專利名稱：一種三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法。
背景技術(shù)：
三角帆蛘是我國最主要的優(yōu)質(zhì)淡水育珠蛘，具有重要的經(jīng)濟價值。育珠蛘的外套膜能分泌物質(zhì)形成貝殼，還能分泌珍珠質(zhì)形成珍珠。淡水蛘的蛘殼通常可分為角質(zhì)層、棱柱層和珍珠層三層結(jié)構(gòu)，而外套膜不同部位的組織細(xì)胞具有形成不同貝殼結(jié)構(gòu)的作用。通常認(rèn)為角質(zhì)層由外套膜邊緣的生殼突起分泌形成，棱柱層由外套膜邊緣膜的高柱狀細(xì)胞分泌形成，珍珠層由外套膜中央膜的柱狀細(xì)胞分泌形成。優(yōu)質(zhì)淡水珍珠中主要含有較厚的珍珠層而含較少的棱柱層結(jié)構(gòu)。因而，研究育珠蛘的外套膜對成殼和育珠的作用對于提高和改善育珠蛘的珍珠質(zhì)量具有非常重要的意義。目前，對貝殼和珍珠形成機制的研究主要集中在參與礦化作用的蛋白和多肽的分離及其基因的克隆，而有關(guān)基因的功能研究還存在很多困難。研究功能基因的定位，尤其是研究相關(guān)基因在參與貝殼和珍珠形成中起重要作用的外套膜中的定位情況，將有助于了解相關(guān)基因的功能，揭示其在生物礦化中的作用，從而為提高養(yǎng)殖珍珠的產(chǎn)量和質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:` 一種三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法，是將三角帆蛘外套膜組織進行原位雜交，根據(jù)外套膜組織原位雜交的結(jié)果對目的基因進行基因定位，所述的外套膜組織原位雜交所用的探針為針對目的基因的探針，所述的目的基因是三角帆蛘SRCR-1基因，GenBank登錄號為accession n0.KC691745，其序列如SEQ ID N0.1所示，所述的探針的序列如SEQ IDN0.2所示。所述的外套膜組織原位雜交包括以下步驟:
(1)將三角帆蛘外套膜組織進行固定；
(2)將固定好的外套膜組織進行切片；
(3)將組織切片進行預(yù)處理；
(4)將預(yù)處理后的組織切片進行雜交；
(5)雜交后的處理與檢測。所述的步驟(I)是將三角帆蛘外套膜組織用4%多聚甲醛溶液在溫度4°C下固定24h,然后用DEPC水配制的I XPBS溶液洗滌組織。所述的4%多聚甲醛溶液的溶質(zhì)為多聚甲醛，溶劑為PBS，多聚甲醛的終濃度為4%(質(zhì)量百分含量)，所述的PBS的制備方法為=NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.44 g、KH2PO4
0.24g，用 DEPC-H2O 配至 I L，調(diào) pH 值至 7.4。所述的步驟(2)是將固定后的外套膜組織切成厚度為7 10 μ m的組織切片，并將烘烤后的切片保存于4°C冰箱。步驟(3)中所述的預(yù)處理按照如下步驟進行:
(a)將組織切片分別進行第一次二甲苯脫蠟5min、第二次二甲苯脫蠟5 min、二甲苯和酒精的等量混合液脫臘5 min ；
(b)然后依次經(jīng)過第一次無水乙醇清洗10min、第二次無水乙醇清洗10 min、95%乙醇清洗5 min、90%乙醇清洗5 min、80%乙醇清洗5 min、70%乙醇清洗5 min、I XPBS溶液清洗 10 min ；
(c)然后再依次經(jīng)過TritonX-100清洗10 min、I XPBS溶液清洗10 min、37°C下含5μ g/mL蛋白酶K的PBS溶液清洗15 min、0.2% (質(zhì)量百分含量)甘氨酸溶液清洗5 min、第一次I XPBS溶液清洗5 min、第二次I XPBS溶液清洗5 min，用4%多聚甲醛溶液滴片固定
5min ；
(d)固定后再用IXPBS溶液清洗兩次，每次均清洗5 min，組織切片放入55°C去離子甲酰胺和IXSSC的等量混合液中浸泡30 min。步驟(4)中所述的雜交條件為:雜交液中加入終濃度為1.0 μ g/mL的探針，混合均勻，75°C加熱5 min后，冰上 急冷，然后將雜交液滴片到組織切片上，于55°C的雜交爐中孵育16 20 ho所述的步驟(5)按照如下步驟進行:
