因已經(jīng)通過我們的實驗研究確定為在組織中差異表達，所述組織中應答動脈阻塞而正在產(chǎn)生側(cè)枝。使用微芯片或者類似技術測定經(jīng)確定在側(cè)枝發(fā)育中起作用的所有、或者大多數(shù)基因以檢測SNPs。通過與我們所確定的基因的一種或多種基因有關的SNP的存在與導致增強的側(cè)枝發(fā)育的那些過程有關來指出存在發(fā)育差對好側(cè)枝的傾向。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及檢測好對差側(cè)枝的方法，該方法包括檢測血液中蛋白的改變，例如，外周血單核細胞中基因陣列所表達的蛋白質(zhì)的改變，其中所述基因已經(jīng)通過我們的實驗研究確定為在組織中差異表達，所述組織中應答動脈阻塞而正在產(chǎn)生側(cè)枝。蛋白質(zhì)水平將高于正常水平、低于正常水平，或者蛋白質(zhì)將被翻譯后修飾，如，但不限于磷酸化狀態(tài)的改變。通過個別蛋白質(zhì)的標準測定法(ELISA，等等)，或者通過更新的方法，如蛋白質(zhì)組分析，可以確定這些蛋白質(zhì)水平/修飾。通過我們所確定的與導致增強的側(cè)枝發(fā)育的那些過程有關的一種或多種基因編碼的蛋白質(zhì)的更低或更高血液水平的存在來指出存在發(fā)育差對好側(cè)枝的傾向。可以測量例如，血液流體和/或血細胞，如外周血單核細胞(PBMCs)中蛋白質(zhì)的水平。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及檢測好對差側(cè)枝的方法，并且包括檢測與已經(jīng)確定在組織中差別表達的那些基因有關的DNA甲基化模式，其中在所述組織中應答動脈阻塞而正在產(chǎn)生側(cè)枝。通過改變基因表達的DNA甲基化模式表明產(chǎn)生差對好側(cè)枝的傾向的存在，其中所述基因表達的改變導致我們所確定的基因的一種或多種基因編碼的蛋白質(zhì)的更低或者更高水平，這些蛋白質(zhì)與導致增強的側(cè)枝發(fā)育的那些過程有關。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及適于實施基因微陣列分析進行檢測的試劑盒，其中該試劑盒含有諸如核酸陣列(基因芯片)的試劑或者PCR引物組，其可以檢測已經(jīng)確定與導致增強的側(cè)枝發(fā)育的那些過程有關的多數(shù)或者所有基因的相關NSPs。這些基因可以選自表1中所列的基因。樣品可以包括該個體的淋巴、靜脈或動脈血、和/或血管組織。在一個實施方案中，使用基因微陣列檢測多態(tài)性。在另一個實施方案中，使用定量PCR檢測該多態(tài)性。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于實施上面任一方法的試劑盒。
在本發(fā)明的特定實施方案中提供了預測個體可能將產(chǎn)生側(cè)枝的可能性的方法，該方法包括測定從哺乳動物得到的樣品的受試者中至少三種基因的表達水平。通過該樣品中至少3種、至少5種、至少10種、至少20種基因的改變的表達預測側(cè)枝發(fā)育的可能性。所述改變的表達可以是增加或者減少的表達。具有增加和減少的表達的基因分別在表2和表3中列出。所述改變的表達水平可以比參比水平至少高兩倍或者低兩倍。通過測定樣品中蛋白質(zhì)表達水平可以確定基因表達水平。在這些實施方案的每一個中，樣品可以含有來自所述受試者的血，和/或可以含有來自該受試者的血細胞，如PBMCs。
在本發(fā)明的其他實施方案中，提供了預測受試者將發(fā)育側(cè)枝的可能性的方法，該方法包括檢測來自該患者的樣品中至少三種遺傳變異的存在，其中所述遺傳變異為SNPs或者改變的DNA甲基化模式。通過樣品中至少3種、至少5種、至少10種、至少20種基因存在遺傳變異來預測側(cè)枝發(fā)育的可能性。所述基因可以選自表1中所列的基因。測定方法可以包括使用基因微陣列或者定量PCR，并且可以是檢測DNA甲基化模式和/或檢測單核苷酸多態(tài)性的方法。
本發(fā)明還提供了實施上述測定法的試劑盒，其中使用PCR實施該測定法，并且其中該試劑盒含有適于擴增相應于表1中基因的至少3種、至少5種、至少10種、或至少20種DNA或者RNA序列的一組引物。在另一實例中，提供了實施上述測定法的試劑盒，其中該試劑盒含有能夠檢測表1中鑒定的基因的許多或者多數(shù)基因中的單核苷酸多態(tài)性。
在另一實施方案中，可以通過測量表1中所列基因編碼的蛋白質(zhì)，例如，可溶蛋白質(zhì)的濃度來確定基因的表達水平。來自所述受試者的樣品可以是血，和/或淋巴?？梢酝ㄟ^例如，ELISA確定蛋白質(zhì)表達水平。
