專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于抗體改形的體外分子定向進(jìn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于抗體改形的體外分子定向進(jìn)化方法，更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)設(shè)計(jì)改形抗體分子、將核糖體展示技術(shù)和DNA改組技術(shù)相結(jié)合，在鼠源單鏈抗體的基礎(chǔ)上直接獲得改形單鏈抗體的抗體改形的體外分子定向進(jìn)化方法。本發(fā)明還提供用此方法獲得的一個(gè)抗4-1BB改形抗體的氨基酸序列及其編碼核苷酸序列，含有該苷酸序列的載體以及含有這些載體的宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有良好的特異性和更高的親和力；能夠進(jìn)行可重復(fù)性的大量生產(chǎn)；在應(yīng)用中，更易于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和定量操作，因此在疾病診斷和治療、科學(xué)研究等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。然而，在應(yīng)用過(guò)程中，尤其是用于疾病治療時(shí)，鼠源單克隆抗體作為異源物質(zhì)，進(jìn)入人體后將激起機(jī)體的免疫反應(yīng)HAMA(人抗鼠抗體反應(yīng))。HAMA反應(yīng)能夠加速抗體從血液中的清除速度，影響治療效果；HAMA反應(yīng)產(chǎn)生的IgE抗體能夠引起機(jī)體的超敏反應(yīng)；由于鼠源單克隆抗體在循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期較短，需要重復(fù)注射用藥。
解決單克隆抗體的鼠源性問(wèn)題的根本途徑是制備人源單克隆抗體。但是，由于以下幾方面原因，很難獲得人雜交瘤細(xì)胞。首先，沒(méi)有合適的人骨髓瘤細(xì)胞(在長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)過(guò)程中不發(fā)生染色體丟失)用于細(xì)胞融合；其次，由于倫理方面的考慮，大多數(shù)抗原不能用于人體免疫；最后，即使某些抗原允許進(jìn)行人體免疫，很難獲得人脾細(xì)胞，而淋巴結(jié)細(xì)胞不是人B細(xì)胞的最佳來(lái)源。通過(guò)構(gòu)建全人抗體庫(kù)，然后采用合適的篩選技術(shù)從中“釣”取針對(duì)某種抗原的人源抗體，被認(rèn)為是抗體工程發(fā)展的又一個(gè)里程碑。由于全人抗體庫(kù)的構(gòu)建和篩選技術(shù)還沒(méi)有完全推廣，利用該途徑獲得的抗體還未廣泛應(yīng)用。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將部分人抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，然后采用雜交瘤技術(shù)制備人單克隆抗體。這種實(shí)驗(yàn)思路目前僅限于研究階段。
另一個(gè)解決單克隆抗體鼠源性的途徑是“抗體人源化”，即替換鼠源單克隆抗體的部分片段，或個(gè)別氨基酸殘基，使其在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上更接近人抗體。該途徑充分利用了現(xiàn)有鼠源單克隆抗體的豐富資源，因此受到普遍重視。
由于抗體的結(jié)構(gòu)和一級(jí)序列決定其激起機(jī)體排異反應(yīng)的能力，在保持抗體的特異性和親和力的同時(shí)，將鼠源抗體的部分序列替換為人源抗體的序列，即可以達(dá)到抗體人源化的目的。
隨著蛋白分子設(shè)計(jì)手段的不斷豐富和對(duì)抗體的結(jié)構(gòu)、功能的認(rèn)識(shí)的不斷深入，抗體人源化策略經(jīng)歷了一系列演變過(guò)程。最初人們將鼠源抗體的可變區(qū)與人源抗體的恒定區(qū)嵌合在一起，制備了第一代人源化抗體嵌合抗體(chimeric antibody)。隨后，人們認(rèn)識(shí)到每個(gè)可變區(qū)(VH或VL)還可以分為3個(gè)超變區(qū)(即CDRs)和3個(gè)FR區(qū)，CDR區(qū)在抗原與抗體之間的特異性結(jié)合方面，起著主要作用，其中CDR3的作用更為關(guān)鍵，因此在構(gòu)建單鏈抗體或單域抗體時(shí)，將鼠源抗體的CDR區(qū)與人源抗體的FR區(qū)嵌合在一起，構(gòu)建第二代人源化抗體CDR移植抗體(CDR-graftingantibody)?？贵w結(jié)構(gòu)與功能的研究的不斷深入，導(dǎo)致人們發(fā)現(xiàn)FR區(qū)的某些關(guān)鍵氨基酸殘基參與抗原、抗體之間的相互作用。因此在進(jìn)行CDR區(qū)移植后，還需要在FR區(qū)某些位置保留鼠源的氨基酸殘基，從而構(gòu)建第三代人源化抗體“改形”抗體(reshaping antibody)。這些關(guān)鍵氨基酸殘基的選擇是獲得高活性改形抗體的關(guān)鍵。
有證據(jù)表明，與鼠源抗體相比，嵌合抗體引起的HAMA反應(yīng)大幅度降低。但是，目前由于實(shí)驗(yàn)方法的限制，還沒(méi)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證移植抗體和改形抗體的人源化程度。
抗體改形一般經(jīng)過(guò)以下幾個(gè)步驟首先確定移植受體抗體序列。通常采用同源搜索的辦法，從genebank或現(xiàn)有的人抗體序列庫(kù)(如Kabat序列庫(kù)、V-base等)尋找與鼠源單克隆抗體最為同源的人抗體序列，作為移植受體。其次，在進(jìn)行CDR移植后，根據(jù)抗體結(jié)構(gòu)或定點(diǎn)突變等已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定鼠源抗體FR區(qū)中的關(guān)鍵氨基酸殘基(即影響抗體親和力的FR區(qū)殘基)，并在改形抗體中加以保留。最后，按照上述改形方案，構(gòu)建改形抗體，并采用原核表達(dá)的方式驗(yàn)證改形抗體的特異性和親和力。
按照上述策略已經(jīng)成功進(jìn)行了幾種抗體的改形。由于操作比較煩瑣，尤其需要反復(fù)優(yōu)化和調(diào)整關(guān)鍵FR區(qū)氨基酸殘基，因此在此基礎(chǔ)上有人提出采用定向進(jìn)化策略進(jìn)行抗體改形。Baca M等人在確定一系列候選關(guān)鍵氨基酸殘基后，采用定點(diǎn)突變的方法在這些位置引入隨機(jī)突變，然后采用噬菌體展示的技術(shù)，從中篩選高親和力的改形抗體。Barbas CF 3rd等人則采用了另外一種策略，在已有的鼠源單克隆抗體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建基因工程抗體Fab，然后分別從人外周血細(xì)胞中擴(kuò)增人抗體VH和VL基因，分別構(gòu)建人抗體VH庫(kù)和VL庫(kù)，進(jìn)一步先后固定鼠抗體的VH基因和VL基因，依次與人抗體VL庫(kù)和VH庫(kù)組合，進(jìn)行定向篩選(guidedselection)，最終將鼠源抗體序列完全替換為人抗體序列，保持原有特異性，提高親和力或保持不變。采用這兩種策略均成功進(jìn)行了抗體的改形。
4-1BB是一種誘導(dǎo)型T細(xì)胞輔刺激因子，表達(dá)在經(jīng)過(guò)激活劑的誘導(dǎo)(如抗CD3抗體、ConA、PMA、PHA、ionomycin等)的T細(xì)胞表面。4-1BB分子含有富含半胱氨酸的基序，因此屬于NGFR/TNFR(神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體/腫瘤壞死因子受體)超家族。該家族成員還包括NGFR、TNFR-I、TNF-II、CD30、CD27、OX40、CD40、FAS/APO-1等。4-1BB輔刺激信號(hào)細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用。在T細(xì)胞激活的早期，CD28、LFA-1、LFA-2等輔刺激信號(hào)分子參與T細(xì)胞活化，同時(shí)誘導(dǎo)4-1BB、CTLA4的表達(dá)。CTLA4與CD28共用配體B7。由于CTLA4與B7的親和力更高，而且兩者相互作用為T(mén)細(xì)胞提供抑制信號(hào)，因此CD28輔刺激信號(hào)對(duì)活化后的T細(xì)胞不能發(fā)揮持續(xù)活化的作用；這時(shí)4-1BB等誘導(dǎo)型輔刺激因子與其配體相互作用，繼續(xù)為T(mén)細(xì)胞提供活化信號(hào)。還有證據(jù)表明4-1BB可以采用不依賴(lài)CD28的方式發(fā)揮輔刺激活化作用，活化T細(xì)胞?；罨妮o助性T細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子，如IL-2、IL-4、IFN-γ、等調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫；活化的CTL細(xì)胞將直接對(duì)靶細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞等)發(fā)揮殺傷作用。綜上所述，4-1BB輔刺激信號(hào)的作用特點(diǎn)在于長(zhǎng)期高效活化T細(xì)胞，在細(xì)胞免疫和體液免疫過(guò)程中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用。(參考文獻(xiàn)Schellekens H.Immolunogenicity of therapeuticproteinsclinical implications and future prospects.Clin Ther.2002 Nov；24(11)1720-40；discussion 1719.2.Huston JS，George AJ.Engineeredantibodies take center stage.Hum Antibodies.2001；10(3-4)127-42.3.DillmanRO.The history and rationale for monoclonal antibodies in the treatment ofhematologic malignancy.Curr Pharm Biotechnol.2001 Dec；2(4)293-300.4.Clark M.Antibody humanizationa case of the′Emperor′s new clothes′？