專利名稱：抗人cd40突變體分子單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結(jié)合蛋白質(zhì)或多肽，更具體地說，本發(fā)明涉及抗人CD40突變體分子單克隆抗體，其制備方法及其在特異性地識別多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞膜表面CD40蛋白突變體分子，并影響多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株細(xì)胞生長周期的生物學(xué)作用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所說的單克隆抗體在診斷和治療多發(fā)性骨髓瘤的中的潛在應(yīng)用。
發(fā)明的背景特異性免疫應(yīng)答是由多種免疫細(xì)胞和分子(膜分子和可溶性因子)參加并受到嚴(yán)格調(diào)控及制約的復(fù)雜生理過程。已知有許多受體-配體相互作用都參與誘導(dǎo)、建立和調(diào)節(jié)抗原特異性免疫反應(yīng)。為了有效地激活T細(xì)胞反應(yīng)，通常至少需要兩個信號。其中除T細(xì)胞抗原受體(TCR)識別抗原提呈細(xì)胞(APC)上的MHC-抗原復(fù)合物以提供第一信號即抗原特異性信號外，還必須獲得T細(xì)胞與APC表達(dá)的共刺激分子相互作用后產(chǎn)生的非抗原特異性、非MHC限制性的第二信號。第二信號即為共刺激信號或協(xié)同刺激信號。如果僅有抗原特異性信號而缺失共刺激信號，T細(xì)胞將表現(xiàn)為無反應(yīng)或免疫耐受狀態(tài)，甚至導(dǎo)致凋亡?？梢姡泊碳ば盘柺荰細(xì)胞克隆擴增、分化和發(fā)揮生物效應(yīng)所必不可少的。因此可以認(rèn)為，第一信號決定了T細(xì)胞活化的特異性，而第二信號則決定T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能否有效進(jìn)行(Noelle RJ，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.896550，1992；Allen RC et al.，Science.259990，1993)。近年來的研究表明，一組細(xì)胞膜分子——共刺激分子的調(diào)節(jié)性表達(dá)、相互作用及信號傳遞在復(fù)雜的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著極其重要的作用。其中CD40和CD40配體(CD40L，CD154)是一對重要的共刺激分子，它們分別屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族和腫瘤壞死因子(TNF)家族成員，參與細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答并發(fā)揮調(diào)控作用。
正常生理條件下，表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞(APC)上的CD40分子與活化的CD4+T細(xì)胞上的CD40L相互作用，介導(dǎo)了一系列細(xì)胞免疫反應(yīng)。CD40/CD40L的信號傳遞在不同細(xì)胞上可產(chǎn)生截然不同的效應(yīng)可以是促進(jìn)細(xì)胞的增殖或分化的正向調(diào)節(jié)，也可以是導(dǎo)致細(xì)胞的生長抑制和/或凋亡的負(fù)向調(diào)節(jié)。大量的實驗研究表明，CD40可介導(dǎo)B細(xì)胞的增殖、分化、抗體的分泌和類型轉(zhuǎn)換、樹突狀細(xì)胞(DC)的激發(fā)、分化和成熟、T淋巴細(xì)胞活化和細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)，以及對CD40陽性腫瘤細(xì)胞生長的抑制和/或促凋亡等活性。
因此，對CD40和CD40L相互作用的分子機制的研究有助于深入了解參與B細(xì)胞激活過程中的信號分子及其信號通路。利用基因定向突變研究的結(jié)果顯示，CD40與CD40L相互作用過程中直接接觸的CD40氨基酸殘基為位于CD40分子胞外段第2、3結(jié)構(gòu)域中的S65，E66，T70，R73，E74，H76，C77，H78，479，K81，Y82，D84，N86，T112，E114，A115，E117(Bajorath J，Marken J S，Chalupny N J et al.Biochemistry，1995；49884)。這些位點的突變將直接影響CD40與CD40L的相互作用。另有文獻(xiàn)報道(Tong A W，Seamour B，Chen J et al.Leuk Lymph，2000；36(5-6)543)，多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞株8226細(xì)胞上CD40分子第3結(jié)構(gòu)域上僅1個氨基酸的突變(密碼子TCA→TTA，即氨基酸Ser→Leu)即可顯著地影響CD40L激發(fā)CD40分子后的信號傳導(dǎo)。
