一種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物的引物、方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，提供一種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物的引物、方法及二者在菊花上的應(yīng)用以及該引物在試劑盒上的應(yīng)用?？焖俸Y選目的基因克隆產(chǎn)物的方法包括：(1)引物設(shè)計(jì)(2)基因克隆擴(kuò)增(3)檢測(cè)引物篩選基因克隆產(chǎn)物，確定克隆產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的基因是否為目的基因。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中，篩選菊花等多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物過(guò)程復(fù)雜、效率低下的問(wèn)題。通過(guò)本發(fā)明提供的檢測(cè)引物，每增加1bp長(zhǎng)度，篩選目的基因的準(zhǔn)確性即提高4倍。例如檢測(cè)引物長(zhǎng)度為18bp，則在原基礎(chǔ)上篩選度提高了418倍。檢測(cè)引物為復(fù)雜基因組基因的分子克隆提供思路，大大提高了基因克隆的效率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物的引物、方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物的引 物、快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物的方法及二者在菊花上的應(yīng)用以及該引物在試 劑盒上的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 菊花（Chrysanthemum morifolium)原產(chǎn)我國(guó)，栽培品種多為六倍體及其非整 倍體，是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，具有觀賞、食用和藥用價(jià)值（李鴻漸， 1993)，距今已有1600多年的栽培歷史。菊花花型、花色、株型等極其豐富，是盆栽、切花和 園林地被應(yīng)用的重要花卉種類(lèi)，具有很高的觀賞和應(yīng)用價(jià)值，在花卉生產(chǎn)中占有十分重要 的地位。
[0003] 菊科作為被子植物第一大科，有1000多個(gè)屬，30000余種，是被子植物最成功的 類(lèi)群之一（強(qiáng)盛，2006)。而菊花作為菊科植物的代表，由毛華菊、野菊和紫花野菊等天 然雜交并經(jīng)人工長(zhǎng)期選育而成（Chen，1957 ;Chen，1985)，是典型的異源六倍體。據(jù)估計(jì)， 50% -70%的被子植物在其進(jìn)化過(guò)程中至少經(jīng)歷過(guò)1次多倍化過(guò)程（Masterson，1994)。然 而，因?yàn)槠浠蚪M經(jīng)過(guò)多次加倍，伴隨著基因數(shù)目的改變而使基因組結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，與原基 因組相比基因表達(dá)水平以及基因組構(gòu)成發(fā)生了顯著的改變，如染色體重組、親本序列的消 除、基因沉默、同源異型轉(zhuǎn)換等（莊勇等，2006)，產(chǎn)生大量的同源基因以及基因拷貝數(shù)增 力口，基因組內(nèi)的不等交換、反轉(zhuǎn)錄插入、大規(guī)模的染色體片段重復(fù)和全基因組重復(fù)等多種方 式形成基因重復(fù)（Zhang，2003)，導(dǎo)致基因冗余、原有基因亞功能化甚至沉默，大大增加了克 隆基因的難度。
[0004] 基因克隆是開(kāi)展分子育種的關(guān)鍵。為了克服基因克隆的難題，多種基因克隆技術(shù) 應(yīng)運(yùn)而生，代表性方法主要有：根據(jù)現(xiàn)有基因序列的同源克隆、根據(jù)基因表達(dá)產(chǎn)物的功能克 隆（Bogan等2003)、根據(jù)連鎖圖譜的定位克隆或圖位克?。ˋrondel等，1992)以及根據(jù)表 型差異的表型克?。↗onsson和Weissman，1992)。近些年隨著基因克隆技術(shù)的發(fā)展，克隆的 基因數(shù)逐年呈指數(shù)增長(zhǎng)，但各種方法都各有其局限性，所以人們總是期待基因克隆技術(shù)不 斷發(fā)展和完善（陳喜文等，2006)。有報(bào)道稱(chēng)，菊科植物即使是二倍體也經(jīng)歷了至少三次染 色體加倍的過(guò)程，而菊花作為異源六倍體，擁有大量的重復(fù)基因，進(jìn)行基因克隆時(shí)，經(jīng)常會(huì) 產(chǎn)生大量的非特異性擴(kuò)增，嚴(yán)重限制了基因克隆的效率。因此如何提高克隆的效率，成為了 菊花基因克隆的關(guān)鍵問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中，篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物尤其是菊花目 的基因克隆產(chǎn)物過(guò)程復(fù)雜，效率低下的問(wèn)題，提供一種基于檢測(cè)引物快速篩選目的基因克 隆產(chǎn)物的引物和方法。
[0006] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 1.本發(fā)明提供一種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物的引物：當(dāng)基因片段 進(jìn)行5' RACE反向擴(kuò)增時(shí)，該引物包括反轉(zhuǎn)錄引物、特異性擴(kuò)增引物和正、反向檢測(cè)引物，引 物長(zhǎng)度分別為16_30bp，Tm 55-65°C，正向和反向檢測(cè)引物相距100_200bp，檢測(cè)引物在特 異性擴(kuò)增引物上游；
[0008] 當(dāng)基因片段進(jìn)行3' RACE正向擴(kuò)增時(shí)，該引物包括特異性擴(kuò)增引物和正、反向檢測(cè) 引物，引物長(zhǎng)度分別為16_30bp，Tm 55-65°C，正向和反向檢測(cè)引物相距100_200bp，檢測(cè)引 物在特異性擴(kuò)增引物下游；
[0009] 當(dāng)基因片段以中間片段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，該引物包括特異性擴(kuò)增引物和正、反向檢測(cè) 引物，引物長(zhǎng)度分別為16_30bp，Tm 55-65°C，正向和反向檢測(cè)引物相距100_200bp，正向檢 測(cè)引物在特異擴(kuò)增引物的下游，反向檢測(cè)引物在特異擴(kuò)增引物的上游，正向特異性擴(kuò)增引 物與正向檢測(cè)引物相距50-100bp，反向特異性擴(kuò)增引物與反向檢測(cè)引物相距50-100bp。
[0010] 2.本發(fā)明提供一種用于快速篩選菊花基因克隆產(chǎn)物的引物，當(dāng)基因片段進(jìn)行 5' RACE反向擴(kuò)增時(shí)，該引物包括反轉(zhuǎn)錄引物、特異性擴(kuò)增引物和正、反向檢測(cè)引物，引物長(zhǎng) 度分別為16_30bp，Tm 55-65°C，正向和反向檢測(cè)引物相距100_200bp，檢測(cè)引物在特異性 擴(kuò)增引物之一 GSP5' -3的上游；