Immolunol Today.2000 Aug；21(8)397-402.5.Morea V，Lesk AM，Tramontano A.Antibody modelingimplications for engineering and design.Methods.2000 Mar；20(3)267-79.6.Klingbeil C，Hsu D H.Pharmacology andsafety assessment of humanized monoclonal antibodies for therapeuticuse.Toxicol Pathol.1999 Jan-Feb；27(1)1-3.7.Baca M，Presta LG，O′ConnorSJ，Wells JA.Antibody humanization using monovalent phage display.J BiolChem 1997 Apr 18；272(16)10678-84.Steinberger P，Sutton JK，Rader C，EliaM.Barbas CF 3rd.Generation and characterization of a recombinant humanCCR5-specific antibody.A phage display approach for rabbit antibodyhumanization.J Biol Chem.2000 Nov 17；275(46)36073-8.8.Rader C，RitterG，Nathan S，Elia M，Gout I，Jungbluth AA，Cohen LS，Welt S，Old LJ，BarbasCF 3rd.The rabbit antibody repertoire as a novel source for the generation oftherapeutic human antibodies.J Biol Chem.2000 May 5；275(18)13668-76.9.Rader C，Cheresh DA，Barbas CF 3rd.A phage display approach for rapidantibody humanizationdesigned combinatorial V gene libraries.Proc NatlAcad Sci U S A.1998 Jul 21；95(15)8910-5.10.Baca M，Presta LG，O′ConnorSJ，Wells JA.Antibody humanization using monovalent phage display.J BiolChem.1997 Apr 18；272(16)10678-84.11.Salih HR，Kiener PA，Nussler V.4-1BB ligand--just another costimulating molecule？Int J Clin Pharmacol Ther.2002 Aug；40(8)348-53.12.Kwon B，Lee HW，Kwon BS.New insights intothe role of 4-1BB in immolune responsesbeyond CD8+T cells.TrendsImmolunol.2002 Aug；23(8)378-80.13.Sica G，Chen L.Modulation of theimmolune response through 4-1BB.Adv Exp Med Biol.2000；465355-62.Review.No abstract available.14.Tan JT，Whitmire JK，Ahmed R，Pearson TC，Larsen CP.4-1BB ligand，a member of the TNF family，is important for thegeneration of antiviral CD8 T cell responses.J Immolunol.1999 Nov1；163(9)4859-68.15.Watts TH，DeBenedette MA.T cell co-stimulatorymolecules other than CD28.Curr Opin Immolunol.1999 Jun；11(3)286-93.16.Vinay DS，Kwon BS.Role of 4-1BB in immolune responses.SeminImmolunol.1998 Dec；10(6)481-9.17.Hurtado JC，Kim SH，Pollok KE，LeeZH，Kwon BS.Potential role of 4-1BB in T cell activation.Comparison withthe costimulatory molecule CD28.J Immolunol.1995 Oct 1；155(7)3360-7.18.Zhou Z，Kim S，Hurtado J，Lee ZH，Kim KK，Pollok KE，Kwon BS.Characterization of human homologue of 4-1BB and its ligand.ImmolunolLett.1995 Feb；45(1-2)67-73.19.Alderson MR，Smith CA，Tough TW，Davis-Smith T，Armitage RJ，F(xiàn)alk B，Roux E，Baker E，Sutherland GR，Din WS.Molecular and biological characterization of human 4-1BB and its ligand.EurJ Immolunol.1994 Sep；24(9)2219-27.20.Schwarz H，Tuckwell J，Lotz M.Areceptor induced by lymphocyte activation(ILA)a new member of the humanNGFR/TNFR family.Gene.1993 Dec 8；134(2)295-8.21.Goodwin RG，DinWS，Davis-Smith T，Anderson DM，Gimpel SD，Sato TA，Maliszewski CR，Brannan CI，Copeland NG，Jenkins NA，et al.Molecular cloning of a ligandfor the inducible T cell gene 4-1BBa member of an emerging family ofcytokines with homology to tumor necrosis factor.Eur J Immolunol.1993Oct；23(10)2631-41.22.Pollok KE，Kim YJ，Zhou Z，Hurtado J，Kim KK，Pickard RT，Kwon BS.Inducible T cell antigen 4-1BB.Analysis of expressionand function.J Immolunol.1993 Feb 1；150(3)771-81.23.Kwon BS，Weissman SM.cDNA sequences of two inducible T-cell genes.Proc NatlAcad Sci U S A.1989 Mar；86(6)1963-7)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是在上述各種策略的基礎(chǔ)上，建立了一套具有特色的體外分子定向進(jìn)化策略，用于抗體改形。首先，在Kabat抗體可變區(qū)序列庫(kù)中進(jìn)行同源搜索，確定序列高度相似的人抗體序列作為移植受體序列。將移植受體序列和鼠源抗體序列在Kabat抗體可變區(qū)序列庫(kù)中進(jìn)行亞群分類(lèi)，確定亞群共有序列以及高度保守位點(diǎn)。在進(jìn)行CDR移植之后，保留在鼠源抗體序列、鼠源亞群共有序列、移植受體序列及其人源亞群共有序列之間一致的FR區(qū)的氨基酸殘基。不一致的位點(diǎn)根據(jù)保守性進(jìn)行取舍。無(wú)法取舍的位點(diǎn)位點(diǎn)“簡(jiǎn)并”鼠源氨基酸殘基和人源氨基酸殘基，分別設(shè)計(jì)成改形VH庫(kù)和改形VL庫(kù)。在兩者之間添加一段連接肽(GGGGSGGGGSGGGGS)后設(shè)計(jì)成改形單鏈抗體庫(kù)。通常氨基酸“簡(jiǎn)并”位點(diǎn)達(dá)到30個(gè)左右，當(dāng)翻譯成DNA水平的改形單鏈抗體庫(kù)后，堿基“簡(jiǎn)并”位點(diǎn)達(dá)到40個(gè)左右，因此該改形單鏈抗體庫(kù)中重組體個(gè)數(shù)約為230-240，即109-1012。如此大的庫(kù)容超過(guò)了噬菌體展示的極限，因此在采用重疊PCR和DNA shuffling技術(shù)構(gòu)建完成上述改形單鏈抗體庫(kù)后，我們采用體外篩選技術(shù)核糖體展示，篩選改形單鏈抗體。應(yīng)用該策略，我們成功進(jìn)行抗4-1BB單鏈抗體的改形。
該策略與結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的抗體改形策略不同，可以從一個(gè)由大量突變體組成的改形抗體庫(kù)中篩選改形抗體。與采用噬菌體展示等體內(nèi)篩選技術(shù)的體內(nèi)分子定向進(jìn)化策略相比，該策略的整個(gè)過(guò)程完全在體外進(jìn)行，不需經(jīng)過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)化的步驟，操作簡(jiǎn)便、快捷，尤其適于進(jìn)行大容量改形抗體庫(kù)(≥1014)的篩選。該策略具有相當(dāng)?shù)莫?dú)創(chuàng)性，在抗體改形中具有廣泛的應(yīng)用前景。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種用于抗體改形的體外分子定向進(jìn)化方法，包括下列步驟(1)根據(jù)抗體序列在進(jìn)化上的保守性確定抗體序列的種屬特異性和個(gè)體特異性，確定FR區(qū)關(guān)鍵氨基酸殘基的位置，并通過(guò)簡(jiǎn)并關(guān)鍵氨基酸殘基的方式，設(shè)計(jì)成改形單鏈抗體庫(kù)抗體庫(kù)；(2)通過(guò)簡(jiǎn)并合成寡聚核苷酸片段以及重疊PCR技術(shù)構(gòu)建初級(jí)改形抗體庫(kù)，并且采用DNA改組技術(shù)隨機(jī)重組簡(jiǎn)并位點(diǎn)和引進(jìn)隨機(jī)突變，形成次級(jí)改形抗體庫(kù)；和(3)通過(guò)PCR的方法構(gòu)建核糖體展示模板，進(jìn)行核糖體展示篩選，實(shí)現(xiàn)分子定向進(jìn)化。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供用于抗4-1BB抗體改形的體外分子定向進(jìn)化方法，包括下列步驟(1)根據(jù)抗體序列在進(jìn)化上的保守性確定抗體序列的種屬特異性和個(gè)體特異性，確定FR區(qū)關(guān)鍵氨基酸殘基的位置，并通過(guò)簡(jiǎn)并關(guān)鍵氨基酸殘基的方式，設(shè)計(jì)成抗4-1BB改形單鏈抗體庫(kù)抗體庫(kù)；(2)通過(guò)簡(jiǎn)并合成寡聚核苷酸片段以及重疊PCR技術(shù)構(gòu)建初級(jí)改形抗體庫(kù)，并且采用DNA改組技術(shù)隨機(jī)重組簡(jiǎn)并位點(diǎn)和引進(jìn)隨機(jī)突變，形成次級(jí)改形抗體庫(kù)；和(3)通過(guò)PCR的方法構(gòu)建核糖體展示模板，進(jìn)行核糖體展示篩選，實(shí)現(xiàn)分子定向進(jìn)化，獲得抗4-1BB改形單鏈抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供使用上述方法構(gòu)建的適合在大腸桿菌中表達(dá)的抗4-1BB改形單鏈抗體的氨基酸序列及其編碼核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種用于表達(dá)抗4-1BB改形單鏈抗體的載體，其含有上述的核苷酸序列。優(yōu)選地，它是4-1BB-pFUW802。
本發(fā)明的再一個(gè)方面是提供一種含有上述載體，優(yōu)選地，含有載體4-1BB-pFUW802的大腸桿菌宿主細(xì)胞。