研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有新鮮分離的多發(fā)性骨髓瘤(MM)均表達(dá)CD40。而且知道MM的發(fā)生和發(fā)展除了與細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞分化異常有關(guān)外，還與轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能正常凋亡有關(guān)。已有研究表明，雖然大多數(shù)多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞均表達(dá)CD40，但發(fā)現(xiàn)使用常規(guī)的CD40單克隆抗體并不能檢測出某些MM細(xì)胞株細(xì)胞(例如8226細(xì)胞)上的CD40分子。這可能是由于編碼CD40分子的基因發(fā)生了突變，表達(dá)了CD40突變體分子。因此，發(fā)現(xiàn)并深入研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子可能出現(xiàn)的突變，制備針對這些突變分子的抗體或其他結(jié)合蛋白，進(jìn)而研究CD40信號對MM生物學(xué)行為的影響及其分子機制，必將為拓展MM的治療思路，最終治愈MM提供依據(jù)。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，其中所說的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1的重鏈和輕鏈分別具有如SEQ ID NO1(重鏈)和2(輕鏈)所示的推測的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，如上限定的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1是由保藏編號為CGMCC No.1164的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的。
本發(fā)明的再一個目的是提供如上限定的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1在診斷和治療多發(fā)性骨髓瘤中的應(yīng)用。
附圖簡要說明

圖1顯示以免疫印跡法分析單克隆抗體3B1與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG2細(xì)胞表面膜蛋白的特異性結(jié)合。其中1是XG2細(xì)胞抽提的膜蛋白，2是Jurkat細(xì)胞抽提的膜蛋白(陰性對照)。
圖2顯示用流式細(xì)胞術(shù)分析單克隆抗體3B1對多株多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面CD40突變體分子的特異性識別。
發(fā)明的具體內(nèi)容本發(fā)明是基于我們首先發(fā)現(xiàn)了多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞膜表面上表達(dá)的CD40突變體分子這一事實。在這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，我們成功地制備了抗所說的CD40突變體分子的單克隆抗體，并通過對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞膜表面上突變CD40受體/CD40配體相互作用途徑的阻斷實驗研究，證實有可能使用本發(fā)明的單克隆抗體作為診斷劑，提供能夠在T細(xì)胞激發(fā)期間特異地結(jié)合多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面上CD40受體的特異性結(jié)合分子，用于多發(fā)性骨髓瘤的實驗室診斷?；蛘?，也可以使用本發(fā)明的單克隆抗體作為治療劑，用于提高T細(xì)胞對多發(fā)性骨髓瘤抗原的識別能力并切斷其第二信號傳遞，增強CD4+T細(xì)胞對瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而達(dá)到抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長和增殖并促使其向正常細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的目的。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1。所說的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1具有如SEQ ID NO1所示的推測的氨基酸序列，并且該抗體是由保藏編號為CGMCC No.1164的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的。
本發(fā)明的另一個目的是提供如上限定的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1在診斷多發(fā)性骨髓瘤，以及改變多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長周期，進(jìn)而促進(jìn)惡性成長的瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