本發(fā)明還提供了促進受試者側(cè)枝形成的方法，這可通過對該受試者施用組合物實現(xiàn)，所述組合物降低表2中所列的至少一種基因的表達和/或增加表3中所鑒定的至少一種基因的表達。該組合物可以含有反義寡核苷酸、siRNA分子、RNAi分子、結(jié)合mRNA形成三鏈體的寡核苷酸，或者在受試者中轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生反義寡核苷酸、siRNA分子、RNAi分子、結(jié)合mRNA形成三鏈體的寡核苷酸的DNA分子。所述組合物可以含有抗體或者可溶蛋白質(zhì)受體，例如，人抗體或者人可溶蛋白質(zhì)受體，其結(jié)合抑制受試者中側(cè)枝形成的蛋白質(zhì)。該組合物可以含有蛋白質(zhì)，施用該蛋白可以彌補表3中鑒定的基因所編碼的蛋白質(zhì)的損失。
根據(jù)下面的詳細描述，本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。然而，應該理解所述詳細描述和特定實施例盡管指出本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但是僅僅為了闡明給出，因為根據(jù)該詳細描述，本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的多種改變和修飾將變得對本領域技術人員來說顯而易見。
附圖
描述表1列出了側(cè)枝發(fā)育期間可以檢測到表達改變的基因。
表2列出了側(cè)枝發(fā)育期間表達增加的基因，還顯示了基因表達改變的時程。
表3列出了側(cè)枝發(fā)育期間表達減少的基因，還顯示了基因表達改變的時程。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于確定個體患者的血管型和預測給定個體是否將天然地或者應答特定血管產(chǎn)生治療而發(fā)育好對差側(cè)枝的可能性的試劑盒、組合物和方法。具體地，已經(jīng)鑒定了在側(cè)枝發(fā)育期間具有改變的表達水平的那些基因，并且已經(jīng)定量了基因表達的改變。通過測量基因表達的改變，可以確定是否給定個體將天然地或者應答特定血管生成治療而發(fā)育好對差側(cè)枝的風險。此外，已經(jīng)測量了側(cè)枝發(fā)育期間不同時間點基因表達的相對變化，并且這些測量允許進一步觀察側(cè)枝的發(fā)展和發(fā)育。
因為基因的差別表達與側(cè)枝發(fā)育有關，表達程度的改變，或者它們差別表達期間時間長度的改變導致側(cè)枝發(fā)育的不同程度。在冠狀動脈疾病和外周血管疾病背景中，側(cè)枝發(fā)育的不同程度可以導致某些個體具有與粥樣硬化性動脈阻塞疾病相關的最小癥狀，而其他個體具有嚴重癥狀。基因表達程度的改變，或者這些基因差別表達期間時間長度的改變由該基因的編碼區(qū)或者該基因的條件組件中的多態(tài)性導致。備選地，這些改變可以由“后生性改變”導致，后生性改變?yōu)橹T如，但不限于，DNA甲基化模式的改變。通過將基因表中的改變與側(cè)枝發(fā)育相關聯(lián)，本發(fā)明鑒定了那些基因，其中多態(tài)性或者改變的DNA甲基化模式可以將敏感性傳遞給發(fā)生差對好側(cè)枝發(fā)育。
與側(cè)枝發(fā)育有關的基因的鑒定允許將表達程度或者持續(xù)時間改變的那些基因用作靶標以鑒定傳遞發(fā)育側(cè)枝的能力改變的遺傳異常，其中所述表達程度或者持續(xù)時間改變部分由該所述基因的多態(tài)性或者DNA甲基化模式的改變導致。鑒定多態(tài)性或者DNA甲基化模式的改變使得可以在實施血管成形術或者開始血管產(chǎn)生治療之前預測患者中差側(cè)枝發(fā)育的危險性。一旦事前危險預測是可能的，這將顯著影響怎樣治療患者?？梢詾樽⒍箓?cè)枝發(fā)育的某些患者提供旁路手術或者血管成形術。其他患者可以先行用血管生成治療并用短程治療(血管內(nèi)放射)積極治療。因此，本發(fā)明提供了用于確定個體患者的“血管型”以預測給定個體是否將天然地或者應答特定血管生成治療而發(fā)育好對差側(cè)枝的可能性的新的改良方法。
此外，鑒定由于SNP或者改變的DNA甲基化模式導致的個體患者的異常表達的基因提供了新的方法用以通過靶定具有改變表達的那些基因的特定組或者亞組的治療改善或者治療所述疾病。因為不同多態(tài)性和DNA甲基化模式在不同患者中側(cè)枝的發(fā)育中起作用，所以本發(fā)明允許鑒定特定異常，其可能是特定患者所特有的。因此，本發(fā)明允許更大的治療特異性。在具有特定多態(tài)性譜的患者中有效的方案不一定在具有不同多態(tài)性譜的另一患者中有效。這些多態(tài)性作圖也使得治療個體化，從而可以避免對特定患者無效的治療策略的不必要的副作用。
具體地，鑒定了約575種基因，它們的表達在側(cè)枝發(fā)育期間改變。因為這些基因的差別表達與側(cè)枝發(fā)育有關，所以表達程度的改變，或者它們差別表達期間時間長度的改變導致發(fā)育側(cè)枝的能力改變。