另外，需要指出的是，在本申請(qǐng)的上下文的公開(kāi)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其它具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)的方面和具有創(chuàng)造性的有益效果對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是可以理解的。


圖1.體外分子定向進(jìn)化策略用于抗4-1BB單鏈抗體改形的實(shí)驗(yàn)路線(xiàn)圖2-1.改形抗41BB VH的設(shè)計(jì)，圖2-2.改形抗41BB VL的設(shè)計(jì)，其中MSUBV-K\HSUBIII\MSUBIIB\HSUBI亞群共有序列；M4B4VL\M4B4VH鼠源抗體輕鏈和重鏈序列；RE4B4VL和RE4B4VH改形抗體輕鏈和重鏈序列，其中并排序列為兼并序列；陰影序列亞群高度保守序列；000001，000040和000760VH候選移植受體序列；004983VL候選移植受體序列。
圖3.改形抗4-1BB單鏈抗體庫(kù)的核苷酸和氨基酸序列，陰影并行堿基為簡(jiǎn)并位點(diǎn)。
圖4.重疊PCR構(gòu)建抗4-1BB抗體初級(jí)抗體庫(kù)流程圖。
圖5.瓊脂糖電泳監(jiān)測(cè)重疊PCR構(gòu)建抗4-1BB初級(jí)改形抗體庫(kù)的過(guò)程，其中A步驟3.所得各PCR產(chǎn)物。泳道1-4分別對(duì)應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物I、II、III、IV。泳道5為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上而下依次為100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp；B步驟4所得各PCR產(chǎn)物。泳道1、2分別對(duì)應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物VH part和VL part，泳道3為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；C步驟5所得PCR產(chǎn)物。泳道1為PCR產(chǎn)物，初級(jí)改形抗4-1BB單鏈抗體庫(kù)，泳道2為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖6.瓊脂糖電泳監(jiān)測(cè)采用DNA shuffling技術(shù)構(gòu)建次級(jí)改形抗體庫(kù)的過(guò)程，其中ADNaseI酶切初級(jí)抗體庫(kù)DNA片段的結(jié)果。泳道1-4依次為酶切3min、2min、1min、30sec的結(jié)果。泳道5為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；B經(jīng)過(guò)自身延伸和PCR后得到的改形次級(jí)抗體庫(kù)DNA片段的鑒定。泳道1為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為全長(zhǎng)改形次級(jí)抗體庫(kù)DNA片段。
圖7-1.核糖體展示模板簡(jiǎn)圖。
圖7-2.核糖體展示元件-1T7元件(引入T7啟動(dòng)子、5’頸環(huán)結(jié)構(gòu)和核糖體結(jié)合位點(diǎn))。
圖7-3.核糖體展示元件-2Spacer元件(引入spacer和3’頸環(huán)結(jié)構(gòu))。
圖8-1.PCR構(gòu)建核糖體展示模板，其中泳道1為全長(zhǎng)核糖體展示模板，泳道2為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖8-2.瓊脂糖電泳鑒定體外轉(zhuǎn)錄的結(jié)果，其中泳道1為RT-PCR產(chǎn)物；泳道2為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖8-3.瓊脂糖電泳鑒定RT-PCR的結(jié)果，其中泳道1為RT-PCR產(chǎn)物；泳道2為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖8-4.Western-blotting鑒定體外翻譯產(chǎn)物，其中36KD為完整的體外翻譯產(chǎn)物；22.5KD為大腸桿菌內(nèi)源性生物素化蛋白。
圖9.pFUW802質(zhì)粒簡(jiǎn)圖。
圖10.ELISA檢測(cè)改形抗4-1BB抗體的結(jié)合活性，其中，對(duì)于每個(gè)克隆的三個(gè)結(jié)果而言(包括空載體對(duì)照)，第一個(gè)柱形代表包被1μg/ml4-1BB時(shí)的測(cè)定結(jié)果；第二個(gè)柱形代表不加任何抗原(4-1BB)時(shí)的測(cè)定結(jié)果；第三條柱形代表前兩個(gè)測(cè)量結(jié)果的差值。因此第三條柱形的數(shù)值代表該改形抗體對(duì)4-1BB的相對(duì)結(jié)合能力。
圖11-1.Re-3的VH區(qū)的序列比對(duì)結(jié)果，圖11-2.Re-3的VL區(qū)的序列比對(duì)結(jié)果。
圖11-3抗4-1BB改形單鏈抗體(re-3)突變位點(diǎn)的分析結(jié)果圖12.Re-3的VH區(qū)的結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果，其中Are-3和m4b4-1 scFv的結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果；Bm4b4-1 scFv的結(jié)構(gòu)，與re-3的明顯不匹配區(qū)已經(jīng)標(biāo)出；C-Eregion-1、region-2、region-3的放大圖。
發(fā)明詳述在進(jìn)行抗體改形時(shí)，需要綜合考慮以下幾方面因素親和力、特異性和免疫原性。抗體的特異性一般認(rèn)為是由CDR區(qū)決定。而CDR區(qū)是決定抗體親和力的主要因素，F(xiàn)R區(qū)為CDR區(qū)提供支撐骨架，間接影響抗體的親和力?？贵w的免疫原性是指其作為異源物質(zhì)，進(jìn)入人體后，激起機(jī)體免疫反應(yīng)的性質(zhì)，如激起機(jī)體HAMA反應(yīng)的能力?？贵w序列的種屬特異性及個(gè)體特異性與其免疫原性直接相關(guān)。在Kabat抗體序列手冊(cè)中，將鼠源抗體序列和人源抗體序列分別分為不同的亞群(subgroup)，每個(gè)亞群的共有序列為該亞群中最為保守的氨基酸殘基，代表著抗體的種屬特異性。其中某些氨基酸(如大多數(shù)CDR區(qū)氨基酸殘基和部分FR區(qū)氨基酸殘基)的保守性非常低，代表抗體的個(gè)體特異性。這些氨基酸殘基有可能是抗體序列重排或體細(xì)胞突變的結(jié)果，與抗體的親和力和特異性相關(guān)。因此這些代表抗體個(gè)體特異性的FR區(qū)氨基酸殘基是進(jìn)行抗體改形時(shí)，需要進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化的部位。
基于上述理論基礎(chǔ)，本發(fā)明提供了一整套用于抗體改形新策略。具體內(nèi)容如下(1)以鼠源抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列為模板，采用同源搜索的方法，從已有的免疫球蛋白序列庫(kù)(Kabatdatabasehttp//www.hgmp.mrc.ac.Uk/Bioinformatics/Databases/kabatn-help.html和http//www.hgmp.mrc.ac.uk/Bioinformatics/Databases/kabatp-help.html；V-basehttp//www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php？menu＝901)中尋找CDR移植受體。在確定了同源性較高的候選移植受體抗體序列后，將每條序列均在Kabat抗體序列庫(kù)中進(jìn)行亞群分類(lèi)，并確定亞群共有序列。通常這些移植受體序列均屬于同一個(gè)亞群。同時(shí)將鼠源抗體序列也在Kabat抗體序列庫(kù)中進(jìn)行亞群分類(lèi)，并確定亞群共有序列。
(2)將鼠源抗體序列及其亞群共有序列、候選移植受體抗體序列及其亞群共有序列進(jìn)行比對(duì)(alignment)，保留鼠源抗體的CDR區(qū)和FR區(qū)內(nèi)一致的序列。我們認(rèn)為，鼠源抗體亞群共有序列和移植受體抗體亞群共有序列，在一定程度上分別代表鼠種屬保守性和人種屬保守性。如果鼠源抗體序列的氨基酸殘基在移植受體抗體亞群共有序列相應(yīng)位置出現(xiàn)，并且屬于高度保守(出現(xiàn)幾率大于90％)，則該氨基酸殘基可能在維持抗體的特征性結(jié)構(gòu)(如Ig fold)方面，具有重要意義，在改形抗體的序列中必須保留。其他的氨基酸殘基有可能是體細(xì)胞突變的結(jié)果，代表該抗體的個(gè)體特異性，有可能與抗體本身的特異性和親和力相關(guān)，所以在改形抗體的序列中，將鼠源氨基酸殘基與移植受體抗體亞群共有序列的相應(yīng)氨基酸殘基簡(jiǎn)并。至此，設(shè)計(jì)完成VH和VL改形抗體庫(kù)。
(3)在兩者之間添加一段重復(fù)性連接肽(GGGGSGGGGSGGGGS)設(shè)計(jì)成改形單鏈抗體庫(kù)。由于在氨基酸水平上，該改形單鏈抗體庫(kù)共存在30個(gè)左右“簡(jiǎn)并”位點(diǎn)。
(4)按照大腸桿菌喜好的密碼子表，將該改形單鏈抗體庫(kù)翻譯成DNA序列。由于選用簡(jiǎn)并密碼，在DNA水平上，約存在40個(gè)左右的兼并位點(diǎn)。這些位點(diǎn)如果自由重組將產(chǎn)生240(約1012)個(gè)重組體。而在進(jìn)行單域抗體的改形時(shí)，簡(jiǎn)并位點(diǎn)減半。單域改形抗體庫(kù)的重組體個(gè)數(shù)最多為106，采用噬菌體展示技術(shù)就可以完成篩選，此過(guò)程即體內(nèi)分子定向進(jìn)化。而單鏈抗體改形抗體庫(kù)的重組體個(gè)數(shù)最多可以達(dá)到1012，因此應(yīng)該選擇核糖體展示作為篩選手段，進(jìn)行體外分子定向進(jìn)化。
(5)按照重疊PCR的要求，將改形單鏈抗體庫(kù)(DNA)“拆分”成60個(gè)核苷酸以下的單鏈寡聚核苷酸片段，進(jìn)一步采用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建初級(jí)改形單鏈抗體庫(kù)。
(6)由于某些單鏈寡聚核苷酸片段含有不止一個(gè)簡(jiǎn)并位點(diǎn)，因此通過(guò)采用DNA改組技術(shù)，進(jìn)行隨機(jī)重組，構(gòu)建次級(jí)改形單鏈抗體庫(kù)。
(7)采用一步PCR反應(yīng)，引入核糖體展示元件，如T7啟動(dòng)子(Promoter)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，空間間隔區(qū)(Spacer)，5’頸環(huán)(Stem loop)和3’Stem loop等。進(jìn)行核糖體展示。