本說明書中所說的“CD40受體”是指B細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)；CD40配體是活化的T細(xì)胞表達(dá)的可與CD40受體特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“CD40”包括完整的CD40、可溶性CD40及包括CD40之功能活性部分的融合蛋白。術(shù)語“CD40突變體”是指由于CD40基因第234位堿基由胞嘧啶(C)突變?yōu)樾叵汆奏?A)，由此導(dǎo)致其所轉(zhuǎn)錄后翻譯的CD40蛋白的78位組氨酸突變?yōu)楣劝滨０返腃D40蛋白分子。術(shù)語“抗CD40突變體分子抗體”可以是CD40突變體分子特異性單克隆或多克隆抗體或它們的免疫學(xué)活性部分。本發(fā)明中，優(yōu)選的是單克隆抗體，特別是小鼠抗人CD40突變體分子抗體。
本發(fā)明人在長期從事免疫細(xì)胞受體/配體相互作用研究的實踐中，首先發(fā)現(xiàn)了多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面上的CD40突變體(其基因在Genebank上的登記號為ss23134804)。我們對該CD40突變體基因及其表達(dá)產(chǎn)物的序列分析顯示，其突變在于基因第234位堿基由胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?，由此?dǎo)致其所轉(zhuǎn)錄后翻譯的CD40蛋白的78位組氨酸突變?yōu)楣劝滨０?。由于CD40分子上的78位氨基酸是CD40與CD40L相互作用過程中直接接觸的CD40氨基酸殘基，它的改變將直接影響CD40分子的信號傳導(dǎo)，進(jìn)而引起一系列CD40分子生物學(xué)功能的改變。因此，不僅可能使用高表達(dá)該突變體分子的XG2等多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株作為免疫原免疫動物，制備特異性單克隆抗體，用于多發(fā)性骨髓瘤的體外免疫診斷，而且有可能使用該抗體作為治療劑，用于提高T細(xì)胞對多發(fā)性骨髓瘤抗原的識別能力并切斷其第二信號傳遞，增強CD4+T細(xì)胞對瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而達(dá)到抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長和增殖并促使其向正常細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的目的。
可以按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法制備本發(fā)明的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1(參見Kohler and Milrtein，Nature 256495-96，1975；Harlow and Lane，Aatibodies，A Laboratory，Cold Spring Harbor Laboritory，1988)。必要時，也可以按照美國專利5,585,089中所述的方法制備相應(yīng)的人源化形式的抗CD40單克隆抗體。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)如上限定的抗人CD40突變體分子的單克隆抗體的方法，該方法包括(1)用預(yù)制備的高表達(dá)人CD40突變體分子的XG2細(xì)胞作為免疫原免疫動物；(2)分離被免疫動物的脾淋巴細(xì)胞并在適于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的條件下與適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞融合；(3)篩選并培養(yǎng)如上得到的雜交瘤細(xì)胞；(4)從細(xì)胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細(xì)胞的動物的腹水液中分離并純化所需的單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，最好使用高表達(dá)CD40分子(包括CD40突變體分子)的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG2細(xì)胞作為制備本發(fā)明單克隆抗體的免疫原。
因此，為了制備本發(fā)明的抗人CD40單克隆抗體，最好選擇具有強免疫原性的生物學(xué)材料如細(xì)胞作為免疫原，并且希望該細(xì)胞所表達(dá)的抗原分子的空間構(gòu)型能以自然狀態(tài)暴露于細(xì)胞膜表面，從而可更有效地激發(fā)機體的免疫反應(yīng)。
可以按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法(Kohler and Milstein，Nature 265495-497，1975)制備能夠生產(chǎn)本發(fā)明抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1的雜交瘤。簡單地說，首先用XG2細(xì)胞免疫BALB/C小鼠。當(dāng)被免疫動物的血清抗體水平達(dá)到峰值時，分離動物的脾細(xì)胞并制備單細(xì)胞懸液。必要時，可使用免疫吸附方法篩選脾細(xì)胞。例如，可以將脾細(xì)胞懸液加到CD40抗原蛋白質(zhì)包被的平板或小孔內(nèi)，表達(dá)CD40多肽特異性免疫球蛋白的B細(xì)胞即結(jié)合到平板上，而不能被其余的懸液洗掉。