基因表達程度的改變，或者所述基因差別表達期間時間長度的改變可以由該基因或者該基因的調(diào)節(jié)組件中的多態(tài)性導致。已經(jīng)為與數(shù)種疾病相關的數(shù)種基因鑒定了這些多態(tài)性，它們傳遞疾病發(fā)生的更大的危險性。因此，本發(fā)明鑒定其中多態(tài)性可以將敏感性傳遞給差對好側(cè)枝發(fā)育的那些基因。類似預測可來自改變的DNA甲基化模式導致的改變的基因表達，所述改變的DNA甲基化模式可以涉及特定SNPs，或者獨立于SNPs調(diào)節(jié)基因表達。因此，對好對差側(cè)枝發(fā)育的隨后參考涉及本發(fā)明鑒定的基因或者它們的調(diào)節(jié)單位的多態(tài)性，或者改變的DNA甲基化模式，其反過來改變基因表達。
某些所鑒定的基因的表達的改變可預測發(fā)育差對好側(cè)枝的能力。通過鑒定在側(cè)枝發(fā)育期間表達改變的575種基因，本發(fā)明人認識到分析那些基因的更多的多態(tài)性或者DNA甲基化模式導致更能夠預測發(fā)育側(cè)枝的能力。這些基因在側(cè)枝發(fā)育中所起的作用指能夠操縱那些基因的表達使得可以改進動脈阻塞性疾病的治療。技術人員將認識到增強或者減小基因表達的方法是本領域中公知的。例如，增強側(cè)枝的方法可以包括基因治療以增加側(cè)枝發(fā)育期間被下調(diào)的基因的表達。這些基因治療可以利用本領域中公知的方法實施并且可以使用，例如病毒和/或非病毒載體遞送核酸，其編碼并且允許所希望的基因表達。反之，減小所希望的基因的表達和/或活性的方法是本領域中眾所周知的并且包括，例如，反義RNA，和RNAi/siRNA方法。治療可以包括減小側(cè)枝發(fā)育期間被上調(diào)的基因的表達的方法。
鑒定與側(cè)枝發(fā)育有關的基因還允許鑒定影響側(cè)枝發(fā)育的蛋白質(zhì)。這又使得可能使用所述方法表達這些蛋白質(zhì)或者改變它們的代謝。改變所表達的蛋白質(zhì)的作用的方法包括，但不限于，使用結(jié)合所鑒定的蛋白質(zhì)的特定抗體或者抗體片段、結(jié)合所鑒定的蛋白質(zhì)的特定受體和可溶性受體片段，或者抑制所鑒定的蛋白質(zhì)影響其生理靶標和發(fā)揮其代謝和生物效應的其他配體或者小分子。此外，在側(cè)枝發(fā)育期間被下調(diào)的那些蛋白質(zhì)可以從外部補加以改善它們的合成減少。
不同多態(tài)性和DNA甲基化模式可以在不同患者的側(cè)枝發(fā)育中起作用。因此，本發(fā)明使得可能鑒定特定患者所特有的特定異常(“血管型鑒定”)，其允許更大的治療特異性。在具有特定多態(tài)性譜的患者中有效的方案不一定在具有不同多態(tài)性譜的另一患者中有效。這些多態(tài)性作圖也使得治療個體化，從而可以避免對特定患者無效的治療策略的不必要的副作用。
側(cè)枝發(fā)育中基因表達改變的闡明發(fā)明人已經(jīng)鑒定了在側(cè)枝發(fā)育期間經(jīng)歷表達改變的基因。那些基因在表1中列出。在側(cè)枝發(fā)育期間顯示出增加和減少的表達的那些基因分別在表2和3中顯示，以及表達時間變化的測量。本發(fā)明人使用如下面詳細描述的鼠收肌的核酸陣列分析實施該分析。然而，技術人員將認識到測量基因表達的其他方法是本領域中眾所周知的。
小鼠是人血管研究的廣泛接受的模型，并且認為在小鼠中得到的結(jié)果高度預測人中的結(jié)果。因此，預期側(cè)枝發(fā)育期間人中基因表達的改變將與小鼠中觀察到的結(jié)果相似或者基本相同。這些基因中表達程度或者這些基因差別表達期間的時間長度的放大的改變將傾向于好對差側(cè)枝。這些放大的改變通常由基因或者該基因的調(diào)節(jié)組件中的多態(tài)性導致，因此所鑒定的在血管產(chǎn)生過程期間受到差別調(diào)節(jié)的小鼠基因?qū)⑴c人基因同源，其中在所述人基因中將發(fā)現(xiàn)這些多態(tài)性傳遞形成好對差側(cè)枝的能力。此外，對于表1中描述的每一種基因，小鼠和人同源物都是已知的，進一步表明在小鼠研究中所得結(jié)果將高度預測在人類中所得結(jié)果。
在給定患者中觀察到的與側(cè)枝發(fā)育相關的SNPs或者改變的DNA甲基化模式的基因也可作為治療性干預的靶標。從而，側(cè)枝發(fā)育期間上調(diào)的那些基因可以由設計用以減少基因表達的療法或者這些基因編碼的蛋白質(zhì)的功能靶定；側(cè)枝發(fā)育期間下調(diào)的那些基因可以由設計用以增加基因表達的療法或者這些基因編碼的蛋白質(zhì)的功能靶定。
已經(jīng)研究了通過實驗誘導的側(cè)枝發(fā)育期間小鼠局部缺血后肢中基因表達的改變，該模型通常被認為是模擬人類中發(fā)生的側(cè)枝發(fā)育的合理的動物模型。得到樣品和對照小鼠后肢組織，從該組織準備RNA，從該RNA產(chǎn)生標記的cRNA并使用Affymetrix GeneChip小鼠基因組分析。比較樣品和對照組織并鑒定了在基因表達中經(jīng)歷顯著改變的那些基因。為了本研究的目的，認為基因表達中兩倍增加或者減少是顯著的，盡管技術人員將認識到在某些情況中基因表達中更小的改變也是顯著的。鑒定了確定在表達中具有顯著改變的那些基因的每一種基因的相應的人基因。