(8)經(jīng)過(guò)3輪核糖體展示篩選后，篩選產(chǎn)物(即RT-PCR產(chǎn)物)直接經(jīng)過(guò)酶切反應(yīng)連入分泌型表達(dá)載體pFUW802，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151(購(gòu)自發(fā)瑪西亞公司)，進(jìn)行分泌型表達(dá)和活性測(cè)定，鑒定與抗原具有較高結(jié)合活性的克隆。經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證后，得到改形單鏈抗體。
與現(xiàn)有的抗體改形策略相比，本發(fā)明提出的體外分子定向進(jìn)化策略具有以下特點(diǎn)1.FR區(qū)的關(guān)鍵氨基酸殘基的確定方式的特點(diǎn)其他的改形策略均是按照抗體結(jié)構(gòu)和定點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定關(guān)鍵氨基酸殘基，可以確定的關(guān)鍵氨基酸殘基數(shù)目較少。按照本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路，根據(jù)抗體序列在進(jìn)化上的保守性確定抗體序列的種屬特異性和個(gè)體特異性，確定關(guān)鍵氨基酸殘基的位置。
2.構(gòu)建改形抗體庫(kù)的方式的特點(diǎn)通過(guò)簡(jiǎn)并合成寡聚核苷酸片段以及重疊PCR技術(shù)構(gòu)建初級(jí)改形抗體庫(kù)，并且采用DNA shuffling技術(shù)隨機(jī)重組簡(jiǎn)并位點(diǎn)和引進(jìn)隨機(jī)突變，形成次級(jí)改形抗體庫(kù)。
3.篩選方式的特點(diǎn)與體內(nèi)篩選方式(如噬菌體展示技術(shù))相比，核糖體展示技術(shù)完全在體外操作，不需要進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可以進(jìn)行大庫(kù)容篩選。按照本發(fā)明確定關(guān)鍵氨基酸殘基位置和簡(jiǎn)并位點(diǎn)數(shù)目的方案，在進(jìn)行單鏈抗體的改形時(shí)，通常在氨基酸水平上共存在15-30個(gè)“兼并”位點(diǎn)。在“翻譯”成DNA序列時(shí)，由于選用兼并密碼，在DNA水平上約存在40個(gè)左右的兼并位點(diǎn)。這些位點(diǎn)如果自由重組將產(chǎn)生240(約1012)個(gè)重組體。單鏈抗體改形抗體庫(kù)的重組體個(gè)數(shù)最多可以達(dá)到1014，噬菌體展示技術(shù)是無(wú)法滿(mǎn)足這一要求的，因此只能選擇核糖體展示作為篩選手段。
4.將DNA shuffling與核糖體展示結(jié)合，進(jìn)行體外分子定向進(jìn)化篩選改形抗體時(shí)，不經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的步驟，因此操作更為簡(jiǎn)便。采用自主構(gòu)建的大腸桿菌分泌型表達(dá)載體(pFUW802)，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的分泌型表達(dá)和鑒定。
可以采用該策略進(jìn)行改形的抗體包括，F(xiàn)ab(fragment of antigenbinding)，單鏈抗體(scFvsingle chain antibody)，單域抗體(single dimainantibody)。
本發(fā)明采用上述體外分子定向進(jìn)化策略成功進(jìn)行了改形，獲得了具有較高結(jié)合活性的抗4-1BB改形單鏈抗體(re-3)。該抗體具有如下氨基酸序列1 QVQLVQSGAE VVKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMHWVNQR PGQGLEWMGE51 INPGNGHTNY NEKFKSSVTI TADTSSSTAY MQLSPLSSED SAVYYCARSF101 TTACAFAYWG QGTLVTVSST SGGGGSGGGS GGGGSSRDIV MTQSPATLSV151 TPGDRATLSC RASQTISDYL HWYQQKSHES PRLLIKYASQ SISGIPNRFS201 GSGSGSDFTL TINSVEPEDF AVYYCQDGHS FPPTFGGGTK LEIK(SEQ ID NO.2)。
本發(fā)明的抗4-1BB改形單鏈抗體(re-3)具有如下核苷酸序列1CAG GTT CAG CTG GTG CAA TCG GGT GCG GAA GTG GTG AAA CCG GGT46GCA TCT GTT AAA GTG TCT TGC AAA GCG AGC GGT TAC ACC TTC ACC91TCT TAC TGG ATG CAC TGG GTT AAT CAG CGT CCG GGT CAG GGT CTG136GAA TGG ATG GGT GAA ATC AAC CCG GGT AAC GGC CAC ACC AAC TAC181AAC GAA AAA TTC AAA AGC AGT GTG ACC ATT ACC GCG GAC ACG TCT226AGC AGC ACC GCG TAC ATG CAG CTG AGC CCC CTG AGC AGC GAA GAC271AGC GCT GTT TAC TAC TGC GCA CGT TCT TTC ACC ACC GCT TGT GCG316TTC GCC TAC TGG GGT CAG GGC ACC CTG GTG ACC GTT TCC TCC ACT361AGT GGA GGC GGT GGG AGC GGC GGT GGT TCT GGG GGT GGC GGC AGC406TCT AGA GAC ATC GTT ATG ACC CAG AGC CCG GCG ACC CTG AGC GTG451ACC CCG GGT GAT CGT GCG ACC CTG TCT TGC CGT GCG TCT CAG ACC496ATC AGC GAC TAC CTG CAC TGG TAC CAA CAG AAA AGC CAC GAA TCC
541CCG CGT CTG CTG ATC AAA TAC GCA TCT CAG TCT ATC AGC GGT ATC586CCG AAC CGT TTC TCT GGT TCC GGT AGC GGT TCT GAC TTC ACC CTG631ACC ATC AAC AGC GTG GAA CCG GAA GAC TTT GCC GTG TAC TAC TGC676CAG GAC GGT CAC TCT TTC CCG CCG ACC TTC GGA GGT GGT ACC AAA721CTG GAA ATC AAA(SEQ ID NO.1)。
本發(fā)明還提供可用于鑒定篩選產(chǎn)物的含有本發(fā)明的抗4-1BB改形單鏈抗體re-3的核苷酸序列的表達(dá)載體。優(yōu)選地，該載體為為pFUW802，其具備以下優(yōu)點(diǎn)具有合適的多克隆位點(diǎn)，用于表達(dá)單鏈抗體；該質(zhì)粒適合進(jìn)行周質(zhì)腔分泌表達(dá)，周質(zhì)腔抽提物可直接用于ELISA檢測(cè)；該質(zhì)粒含有c-myc檢測(cè)標(biāo)簽，方便用抗c-myc標(biāo)簽的抗體(如9E10)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。
本發(fā)明還提供了含有上述載體的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選地為大腸桿菌。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例根據(jù)抗體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列的進(jìn)化保守性，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并改形抗4-1BB單鏈抗體庫(kù)，然后將核糖體展示技術(shù)和DNA改組技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)體外分子定向進(jìn)化。從改形單鏈抗體庫(kù)中篩選改形抗4-1BB單鏈抗體。該分子定向進(jìn)化方法的實(shí)驗(yàn)路線(xiàn)見(jiàn)圖1。
1.初級(jí)改形抗4-1BB單鏈抗體庫(kù)的分子設(shè)計(jì)(1)將文獻(xiàn)(Garni-Wagner BA，et al.，4-1BB is expressed onCD45RAhiROhi transitional T cell in humans.Cell Immunol.1996Apr 10；169(1)91-8.)報(bào)道的具有激動(dòng)活性的鼠抗4-1BB抗體(4b4-1克隆)的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列(見(jiàn)圖2.1M4B4VH和圖2.2M4B4VL)，按照同源搜索的方法，分別從Kabat序列庫(kù)和V-base庫(kù)中尋找同源程度最高的人抗體序列(VH見(jiàn)圖2.1000001，000040，000760；VL見(jiàn)圖2.2004983)作為候選移植受體序列。進(jìn)一步將原鼠源抗體序列和候選抗體序列在Kabat序列庫(kù)中進(jìn)行亞群歸類(lèi)，并確定各自的亞群共有序列(VH見(jiàn)圖2.1HSUBIII；VL見(jiàn)圖2.2HSUBI)。在每個(gè)亞群中，F(xiàn)R區(qū)內(nèi)出現(xiàn)幾率為90％以上的氨基酸殘基定為高度保守殘基(圖2.1和圖2.2中陰影部分)。
(2)進(jìn)行CDR區(qū)移植，保留鼠抗4-1BB抗體(4b4-1)的CDR區(qū)，以及在鼠源抗體序列、鼠源亞群共有序列、候選移植受體亞群共有序列之間，完全一致的FR區(qū)氨基酸殘基。三者之間不一致的氨基酸位點(diǎn)，如果鼠源抗體的氨基酸殘基與鼠源亞群共有序列一致，并且是高度保守殘基，則將其替代為候選移植受體亞群共有序列的相應(yīng)氨基酸殘基。否則保留該氨基酸殘基或者將其與候選移植受體亞群共有序列的相應(yīng)氨基酸殘基簡(jiǎn)并。至此，改形抗4-1BB VH(圖2-1)和改形抗4-1BB VL(圖2-2)設(shè)計(jì)完成。將兩者以一段連接肽連接起來(lái)即設(shè)計(jì)完成初級(jí)改形抗4-1BB單鏈抗體庫(kù)(見(jiàn)圖3)。
(3)進(jìn)一步，按照大腸桿菌偏向的遺傳密碼(http//www.kazusa.or.jp/codon/)將該氨基酸水平的改形抗體庫(kù)轉(zhuǎn)換為DNA水平的改形抗4-1BB單鏈抗體庫(kù)(見(jiàn)圖3)。
(4)將DNA水平的改形抗4-1BB單鏈抗體庫(kù)拆分成24條寡聚核苷酸片段，以便于使用重疊PCR技術(shù)拼接成全長(zhǎng)的初級(jí)改形抗4-1BB單鏈抗體庫(kù)DNA片段。由于每個(gè)單鏈寡聚核苷酸片段含有不止一個(gè)簡(jiǎn)并位點(diǎn)，因此需要進(jìn)一步通過(guò)DNA改組技術(shù)進(jìn)行隨機(jī)重組，構(gòu)建次級(jí)改形抗4-1BB單鏈抗體庫(kù)。以下為用于拼接全長(zhǎng)初級(jí)改形抗4-1BB單鏈抗體庫(kù)的寡聚核苷酸片段，括號(hào)內(nèi)的核苷酸與前一個(gè)核苷酸簡(jiǎn)并。