然后可以收集所得到的B細(xì)胞或所有解離的脾細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)娜诤蟿├缇垡叶嫉恼T導(dǎo)下與骨髓瘤融合以形成雜交瘤。然后可以在選擇性培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)以篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)、Western印跡法、免疫沉淀法等方法鑒定所需的陽性抗性細(xì)胞株。于體外(例如在組織培養(yǎng)瓶或多孔纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(作為小鼠腹水)培養(yǎng)所選擇的分泌抗人CD40抗體的雜交瘤，并從細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠腹水液中收集和純化所需的抗人CD40突變體分子單克隆抗體。
流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的抗人CD40突變體分子單克隆抗體能夠特異地識別多個多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(XG2，XG6，8226，U266)表面上表達(dá)的CD40突變體分子。該抗體被定名為3B1。
進(jìn)一步的核苷酸和氨基酸序列分析結(jié)果顯示，純化的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1的重鏈和輕鏈多肽分別具有如序列表SEQ ID NO1和2所示的推測的氨基酸序列。其中所有氨基酸序列都是以氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫符表示的。
本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株被命名為3B1(Hybridoma SI CD40.1(3B1))，并已按照布達(dá)佩斯條約和中國專利法實施細(xì)則第25條的規(guī)定，于2004年6月2日將這些雜交瘤細(xì)胞系樣品保藏在中國北京中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.1164。
我們的研究表明，本發(fā)明的單克隆抗體能夠特異性識別多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面表達(dá)的、其他常規(guī)CD40單克隆抗體不能識別的CD40突變體分子。例如，使用本發(fā)明的單克隆抗體以流式細(xì)胞分析術(shù)檢測多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG6、U266和8226等的細(xì)胞表面CD40突變體分子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示陽性表達(dá)率分別為51.9％、66.7％和72.8％％。相反，使用目前已知的其他多種CD40單克隆抗體(例如mAb89，3B2，5C11等)檢測上述靶細(xì)胞表面表達(dá)的CD40突變體分子，結(jié)果均為陰性(參見實施例1)。因此，有可能使用本發(fā)明的單克隆抗體或建立在該抗體基礎(chǔ)上的免疫檢測試劑盒，檢測多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞膜表面CD40突變體分子的存在及其水平，借以作為多發(fā)性骨髓瘤的實驗室診斷或預(yù)后的指標(biāo)。
另一方面，我們用本發(fā)明的單克隆抗體3B1處理多株表達(dá)CD40突變體分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株細(xì)胞(包括的XG6，U266，8226)，結(jié)果可見，該單克隆抗體可顯著地影響XG6，U266，8226等多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長周期，導(dǎo)致XG6細(xì)胞的生長周期阻滯在G2期，并使U266和8226細(xì)胞的生長周期阻滯在G1和G2期(參見實施例1)。因此，有可能使用本發(fā)明的單克隆抗體作為治療劑，用于提高T細(xì)胞對多發(fā)性骨髓瘤抗原的識別能力并切斷其第二信號傳遞，阻斷多發(fā)性骨髓瘤的生長周期并增強CD4+T細(xì)胞對瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而達(dá)到抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖并促使其惡性生長發(fā)生逆轉(zhuǎn)的目的。我們的初步動物實驗也已證實，本發(fā)明的CD40突變體分子單克隆抗體3B1可以有效地抑制多發(fā)性骨髓瘤動物模型的腫瘤的生長(數(shù)據(jù)未示出)。
因此，本發(fā)明的抗CD40突變體分子單克隆抗體有可能作為一種診斷和/或治療劑，用于體外診斷或者體內(nèi)治療細(xì)胞表面高表達(dá)突變CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤。