盡管約575種基因表現(xiàn)出在側(cè)枝發(fā)育中具有改變的表達(表1)，但是可能通過分析這些基因中一些基因的子集可靠地預測好對差側(cè)枝發(fā)育。在本發(fā)明的實施方案中，可以研究至少5、10、15、20或50種基因，如果希望，可以研究表1中所列的所有或者大多數(shù)基因。還可以分析這些基因的多態(tài)性或者改變基因表達的改變的DNA甲基化模式。最初可以分析所有基因，但是通過含有這些基因的一些成員的子集可以進行可靠預測。在其他實施方案中，可以研究至少5、10、15、20或50種基因，如果希望，可以研究表1中所列的所有或者大多數(shù)基因，例如，該研究可以使用測序、短串聯(lián)重復結(jié)合研究、單核苷酸多態(tài)性結(jié)合研究，等等。然而，在每種情況中，通常更方便地研究基因的更小的子集中基因表達或者多態(tài)性。
通過測量一組基因的表達的變化(例如，通過血液蛋白質(zhì)分析或者通過分析血細胞，如PBMCs中的蛋白質(zhì))，或者通過鑒定多態(tài)性或者影響幾組基因表達的DNA甲基化模式，而不是單個基因，本發(fā)明提供了對所觀察到的改變可以預測差對好側(cè)枝發(fā)育的更大的統(tǒng)計置信度，如通過提供個體的可靠的危險性作圖實現(xiàn)。從而，單個基因的表達的改變或者單個基因多態(tài)性不能將對好對差側(cè)枝發(fā)育的敏感性增加到足夠跨越診斷閾值。另一方面，由于存在多個多態(tài)性和/或DNA甲基化模式，多種特定基因的表達的協(xié)同改變更可能增加差對好協(xié)同側(cè)枝發(fā)育的可能性。這和個體僅具有傾向于動脈粥樣硬化的一個危險因素(膽固醇升高)的情況類似。隨著危險因素數(shù)目的增加(膽固醇升高加上高血壓、肥胖、吸煙、糖尿病，等等)，危險性顯著增加。
鑒定多態(tài)性或者DNA甲基化模式的改變使得可以在進行血管成形術步驟或者啟動血管生成治療之前預測患者中差側(cè)枝發(fā)育的危險性。該步驟前危險預測可以用于影響患者的治療?？梢詾樽⒍箓?cè)枝發(fā)育的某些患者提供旁路手術或者血管成形術。其他患者可以先行用血管生成治療并用短程治療(血管內(nèi)放射)積極治療。因此，本發(fā)明提供了用于確定個體患者的“血管型”以預測給定個體是否將天然地或者應答特定血管生成治療而發(fā)育好對差側(cè)枝的可能性的新的改良方法。
增加差對好側(cè)枝發(fā)育的敏感性的多種基因的調(diào)節(jié)異?？梢灾苯訙y量患者樣品中基因多態(tài)性和改變的DNA甲基化模式，所述基因多態(tài)性和改變的DNA甲基化模式導致側(cè)枝發(fā)育期間差異表達基因的表達中生物學上重要改變。這些樣品含有DNA，其可以最方便地從外周血，例如，從PBMCs得到。本發(fā)明人使用核酸陣列方法鑒定在應答急性血管損傷的愈合過程中表現(xiàn)出顯著改變的表達的全套基因。然而，用于測量基因表達變化的其他方法也是本領域中眾所周知的。例如，使用定量免疫測定法如ELISA可以測量組織樣品分離物中蛋白質(zhì)水平。用于使用ELISA方法測量許多蛋白質(zhì)水平的試劑盒可通過商業(yè)途徑從諸如R&D Systems(Minneapolis，MN)的供應商得到，并且使用眾所周知的技術也可以開發(fā)ELISA方法。見例如，AntibodiesALaboratory Manual(Harlow和Lane編著，Cold Spring HarborPress)。用于這些ELISA方法中的抗體可以通過商業(yè)途徑得到或者可以使用眾所周知的方法制備。
定量分析多種蛋白質(zhì)的其他方法包括，例如，蛋白質(zhì)組技術，如同位素編碼的親和標記試劑、MALDI TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜、和2D-凝膠/質(zhì)譜技術。這些技術可通過商業(yè)途徑從，例如，Large ScaleProteomics Inc.(Germantown MD)和Oxford Glycosystems(OxfordUK)得到。
備選地，可以用定量mRNA擴增方法，如定量RT-PCR在信使水平上測量基因表達的改變。用于實施這些方法的系統(tǒng)也可以通過商業(yè)途徑得到，例如TaqMan系統(tǒng)(Roche Molecular System，Alameda，CA)和Light Cycler系統(tǒng)(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)。設計用于RT-PCR中的適宜引物的方法和相關方法是本領域中眾所周知的。尤其可以通過商業(yè)途徑得到許多軟件包以設計PCR引物序列。