1.5’-GGCCATGGACTACAAAGACCTC-3’；2.5’-CAGCTGACCGTGAGGTCTTTGTAGTCCAT；3.5’-CTCGAGCAGGTTCAGCTGC(G)A(T)GCAAC(T)CGGGTGCGGAAC(G)TGG(A)T(A)GAAACCGG GTGCATCTG-3’；4.5’-TGAAGGTGTAACCGCTCGCTTTGCAAGACAG(C)TTTAACAGATGCACCCGGTTTC-3’；
5.5’-CGAGCGGTTACACCTTCAC(G)CTCTTACTGGATGCACTGGGTT-3’；6.5’-CCTG ACCCGGACGCTGT(A)T(C)T(G)AACCCAGTGCATCCAGTA-3’；7.5’-AGCGTCCGGGTCAGGG(T)TCTGGAATGGATC(G)GGTGAAATCAACCCGGGTAACGGCCAC-3’；8.5’-GCTTTTGAA TT T TTCGTTGTAGTTG GTGTGGCCGTTACCCGGG-3’；9.5’-CGAAAAATTCAAAAGCA(C)A(G)A(T)GC(T)GACCC(A)TTACCGT(C)GGACAA(C)GTCTC(G)CAGACCGTACA-3’；10.5’-CAGGGAGCTCAGCTGCATGTA CGCGGTGCTG-3’；11.5’-GCAGCTGAGCCTGA(C)C(G)CAGCGAAGACAG(C)CGCTGTTTACTACTGCGC-3’；12.5’-CCCAGTAGGCGAACGCACGAGCGGTGGTGAAAGAACGTGCGCAGTAGTAAACAGCG-3’；13.5’-GCGTTCGCCTACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTGACCGTTTCCTCCACTAGTGGAGGC-3’；14.5’-TAGAGCTACCGCCACCCCCAGAACCACCACCGCCGCTCCCACCGCCTCCACTAGTGGAG-3’；15.5’-GGTGGCGGAAGCTCTAGAGACATCGTTATGACCCAGAGCC-3’；16.5’-GACGCACGGCAAGACAGGC(G)TCA(G)CACGA(T)TCACCCGGGG(C)TCACGC
TCT(A)GGGTCGCCT(G)GGCTCTGGGTCATAAC-3’；17.5’-CCTGTCTTGCCGTGCGTCTCAGACCATCAGCGACTACCTGCACTGGTACCAACAGAAA-3’；18.5’-TGATCAGCAGACGCGGGGA(C)TTC(G)GTGGCTTTTCTGTTGGTACCAGTG-3’；19.5’-CCCGCGTCTGCTGATCAAATACGCATCTCAGTCTATCAGCGGTATCCCG-3’；20.5’-GGGTGAAGTCAGAACCGCTACCGGAACCAGAGAAACGGC(T)T(C)CGGGATACCGCTGATAGA-3’；21.5’-CGGTTCTGACTTCACCCTGAG(C)CATCAACAGCGTGGAACCGGAAGAC-3’；22.5’-GCGGGAAAGAGTGACCGTCCTGGCAGTAGTACACGC(G)CAAC(A)GTCTTCCGGTTCCACGC-3’；23.5’-CGGTCACTCTTTCCCGCCGACCTTCGGTGGTGGTACCAAA-3’；24.5’-ACCGAATTCTTTGATTTCCAG(C)TTTGGTACCACCACCGAA-3’.
2.重疊PCR構(gòu)建抗4-1BB抗體初級(jí)抗體庫(kù)(操作過(guò)程見(jiàn)圖4)步驟1方法按照?qǐng)D4將片段1-24各自配對(duì)重疊延伸，不加引物，反應(yīng)產(chǎn)物((1)-(12))不需要回收，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。
混合物按照?qǐng)D4將片段1-24兩兩配對(duì)，各1μl(10pmol)；2μl 10×PCR緩沖液(500mM KCl，50mM Tris pH 8.5，25mM Mg(Cl)2下同)；2μldNTP(2mM dATP，dTTP，dCTP，dGTP)(購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司，下同)；0.3μl Taq酶(1U)(購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司，下同)；水14μl。
反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；10個(gè)循環(huán)。
步驟2方法按照?qǐng)D4將反應(yīng)產(chǎn)物(2)-(11)各自配對(duì)重疊延伸，不加引物。反應(yīng)產(chǎn)物(A-E)不需要回收，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。
混合物按照?qǐng)D4將反應(yīng)產(chǎn)物(2)-(11)進(jìn)行配對(duì)，各10μl。
反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；10個(gè)循環(huán)。
步驟3方法按照?qǐng)D4將反應(yīng)產(chǎn)物(1)、A、B、C、E、(12)分別配對(duì)，單獨(dú)使用反應(yīng)產(chǎn)物D，添加各自小引物(引物1和6對(duì)應(yīng)(1)和A的配對(duì)，引物7和14對(duì)應(yīng)B和C的配對(duì)，引物15和18對(duì)應(yīng)D，引物19和24對(duì)應(yīng)E和(12)的配對(duì))，PCR擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物(I-IV)1％瓊脂糖凝膠電泳回收(見(jiàn)圖5-A)。
混合物按照?qǐng)D4將反應(yīng)產(chǎn)物(1)、A、B、C、E、(12)分別配對(duì)，各1μl；2μl 10×PCR緩沖液；2μl dNTP(2mM each)；引物各1μl，約10pmol；0.3μl Taq酶(1U)；水12μl(或13μl)。
反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；25個(gè)循環(huán)。
步驟4按照?qǐng)D4將反應(yīng)產(chǎn)物I-IV分別配對(duì)，添加各自引物(1和14對(duì)應(yīng)I和II的配對(duì)，15和24對(duì)應(yīng)III和IV的配對(duì))，PCR擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物(VH part和VL part)1％瓊脂糖凝膠電泳回收(見(jiàn)圖5-B)。
混合物按照?qǐng)D4將反應(yīng)產(chǎn)物I-IV分別配對(duì)，各1μl；2μl 10×PCR緩沖液；2μl dNTP(2mM each)；引物各1μl(10pmol)；0.3μl Taq酶(1U)；水12μl。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；25個(gè)循環(huán)。
步驟5按照?qǐng)D4將反應(yīng)產(chǎn)物VH part和VL part配對(duì)，添加引物1和24，PCR擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳回收750bpDNA片段，即初級(jí)改形抗4-1BB單鏈抗體庫(kù)(見(jiàn)圖5-C)。
混合物反應(yīng)產(chǎn)物VH part和反應(yīng)產(chǎn)物VL part各1μl；2μl 10×PCR緩沖液；2μl dNTP(2mM each)；引物各1μl(pmol)，約10pM；0.3μl Taq酶(1U)；水12μl。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸1min；25個(gè)循環(huán)。
3DNA改組技術(shù)構(gòu)建次級(jí)改形抗4-1BB單鏈抗體庫(kù)(1)將2-5μg 750bp DNA片段溶于20μl水中，加入2.5μl緩沖液I(1MTris-HCl pH7.5)2.5μl緩沖液II(200mM MnCl2).。15℃平衡5min。
(2)同時(shí)將1μl RQI DNaseI(I型DNA酶)(購(gòu)自普洛麥格公司)與24μl水混合，15℃平衡5min。
(3)將上述兩種溶液混合均勻，于30sec、1min、2min、3min、分別取10μl立即加入到已有5μl冰預(yù)冷的緩沖液III(50mM EDTA，30％甘油)的EP管內(nèi)。
(4)最后以2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定(見(jiàn)圖6-A)，采用小片段DNA高效膠回收試劑盒(購(gòu)自上海華舜公司)回收50-100bp的小片段，溶解在10μl水中。
(5)自身PCR或無(wú)引物PCRPCR反應(yīng)混合物5μl 10×PCR緩沖液；5μl dNTP(2mM each)；2.5U pfu酶(購(gòu)自上海博亞生物技術(shù)有限公司)；10μl回收小片段；水29.5μl。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性4min；94℃變性30sec；55℃退火1min；72℃延伸1min 30sec；30-40個(gè)循環(huán)?；厥掌卧叫。嘶饻囟仍降?，循環(huán)數(shù)越多。不用回收。
(6)PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)混合物2μl 10×PCR緩沖液；2μldNTP(2mM each)；引物1和24(參照?qǐng)D4)各加1μl(10pmol)；0.5μlpfu(2.5U)；上一輪PCR產(chǎn)物1μl；水13μl。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性4min；94℃變性30sec；58℃退火30sec，72℃延伸1min，20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸2.5min。1％瓊脂糖凝膠電泳回收750bp附近的特異片段(見(jiàn)圖6-B)，溶于30μl ddH2O，即次級(jí)改形抗體庫(kù)。
4采用PCR方法構(gòu)建核糖體展示模板(簡(jiǎn)圖見(jiàn)圖7-1)采用PCR技術(shù)，引進(jìn)核糖體展示元件PCR反應(yīng)混合物2μl 10×PCR緩沖液；2μl dNTP(2mM each)；引物T7-primer和T5te各加1μl(10pmol)；0.5μl pfu酶(2.5U)；T7和spacer元件(提前制備，序列見(jiàn)圖7-2和圖7-3，具體序列來(lái)自文獻(xiàn)Hanes J，et al.，Selecting and evolving functional proteins in vitro by ribosome display.Methods Enzymol.2000；328404-30.)各1μl(約10pmol)；次級(jí)改形抗體庫(kù)1μl；水11μl。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性4min；94℃變性30sec；40℃退火30sec，8個(gè)循環(huán)，然后58℃退火30sec，22個(gè)循環(huán)；72℃延伸2.5min。1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定(見(jiàn)圖8-1)，回收1,000bp附近的特異片段。將PCR產(chǎn)物直接用于體外轉(zhuǎn)錄。
T7-primer.
ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGG；T5te.CCGCACACCTTACTGGTGTGCGGATCACCAGTAGC。
5體外轉(zhuǎn)錄(1)去除RNasePCR產(chǎn)物中加入等體積酚-氯仿-異戊醇(25/24/1)，搖勻后12,000g，4℃離心15秒；取水相，加入2倍體積的氯仿，搖勻后再次12,000g，4℃離心15sec；取水相，加入1/10體積的1mol NaCl和2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃放置30min，12,000g，4℃離心30min；70％乙醇洗滌，干燥后溶于無(wú)RNA酶水中。
(2)體外轉(zhuǎn)錄依次加入以下各種組分30μl 5×T7 RNA聚合酶緩沖液(1MHEPES-KOH pH7.6；150mM醋酸鎂；10mM精胺；0.2mM DTT)；60μl DTT(100mM)(二硫蘇糖醇，購(gòu)自Sigma公司)；120U RNasin(RNA酶抑制劑，下同)(購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司)；20μl NTP(50mM)(購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司)；1.5-3μg DNA模板；300U T7 RNA聚合酶(購(gòu)自普洛麥格公司)；用水補(bǔ)足至150μl。在37℃水浴2個(gè)hr，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
(3)LiCl選擇性沉淀RNA將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于冰上冷卻后，加入等體積的冰預(yù)冷的6M LiCl，輕輕混勻后，冰上放置30min；16,000g，4℃離心30min；加入500μl 70％乙醇洗滌沉淀，不用干燥，加入100μl無(wú)RNA酶水溶解沉淀；加入1/10體積的1M NaCl和2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃放置過(guò)夜；16,000g，4℃離心30min；加入500μl 70％乙醇洗滌沉淀，加入無(wú)RNA酶水溶解沉淀，并立即進(jìn)行體外翻譯。否則直接將沉淀懸浮在70％乙醇中，置-70℃或液氮保存。
(4)采用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(見(jiàn)圖8-2)
6體外翻譯(1)準(zhǔn)備冰預(yù)冷的洗滌緩沖液WBTH緩沖液(250mM Tris-HAc pH7.5，150mM NaCl，50mM Mg(Ac)2，0.1％Tween-20 and 2.5mg/ml肝素)(2)在冰上混合下列組分預(yù)混合物(250mM Tris-HAc pH7.5，氨基酸混合物(除蛋氨酸外，每種氨基酸1.75mM)10mM ATP，2.5mM GTP，5mMcAMP，150mM乙酰磷酸，2.5mg/ml E.coli tRNA，0.1mg/ml葉酸，7.5％PEG 8000)22μl；蛋氨酸(200mM)1.1μl；谷氨酸鉀(2M)11μl；Mg(Ac)2(100mM)7.6μl；anti-ssrA(200μM)2μl；真核分子伴侶PDI(44μM)(購(gòu)自Sigma公司)1.5μl；S-30抽提物(購(gòu)自普洛麥格公司)40μl。補(bǔ)水至100μl。
備注大腸桿菌具有一個(gè)10S-RNA多肽標(biāo)記系統(tǒng)，該系統(tǒng)以10S-RNA為模板翻譯出一個(gè)10肽，該10肽能夠標(biāo)記不含終止密碼的mRNA的翻譯產(chǎn)物，從而使后者被胞內(nèi)蛋白酶所識(shí)別而降解。anti-ssrA與10S-RNA互補(bǔ)，能夠抑制以其為模板的翻譯過(guò)程，從而抑制10S-RNA多肽標(biāo)記系統(tǒng)的作用。anti-ssrA(CTTAAGCACACCA GTAAGGTGTGCGGTCAGGATATTC ACCACAATCC C)。
(3)加入10μg/10μl mRNA庫(kù)，輕輕混勻后，37℃水浴放置7分鐘。
(4)將上述混合物與440μl WBTH混合，輕輕混勻后冰浴放置，準(zhǔn)備進(jìn)行親和篩選。
7.液相親和篩選(1)使用冰預(yù)冷的WBT緩沖液將鏈親和素-磁珠(購(gòu)自普洛麥格公司下同)洗4次，然后與等體積的WBT緩沖液(250mM Tris-HAc pH7.5，150mM NaCl，50mM Mg(Ac)2，0.1％Tween-20)混合，冰上保存。
(2)封閉篩選管將5ml的篩選管注滿(mǎn)4％的脫脂奶粉水溶液，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)1hr，進(jìn)行封閉。然后使用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，Na2HPO41.8mM KH2PO4)洗3次，注滿(mǎn)WBT，冰上保存。
(3)制備無(wú)生物素的脫脂奶粉溶液將1ml 12％的滅菌脫脂奶粉水溶液與100μl鏈親和素-磁珠混合后，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)1hr。去除鏈親和素-磁珠后，冰上保存(4)將體外翻譯產(chǎn)物與4倍體積(200μl)WBTH混合，輕輕搖勻。16,000g，4℃離心5min，去除不溶性成分，上清與50μl的無(wú)生物素的12％脫脂奶粉溶液和一定量生物素化4-1BB(購(gòu)自R&D公司)混合，使脫脂奶粉的濃度達(dá)到2％。將上述溶液轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的篩選管中，在冰室中反復(fù)倒轉(zhuǎn)1小時(shí)。使抗原和抗體充分結(jié)合。
(5)加入100μl鏈親和素-磁珠，繼續(xù)冰上反復(fù)倒轉(zhuǎn)10-15min，捕獲抗原-抗體-核糖體-mRNA復(fù)合物。
(6)以冰預(yù)冷的WBT緩沖液洗5次，加入200μl冰預(yù)冷的EB20緩沖液(50mM Tris-HAc pH 7.5，150mM NaCl，20mM EDTA 50μg/ml酵母tRNA(購(gòu)自Sigma公司)，繼續(xù)冰上反復(fù)倒轉(zhuǎn)5min，使核糖體大小亞基分離，釋放mRNA。解離下來(lái)的mRNA液氮保存或立即分離。
8分離純化mRNA及RT-PCR(1)采用Roche公司的高純度mRNA純化試劑盒純化mRNA。純化過(guò)程中使用DNaseI(I型DNA酶)消化殘留的DNA轉(zhuǎn)錄模板，以避免干擾對(duì)下一步的RT-PCR反應(yīng)。
(2)向洗脫下來(lái)的mRNA中，補(bǔ)加2μl T5te(約20pmol)引物，立即70℃水浴10min。然后室溫10min。
(3)同時(shí)準(zhǔn)備cDNA第一條鏈合成預(yù)混合物10μ1 5第一條鏈合成緩沖液()；10μl dNTP(2mM each)；5μl DTT(100mM)；50U RNasin；250Ustratascript逆轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自stratagene公司)。補(bǔ)水至27μl的總體積。將處理好的mRNA樣品(約23μl)加入到上述預(yù)混合物中，42℃水浴放置1hr后，75℃放置3min，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。
(4)合成第二條鏈PCR反應(yīng)混合物2μl 10×PCR緩沖液；2μl dNTP(2mMeach)；引物P1和P22各加1μl；0.5μl Taq酶(2.5U)；5μl第一條鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物，水9.5μl。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性4min；94℃變性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸2.5min；30個(gè)循環(huán)。1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收750bp附近的特異片段(見(jiàn)圖8-3)?；厥掌尾捎肞CR方法重新引進(jìn)核糖體展示元件，再次進(jìn)行核糖體展示，即重復(fù)實(shí)施例4-7。經(jīng)過(guò)三輪核糖體展示后，最后一輪篩選的RT-PCR產(chǎn)物，按照實(shí)施例10的操作進(jìn)行表達(dá)和鑒定。
9.體外翻譯產(chǎn)物的鑒定在進(jìn)行親和篩選之前，需要對(duì)是否成功進(jìn)行體外翻譯和體外翻譯的完整性進(jìn)行鑒定。由于體外翻譯體系較小，翻譯產(chǎn)物的量較少，因此普通的SDS-PAGE電泳和Western-blotting的靈敏度能滿(mǎn)足檢測(cè)要求。我們采用普洛麥格公司的TranscendTM Biotinlated Lysine tRNA作為翻譯底物，用于體外翻譯使翻譯產(chǎn)物生物素化，以便進(jìn)一步采用HRP標(biāo)記鏈親和素顯色系統(tǒng)進(jìn)行Western-blotting進(jìn)行檢測(cè)。該方法的靈敏度與放射自顯影Western-blotting相當(dāng)。
(1)在冰上混合下列組分預(yù)混合物(250mM Tris-HAc pH7.5，氨基酸混合物(除蛋氨酸外，每種氨基酸1.75mM)10mM ATP，2.5mM GTP，5mM cAMP，150mM乙酰磷酸，2.5mg/ml E.coli tRNA，0.1mg/ml葉酸，7.5％PEG 8000)22μl；蛋氨酸(200mM)1.1μl；谷氨酸鉀(2M)11μl；Mg(Ac)2(100mM)7.6μl；anti-ssrA(200μM)2μl；真核分子伴侶PDI(44μM)(購(gòu)自Sigma公司)1.5μl；S-30抽提物(購(gòu)自普洛麥格公司)40μl；TranscendTMBiotinlated Lysine tRNA(購(gòu)自普洛麥格公司)1-2μl。補(bǔ)水至100μl。
(2)加入10μg/10μl mRNA庫(kù)，輕輕混勻后，37℃水浴放置7分鐘。
(3)進(jìn)行變性非連續(xù)SDS-PAGE電泳，分離膠濃度8％。
(4)電泳結(jié)束后，將凝膠用清水漂洗，放入電轉(zhuǎn)緩沖液中浸泡，剪裁比凝膠稍大的纖維素膜和較之略小的濾紙一同在電轉(zhuǎn)緩沖液中浸泡。在電轉(zhuǎn)夾上依次加濾紙-凝膠-纖維素膜-濾紙，除凈各層間氣泡。
(5)電轉(zhuǎn)恒流0.3-0.4A電轉(zhuǎn)1-2hr后，取下纖維膜和凝膠，用TBS緩沖液(100mM Tris-Cl，0.9％(w/v)NaCl，pH 7.5)洗凈纖維膜。
(6)封閉將纖維素膜浸泡在封閉液中，輕輕振搖2hr。
(7)添加HRP標(biāo)記的鏈親和素用TBST緩沖液(100mM Tris-Cl，0.9％(w/v)NaCl，pH 7.5，0.05-0.1％(V/V)Tween-100)洗膜三次，每次5min。將纖維素膜浸泡在含適當(dāng)濃度HRP標(biāo)記的鏈親和素的封閉液中。輕輕振搖1hr，(8)顯色洗膜方法如上。加入DAB顯色液(5ml 100mM Tris-Cl，pH7.5；100μl DAB貯存液(DAB3.3‘二氨基聯(lián)苯胺，購(gòu)自Sigma公司。溶于水(40mg/ml)后，分裝成100μl，-20℃保存)；25μl NiCl貯存液(溶于水，80g/ml，分裝成100μl，-20℃保存)；15μl 30％H2O2)。