[0011] 反轉(zhuǎn)錄引物為：
[0012] GSP5' -1 :如 SEQ ID N0. 5 所示；
[0013] 特異性擴(kuò)增引物為：
[0014] GSP5' -2 :如 SEQ ID N0. 6 所示
[0015] GSP5' -3 :如 SEQ ID NO. 7 所示；
[0016] 檢測(cè)引物為：
[0017] 5, RACE JC-F :如 SEQ ID N0. 3 所示
[0018] 5' RACE JC-R :如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0019] 當(dāng)基因片段進(jìn)行3' RACE正向擴(kuò)增時(shí)，該引物包括特異性擴(kuò)增引物和正、反向檢測(cè) 引物，引物長(zhǎng)度分別為16_30bp，Tm 55-65°C，正向和反向檢測(cè)引物相距100_200bp，檢測(cè)引 物在特異性擴(kuò)增引物之一 GSP3' -3的下游；
[0020] 特異擴(kuò)增引物為：
[0021] GSP3' -1 :如 SEQ ID N0. 8 所示
[0022] GSP3' -2 :如 SEQ ID Ν0· 9 所示
[0023] GSP3' -3 :如 SEQ ID Ν0· 10 所示；
[0024] 檢測(cè)引物為：
[0025] 3' RACE JC-F :如 SEQ ID N0. 11 所示
[0026] 3, RACE JC-R :如 SEQ ID Ν0· 12 所示。
[0027] 當(dāng)基因片段以中間片段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，該引物包括特異性擴(kuò)增引物和正、反向檢測(cè) 引物，引物長(zhǎng)度分別為16_30bp，Tm 55-65°C，正向和反向檢測(cè)引物相距100_200bp，正向 檢測(cè)引物在正向特異擴(kuò)增引物的下游，反向檢測(cè)引物在反向特異擴(kuò)增引物的上游，正向特 異性擴(kuò)增引物與正向檢測(cè)引物相距50-100bp，反向特異性擴(kuò)增引物與反向檢測(cè)引物相距 50-100bp ；
[0028] 特異擴(kuò)增引物為：
[0029] 中間 GSP-F :如 SEQ ID NO. 13 所示
[0030] 中間 GSP-R :如 SEQ ID NO. 14 所示；
[0031] 檢測(cè)引物為：
[0032] 中間 JC-F :如 SEQ ID NO. 15 所示
[0033] 中間 JC-R :如 SEQ ID NO. 16 所示。
[0034] 3. -種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物的方法，包括如下步驟：
[0035] (1)弓丨物設(shè)計(jì)：當(dāng)基因片段進(jìn)行5'RACE反向擴(kuò)增時(shí)，使用primer premier 5. 0軟 件設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物、檢測(cè)引物和接頭引物，反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物和檢 測(cè)引物設(shè)計(jì)參數(shù)分別為引物長(zhǎng)度16_30bp，Tm 55-65°C，反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物和檢測(cè) 引物都根據(jù)已知中間片段設(shè)計(jì)，檢測(cè)引物在特異擴(kuò)增引物的上游，正向和反向檢測(cè)引物相 距 100-200bp ;
[0036] 當(dāng)基因片段進(jìn)行3' RACE正向擴(kuò)增時(shí)，使用primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)特 異擴(kuò)增引物、檢測(cè)引物和接頭引物，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物設(shè)計(jì)參數(shù)分別為引物長(zhǎng)度 16-30bp，Tm55-65°C，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物都根據(jù)已知中間片段設(shè)計(jì)，檢測(cè)引物在特異 擴(kuò)增引物的下游，正向和反向檢測(cè)引物大概相距100_200bp ;
[0037] 當(dāng)基因片段以中間片段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，使用primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)特異 擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物設(shè)計(jì)參數(shù)分別為引物長(zhǎng)度16_30bp，Tm 55-65°C，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物都根據(jù)已知中間片段設(shè)計(jì)，正向檢測(cè)引物在上一步設(shè)計(jì) 好的特異擴(kuò)增引物的下游，反向檢測(cè)引物在上一步設(shè)計(jì)好的特異擴(kuò)增引物的下游，正向特 異性擴(kuò)增引物與正向檢測(cè)引物相距50-100bp，反向特異性擴(kuò)增引物與反向檢測(cè)引物相距 50-100bp ；
[0038] (2)基因克隆擴(kuò)增：提取多倍體植物葉片RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用預(yù)先設(shè)計(jì) 好的特異性擴(kuò)增引物和接頭引物或者特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電 泳進(jìn)行片段大小選擇，切膠回收，利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收PCR凝膠產(chǎn)物；
[0039] (3)檢測(cè)引物篩選基因克隆產(chǎn)物：將步驟2)回收的PCR凝膠產(chǎn)物利用設(shè)計(jì)好的檢 測(cè)引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇；
[0040] 選擇結(jié)果如下：當(dāng)基因克隆產(chǎn)物為非特異性片段時(shí)，步驟2)中PCR凝膠產(chǎn)物經(jīng)過(guò) 步驟3)后不能跑出電泳條帶；基因克隆產(chǎn)物為特異性片段時(shí)，步驟2)中的PCR凝膠產(chǎn)物經(jīng) 過(guò)步驟3)后能跑出大小為100-200bp的條帶。
[0041] 4.本發(fā)明還提供一種快速篩選菊花目的基因克隆產(chǎn)物的方法，包括如下步驟：
[0042] (1)弓丨物設(shè)計(jì)：當(dāng)基因片段進(jìn)行5'RACE反向擴(kuò)增時(shí)，使用primer premier 5. 0軟 件設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物、檢測(cè)引物和接頭引物，反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物和檢 測(cè)引物設(shè)計(jì)參數(shù)分別為引物長(zhǎng)度16_30bp，Tm 55-65°C，反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物和檢測(cè) 引物都根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)，檢測(cè)引物在特異擴(kuò)增引物之一 GSP5' -3的上游，正向和反向檢 測(cè)引物相距100_200bp ;