核酸陣列提供了研究多種基因表達的尤其吸引人的方法。具體地，陣列提供了同時測定多種基因的表達的方法。這些方法是本領域中眾所周知的并且商業(yè)化系統(tǒng)可以從例如，Affymetrix(Santa Clara，CA)，Incyte(Palo Alto，CA)，Research Genetics(Huntsville，AL)和Agilent(Palo Alto，CA)得到。還見美國專利號5,445,934、5,700,637、6,080,585、6,261,776，這里完整引用這些專利作為參考。
基因表達的程度的改變或者基因差別表達期間時間長度的改變可以由基因中或者該基因的調(diào)節(jié)組件中的多態(tài)性導致。這些多態(tài)性傳遞疾病發(fā)展的更大的危險，已經(jīng)為與若干疾病相關的基因鑒定了所述多態(tài)性。因此，本發(fā)明鑒定了這樣的基因，這些基因中多態(tài)性或者改變的DNA甲基化模式可以將易感性傳遞給差對好側(cè)枝發(fā)育。本發(fā)明的一個目的是通過開發(fā)DNA微陣列芯片鑒定這些多態(tài)性，所述芯片含有影響我們所鑒定的在側(cè)枝發(fā)育中起作用的那些基因的所有那些SNPs(例如，通過使用Affymetrix GeneChip系統(tǒng))。
鑒定基因中多態(tài)性的方法是本領域中眾所周知的。見，例如，美國專利號6,235,480和6,268,146，這里完整引用這些專利作為參考。一旦鑒定了多態(tài)性，使用核酸陣列檢測基因中特定多態(tài)性的方法也是本領域中眾所周知的。
從而，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了方法，在所述方法中為選自表1中所示基因的至少3種基因鑒定了SNPs或改變的DNA甲基化模式。在本發(fā)明的其他實施方案中，確定至少5種基因的SNPs或改變的DNA甲基化模式以確定好對差側(cè)枝發(fā)育的可能性。在其他實施方案中，所測定的基因數(shù)為10。在其他實施方案中，所測定的基因數(shù)為20或者至少約20。在另外的實施方案中，所測定的基因數(shù)為50或者至少約50。不管選自表1中所示基因的所分析基因的子集中基因的數(shù)目為多少，多態(tài)性或者DNA甲基化模式的總數(shù)可以允許預測好對差側(cè)枝發(fā)育。類似地，此處鑒定的基因表達中的協(xié)同變化可以允許預測好對差側(cè)枝發(fā)育。
關于多態(tài)性，隨著生物學重要的多態(tài)性的數(shù)目增加，可以進行的預測的置信度也增加。類似地，許多所鑒定的基因的表達中協(xié)同變化表明增加了預測可以得到的置信度。隨著表1中所列基因的更多多態(tài)性被鑒定，甚至更有效的風險分布譜也是可能的。從而，在本發(fā)明的其他實施方案中，測定至少5種基因或者至少約5種基因的表達以確定側(cè)枝發(fā)育的能力。在其他實施方案中，所測定的基因數(shù)為10。在其他實施方案中，所測定的基因數(shù)為20或者至少約20。在另外的實施方案中，所測定的基因數(shù)為50或者至少約50。
技術人員將認識到由于側(cè)枝發(fā)育的異質(zhì)性，不是所有具有差側(cè)枝發(fā)育的個體將表現(xiàn)出表1中所列基因的每種基因的表達都改變。從而，可能一種、一些，或者許多基因?qū)⒉幻黠@表現(xiàn)出改變的表達(因此將不含有生物學上重要的多態(tài)性或者改變的DNA甲基化模式)，并且不同的個體將表現(xiàn)出不同的組合；然而，全體基因表達中多態(tài)性導致的協(xié)同改變可以高度預測差對好側(cè)枝發(fā)育的存在。
通常，當研究僅相對少數(shù)基因的表達時，可以觀察到多數(shù)或者所有基因中表達的改變以提供對好對差側(cè)枝發(fā)育的可靠診斷。例如，當僅測量三種基因時，所有三種基因可以顯示出表達中的相關改變以允許可靠地診斷受損的側(cè)枝發(fā)育。當研究五種基因時，至少四種基因中的改變通常將提供可靠的診斷。當測量10種基因時，當觀察到至少七種基因改變時，得到可靠診斷。當測量10種以上的基因時，90％、80％、70％、60％或50％的所測量的基因中的改變可以預測受損的側(cè)枝發(fā)育。隨著這些百分數(shù)減小，診斷的可靠性也減小，但是技術人員將認識到當觀察到表1中所列基因的20或30種基因的表達中的協(xié)同改變時，這可以高度預測差對好側(cè)枝發(fā)育的可能性。通常，隨著基因數(shù)目增加，可能通過觀察所研究的基因的相對小的子集中表達的協(xié)同改變提供可靠診斷。
組織采樣以確定改變的基因表達和導致相關基因表達中生物學上重要的改變的多態(tài)性的存在盡管含有核酸的任何樣品都適于該目的，但是最簡單的采樣組織是外周靜脈或動脈血。然而，可以使用其他組織，如血管組織，尤其動脈血管組織或者靜脈血管組織。