(9)待顯色至理想程度時(shí)用清水沖洗，終止反應(yīng)，充分沖洗后避光保存纖維素膜。(結(jié)果見(jiàn)圖8-4)10.分泌型表達(dá)載體pFUW802的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)室在載體pCOMB3(Huse WD，et al.，Generation of a largecombinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda.Science.1989 Dec；246(4935)1275-81.)的基礎(chǔ)上構(gòu)建了分泌型表達(dá)載體pFUW80(張衛(wèi)國(guó)等，噬菌體呈示單鏈抗體表達(dá)載體及小鼠非特異抗體庫(kù)的構(gòu)建，遺傳學(xué)報(bào)，26(2)99-106，1999)。該載體在多克隆位點(diǎn)之后帶有His純化標(biāo)簽(His)6，因此可以采用金屬螯合親和層析對(duì)使用該載體表達(dá)的外源蛋白直接進(jìn)行純化。為了對(duì)該載體表達(dá)的外源蛋白直接進(jìn)行ELISA檢測(cè)，我們將His純化標(biāo)簽替換為c-myc檢測(cè)標(biāo)簽(EQKLISEEDL)(c-myc檢測(cè)標(biāo)簽序列來(lái)自公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)Hilpert K.et al.，Anti-c-myc antibody 9E 10epitope key positions and variability characterizedusing peptide spot synthesis on cellulose.Protein Eng.2001 Oct；14(10)803-6.)，構(gòu)建成分泌型表達(dá)載體pFUW802，實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)表。pFUW802的簡(jiǎn)圖見(jiàn)圖9。
11抗體的分泌型表達(dá)及鹽休克法提取周質(zhì)腔組分(1)將最后一輪篩選獲得的RT-PCR產(chǎn)物，XhoI/EcoRI雙切后連入分泌型表達(dá)載體pFUW802(簡(jiǎn)圖見(jiàn)圖9)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151(購(gòu)自發(fā)瑪西亞公司)，涂LB-A平板(10g/l tryptone(購(gòu)自GIBCO公司，下同)，5g/l yeast extract(購(gòu)自GIBCO公司，下同)，5g/l NaCl，15g/l瓊脂and 100μg/ml氨芐青霉素，pH7.5)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
(2)挑取單克隆，接種96孔深孔培養(yǎng)板，1ml SBAG-2％液體培養(yǎng)基/孔(35g/l tryptone，20g/l yeast extract，5g/l NaCl，and 100μg/ml氨芐青霉素，pH7.5，2％葡萄糖)，30℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，250rpm。
(3)1/100轉(zhuǎn)接大試管中，5ml SBAG-0.1％液體培養(yǎng)基/管(35g/l tryptone，20g/l yeast extract，5g/l NaCl，and 100μg/ml氨芐青霉素，pH7.5，0.1％葡萄糖)，30℃搖床培養(yǎng)2-3hr，250rpm，至OD600＝0.8-0.9，補(bǔ)加IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司)至終濃度1mM。繼續(xù)30℃搖床培養(yǎng)20-24hr，250rpm。1,500g離心20min，收集所有菌體。小心吸除上清。每管添加100μl 1×TES緩沖液(0.2M Tris-HCl pH8.0，0.5mM EDTA，0.5M蔗糖)，混勻后補(bǔ)加150μl冰預(yù)冷的1/5×TES，再次混勻，冰上放置30min，進(jìn)行鹽休克，12,000g離心10min保留上清。
(4)采用同樣的條件誘導(dǎo)表達(dá)鼠抗4-BB單鏈抗體(m4b4-1 scFv)以及提取周質(zhì)腔組分。m4b4-1 scFv為本實(shí)驗(yàn)室將公開(kāi)發(fā)表文獻(xiàn)(Hong HJ，et al.，A humanized anti--4-1BB monoclonal antibody suppressesantigen-induced humoral immune response in nonhuman primates.JImmunother.2000 Nov-Dec；23(6)613-21.)所列的VH和VL序列，以單鏈抗體通用連接肽(GGGGSGGGGSGGGG S)相連，構(gòu)建而成的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)表。
(5)采用直接ELISA檢測(cè)上述周質(zhì)腔抽提物中的抗體結(jié)合活性。ELISA操作按照常規(guī)方法進(jìn)行。其中需要指出的是抗原(4-1BB購(gòu)自R&D公司)包被濃度1μg/ml；抗c-myc標(biāo)簽抗體(9E10)作為一級(jí)檢測(cè)抗體(購(gòu)自R&D公司)；HRP-羊抗鼠IgG作為二級(jí)檢測(cè)抗體(購(gòu)自R&D公司)；OPD(鄰苯二胺)(購(gòu)自Sigma公司)顯色。周質(zhì)腔抽提物不經(jīng)稀釋?zhuān)苯舆M(jìn)行檢測(cè)。我們一共挑取了20個(gè)克隆，經(jīng)過(guò)ELISA測(cè)活，確定其中5個(gè)克隆為陽(yáng)性克隆。經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序(上海博亞生物技術(shù)有限公司)后，發(fā)現(xiàn)這5個(gè)克隆分別具有三種抗體序列re-1(1個(gè)克隆)，re-2(1個(gè)克隆)和re-3(3個(gè)克隆)。Re-1改形抗體序列缺失大段VH序列，結(jié)合活性最低；re-2改形抗體序列缺失輕鏈CDR3，結(jié)合活性居中；re-3抗體的序列完整，結(jié)合活性最高。圖10列出了三個(gè)陽(yáng)性克隆的ELISA測(cè)定結(jié)果結(jié)果見(jiàn)。Re-3克隆VH和VL的氨基酸序列見(jiàn)圖11-1和圖11-2。
12.改形抗4-1BB單鏈抗體的序列和結(jié)構(gòu)分析將改形抗4-1BB單鏈抗體re-3的VH和VL序列分別與鼠抗4-1BB單克隆抗體(4b4-1)，鼠源亞群共有序列和人源模板亞群共有序列的VH和VL序列進(jìn)行比對(duì)(見(jiàn)圖11-1和圖11-2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)改形抗4-1BB單鏈抗體re-3的VH的設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并位點(diǎn)中，有11個(gè)選擇了人源殘基(V5，S7，V11，V20，T30，G44，M48，V68，I70，A72，T74)，3個(gè)選擇鼠源殘基(V12，M76，S91)，4個(gè)發(fā)生突變(N38，S67，P85，S87)；VL的設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并位點(diǎn)中，有7個(gè)選擇了人源殘基(P8，L11，A19，T20，T74，F(xiàn)83，A84)，5個(gè)選擇鼠源殘基(T14，D17，E42，S43，L104)，1個(gè)發(fā)生突變(N6O)。對(duì)上述5個(gè)突變進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)(分析結(jié)果見(jiàn)如圖11-3)，四個(gè)突變(VHN38，S67，S87；VLN6O)是簡(jiǎn)并核苷酸隨機(jī)重組的結(jié)果。另外一個(gè)突變(VHP85)是在非簡(jiǎn)并位點(diǎn)發(fā)生核苷酸隨機(jī)突變所致。這說(shuō)明我們?cè)诔晒M(jìn)行抗4-1BB單鏈抗體的改形的同時(shí)，通過(guò)引進(jìn)突變和篩選，實(shí)現(xiàn)了分子定向進(jìn)化。
將re-3和m4b4-1 scFv分別進(jìn)行在線(xiàn)結(jié)構(gòu)模擬(網(wǎng)址為http//www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)和在線(xiàn)結(jié)構(gòu)比對(duì)(網(wǎng)址為http//cl.sdsc.edu/ce.html)。比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖12-A。在re-3和m4b4-1 scFv之間的明顯不匹配區(qū)(region1，region2，region3)均位于VH內(nèi)(見(jiàn)圖12-B，圖12-C，圖12-D，圖12-E)，而且HFR2區(qū)的兩個(gè)突變(P85，S87)對(duì)CDR3的構(gòu)像產(chǎn)生了遠(yuǎn)程影響。這兩個(gè)位點(diǎn)將是進(jìn)一步進(jìn)行抗體親和力成熟時(shí)，需要進(jìn)行重點(diǎn)優(yōu)化的位點(diǎn)。
SEQUENCE LISTING<110>北京安波特基因工程技術(shù)有限公司中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所<120>一種用于抗體改形新的體外分子定向進(jìn)化方法<130>I030369<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>732<212>DNA<213>Artificial<220>
<221>CDS<222>(1)..(732)<223>
<400>1cag gtt cag ctg gtg caa tcg ggt gcg gaa gtg gtg aaa ccg ggt gca 48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15tct gtt aaa gtg tct tgc aaa gcg agc ggt tac acc ttc acc tct tac 96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30tgg atg cac tgg gtt aat cag cgt ccg ggt cag ggt ctg gaa tgg atg144Trp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45ggt gaa atc aac ccg ggt aac ggc cac acc aac tac aac gaa aaa ttc192Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60aaa agc agt gtg acc att acc gcg gac acg tct agc agc acc gcg tac240Lys Ser Ser Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg cag ctg agc ccc ctg agc agc gaa gac agc gct gtt tac tac tgc288Met Gln Leu Ser Pro Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gca cgt tct ttc acc acc gct tgt gcg ttc gcc tac tgg ggt cag ggc336Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Cys Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110acc