[0043] 反轉(zhuǎn)錄引物為：
[0044] GSP5' -1 :如 SEQ ID N0. 5 所示；
[0045] 特異性擴(kuò)增引物為：
[0046] GSP5, -2 :如 SEQ ID N0. 6 所示
[0047] GSP5' -3 :如 SEQ ID NO. 7 所示；
[0048] 檢測(cè)引物為：
[0049] 5' RACE JC-F :如 SEQ ID NO. 3 所示
[0050] 5' RACE JC-R :如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0051] 當(dāng)基因片段進(jìn)行3' RACE正向擴(kuò)增時(shí)，使用primer premier 5· 0軟件設(shè)計(jì)特 異擴(kuò)增引物、檢測(cè)引物和接頭引物，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物設(shè)計(jì)參數(shù)分別為引物長(zhǎng)度 16-30bp，Tm55-65°C，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物都根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)，檢測(cè)引物在特異擴(kuò)增 引物之一 GSP3' -3的下游，正向和反向檢測(cè)引物大概相距100-200bp ;
[0052] 特異擴(kuò)增引物為：
[0053] GSP3, -1 :如 SEQ ID N0. 8 所示
[0054] GSP3' -2 :如 SEQ ID NO. 9 所示
[0055] GSP3' -3 :如 SEQ ID Ν0· 10 所示；
[0056] 檢測(cè)引物為：
[0057] 3' RACE JC-F :如 SEQ ID N0. 11 所示
[0058] 3' RACE JC-R :如 SEQ ID Ν0· 12 所示。
[0059] 當(dāng)基因片段以中間片段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，使用primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)特異 擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物設(shè)計(jì)參數(shù)分別為引物長(zhǎng)度16_30bp，Tm 55-65°C，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物都根據(jù)已知中間片段設(shè)計(jì)，正向檢測(cè)引物在上一步設(shè)計(jì) 好的正向特異擴(kuò)增引物的下游，反向檢測(cè)引物在上一步設(shè)計(jì)好的反向特異擴(kuò)增引物的下 游，正向特異性擴(kuò)增引物與正向檢測(cè)引物相距50-100bp，反向特異性擴(kuò)增引物與反向檢測(cè) 引物相距50-100bp ;
[0060] 特異擴(kuò)增引物為：
[0061] 中間 GSP-F :如 SEQ ID N0. 13 所示
[0062] 中間 GSP-R :如 SEQ ID Ν0· 14 所示；
[0063] 檢測(cè)引物為：
[0064] 中間 JC-F :如 SEQ ID N0. 15 所示
[0065] 中間 JC-R :如 SEQ ID Ν0· 16 所示。
[0066] (2)基因克隆擴(kuò)增：提取菊花植物葉片RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用預(yù)先設(shè)計(jì)好 的特異性擴(kuò)增引物和接頭引物或者特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳 進(jìn)行片段大小選擇，切膠回收，利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收PCR凝膠產(chǎn)物；
[0067] (3)檢測(cè)引物篩選基因克隆產(chǎn)物：將步驟2)回收的PCR產(chǎn)物利用設(shè)計(jì)好的檢測(cè)引 物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇；
[0068] 選擇結(jié)果如下：當(dāng)基因克隆產(chǎn)物為非特異性片段時(shí)，步驟2)中PCR凝膠產(chǎn)物經(jīng)過(guò) 步驟3)后不能跑出電泳條帶；基因克隆產(chǎn)物為特異性片段時(shí)，步驟2)中的PCR凝膠產(chǎn)物經(jīng) 過(guò)步驟3)后能跑出大小為100-200bp的條帶。
[0069] 接頭引物設(shè)計(jì)按照一般的設(shè)計(jì)原則，該方法中接頭引物為：
[0070] 5' RACE :接頭引物分別為：
[0071] AAP 序列：GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG ;
[0072] AUAP 序列：GGCCACGCGTCGACTAGTAC ;
[0073] 3' RACE :接頭引物為：
[0074] AP 序列：CTGATCTAGAGGTACCGGATCC
[0075] 5.上述1提供的引物在快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物試劑盒中的應(yīng)用。
[0076] 6.上述2提供的引物在快速篩選菊花目的基因克隆產(chǎn)物試劑盒中的應(yīng)用。
[0077] 7.本發(fā)明還提供一種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物的試劑盒，其包括上 述1提供的引物。
[0078] 8.本發(fā)明還提供一種快速篩選菊花目的基因克隆產(chǎn)物的試劑盒，其包括上述2提 供的引物。
[0079] 本發(fā)明有益效果：
[0080] 1.本發(fā)明利用檢測(cè)引物，能夠快速篩選目的基因，提高了基因的準(zhǔn)確性。
[0081] 2.本發(fā)明充分利用已知片段設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物，結(jié)果真實(shí)可靠。
[0082] 3.每增加 lbp檢測(cè)引物的長(zhǎng)度，篩選目的基因的準(zhǔn)確性即提高4倍。例如檢測(cè)引 物長(zhǎng)度為18bp，則在原基礎(chǔ)上篩選度提高了 418倍。
[0083] 4.檢測(cè)引物為復(fù)雜基因組基因的分子克隆提供思路，大大提高了基因克隆的效 率。
[0084] 5.檢測(cè)引物排除了非目的基因的干擾，節(jié)約時(shí)間，降低了測(cè)序成本，提高了經(jīng)濟(jì) 效益，對(duì)指導(dǎo)異源多倍體植物基因克隆尤其是菊花基因克隆具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意 義。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0085] 圖1基因片段進(jìn)行5' RACE擴(kuò)增原理圖和PCR擴(kuò)增條帶
[0086] 1 :基因片段進(jìn)行5' RACE反向擴(kuò)增原理圖：AAP、AUAP :接頭引物；JC-F、JC-R :正反 向檢測(cè)引物；GSP5' -1 :反轉(zhuǎn)錄引物；GSP5' -2、GSP5' -3 :2次巢式PCR時(shí)分別使用的特異擴(kuò) 增引物；
