專利名稱：一種獲得目的mRNA的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到一種獲得目的mRNA的方法，更具體地說是將目的基因轉入大腸桿菌中進行表達，提取大腸桿菌的總RNA，然后通過親和層析加以分離純化，最終得到需要的mRNA。
背景技術：
信使RNA(mRNA)是DNA轉錄的產(chǎn)物。DNA所編碼的遺傳信息轉錄成mRNA序列，mRNA序列在核糖體上指導蛋白質的合成，這一過程稱為翻譯。因此，如果能檢測到蛋白質的表達，就能推斷出編碼它的特異性mRNA的存在。而且在一般情況下，蛋白表達量與編碼該蛋白的mRNA的數(shù)量成正比。但是編碼某一蛋白質的mRNA很難得到分離，這主要是因為mRNA的絕對量較少，而且mRNA的序列特異性很高，目前缺乏通用的方法對之加以分離純化。
大腸桿菌表達系統(tǒng)是最常用的原核表達系統(tǒng)，許多外源基因在大腸桿菌表達系統(tǒng)中實現(xiàn)了高表達。與真核表達系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有遺傳學背景透徹、操作簡單、周期短、產(chǎn)量高等特點，是表達外源蛋白的首選表達系統(tǒng)。
目前對mRNA進行分離純化的方法主要是應用mRNA末端的poly(A+)序列，可以通過A-T堿基互補原則，利用商業(yè)化的oligo(dT)纖維素進行分離純化。
但是大腸桿菌中沒有轉錄后RNA加尾機制，其自身的mRNA均不含有poly(A+)尾巴，外源目的基因在大腸桿菌內(nèi)的轉錄后mRNA也沒有poly(A+)。
所以，目前需要一種既能有效利用大腸桿菌的高表達的優(yōu)勢，同時又有利于目的mRNA分離純化的技術。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種改造后的目的基因在原核細胞內(nèi)的轉錄、翻譯表達，利用A-T堿基互補原則獲得目的mRNA的方法。以克服現(xiàn)有技術中不易獲得mRNA，且獲得的不具有特異性的缺點。
由于大腸桿菌中沒有轉錄后RNA加尾機制，其自身的mRNA均不含有poly(A+)尾巴，外源目的基因通過載體進入大腸桿菌后，轉錄的mRNA也不含有poly(A+)，本發(fā)明的關鍵就在于在構建表達載體過程中在外源基因序列中人為地引入oligo(dT)序列，并使之誘導表達，則其所轉錄的mRNA將含有poly(A+)序列，提取大腸桿菌中的總RNA后，因為只有我們所需要的mRNA含有poly(A+)序列，就可以利用商業(yè)化的oligo(dT)纖維素進行分離純化。
本發(fā)明的具體方案(1)目的基因的改造和表達載體的構建在目的基因的3’末端引入oligo(dT)n序列(其中n為20-40，優(yōu)選為20-30。)，然后分別在5’端和3’端加上限制性內(nèi)切酶(如BamHI、EcoRI、XhoI、NotI等)的識別序列，成為改造后的目的基因。在載體的多克隆位點插入改造后的目的基因，成為重組的表達載體。本發(fā)明的目的基因可以是任何有疾病篩選功能的基因片段，將在實施例中以SARS冠狀病毒基因序列的18159位至18260位為例，介紹該表達載體的構建及后續(xù)步驟。其中載體可以為真核表達載體，也可以為原核表達載體，如pGEX4T-1質粒、pPIC質粒等，優(yōu)選的為pGEX4T-1質粒。
(2)將該表達載體轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過加入IPTG誘導外源基因的高效表達。外源基因的表達情況用SDS蛋白凝膠電泳方法檢測。
(3)取誘導后高效表達外源基因的細菌培養(yǎng)液，通過抽提細菌總RNA?？俁NA的抽提可選用Trizol抽提法或異硫氰酸胍法。
(4)其中含有poly(A+)序列的外源蛋白的目的mRNA通過oligo(dT)纖維素進行親和純化。用RT-PCR方法對得到的特異性mRNA進行檢測。
本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)通用性由于大腸桿菌本身不具備RNA加尾機制，任何一段外源基因加上oligo(dT)序列后都可以運用本方法獲得其所編碼的mRNA。
(2)易于檢測目的基因片段是以融合蛋白的形式表達，因此其表達情況可以用SDS蛋白凝膠電泳方式進行檢測，使得其在應用上方便、快速、可靠。
(3)目的mRNA易于純化由于在轉錄目的mRNA的基因序列中引入oligo(dT)序列，轉錄得到的目的mRNA含有poly(A+)序列，可以使用商業(yè)化的oligo(dT)纖維素對其進行分離純化。
(4)獲得的mRNA可用作對SARS病毒進行PCR檢測試劑盒的陽性對照。


圖1是PCR鑒定凝膠電泳2是融合蛋白GST-S誘導表達的SDS蛋白凝膠電泳分析3是目標mRNA純化后的RT-PCR檢測圖具體實施方式
本發(fā)明內(nèi)容通過以下的實施例和附圖作進一步闡述，獲得SARS冠狀病毒的mRNA的方法。