(a)雜交后的組織切片用甲酰胺和IXSSC的等量混合液于55°C下洗滌兩次，每次均洗漆 30 min ；
(b)組織切片用NTEBuffer于37°C下洗滌10 min，然后用加有終濃度為20 μ g/mL的RNase A的NTE Buffer溶液于37 °C下洗滌30 min，再用NTE Buffer于37 °C下洗滌10min ；
(c)分別用1XSSC、0.5XSSC、0.1XSSC于37°C下各洗滌一次，每次均為10 min ；
(d)用IXPBS溶液于37°C下洗漆切片5 min,再將組織切片浸入Blocking solution溶液中，室溫浸泡I h,然后浸入1% BSA溶液中，室溫浸泡30 min ；
(e)按1:2000 的抗體效價，在 Blocking solution 溶液中加入 Ant1-Digoxigenin-AP抗體，將組織切片浸入其中，室溫浸泡2 h；
(f)將經(jīng)過抗體孵育后的組織切片用Washsolution室溫洗漆2次,每次洗漆20 min ；
(g)再將切片浸入Detectionsolution溶液中，室溫浸泡3 min ；
(h)然后將切片放于NBT/BCIP反應(yīng)液中避光孵育12 16h，在此過程中觀察切片呈色強度；
(i)當(dāng)顯色完全后，將切片用 IXPBS溶液室溫清洗10 min ；
(j )最后將切片經(jīng)過二甲苯脫色，用中性樹脂封片，觀察，拍照。所述的NTE Buffer 的具體成分為:500 mmol /T, NaCl, 10 mmol/L Tris, I mmol/LEDTA，pH 8.00所述的三角帆蛘為健康3齡三角帆蛘。
本發(fā)明優(yōu)點在于:
1、本發(fā)明為三角帆蛘外套膜的研究提供了基因定位的方法，為進一步研究三角帆蛘的礦化機制及成珠機理提供了很好的技術(shù)手段；
2、本發(fā)明的方法易于操作，無需特殊設(shè)備，成本較低，技術(shù)適應(yīng)性較好，顯色后的組織切片能夠清地觀察到基因在外套膜中的表達定位情況；
3、本發(fā)明對于實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中提高和改善淡水育珠蛘的珍珠品質(zhì)也具有理論意義。


附圖1是三角帆蛘SRCR-1基因在外套膜中的原位雜交結(jié)果X4倍圖。附圖2是三角帆蛘SRCR-1基因在外套膜中的原位雜交結(jié)果X20倍圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細(xì)說明。
·
實施例1
4%多聚甲醛溶液的溶質(zhì)為多聚甲醛，溶劑為PBS，多聚甲醛的終濃度為4% (質(zhì)量百分含量)。所述的 PBS 的制備方法為=NaCl 8 g、KCl 0.2 g,Na2HPO4 1.44 g,KH2PO4 0.24g，用DEPC-H2O配至I L，調(diào)pH值至7.4。所述的DEPC-H2O的配制方法如下:1000 mL雙蒸水中加入I mL DEPC，磁力攪拌器攪拌過夜，高壓滅菌，封閉備用。Triton X-100為0.3%的工作濃度，溶劑為TOS。0.2%甘氨酸溶液，溶質(zhì)為甘氨酸，溶劑為PBS，甘氨酸的終濃度為0.2% (質(zhì)量百分含量)。NTE Buffer的具體組分為:500mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris, I mmol/L EDTA，PH 8.0。1% BSA 溶液的制備方法如下:0.5g BSA 溶解于 50 mL Blocking solution 溶液中。三角帆蛘為健康3齡三角帆蛘。Triton X_100、蛋白酶K、SSC等試劑購于生工生物工程(上海)股份有限公司。Blocking solution溶液、Wash solution溶液、Detectionsolution 溶液、Ant1-Digoxigenin-AP 抗體、NBT/BCIP 反應(yīng)液購于 Roche 公司。三角帆蛘外套膜目的基因SRCR-1的定位方法，具體步驟如下:
1、制備探針
Ca)根據(jù)三角帆蛘SRCR-1基因的GenBank序列(如SEQ ID N0.1所示)，設(shè)計特異性引物，SRCR-1的特異性引物如下:
上游引物:5' - AGTCAATGAGTCTGCACCCG -3'
下游引物:5' - TCCGTCACACTGAGAAAGGT -3'
(b)將三角帆蛘的SRCR-1基因用設(shè)計的引物進行PCR擴增，擴增出214bp的針對SRCR-1基因的探針序列(如SEQ ID N0.2所示)；
(c)將PCR產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收；
Cd)將回收后的產(chǎn)物于16°C與多克隆位點兩端具有T7、SP6啟動子的載體進行過夜連
接;
Ce)將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，于37°C搖菌培養(yǎng)過夜，然后進行測序驗證；
Cf)測序正確后，經(jīng)判斷確認(rèn)SRCR-1基因的探針序列插入載體的順序是正向的；
(g)使用限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒進行酶切；(h)將酶切產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收；
(i )分別用T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶對探針進行體外轉(zhuǎn)錄，用地高辛標(biāo)記，合成正義和反義探針，-80°C保存?zhèn)溆谩?、三角帆蛘的選擇和組織固定
選擇健康3齡三角帆蛘(殼長>10 cm,殼寬>8 cm),貝殼完整無殘缺。將開殼器輕輕插入三角帆蛘的兩殼之間，撐開雙殼，注意不要破壞外套膜的完整性。用剪刀沿殼邊緣向殼頂方向剪取寬0.5 cm、長I cm的外套膜組織，用DEPC水配制的I XPBS溶液洗滌組織。然后用鑷子在濾紙上將組織充分展平拉直，浸泡于4%多聚甲醛溶液中4°C下固定24 h，用DEPC水配制的IXPBS溶液洗滌組織。3、對固定好的外套膜組織進行切片
將固定后的組織切成厚度為7 10 μ 的組織切片，并將烘烤后的切片保存于4°C冰箱。4、將組織切片進行預(yù)處理
(a)將組織切片分別進行第一次二甲苯脫蠟5min、第二次二甲苯脫蠟5 min、二甲苯和酒精的等量混合液脫臘5 min ；
(b)然后依次經(jīng)過第一次無水乙醇清洗10min、第二次無水乙醇清洗10 min、95%乙醇清洗5 min、90%乙醇清洗5 min、80%乙醇清洗5 min、70%乙醇清洗5 min、I XPBS溶液清洗 10 min ；
(c)然后再依次經(jīng)過Trit onX-100清洗10 min、I XPBS溶液清洗10 min、37°C下含5μ g/mL蛋白酶K的PBS溶液清洗15 min、0.2% (質(zhì)量百分含量)甘氨酸溶液清洗5 min、第一次I XPBS溶液清洗5 min、第二次I XPBS溶液清洗5 min，用4%多聚甲醛溶液滴片固定5 min ；
(d)固定后再用IXPBS溶液清洗兩次，每次均清洗5 min，組織切片放入55°C去離子甲酰胺和IXSSC的等量混合液中浸泡30 min。5、雜交
雜交液中加入終濃度為1.0 μ g/mL的探針，混合均勻，75°C加熱5 min后，冰上急冷，然后將雜交液滴片到組織切片上，于55°C的雜交爐中孵育16 20 h。6、雜交后處理與檢測
(a)雜交后的組織切片用甲酰胺和IXSSC的等量混合液于55°C下洗滌兩次，每次均洗漆 30 min ；
(b)組織切片用NTEBuffer于37°C下洗滌10 min，然后用加有終濃度為20 μ g/mL的RNase A的NTE Buffer溶液于37°C下洗滌30 min，再用NTE Buffer于37°C下洗滌10min ；
(c)分別用1XSSC、0.5XSSC、0.1XSSC于37°C下各洗滌一次，每次均為10 min ；