[0087] 2 :基因片段進(jìn)行5' RACE反向擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳圖；M :Marker DNA，大小為 2000bp ；
[0088] 3 :回收后的電泳條帶經(jīng)檢測(cè)引物PCR后的瓊脂糖凝膠電泳圖；M :Marker DNA，大 小為 2000bp ;
[0089] 4 :當(dāng)基因片段進(jìn)行5' RACE反向擴(kuò)增時(shí)，檢測(cè)引物擴(kuò)增后的條帶的測(cè)序結(jié)果。
[0090] 圖2基因片段進(jìn)行3' RACE擴(kuò)增原理圖和PCR擴(kuò)增條帶
[0091] 1 :基因片段進(jìn)行3' RACE反向擴(kuò)增原理圖：AP :接頭引物；JC-F、JC-R :正反向檢測(cè) 引物；GSP3' -1、GSP3' -2、GSP3' -3 :三次擴(kuò)增時(shí)使用的特異擴(kuò)增引物；
[0092] 2 :基因片段進(jìn)行3' RACE正向擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳圖；M :Marker DNA，大小為 5000bp ；
[0093] 3 :回收后的電泳條帶經(jīng)檢測(cè)引物PCR后的瓊脂糖凝膠電泳圖；M :Marker DNA，大 小為 2000bp ;
[0094] 4 :基因片段進(jìn)行3' RACE反向擴(kuò)增時(shí)，檢測(cè)引物擴(kuò)增后條帶的測(cè)序結(jié)果。
[0095] 圖3基因片段以中間片段擴(kuò)增原理圖和PCR擴(kuò)增條帶
[0096] 1 :基因片段以中間片段擴(kuò)增原理圖：JC-F、JC-R :正反向檢測(cè)引物；GSP-F、GSP_R、 擴(kuò)增時(shí)使用的特異擴(kuò)增引物；
[0097] 2 :基因片段以中間片段進(jìn)行擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳圖；M Marker DNA，大小為 2000bp ；
[0098] 3 :回收后的電泳條帶經(jīng)檢測(cè)引物PCR后的瓊脂糖凝膠電泳圖；M :Marker DNA，大 小為 2000bp ;
[0099] 4 :基因片段以中間片段擴(kuò)增時(shí)，檢測(cè)引物擴(kuò)增后的條帶測(cè)序結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0100] 下述實(shí)施例中所用方法若無(wú)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域慣用的技術(shù)手段，所用的試劑、 材料，如無(wú)特殊說(shuō)明均可通過(guò)商業(yè)途徑得到。
[0101] 實(shí)施例1
[0102] 基因片段進(jìn)行5' RACE反向擴(kuò)增
[0103] 1)檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)
[0104] 使用primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物、檢測(cè)引物和接頭 引物，默認(rèn)安裝在C盤(pán)根目錄下。
[0105] 反轉(zhuǎn)錄引物為：
[0106] GSP5' -1 :如 SEQ ID N0. 5 所示；
[0107] 特異性擴(kuò)增引物為：
[0108] GSP5, -2 :如 SEQ ID N0. 6 所示
[0109] GSP5' -3 :如 SEQ ID NO. 7 所示；
[0110] 檢測(cè)引物對(duì)為：
[0111] 5' RACE JC-F 如 SEQ ID N0. 3 所示
[0112] 5' RACE JC-R 如 SEQ ID NO. 4 所示；
[0113] 接頭引物為：
[0114] AAP 序列：GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG ;
[0115] AUAP 序列：GGCCACGCGTCGACTAGTAC
[0116] 反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物都根據(jù)已知基因片段設(shè)計(jì)，檢測(cè)引物在特 異擴(kuò)增引物之一 GSP5' -3的上游，正向和反向檢測(cè)引物相距200bp，如圖1-1所示。
[0117] 2)PCR產(chǎn)物的獲得
[0118] 采集菊花葉片，用錫箔紙包裹并置于液氮罐里，速凍后置于_80°C冰箱內(nèi)保存。使 用Trizol試劑提取菊花的總RNA。利用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑處理總RNA得到cDNA。
[0119] 反轉(zhuǎn)錄過(guò)程如下所述：
[0120] a.在蛋白酶K處理的PCR管中配制下列混合液：1 μ L RNA、2y L lOmmol · I^GSPS' -1、9μ L RNase Free H20 ;
[0121] b. 70°C保溫lOmin后迅速置于冰上冰浴2min以上；
[0122] c.在PCR管中配置下列反轉(zhuǎn)錄溶液：4yL 5XM-MLV Buffer、lyL lOmmol ·?-1(1ΝΤΡ8、0·5μ? 40U RNase Inhibitor、?！?8yL 200U RNase M-MLV(RHase Η)、 1. 7 μ L RNase Free H20 ；
[0123] d. 42°C延伸 60min，70°C保溫 15min，冰上冷卻得到 cDNA。
[0124] 使用 TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver. 4· 0 試劑盒純化 cDNA產(chǎn)物。對(duì)cDNA純化產(chǎn)物進(jìn)行TdT加尾，TdT加尾為24 μ L的反應(yīng)體系，其中包括6. 5 μ 1 RNase Free Η20、5·0μ1 5XTail Buffer、2.5yl 2mM dCTP、10yl 純化 cDNA。將上述反應(yīng) 液混合均勻，94°C保溫2-3min后冰浴lmin ;稍離心，置于冰上；加入1 μ 1 TdT，稍混勻，37°C 保溫lOmin ;然后65°C保溫lOmin使TdT受熱失活，稍離心，置于冰上。
[0125] 將加尾的cDNA利用特異引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系采用25 μ L的反 應(yīng)體系，其中包括 1 μ L純化cDNA，L 5μ L 25mmol ?LHMg&Jy L 2. 5mmol ·ΓΜΝΤΡ8、(λ 2μ L 5U TaqDNA聚合酶、lyL lOmmol.I^GSPS，-〗和 lyL lOmmol.I^AAPJ.SyL 10XPCR buffer和16 μ L無(wú)菌去離子水。
[0126] PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性2min ;然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)：94°C變性30s，55°C復(fù)性 30s，72°C延伸 2min，最后 72°C延伸 lOmin。
[0127] 將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍，以稀釋產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪巢式PCR擴(kuò)增。 PCR擴(kuò)增體系采用25 μ L的反應(yīng)體系，其中包括1 μ L模板cDNA，1. 5 μ L 25mmol · Llg' 2 μ L2. 5mmol · I^dNTPs、?！?2 μ L 5U TaqDNA 聚合酶、1 μ L lOmmol · L-1GSP5, -3 和 1 μ L lOmmol · I^AUAPJ.SyL 10XPCR buffer 和 16yL 無(wú)菌去離子水。
[0128] PCR反應(yīng)程序和瓊脂糖電泳程序同上，使用紫外凝膠成像儀檢測(cè)，如圖1-2所示， 共得到A、B、C、D四組條帶，如果跑出來(lái)的條帶比已經(jīng)確定的中間片段長(zhǎng)度短或者相近，可 以排除，從而進(jìn)行片段大小選擇，切膠，使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收PCR凝膠產(chǎn) 物。
[0129] 3)檢測(cè)引物篩選目的基因
[0130] 將步驟2)中回收的四組A、B、C、D的PCR凝膠產(chǎn)物利用檢測(cè)引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò) 増，PCR鑒定體系采用25 μ L的反應(yīng)體系，其中包括1 μ L模板cDNA，1. 5 μ L 25mmol ?LdMg' 2yL S.Smmol.rMNTPsJJyL 5U TaqDNA 聚合酶、lyL lOmmol·!/1 檢測(cè)引物 JC-F、 JC-R、2. 5yL 10XPCR buffer和16yL無(wú)菌去離子水。PCR反應(yīng)程序和瓊脂糖電泳程序同 步驟2)，使用紫外凝膠成像儀檢測(cè)，如圖1-3所示。進(jìn)行片段大小選擇，若第一次PCR凝膠 產(chǎn)物未跑出條帶，則為非特異性擴(kuò)增片段，圖1-3中A、B、D三組未跑出條帶，說(shuō)明A、B、D為 非特異性擴(kuò)增片段；若經(jīng)過(guò)檢測(cè)引物對(duì)PCR電泳后具有預(yù)測(cè)大小片段的條帶，則說(shuō)明該條 帶為目的基因片段。如圖1-3中，第一次PCR凝膠產(chǎn)物跑出條帶大小200bp左右，即C帶，確 定該片段為目的基因片段。將步驟2)切膠獲得的C帶PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序，如圖1-4所示， 確定其便為目的條帶。
[0131] 實(shí)施例2
[0132] 基因片段進(jìn)行3' RACE正向擴(kuò)增
[0133] 1)檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)
[0134] 使用primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，默認(rèn)安裝在C盤(pán)根目錄下。特異擴(kuò) 增引物為：
[0135] GSP3' -1 :如 SEQ ID N0. 8 所示
[0136] GSP3' -2 :如 SEQ ID Ν0· 9 所示
[0137] GSP3' -3 :如 SEQ ID Ν0· 10 所示；
[0138] 檢測(cè)引物對(duì)為：
[0139] 3, RACE JC-F 如 SEQ ID NO. 11 所示
[0140] 3, RACE JC-R 如 SEQ ID NO. 12 所示；
[0141] 接頭引物為：
[0142] AP :CTGATCTAGAGGTACCGGATCC
[0143] 特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物都根據(jù)已知基因片段設(shè)計(jì)，檢測(cè)引物在上一步設(shè)計(jì)好的 特異擴(kuò)增引物之一 GSP3' -3的下游，正向和反向檢測(cè)引物相距200bp，如圖2-1所示。
[0144] 2)PCR產(chǎn)物的獲得
[0145] 采集菊花葉片，用錫箔紙包裹并置于液氮罐里，速凍后置于-80°C冰箱內(nèi)保存。使 用Trizol試劑提取菊花的總RNA。利用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑處理總RNA得到cDNA ;
[0146] 反轉(zhuǎn)錄過(guò)程如下所述：
[0147] a.在蛋白酶K處理的PCR管中配制下列混合液：1 μ L RNA、2y L 50mmol · L_1dT-AP>9u L RNase Free H20 ；
[0148] dT-AP 序列：CTGATCTAGAGGTACCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTT
[0149] b. 70°C保溫lOmin后迅速在冰上急冷2min以上；
[0150] c.在PCR管中配置下列反轉(zhuǎn)錄溶液：4yL 5XM-MLV Buffer、lyL lOmmol ·?-1(1ΝΤΡ8、0·5μ? 40U RNase Inhibitor、。· 8yL 200U RNase M-MLV(RHase Η)、 1. 7 μ L RNase Free H20 ；
[0151] d. 42Γ延伸 60min，7(TC保溫 15min，冰上冷卻得到 cDNA。
[0152] 將得到的cDNA利用特異引物GSP3' -1和接頭引物AP進(jìn)行第一次巢式PCR擴(kuò)增。 PCR擴(kuò)增體系采用25 μ L的反應(yīng)體系，其中包括1 μ L模板cDNA，1. 5 μ L 25mmol · Llg' 2 μ L2. 5mmol · I^dNTPs、?！?2 μ L 5U TaqDNA 聚合酶、1 μ L lOmmol · L-1GSP3, -1 和 1 μ L lOmmol · Γ1 接頭引物 AP、2.5yL 10XPCR buffer 和 16yL 無(wú)菌去離子水。
[0153] PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)：94°C變性30s，55°C復(fù)性 30s，72°C延伸 2min，最后 72°C延伸 lOmin。
[0154] 以第一次PCR產(chǎn)物稀釋100倍為模板，利用特異引物GSP3'_2和接頭引物AP進(jìn)行 第二次巢式PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及程序同上。
[0155] 以第二次PCR產(chǎn)物稀釋100倍為模板，利用特異引物GSP3'-3和接頭引物AP進(jìn)行 第三次巢式PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及程序同上。
[0156] 瓊脂糖電泳程序同上，使用紫外凝膠成像儀檢測(cè)，如圖2-2所示，共得到A、B兩組 條帶，切膠，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收PCR凝膠產(chǎn)物。
[0157] 3)檢測(cè)引物篩選目的基因