研究表1中所列基因的基因多態(tài)性、DNA甲基化模式，和蛋白質(zhì)水平的方法可以通過數(shù)種方法鑒定多態(tài)性，所述方法包括限制酶消化、測序、短串聯(lián)重復結(jié)合研究、單核苷酸多態(tài)性結(jié)合研究，等等。這些方法是本領域中眾所周知的。
還可以在蛋白質(zhì)水平上研究基因表達。首先分離靶組織，然后通過眾所周知的方法提取總蛋白質(zhì)。例如，使用ELISA方法，利用對靶蛋白特異的一對抗體實施定量分析。
表1中所列蛋白質(zhì)的子集是可溶的或者分泌性的。在這些實例中，可以在血、血漿或者淋巴中發(fā)現(xiàn)所述蛋白質(zhì)，并且可以通過用于分析這些組織的蛋白質(zhì)所描述的那些方法的任一種分析那些蛋白質(zhì)。這提供了得到用于預測產(chǎn)生側(cè)枝的能力的患者樣品的最小侵入性方法。鑒定分泌蛋白質(zhì)的方法是本領域中公知的。
用來源于任一來源(包括外周血)的組織可以可靠地檢測基因多態(tài)性；血液蛋白質(zhì)水平可以作為鑒定改變的基因表達的來源。
RNA表達從組織分離RNA的方法是本領域中眾所周知的。見，例如，Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual(第三版)Cold Spring Harbor Press，2001。也可以用商業(yè)試劑分離RNA。
簡言之，例如，將細胞或者組織裂解并將裂解的細胞離心除去核沉淀。然后回收上清液并使用苯酚/氯仿萃取然后通過乙醇沉淀提取核酸。這提供了總RNA，通過測量260-280nM的光密度可以定量總RNA。
通過利用mRNA的“PolyA”尾，使用幾種通過商業(yè)途徑可得到的試劑盒可以從總RNA分離mRNA。QIAGEN mRNA Midi試劑盒(目錄號70042)；Promega PolyATtractmRNA分離系統(tǒng)(目錄號Z5200)。QIAGEN試劑盒提供了旋轉(zhuǎn)柱，使用為了分離polyA mRNA而設計的Oligotex樹脂，并且在30分鐘內(nèi)從總RNA產(chǎn)生基本上純的mRNA。Promega系統(tǒng)使用生物素化寡dT探針與mRNA polyA尾雜交并且需要約45分鐘純mRNA。
使用氯化銫緩沖(Cushion)梯度法也可以分離mRNA。簡言之，將快速冷凍組織在異硫氰酸Guanethedium中勻漿，在氯化銫緩沖液上分層，并超速離心24小時得到總RNA。
基因微陣列分析微陣列技術是測量mRNA的單一樣品中多種基因的表達的非常有效的方法。例如，通過商業(yè)途徑從Affymetrix Inc.(Santa Clara，Ca)得到的Gene Chip技術使用芯片，其上平鋪數(shù)千種已知基因和表達序列標簽(ESTs)的探針。制備生物素化cRNA(線性擴增的RNA)并與芯片上的探針雜交。然后互補序列顯色并且信號強度與該基因表達的mRNA的拷貝數(shù)匹配。
蛋白質(zhì)表達還可以在蛋白質(zhì)水平上研究基因表達。首先分離靶標組織，然后通過眾所周知的方法提取總蛋白質(zhì)。例如，使用ELISA方法，利用對靶蛋白質(zhì)特異的一對抗體實施定量分析。
表1中所列蛋白質(zhì)的子集是可溶的或者分泌性的。在這些實例中，可以在血、血漿或者淋巴中發(fā)現(xiàn)所述蛋白質(zhì)，并且可以通過用于分析這些組織的蛋白質(zhì)所描述的那些方法的任一種分析那些蛋白質(zhì)。這提供了得到用于預測形成再狹窄或粥樣硬化的風險的患者樣品的最小侵入性方法。鑒定分泌蛋白質(zhì)的方法是本領域中公知的。
新興蛋白質(zhì)組技術可以提供強有力的分析工具用以測定許多蛋白質(zhì)中的改變。
提供下面的實施例用以闡明本發(fā)明的實施方案，但是絕不應該將這些實施例看作是對本發(fā)明范圍的限制。
實施例小鼠后肢的微陣列分析分離RNA小鼠經(jīng)歷股動脈連接和切除。用假手術處理對照組。收集手術和假手術后的小鼠內(nèi)收肌并將其快速冷凍。將合并的肌肉(30-50mg)用研缽和研杵碾碎成粉末(在液氮中收集)然后在2.5ml異硫氰酸胍中勻漿。在氯化銫緩沖梯度上4℃下超速離心24小時提取總RNA。見Sambrook等人，如前。
靶標制備和DNA微陣列雜交對于第一條鏈cDNA合成反應，將5.0-8.0μg總RNA在70℃下與T7-(dT)24引物孵育10分鐘，然后置于冰上。對于溫度調(diào)節(jié)步驟，加入5×第一條鏈cDNA緩沖液，0.1M DTT，和10mM dNTP混合物，并將反應物在42℃孵育1小時。加入SSII逆轉(zhuǎn)錄酶，并將反應物在42℃孵育1小時。第一條鏈合成完畢后，向反應管加入5×第二條鏈反應緩沖液，10mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、DNA連接酶、DNA聚合酶I、和RNA酶H。然后將樣品在16℃孵育。加入0.5M EDTA后，用相鎖凝膠-苯酚/氯仿萃取，然后通過乙醇沉淀清潔cDNA。