pGEX4T-S載體系統(tǒng)的構建從Genbank accession numberAY485278得到SARS coronavirus Sino3-11(SARS冠狀病毒)基因序列的18159位至18268位(SEQ ID NO1)TA ATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGG CS基因通過在如SEQ ID NO1的3’末端人為引入oligo(dT)23序列得到，并在其5’端和3’端分別添加限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI序列，最終其全基因序列為(SEQ ID NO2)
BamHI senseGGATCCTA ATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGG CTTTTTTTTTTTTTTTTTAntisenseTTTTTTTGAATTCEcoRI融合蛋白GST-S的誘導表達首先用BamHI和EcoRI酶將pGEX4T-1質粒和S基因DNA序列分別進行雙酶切操作，經(jīng)割膠回收試劑盒割膠回收后，用T4 DNA連接酶14℃過夜連接。連接液直接轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。轉化后的DH5α細胞涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)。從培養(yǎng)基上挑取單菌落，以一對針對S基因的特異性引物(sense5′ccaagtcaatggttacccta3′；antisense 5′catctctagttgcatgacagc3′)用PCR的方法檢測重組質粒pGEX4T-S構建成功(圖1)，其中1-5為挑選的菌落，6為陰性對照，7為陽性對照，8為標準。
從平板上挑取單菌落接種到3ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃搖菌過夜。按照1/100的比例轉接到100ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600值達到0.7后，加入終濃度為1mM的IPTG誘導。外源基因表達情況通過SDS蛋白凝膠電泳檢測(圖2)，其中1為未經(jīng)誘導的菌體蛋白，2-4為經(jīng)IPTG誘導后表達的菌體蛋白，5為蛋白標準。
細菌總RNA抽提取IPTG誘導3小時后的菌液2ml離心收集菌體。加入1ml Trizol溶液破菌后，室溫靜置5分鐘。加入0.2ml氯仿，溫和振蕩后室溫靜置2分鐘，然后4℃ 10,000g 10分鐘離心分層。將分層后的上層水溶液轉移到一個干凈的試管中，其中的RNA用0.5ml異丙醇沉淀。室溫靜置5分鐘后沉淀的RNA離心收集。RNA用1ml乙醇清洗后離心收集。最終得到的RNA溶于去RNA酶的水中。RNA濃度用分光光度計260nm波長測定。
目標mRNA的純化離心管中秤取1克Oligo(dT)纖維素，加入1×上樣緩沖液(0.5M LiCl，10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，0.1％SDS)10ml懸浮。
根據(jù)總RNA量裝填Oligo(dT)纖維素柱(10mg總RNA/1ml床體積)。加10倍體積的Mili-Q水洗柱，然后用10倍體積的0.1mol/L NaOH洗柱，再用10倍體積的Milli-Q水洗柱，直至流出液pH＝7。用10倍體積的1×洗脫緩沖液(0.15M LiCl，10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，0.1％SDS)洗柱，最后用10倍體積的1×上樣緩沖液洗柱，以使層析柱平衡。RNA樣品在68℃變性3min，然后迅速插入冰水浴內(nèi)，加入等體積2×上樣緩沖液并混勻。隨后將總RNA溶液上樣于層析柱，收集流出液，再次變性后上樣掛柱，收集的流出液-20℃冷凍暫時保存，待mRNA檢測完后丟棄。在所有液體流干后，用10倍體積的1×上樣緩沖液洗柱，直至OD260值接近或為零。
洗柱完畢后，加3倍柱床體積的1×洗脫緩沖液洗脫mRNA，在1.5ml離心管中收集流出液。加2.5倍體積的無水乙醇和0.1體積的3mol/LNaAc(pH5.2)，混勻后-20℃沉淀2小時。4℃ 14000rpm離心20min以收集mRNA。晾干沉淀，重溶于100μl無RNA酶的TE緩沖液中，OD260定量后作為RT-PCR的模板進行檢測。
RT-PCR檢測獲得的mRNA按照Promega公司的RT-PCR試劑盒說明書，在0.5ml PCR薄壁管中加入以下組份去核酸酶水 28μlAMV/Tfl5X反應緩沖液 10μldNTP混合液 1μl引物各1μl25mM MgSO42μl
AWV逆轉錄酶1μlTfl DNA聚合酶 1μlmRNA模板 5μl上述組分經(jīng)充分混合后，在PCR儀上按以下條件反應48℃ 45min94℃ 2min 4℃ 保存RT-PCR的結果用瓊脂糖電泳分析(圖3)，1為陰性對照，2為檢測樣本，3為蛋白標準。