[0158] 將步驟2)中回收的兩組A、B的PCR產(chǎn)物利用檢測(cè)引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)増，PCR 鑒定體系采用25yL的反應(yīng)體系，其中包括lyL模板cDNA，1.5yL 25mmol ?Llg' Syl^.Smmol'I^dNTPs'OJyL 5U TaqDNA 聚合酶、lyL lOmmol·!/1 檢測(cè)引物 JC-F 和 JC-R、2. 5yL 10XPCR buffer和16yL無(wú)菌去離子水。PCR反應(yīng)程序和瓊脂糖電泳程序同 步驟2)，使用紫外凝膠成像儀檢測(cè)，如圖2-3所示。進(jìn)行片段大小選擇，若第一次PCR凝膠 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)檢測(cè)引物擴(kuò)增后未跑出條帶，則為非特異性擴(kuò)增片段，圖2-3中A未跑出條帶，說(shuō) 明A為非特異性擴(kuò)增片段；若經(jīng)過(guò)檢測(cè)引物擴(kuò)增后跑出條帶，則說(shuō)明該條帶為目的基因片 段。如圖2-3中，第一次PCR凝膠產(chǎn)物經(jīng)過(guò)檢測(cè)引物跑出條帶大小200bp，即B帶，確定該片 段為目的基因片段。將步驟2)切膠獲得的B帶PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序，確定其便為目的條帶， 如圖2-4所示。
[0159] 實(shí)施例3
[0160] 基因片段進(jìn)行中間片段的雙向擴(kuò)增
[0161] 1)檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)
[0162] 使用primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，默認(rèn)安裝在C盤(pán)根目錄下。如圖1 所示，特異擴(kuò)增引物為：
[0163] 中間 GSP-F :如 SEQ ID N0. 13 所示
[0164] 中間 GSP-R :如 SEQ ID NO. 14 所示；
[0165] 檢測(cè)引物對(duì)為：
[0166] 中間 JC-F 如 SEQ ID N0. 15 所示
[0167] 中間 JC-R 如 SEQ ID NO. 16 所示；
[0168] 特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物都根據(jù)已知基因片段設(shè)計(jì)，正向和反向檢測(cè)引物相距 200bp，正向檢測(cè)引物在正向特異擴(kuò)增引物的下游，反向檢測(cè)引物在反向特異擴(kuò)增引物的上 游，正向特異性擴(kuò)增引物與正向檢測(cè)引物相距50-100bp，反向特異性擴(kuò)增引物與反向檢測(cè) 引物相距50-100bp，如圖3-1所示。
[0169] 2)PCR產(chǎn)物的獲得
[0170] 采集菊花葉片，用錫箔紙包裹并置于液氮罐里，速凍后置于_80°C冰箱內(nèi)保存。使 用Trizol試劑提取菊花的總RNA。利用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑處理總RNA得到cDNA ;
[0171] 反轉(zhuǎn)錄過(guò)程如下所述：
[0172] a.在蛋白酶K處理的PCR管中配制下列混合液：1 μ L RNA、2y L 50mmol · L ^ligo(dT)18Primer>9μ L RNase Free H20 ；
[0173] b. 70°C保溫lOmin后迅速在冰上急冷2min以上
[0174] c.在PCR管中配置下列反轉(zhuǎn)錄溶液：4yL 5XM-MLV Buffer、lyL lOmmol ·?-1(1ΝΤΡ8、0·5μ? 40U RNase Inhibitor、?！?8yL 200U RNase M-MLV(RHase Η)、 1. 7 μ L RNase Free H20
[0175] d. 42Γ延伸 60min，7(TC保溫 15min，冰上冷卻得到 cDNA。
[0176] 進(jìn)行內(nèi)參檢測(cè)分析cDNA質(zhì)量。內(nèi)參檢測(cè)的PCR鑒定體系采用25μ L的反應(yīng)體 系，其中包括 1 μ L 模板 cDNA，1. 5 μ L 25mmol · L-1Mg2+、2 μ L 2. 5mmol · I/MNTPs、?！?2 μ L 5U TaqDNA 聚合酶、lyL lOmmol·!/1 內(nèi)參引物 Actin-F 和 Actin-R、2.5yL 10XPCR buffer 和16 μ L無(wú)菌去離子水。
[0177] 其中，Actin-F :序列如 SEQ ID Ν0· 1 所示；
[0178] Actin-R :序列如 SEQ ID Ν0· 2 所示；
[0179] 反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)：94°C變性30s，55°C復(fù)性 30s，72°C延伸30s，最后72°C延伸lOmin;反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物加入2yL loading buffer， 以2000bp DNA marker為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，采用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為 IXTAE，180V穩(wěn)壓電泳20min左右，至loading buffer移到凝膠下部1/2到2/3處電泳 結(jié)束，使用紫外凝膠成像儀檢測(cè)是否有條帶跑出，若有500bp左右的擴(kuò)增條帶跑出，帶型穩(wěn) 定，則得到質(zhì)量好的cDNA。
[0180] 內(nèi)參檢測(cè)結(jié)束，選擇質(zhì)量好的cDNA。將得到的質(zhì)量好的cDNA利用特異引物 GSP-F、GSP-R進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系采用25 μ L的反應(yīng)體系，其中包括1 μ L模 板 cDNA，1. 5 μ L 25mmol 噸^%'〗μ L 2. 5mmol ?I^dNTPs、。· 2 μ L 5U TaqDNA 聚合酶、1 μ L lOmmol · Γ1 特異引物 GSP-F 和 GSP-R、2.5yL 10XPCR buffer 和 16yL 無(wú)菌去離子水。
[0181] PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)：94°C變性30s，55°C復(fù)性 30s，72°C延伸 2min，最后 72°C延伸 lOmin。
[0182] 瓊脂糖電泳程序同上，使用紫外凝膠成像儀檢測(cè)，如圖3-2所示，共得到A、B兩組 條帶，切膠，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收PCR凝膠產(chǎn)物。
[0183] 3)檢測(cè)引物篩選目的基因
[0184] 將步驟2)中回收的兩組A、B的PCR凝膠產(chǎn)物利用檢測(cè)引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)増， PCR鑒定體系采用25 μ L的反應(yīng)體系，其中包括1 μ L模板cDNA，1. 5 μ L 25mmol · Llg2"、 Syl^.Smmol'I^dNTPs'OJyL 5U TaqDNA 聚合酶、lyL lOmmol·!/1 檢測(cè)引物 JC-F 和 JC-R、2. 5yL 10XPCR buffer和16yL無(wú)菌去離子水。PCR反應(yīng)程序和瓊脂糖電泳程序同 步驟2)，使用紫外凝膠成像儀檢測(cè)，如圖3-3所示。進(jìn)行片段大小選擇，若第一次PCR凝膠 產(chǎn)物未跑出條帶，則為非特異性擴(kuò)增片段，圖3-3中A未跑出條帶，說(shuō)明A為非特異性擴(kuò)增 片段；若經(jīng)過(guò)檢測(cè)引物對(duì)PCR電泳后跑出相應(yīng)條帶，則說(shuō)明該條帶為目的基因片段。如圖 3-3中，第一次PCR凝膠產(chǎn)物跑出條帶大小200bp，即B帶，確定該片段為目的基因片段。將 步驟2)切膠獲得的B帶PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序，確定其便為目的條帶，如圖3-4所述。