生物素標記的cRNA的合成(體外轉(zhuǎn)錄)使用(ENZO Biochem，Inc.，New York，NY)的ENZO BioArrayRNA轉(zhuǎn)錄標記試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商的方案完成生物素-標記的cRNA的合成。為了進行反應，將1μg cDNA、10×HY反應緩沖液、10×生物素標記的核糖核苷酸、10×DTT、10×RNA酶抑制劑混合物和20×T7 RNA聚合酶在37℃孵育4-5小時。用QIAGEN的RNeasy旋轉(zhuǎn)柱純化標記RNA，然后乙醇沉淀并定量。
用于靶標制備的cRNA的片段化將5×片段化緩沖液(200mM Tris-乙酸，pH8.1，500mM KOAc，150mM Mg)Ac)加入cRNA。樣品在94℃孵育35分鐘，然后置于冰上。片段化cRNA在-70℃保存。
靶標雜交如下制備雜交混合液將片段化cRNA(15μg調(diào)節(jié)的)、對照寡核苷酸B2(Affymetrix)、20×真核雜交對照(Affymetrix)、鮭精DNA、乙?；疊SA、和2×雜交緩沖液(Affymetrix)合并，加熱到99℃保持5分鐘。然后以最大速度將雜交混合液離心5分鐘以從混合液除去任何不溶的物質(zhì)。離心后，將混合液在45℃加熱5分鐘。然后將澄清的雜交混合液加入Affymetrix探針陣列柱體，其已經(jīng)用1×雜交緩沖液預先濕潤。然后將探針陣列置于45℃便攜式旋轉(zhuǎn)烤肉器盒狀烘箱(設置為60轉(zhuǎn)/分鐘)中并雜交16小時。
洗滌、染色和掃描探針陣列用GeneChipFluidics Station 400洗滌和染色陣列。用GenChip軟件運行該儀器。簡言之，將陣列用非嚴格洗滌緩沖液在25℃洗滌10輪，然后用嚴格洗滌緩沖液在50℃洗滌4輪。然后用藻紅蛋白-鏈霉抗生物素蛋白在25℃將陣列染色10分鐘。將陣列用非嚴格洗滌緩沖液在25℃洗滌10輪。再次用藻紅蛋白-鏈霉抗生物素蛋白在25℃將探針陣列染色10分鐘，然后用非嚴格洗滌緩沖液在30℃洗滌15輪。將探針陣列置于HP Gene ArrayTM掃描儀中檢測雜交信號，該掃描儀使用GeneChip軟件運行。
數(shù)據(jù)分析用GeneChip軟件(版本3.3)使用生產(chǎn)商的使用說明進行數(shù)據(jù)分析。Lockhart，D.J.等人，Nat.Biotechnol.141675-80(1996)。簡言之，每種基因由芯片上的1-3個探針組代表和查詢。每個探針組含有16個完美匹配(PM)和16個錯配(MM)25個核苷酸堿基探針。錯配在該25個核苷酸堿基探針的中間有一個堿基改變。比較來自PM和MM探針的雜交信號，這允許測量特異信號強度并且消除了來源于兩個對照芯片的數(shù)據(jù)的非特異交叉雜交。用每種探針對的強度差異以及強度的比值進行“存在”或者“缺乏”調(diào)用。對照用作基線并將實驗GeneChip測定值與基線比較得到四個矩陣，其用于確定差異調(diào)用，該調(diào)用指出特定基因的轉(zhuǎn)錄水平是否改變。
用電子數(shù)據(jù)表分析(Microsoft Excel)進行迭代比較。每個實驗數(shù)據(jù)設置在特定時間點(n＝2)并且為每種基因確定對照和實驗之間表達的差異。提取在所有4個成對比較中都具有差異調(diào)用的基因用于進一步分析。
GeneSpring分析將來自每種GeneChip測定的數(shù)據(jù)送入GeneSpring軟件并且分析基于時間表達譜的基因簇。將0.97或者更大的相關性系數(shù)作為界限以產(chǎn)生具有顯著表達同源性的基因簇。
本領域中技術人員在考慮本文中公開的說明書和實踐后，本發(fā)明的其他實施方案和用途對于他們將變得顯而易見。將此處引用的所有參考文獻，包括所有美國和國外專利和專利申請都特別和完整地并入本文作為參考。該說明書和實施例僅是示例性的，本發(fā)明的真正范圍和精神由所附權利要求書指出。
權利要求
1.預測受試者將發(fā)育側(cè)枝的可能性的方法，該方法包括測定來自所述哺乳動物的樣品中所述受試者中至少3種基因的表達水平。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中通過所述樣品中至少3種、至少5種、至少10種、至少20種、或至少20種基因的改變的表達預測側(cè)枝發(fā)育的可能性。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中通過所述樣品中至少3種、至少5種、至少10種、至少20種、或至少20種基因的增加的表達預測側(cè)枝發(fā)育的可能性。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其中通過所述樣品中至少3種、至少5種、至少10種、至少20種、或至少20種基因的減少的表達預測側(cè)枝發(fā)育的可能性。
5.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中所述基因選自表1中所列基因。