以下借助非限制性實施例舉例詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明的基本精神和原則前提下，改變或改動本說明書中描述的某些技術(shù)內(nèi)容或技術(shù)環(huán)節(jié)。但人們可以理解到，這些平行的改變或改動均將包括在本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實施例1抗人CD40突變體分子單克隆抗體的制備本實施例描述本發(fā)明的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1的制備。
(1)分泌抗人CD40突變體分子單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備使用高表達(dá)CD40分子(包括CD40突變體分子)的XG2細(xì)胞作為免疫原，三次免疫接種Balb/c小鼠(107/500μl/只)(間隔3周)。末次免疫后第四天，取小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞融合(共10塊96孔板)。以高表達(dá)CD40分子的XG2為陽性對照并以不表達(dá)CD40分子的XG7為陰性對照，用間接免疫熒光法對雜交瘤培養(yǎng)物上清進(jìn)行初步篩選、蛋白鑒定及Ig亞類鑒定(圖1)。陽性克隆經(jīng)3次有限稀釋后，使克隆的陽性率達(dá)到約95％。經(jīng)復(fù)篩和克隆后獲得穩(wěn)定地分泌特異性鼠抗人CD40的雜交瘤細(xì)胞株，并被命名為3B1。這些雜交瘤細(xì)胞經(jīng)體外持續(xù)傳代(40代)后，仍能穩(wěn)定地分泌特異性抗體。
(2)抗人CD40突變體分子單克隆抗體的制備與特性鑒定(a)采用本室建立的腹水體內(nèi)誘生方法生產(chǎn)單克隆抗體。取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，腹腔內(nèi)注入Pristane(0.5ml/只)。一周后腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞(1×107/只)，同時再次腹腔內(nèi)注射Pristane與福氏不完全佐劑的等體積混合物(0.2ml/只)。5-10天后收獲腹水，并離心取上清于-80℃保存。
(b)腹水型單抗的純化和定量。收集宿主動物的腹水液，經(jīng)去除纖維蛋白和鹽析處理后，以蛋白G親和柱層析法純化。收集蛋白峰流出液，對磷酸鹽緩沖液(PBS)透析后用751紫外分光光度計測定抗體蛋白濃度為0.8～10mg/ml。間接免疫熒光法分析顯示，純化后單抗的效價為1∶1000以上。
(c)Ig亞類鑒定。采用試紙快速測定(Argen公司)法，鑒定Ig亞類，結(jié)果顯示3B1為IgG1型。
(d)CD40突變體分子在多種腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)。收集培養(yǎng)的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG2，XG6，8226，U266，加入單抗3B1(每管2μg)，4℃孵育30分鐘。洗滌后用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG處理細(xì)胞，4℃孵育30分鐘后進(jìn)行流式細(xì)胞分析。結(jié)果可見，單克隆抗體3B1能夠特異地識別XG2、XG6、8226、U266等多種腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的CD40突變體分子。其他多種已知的單克隆抗體(mAb89，3B2，5C11)均不能識別只表達(dá)CD40突變體分子的XG6、8226、U266細(xì)胞系，但能識別共表達(dá)正常CD40分子和CD40突變體分子的XG2細(xì)胞表面的正常CD40分子。結(jié)果(以CD40突變體分子的陽性表達(dá)率表示)如下列表1和圖2所示。
表1單克隆抗體3B1對腫瘤細(xì)胞表面的膜蛋白分子的識別
由表1所示的結(jié)果可以看出，單克隆抗體3B1除了能識別其免疫原-超高表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株-XG2以外，還可以中等強度識別另外三株多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG6，8226，U266，陽性率分別是51.9％，66.7％，72.8％；而其他多種CD40單克隆抗體(mAb89，3B2，5C11)均不能識別XG6、8226、U266表面CD40突變體分子的抗原位點。
圖2顯示用流式細(xì)胞術(shù)分析單克隆抗體3B1識別多種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株細(xì)胞表面的CD40突變體分子。其中，第一行顯示3B1識別XG2細(xì)胞表面的CD40突變體分子，并且該分子在XG2細(xì)胞上高表達(dá)(表達(dá)率高達(dá)99.8％)；第二行顯示3B1識別XG6細(xì)胞表面的CD40突變體分子，并且該分子在XG6細(xì)胞上中度表達(dá)(表達(dá)率達(dá)51.9％)；第三行顯示3B1識別8226細(xì)胞表面的CD40突變體分子，并且該分子在8226細(xì)胞上中度表達(dá)(表達(dá)率為66.7％)；第四行顯示3B1識別U266細(xì)胞表面的CD40突變體分子，并且該分子在U266細(xì)胞上中度表達(dá)(表達(dá)率為72.8％)。相反，抗體5C11則不識別三株只表達(dá)CD40突變體分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG6，8226，U266表面的膜分子，只識別共表達(dá)CD40正常體和突變體的XG2細(xì)胞表面的正常CD40分子。