[0185] 可以知道，上述實(shí)施例僅為了說(shuō)明發(fā)明原理而采用的示例性實(shí)施方式，然而本發(fā) 明不僅限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)情況下，可以做出各種改進(jìn)和變更，這 些改進(jìn)和變更也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物的引物，其特征在于：當(dāng)基因片段進(jìn)行 5' RACE反向擴(kuò)增時(shí)，該引物包括反轉(zhuǎn)錄引物、特異性擴(kuò)增引物和正、反向檢測(cè)引物，引物長(zhǎng) 度分別為16_30bp，Tm 55-65°C，正向和反向檢測(cè)引物相距100_200bp，檢測(cè)引物在特異性 擴(kuò)增引物上游； 當(dāng)基因片段進(jìn)行3' RACE正向擴(kuò)增時(shí)，該引物包括特異性擴(kuò)增引物和正、反向檢測(cè)引 物，引物長(zhǎng)度分別為16_30bp，Tm 55-65°C，正向和反向檢測(cè)引物相距100_200bp，檢測(cè)引物 在特異性擴(kuò)增引物下游； 當(dāng)基因片段以中間片段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，該引物包括特異性擴(kuò)增引物和正、反向檢測(cè)引 物，引物長(zhǎng)度分別為16_30bp，Tm 55-65°C，正向和反向檢測(cè)引物相距100_200bp，正向檢 測(cè)引物在正向特異擴(kuò)增引物的下游，反向檢測(cè)引物在反向特異擴(kuò)增引物的上游，正向特 異性擴(kuò)增引物與正向檢測(cè)引物相距50-100bp，反向特異性擴(kuò)增引物與反向檢測(cè)引物相距 50_100bp。
2. -種快速篩選菊花目的基因克隆產(chǎn)物的引物，其特征在于： 當(dāng)基因片段進(jìn)行5' RACE反向擴(kuò)增時(shí)，該引物包括反轉(zhuǎn)錄引物、特異性擴(kuò)增引物和 正、反向檢測(cè)引物，引物長(zhǎng)度分別為16_30bp，Tm 55-65°C，正向和反向檢測(cè)引物相距 100-200bp，檢測(cè)引物在特異性擴(kuò)增引物之一 GSP5' -3上游； 反轉(zhuǎn)錄引物為： GSP5' -1 :如 SEQ ID NO. 5 所示； 特異性擴(kuò)增引物為： GSP5' -2 :如 SEQ ID NO. 6 所示 GSP5' -3 :如 SEQ ID NO. 7 所示； 檢測(cè)引物為： 5' RACE JC-F :如 SEQ ID NO. 3 所示 5' RACE JC-R :如 SEQ ID NO. 4 所示； 當(dāng)基因片段進(jìn)行3' RACE正向擴(kuò)增時(shí)，該引物包括特異性擴(kuò)增引物和正、反向檢測(cè)引 物，引物長(zhǎng)度分別為16_30bp，Tm 55-65°C，正向和反向檢測(cè)引物相距100_200bp，檢測(cè)引物 在特異性擴(kuò)增引物之一 GSP3' -3下游； 特異擴(kuò)增引物為： GSP3' -1 :如 SEQ ID NO. 8 所示 GSP3' -2 :如 SEQ ID NO. 9 所示 GSP3' -3 :如 SEQ ID NO. 10 所示； 檢測(cè)引物為： 3' RACE JC-F :如 SEQ ID NO. 11 所示 3' RACE JC-R :如 SEQ ID NO. 12 所示； 當(dāng)基因片段以中間片段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，該引物包括特異性擴(kuò)增引物和正、反向檢測(cè)引 物，引物長(zhǎng)度分別為16_30bp，Tm 55-65°C，正向和反向檢測(cè)引物相距100_200bp，正向檢 測(cè)引物在正向特異擴(kuò)增引物的下游，反向檢測(cè)引物在反向特異擴(kuò)增引物的上游，正向特 異性擴(kuò)增引物與正向檢測(cè)引物相距50-100b p，反向特異性擴(kuò)增引物與反向檢測(cè)引物相距 50-100bp ； 特異擴(kuò)增引物為： 中間 GSP-F :如 SEQ ID NO. 13 所示 中間 GSP-R :如 SEQ ID NO. 14 所示； 檢測(cè)引物為： 中間JC-F :如SEQ ID NO. 15所示 中間 JC-R :如 SEQ ID NO. 16 所示。
3. -種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物的方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 引物設(shè)計(jì)：當(dāng)基因片段進(jìn)行5'RACE反向擴(kuò)增時(shí)，使用primer premier 5.0軟件設(shè) 計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物、檢測(cè)引物、接頭引物，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物設(shè)計(jì)參數(shù)分 別為引物長(zhǎng)度16_30bp，Tm 55-65°C，反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物都根據(jù)已知中 間片段設(shè)計(jì)，檢測(cè)引物在特異擴(kuò)增引物的上游，正向和反向檢測(cè)引物相距100_200bp ; 當(dāng)基因片段進(jìn)行3' RACE正向擴(kuò)增時(shí)，使用primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引 物、檢測(cè)引物、接頭引物，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物設(shè)計(jì)參數(shù)分別為引物長(zhǎng)度16_30bp，Tm 55-65°C，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物都根據(jù)已知中間片段設(shè)計(jì)，檢測(cè)引物在特異擴(kuò)增引物的 下游，正向和反向檢測(cè)引物大概相距100_200bp ; 當(dāng)基因片段以中間片段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，使用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引 物和檢測(cè)引物，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物設(shè)計(jì)參數(shù)分別為引物長(zhǎng)度16-30bp，Tm 55-65°C， 特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物都根據(jù)已知中間片段設(shè)計(jì)，正向檢測(cè)引物在上一步設(shè)計(jì)好的正向 特異擴(kuò)增引物的下游，反向檢測(cè)引物在上一步設(shè)計(jì)好的反向特異擴(kuò)增引物的上游，正向特 異性擴(kuò)增引物與正向檢測(cè)引物相距50-100bp，反向特異性擴(kuò)增引物與反向檢測(cè)引物相距 50-100bp ； (2) 基因克隆擴(kuò)增：提取多倍體植物葉片RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用預(yù)先設(shè)計(jì)好的 特異性擴(kuò)增引物和接頭引物或者特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn) 行片段大小選擇，切膠回收，利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收PCR凝膠產(chǎn)物； (3) 檢測(cè)引物篩選基因克隆產(chǎn)物：將步驟2)回收的PCR凝膠產(chǎn)物利用設(shè)計(jì)好的檢測(cè)引 物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇； 選擇結(jié)果如下：當(dāng)基因克隆產(chǎn)物為非特異性片段時(shí)，步驟2)中PCR凝膠產(chǎn)物經(jīng)過(guò)步驟 3)后不能跑出電泳條帶；基因克隆產(chǎn)物為特異性片段時(shí)，步驟2)中的PCR凝膠產(chǎn)物經(jīng)過(guò)步 驟3)后能跑出大小為100-200bp的條帶。