以上結果表明實施例中在S基因3’末端人為引入oligo(dT)序列并構建融合表達載體后，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中獲得了高效表達。含poly(A+)序列的目標mRNA成功地用oligo(dT)纖維素進行了純化。
SARS冠狀病毒是一種RNA病毒，針對RNA病毒檢測的PCR試劑盒需要有經(jīng)純化的RNA片段作為陽性對照。運用本發(fā)明提供的方法，可以方便地獲得高純度的所需RNA片段，用于相關PCR檢測試劑盒的開發(fā)。
序列表<110>華東理工大學<120>一種獲得目的mRNA的方法<130>SPI048144<160>2<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>110<212>DNA<213>SARS病毒(SARS coronavirus Sino3-11)<220>
<221>CDS<222>(18159)...(18268)<400>1taccaagtca atggttaccc taatatgttt atcacccgcg aagaagctat tcgtcacgtt 60cgtgcgtgga ttggctttga tgtagagggc tgtcatgcaa ctagagatgc110<210>2<211>145<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工設計，與載體連接進入宿主細胞的序列<400>2ggatcctacc aagtcaatgg ttaccctaat atgtttatca cccgcgaaga agctattcgt 60cacgttcgtg cgtggattgg ctttgatgta gagggctgtc atgcaactag agatgctttt 120tttttttttt tttttttttg aattc 14權利要求
1.一種獲得目的mRNA的方法，其特征在于該方法包括如下步驟①在目的基因的3’末端引入oligo(dT)序列，構建表達載體；②表達載體轉化到大腸桿菌中；③轉化后的大腸桿菌總RNA提取；④mRNA從總RNA中的分離純化；其中oligo(dT)的數(shù)目為20-40。
2.一種如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的目的基因是任何對疾病的診斷和篩選有意義的基因序列。
3.一種如權利要求1所述的方法，其特征在于在目的基因的3’末端引入oligo(dT)序列后，分別在5’端和3’端加上限制性內(nèi)切酶的識別序列，其中的限制性內(nèi)切酶為BamHI、EcoRI、XhoI或NotI中的一種。
4.一種如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的目的基因為SEQ IDNO1。
5.一種如權利要求4所述的方法，其特征在于所述的oligo(dT)的數(shù)目為23。
6.一種如權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于改造后的基因序列為SEQ ID NO2。
7.一種如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于所述的載體為pGEX4T-1質粒。
8.一種如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的總RNA提取方法為Trizol抽提法或異硫氰酸胍法。
9.一種如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的mRNA從總RNA中的分離純化是將總RNA通過裝填Oligo(dT)的纖維素柱，進行洗脫。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種獲得目的mRNA的方法。該方法是將目的基因進行改造，在其3’末端引入oligo(dT)序列，然后分別在5’端和3’端加上限制性內(nèi)切酶識別序列，并與載體結合，轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，促使其高表達，提取大腸桿菌的總RNA，然后用oligo(dT)纖維素進行分離純化，獲得所需的目的mRNA。本發(fā)明提供的方法，可以方便地獲得高純度的所需的mRNA片段，用于相關基因PCR檢測試劑盒的開發(fā)。
文檔編號C12N15/70GK1563377SQ200410017218
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月25日 優(yōu)先權日2004年3月25日
發(fā)明者楊忠, 趙建龍, 馬昱澍, 肖君華, 王錦之, 魏東芝 申請人:華東理工大學