6.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述基因選自表2中所列基因。
7.根據(jù)權利要求4的方法，其中所述基因選自表2中所列基因。
8.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述樣品含有來自所述受試者的血液。
9.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述改變的表達水平比參比水平高或低至少2倍。
10.權利要求1-9任一項的方法，其中通過測定樣品中蛋白質(zhì)表達水平確定基因表達水平。
11.預測受試者將發(fā)育側(cè)枝的可能性的方法，該方法包括檢測源于所述患者的樣品中至少3種遺傳變異的存在，其中所述遺傳變異為SNPs或者改變的DNA甲基化模式。
12.根據(jù)權利要求11的方法，其中通過所述樣品中至少3種、至少5種、至少10種、至少20種、或至少20種基因的遺傳變異預測側(cè)枝發(fā)育的可能性。
13.根據(jù)權利要求11或12的方法，其中所述基因選自表1中所列基因。
14.根據(jù)權利要求1或11的方法，其中測定方法包括使用基因微陣列或者定量PCR。
15.根據(jù)權利要求11的方法，其中該測定包括檢測DNA甲基化模式的方法。
16.根據(jù)權利要求11的方法，其中該測定包括檢測單核苷酸多態(tài)性的方法。
17.實施根據(jù)權利要求1或11的測定法的試劑盒，其中將使用PCR實施所述測定法并且其中所述試劑盒含有適于擴增相應于表1中所列基因的至少3種、至少5種、至少10種、或至少20種DNA或者RNA序列的一組引物。
18.實施根據(jù)權利要求11的測定法的試劑盒，其中所述試劑盒含有能夠檢測表1中鑒定的許多基因中單核苷酸多態(tài)性的核酸陣列。
19.根據(jù)權利要求18的試劑盒，其中所述陣列能夠檢測表1中鑒定的多數(shù)基因中可能存在的單核苷酸多態(tài)性。
20.根據(jù)權利要求1的方法，其中通過測量所述基因編碼的蛋白質(zhì)的濃度確定所述基因的表達水平。
21.根據(jù)權利要求20的方法，其中所述蛋白質(zhì)是可溶蛋白質(zhì)。
22.根據(jù)權利要求21的方法，其中所述樣品是血液和/或淋巴。
23.根據(jù)權利要求20的方法，其中通過ELISA確定蛋白質(zhì)表達水平。
24.促進受試者中側(cè)枝形成的方法，該方法包括對所述受試者施用減少表2中鑒定的至少一種基因的表達和/或增加表3中鑒定的至少一種基因的表達的組合物。
25.根據(jù)權利要求24的方法，其中所述組合物含有反義寡核苷酸、siRNA分子、RNAi分子、結(jié)合mRNA形成三鏈體的寡核苷酸，或者在所述受試者中轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生反義寡核苷酸、siRNA分子、RNAi分子、或者結(jié)合mRNA形成三鏈體的寡核苷酸的DNA分子。
26.根據(jù)權利要求24的方法，其中所述組合物含有結(jié)合抑制所述受試者中側(cè)枝形成的蛋白質(zhì)的抗體或者可溶蛋白質(zhì)受體。
27.根據(jù)權利要求26的方法，其中所述組合物含有人抗體或者人可溶蛋白質(zhì)受體。
28.根據(jù)權利要求24的方法，其中所述組合物含有蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)被施用以彌補表3中鑒定的基因編碼的蛋白質(zhì)的損失。
全文摘要
本發(fā)明涉及確定個體患者的“血管型”以預測給定個體是否將天然地發(fā)生好對差的側(cè)枝的可能性。因此，這可以包括得到和提供與側(cè)枝發(fā)育有關的基因列表。具體地，確定個體患者的“血管型”可用于預測給定個體將應答特定血管生成治療發(fā)育好對差側(cè)枝的可能性。從通過實驗研究確定為在組織(其中應答動脈阻塞而正在發(fā)育側(cè)枝)中差異表達的基因的陣列，可以鑒定單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，或者其他后生性改變，如DNA甲基化模式。使用微芯片或者類似的技術測定為確定在側(cè)枝發(fā)育中起作用的所有、或者大多數(shù)基因檢測SNPs和DNA甲基化。此外，可以在諸如外周血細胞的組織中檢測候選基因的任何組合的異常低或者異常高的差別表達。通過存在SNPs，和/或DNA甲基化模式的改變，和/或與一種或多種基因的表達水平有關的差異的存在表明發(fā)育好對差側(cè)枝的傾向的存在。
文檔編號C12Q1/68GK1748037SQ200380109624
公開日2006年3月15日 申請日期2003年12月10日 優(yōu)先權日2002年12月10日
發(fā)明者S·E·埃普斯坦, M·S·伯內(nèi)特 申請人:醫(yī)療星研究院