(f)單抗的Western印跡鑒定。收集XG2和Jurkat細(xì)胞(不表達(dá)CD40分子的T淋巴細(xì)胞株)，經(jīng)破膜處理后抽提膜蛋白。經(jīng)12％SDS-PAGE電泳將所得膜蛋白電轉(zhuǎn)移(0.65mA/cm2)至硝酸纖維膜上，用5％脫脂奶粉4℃封閉過夜。24小時后加入純化的抗體，室溫孵育1小時。然后用TBST溶液洗去未結(jié)合的抗體，并加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的二抗保溫30分鐘。孵育后加入底物顯色并記錄結(jié)果。結(jié)果如圖1所示。
由圖1可以看出，本發(fā)明的3B1抗體能夠與XG2細(xì)胞表面的CD40突變體分子特異地結(jié)合而形成一條清晰的陽性條帶。
實施例2抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長的影響本實施例描述本發(fā)明的單克隆抗體3B1對多株多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的生長影響。
(1)抗CD40突變體分子單克隆抗體3B1誘導(dǎo)多種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株細(xì)胞生長周期的改變收集生長良好的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG6，U266，8226細(xì)胞，加入24孔培養(yǎng)板中(每2×105/孔)。向各小孔中加入3B1(10ug/ml)，培養(yǎng)48小時后再加入PI(5ug/ml)。37℃反應(yīng)30分鐘后用流式細(xì)胞儀檢測。其中使用同型IgG作為陰性對照。結(jié)果如下列表2所示。
表2單克隆抗體3B1對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的長周期的影響
由表2所示的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的單克隆抗體明顯影響了XG6，8226和U266細(xì)胞的生長，并使其生長停滯在G2期。相似地，本發(fā)明的單克隆抗體同樣可阻斷8226和U266細(xì)胞的生長，并使其生長周期阻滯在G1和G2期。
序列表<110>蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所<120>抗人CD40突變體分子單克隆抗體及其應(yīng)用<140>
<141>
<160>1<210>1<211>135<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)合成的單克隆抗體3B1的重鏈核甘酸編碼序列推測的氨基酸序列。
<400>1ACMPAGRRLG VKLQESGPEL VKPGASVKMS CKASGYTFTS YVIQWVKQKPGQGLEWIGSI NPYNDYTKYN EKFKGKATLT SDKSSITAYM EFSSLTSEDSALYYCARWGD GNYWGQGTTL TVSSAKTTPP SVYPL<210>2<211>120<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)合成的單克隆抗體3B1的輕鏈核甘酸編碼序列推測的氨基酸序列。
<400>2PSLHACRSTI EIQMTQSPAS LAVSLGQRAT ISYRASKSVS TSGYSYMHWN QQKPGQPPRLLLYLVSNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHIRELTR SEGGPSWRSN
權(quán)利要求
1.分別具有如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的重鏈和輕鏈氨基酸序列的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1。
2.權(quán)利要求1的單克隆抗體是由保藏登記號為CCGCC No.1164的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的。
3.權(quán)利要求1的單克隆抗體用于改變多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長周期，促進(jìn)惡性成長的瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結(jié)合蛋白質(zhì)或多肽，更具體地說，本發(fā)明涉及抗人CD40突變體分子單克隆抗體，其制備方法及其在特異性地識別多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞膜表面CD40蛋白突變體分子，并改變所說的細(xì)胞的生長周期中的應(yīng)用。
文檔編號C12P21/08GK1844151SQ20051003873
公開日2006年10月11日 申請日期2005年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月7日
發(fā)明者張學(xué)光, 莊羽美, 鄭璐 申請人:蘇州大學(xué)