ctg gtg acc gtt tcc tcc act agt gga ggc ggt ggg agc ggc ggt384Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125ggt tct ggg ggt ggc ggc agc tct aga gac atc gtt atg acc cag agc432Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asp Ile Val Met Thr Gln Ser130 135 140ccg gcg acc ctg agc gtg acc ccg ggt gat cgt gcg acc ctg tct tgc480Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys145 150 155 160cgt gcg tct cag acc atc agc gac tac ctg cac tgg tac caa cag aaa528Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175agc cac gaa tcc ccg cgt ctg ctg atc aaa tac gca tct cag tct atc576Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile180 185 190agc ggt atc ccg aac cgt ttc tct ggt tcc ggt agc ggt tct gac ttc624Ser Gly Ile Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe195 200 205acc ctg acc atc aac agc gtg gaa ccg gaa gac ttt gcc gtg tac tac672Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr210 215 220tgc cag gac ggt cac tct ttc ccg ccg acc ttc gga ggt ggt acc aaa720Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys225 230 235 240ctg gaa atc aaa732Leu Glu Ile Lys<210>2<211>244<212>PRT<213>Artificial<400>2Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ser Ser Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Pro Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Cys Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asp Ile Val Met Thr Gln Ser130 135 140Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys145 150 155 160Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys165 170 175Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile180 185 190Ser Gly Ile Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe195 200 205Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr210 215 220
Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys225 230 235 240Leu Glu Ile Lys
權(quán)利要求
1.一種用于抗體改形的體外分子定向進(jìn)化方法，包括下列步驟(1)根據(jù)根據(jù)抗體序列在進(jìn)化上的保守性確定抗體序列的種屬特異性和個(gè)體特異性，確定關(guān)鍵氨基酸殘基的位置；(2)通過(guò)簡(jiǎn)并合成寡聚核苷酸片段以及重疊PCR技術(shù)構(gòu)建初級(jí)改形抗體庫(kù)，并且采用DNA改組技術(shù)隨機(jī)重組簡(jiǎn)并位點(diǎn)和引進(jìn)隨機(jī)突變，形成次級(jí)改形抗體庫(kù)；和(3)通過(guò)PCR的方法構(gòu)建核糖體展示模板，進(jìn)行核糖體展示篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，包括下列步驟(1)以鼠源抗體的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL的氨基酸序列為模板，采用同源搜索的方法，從已有的免疫球蛋白序列庫(kù)中尋找CDR移植受體；(2)將鼠源抗體序列及其亞群共有序列、候選移植受體抗體序列及其亞群共有序列進(jìn)行比對(duì)，保留鼠源抗體的CDR區(qū)和FR區(qū)內(nèi)一致的序列；(3)在兩者之間添加一段重復(fù)性連接肽GGGGSGGGGSGGGGS設(shè)計(jì)成改形單鏈抗體庫(kù)；(4)按照大腸桿菌喜好的密碼子表，將該改形單鏈抗體庫(kù)翻譯成DNA序列；(5)按照重疊PCR的要求，將改形單鏈抗體庫(kù)DNA“拆分”成60個(gè)核苷酸以下的單鏈寡聚核苷酸片段，進(jìn)一步采用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建初級(jí)改形單鏈抗體庫(kù)，(6)通過(guò)采用DNA改組技術(shù)，進(jìn)行隨機(jī)重組，構(gòu)建次級(jí)改形單鏈抗體庫(kù)，(7)采用一步PCR反應(yīng)，引入核糖體展示元件進(jìn)行核糖體展示，(8)經(jīng)過(guò)3輪核糖體展示篩選后，篩選產(chǎn)物直接經(jīng)過(guò)酶切反應(yīng)連入分泌型表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行分泌型表達(dá)和活性測(cè)定，鑒定與抗原具有較高結(jié)合活性的克隆，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證后，得到改形單鏈抗體。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用該策略進(jìn)行改形的抗體包括，F(xiàn)ab，單鏈抗體，單域抗體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所改形的抗體為抗4-1BB單鏈抗體。
5.一種使用權(quán)利要求4的方法構(gòu)建的適合在大腸桿菌中表達(dá)的抗4-1BB改形單鏈抗體。
6.權(quán)利要求5的抗4-1BB改形單鏈抗體re-3，其特征在于具有如下氨基酸序列1 QVQLVQSGAE VVKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMHWVNQR PGQGLEWMGE51 INPGNGHTNY NEKFKSSVTI TADTSSSTAY MQLSPLSSED SAVYYCARSF101 TTACAFAYWG QGTLVTVSST SGGGGSGGGS GGGGSSRDIV MTQSPATLSV151 TPGDRATLSC RASQTISDYL HWYQQKSHES PRLLIKYASQ SISGIPNRFS201 GSGSGSDFTL TINSVEPEDF AVYYCQDGHS FPPTFGGGTK LEIK。
7.編碼權(quán)利要求5的抗4-1BB改形單鏈抗體re-3的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求7的核苷酸序列，其特征在于具有如下核苷酸序列1CAG GTT CAG CTG GTG CAA TCG GGT GCG GAA GTG GTG AAA CCG GGT46GCA TCT GTT AAA GTG TCT TGC AAA GCG AGC GGT TAC ACC TTC ACC91TCT TAC TGG ATG CAC TGG GTT AAT CAG CGT CCG GGT CAG GGT CTG136GAA TGG ATG GGT GAA ATC AAC CCG GGT AAC GGC CAC ACC AAC TAC181AAC GAA AAA TTC AAA AGC AGT GTG ACC ATT ACC GCG GAC ACG TCT226AGC AGC ACC GCG TAC ATG CAG CTG AGC CCC CTG AGC AGC GAA GAC271AGC GCT GTT TAC TAC TGC GCA CGT TCT TTC ACC ACC GCT TGT GCG316TTC GCC TAC TGG GGT CAG GGC ACC CTG GTG ACC GTT TCC TCC ACT361AGT GGA GGC GGT GGG AGC GGC GGT GGT TCT GGG GGT GGC GGC AGC406TCT AGA GAC ATC GTT ATG ACC CAG AGC CCG GCG ACC CTG AGC GTG451ACC CCG GGT GAT CGT GCG ACC CTG TCT TGC CGT GCG TCT CAG ACC496ATC AGC GAC TAC CTG CAC TGG TAC CAA CAG AAA AGC CAC GAA TCC541CCG CGT CTG CTG ATC AAA TAC GCA TCT CAG TCT ATC AGC GGT ATC586CCG AAC CGT TTC TCT GGT TCC GGT AGC GGT TCT GAC TTC ACC CTG631ACC ATC AAC AGC GTG GAA CCG GAA GAC TTT GCC GTG TAC TAC TGC676CAG GAC GGT CAC TCT TTC CCG CCG ACC TTC GGA GGT GGT ACC AAA721CTG GAA ATC AAA
9.一種抗4-1BB改形單鏈抗體的載體，其含有權(quán)利要求7或8的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求9的載體，它是4-1BB-pFUW802。
11.一種宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求9或10的載體。
12.權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌HB2151細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于抗體改形的體外分子定向進(jìn)化方法，通過(guò)設(shè)計(jì)改形抗體分子、將核糖體展示技術(shù)和DNA改組技術(shù)相結(jié)合，在鼠源單鏈抗體的基礎(chǔ)上直接獲得改形單鏈抗體的抗體改形的體外分子定向進(jìn)化方法。本發(fā)明還提供用此方法獲得的一個(gè)抗4－1BB改形抗體的氨基酸序列及其編碼核苷酸序列，含有該核苷酸序列的載體以及含有這些載體的宿主細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1566341SQ0314115
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月12日
發(fā)明者王祥武, 黃華樑, 周炳, 林晴 申請(qǐng)人:北京安波特基因工程技術(shù)有限公司, 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所