(d)用IXPBS溶液于37°C下洗漆切片5 min,再將組織切片浸入Blocking solution溶液中，室溫浸泡I h,然后浸入1% BSA溶液中，室溫浸泡30 min ；
(e)按1:2000 的抗體效價，在 Blocking solution 溶液中加入 Ant1-Digoxigenin-AP抗體，將組織切片浸入其中，室溫浸泡2 h ；
(f)將經(jīng)過抗體孵育后的組織切片用Washsolution室溫洗漆2次,每次洗漆20 min ；(g)再將切片浸入Detectionsolution溶液中，室溫浸泡3 min ；
(h)然后將切片放于NBT/BCIP反應(yīng)液中避光孵育12 16h，在此過程中觀察切片呈色強度；
(i)當(dāng)顯色完全后，將切片用IXPBS溶液室溫清洗10 min ；
(j )最后將切片經(jīng)過二甲苯脫色，用中性樹脂封片，觀察，拍照。結(jié)果表明:光鏡下可見三角帆蛘外套膜各層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，特征明顯。由圖1、圖2可見，三角帆蛘SRCR-1基因特異性地表達于外套膜邊緣膜的腹膜區(qū)以及邊緣膜頂端的外折區(qū)，可推測三角帆蛘SRCR-1基因參與貝殼棱柱層和角質(zhì)層的形成。本方法得到的結(jié)果圖像色彩清晰、對比度適當(dāng)，可準(zhǔn)確對目的基因的表達情況進行定位。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍 。
權(quán)利要求
1.一種三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法，是將三角帆蛘外套膜組織進行原位雜交，根據(jù)外套膜組織原位雜交的結(jié)果對目的基因進行基因定位，其特征在于，所述的外套膜組織原位雜交所用的探針為針對目的基因的探針，所述的目的基因的序列如SEQ ID N0.1所示，所述的探針的序列如SEQ ID N0.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的外套膜組織原位雜交包括以下步驟: (1)將三角帆蛘外套膜組織進行固定； (2)將固定好的外套膜組織進行切片； (3)將組織切片進行預(yù)處理； (4)將預(yù)處理后的組織切片進行雜交； (5)雜交后的處理與檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的步驟(I)是將三角帆蛘外套膜組織用4%多聚甲醛溶液在溫度4°C下固定24 h，然后用DEPC水配制的I X PBS溶液洗滌組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的4%多聚甲醛溶液的溶質(zhì)為多聚甲醛，溶劑為PBS，多聚甲醛的終濃度為4% (質(zhì)量百分含量)，所述的 PBS 的制備方法為=NaCl 8 g、KCl 0.2 g,Na2HPO4 1.44 g,KH2PO4 0.24g，用 DEPC-H2O配至I L，調(diào)pH值至7.4。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述 的三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的步驟(2)是將固定后的外套膜組織切成厚度為7 10 μ m的組織切片，并將烘烤后的切片保存于4°C冰箱。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，步驟(3)中所述的預(yù)處理按照如下步驟進行: (a)將組織切片分別進行第一次二甲苯脫蠟5min、第二次二甲苯脫蠟5 min、二甲苯和酒精的等量混合液脫臘5 min ； (b)然后依次經(jīng)過第一次無水乙醇清洗10min、第二次無水乙醇清洗10 min、95%乙醇清洗5 min、90%乙醇清洗5 min、80%乙醇清洗5 min、70%乙醇清洗5 min、I XPBS溶液清洗 10 min ； (c)然后再依次經(jīng)過TritonX-100清洗10 min、I XPBS溶液清洗10 min、37°C下含5μ g/mL蛋白酶K的PBS溶液清洗15 min、0.2% (質(zhì)量百分含量)甘氨酸溶液清洗5 min、第一次I XPBS溶液清洗5 min、第二次I XPBS溶液清洗5 min，用4%多聚甲醛溶液滴片固定5 min ； (d)固定后再用IXPBS溶液清洗兩次，每次均清洗5 min，組織切片放入55°C去離子甲酰胺和IXSSC的等量混合液中浸泡30 min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，步驟(4)中所述的雜交條件為:雜交液中加入終濃度為1.0 μ g/mL的探針，混合均勻，75°C加熱5min后，冰上急冷，然后將雜交液滴片到組織切片上，于55°C的雜交爐中孵育16 20 h。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的步驟(5)按照如下步驟進行:(a)雜交后的組織切片用甲酰胺和IXSSC的等量混合液于55°C下洗滌兩次，每次均洗漆 30 min ； (b)組織切片用NTEBuffer于37°C下洗滌10 min，然后用加有終濃度為20 μ g/mL的RNase A的NTE Buffer溶液于37°C下洗滌30 min，再用NTE Buffer于37°C下洗滌10min ； (c)分別用1XSSC、0.5XSSC、0.1XSSC于37°C下各洗滌一次，每次均為10 min ； (d)用IXPBS溶液于37°C下洗漆切片5 min,再將組織切片浸入Blocking solution溶液中，室溫浸泡I h,然后浸入1% BSA溶液中，室溫浸泡30 min ； (e)按1:2000 的抗體效價，在 Blocking solution 溶液中加入 Ant1-Digoxigenin-AP抗體，將組織切片浸入其中，室溫浸泡2 h ； (f)將經(jīng)過抗體孵育后的組織切片用Washsolution室溫洗漆2次,每次洗漆20 min ； (g)再將切片浸入Detectionsolution溶液中，室溫浸泡3 min ； (h)然后將切片放于NBT/BCIP反應(yīng)液中避光孵育12 16h，在此過程中觀察切片呈色強度； (i)當(dāng)顯色完全后，將切片用IXPBS溶液室溫清洗10 min ； (j )最后將切片經(jīng)過二甲苯脫色，用中性樹脂封片，觀察，拍照。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的NTE Buffer 的具體成分為:500 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris, I mmol/L EDTA，pH 8.0。
10.根據(jù)權(quán)利要求1·-9中任一所述的三角帆蛘外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的三角帆蛘為健康3齡三角帆蛘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，是將三角帆蚌外套膜組織進行原位雜交，根據(jù)外套膜組織原位雜交的結(jié)果對目的基因進行基因定位，所述的外套膜組織原位雜交所用的探針為針對目的基因的探針，所述的目的基因的序列如SEQIDNo.1所示，所述的探針的序列如SEQIDNo.2所示。本發(fā)明為三角帆蚌外套膜參與的成殼和育珠研究提供了基因定位的方法，也為進一步研究三角帆蚌生長和育珠過程中各種分子機制提供了一種技術(shù)手段。本發(fā)明的方法易于操作，節(jié)省時間，無需特殊設(shè)備，成本較低。本發(fā)明對養(yǎng)殖中提高淡水珍珠質(zhì)量的研究有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK103243160SQ20131014162
公開日2013年8月14日 申請日期2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月23日
發(fā)明者李家樂, 李西雷, 白志毅, 汪桂玲, 羅紅瑞 申請人:上海海洋大學(xué)