4. 一種快速篩選菊花目的基因克隆產(chǎn)物的方法，其特征在于：包括如下步驟： (1)引物設(shè)計(jì)：當(dāng)基因片段進(jìn)行5'RACE反向擴(kuò)增時(shí)，使用primer premier 5.0軟件設(shè) 計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物、檢測(cè)引物和接頭引物，反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引 物設(shè)計(jì)參數(shù)分別為引物長(zhǎng)度16_30bp，Tm 55-65°C，反轉(zhuǎn)錄引物、特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物 都根據(jù)已知中間片段設(shè)計(jì)，檢測(cè)引物在特異擴(kuò)增引物之一 GSP5' -3的上游，正向和反向檢 測(cè)引物相距100_200bp ; 反轉(zhuǎn)錄引物為： GSP5' -1 :如 SEQ ID NO. 5 所示； 特異性擴(kuò)增引物為： GSP5' -2 :如 SEQ ID NO. 6 所示 GSP5' -3 :如 SEQ ID NO. 7 所示； 檢測(cè)引物為： 5' RACE JC-F :如 SEQ ID NO. 3 所示 5' RACE JC-R :如 SEQ ID NO. 4 所示； 當(dāng)基因片段進(jìn)行3' RACE正向擴(kuò)增時(shí)，使用primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引 物、檢測(cè)引物和接頭引物，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物設(shè)計(jì)參數(shù)分別為引物長(zhǎng)度16_30bp，Tm 55-65°C，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物都根據(jù)已知中間片段設(shè)計(jì)，檢測(cè)引物在特異擴(kuò)增引物之 一 GSP3' -3的下游，正向和反向檢測(cè)引物大概相距100-200bp ; 特異擴(kuò)增引物為： GSP3' -1 :如 SEQ ID NO. 8 所示 GSP3' -2 :如 SEQ ID NO. 9 所示 GSP3' -3 :如 SEQ ID NO. 10 所示； 檢測(cè)引物為： 3' RACE JC-F :如 SEQ ID NO. 11 所示 3' RACE JC-R :如 SEQ ID NO. 12 所示； 當(dāng)基因片段以中間片段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，使用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引 物和檢測(cè)引物，特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物設(shè)計(jì)參數(shù)分別為引物長(zhǎng)度16-30bp，Tm 55-65°C， 特異擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物都根據(jù)已知中間片段設(shè)計(jì)，正向檢測(cè)引物在上一步設(shè)計(jì)好的正向 特異擴(kuò)增引物的下游，反向檢測(cè)引物在上一步設(shè)計(jì)好的反向特異擴(kuò)增引物的下游，正向特 異性擴(kuò)增引物與正向檢測(cè)引物相距50-100bp，反向特異性擴(kuò)增引物與反向檢測(cè)引物相距 50-100bp ； 特異擴(kuò)增引物為： 中間 GSP-F :如 SEQ ID NO. 13 所示 中間 GSP-R :如 SEQ ID NO. 14 所示； 檢測(cè)引物為： 中間JC-F :如SEQ ID NO. 15所示 中間 JC-R :如 SEQ ID NO. 16 所示； (2) 基因克隆擴(kuò)增：提取菊花植物葉片RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用預(yù)先設(shè)計(jì)好的特 異性擴(kuò)增引物和接頭引物或者特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行 片段大小選擇，切膠回收，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收PCR凝膠產(chǎn)物； (3) 檢測(cè)引物篩選基因克隆產(chǎn)物：將步驟2)回收的PCR產(chǎn)物利用設(shè)計(jì)好的檢測(cè)引物再 次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇； 選擇結(jié)果如下：當(dāng)基因克隆產(chǎn)物為非特異性片段時(shí)，步驟2)中PCR凝膠產(chǎn)物經(jīng)過(guò)步驟 3)后不能跑出電泳條帶；基因克隆產(chǎn)物為特異性片段時(shí)，步驟2)中的PCR凝膠產(chǎn)物經(jīng)過(guò)步 驟3)后能跑出大小為100-200bp的條帶。
5. 權(quán)利要求1所述引物在快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物試劑盒中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求2所述引物在快速篩選菊花目的基因克隆產(chǎn)物試劑盒中的應(yīng)用。
7. -種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產(chǎn)物的試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1 所述的引物。
8. -種快速篩選菊花目的基因克隆產(chǎn)物的試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求2所述的 引物。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104195249SQ201410452747
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】陳發(fā)棣, 趙楠, 陳素梅, 蔣甲福, 張飛, 廖園 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)