專利名稱：抗人4－1bbl單克隆抗體制備及其應(yīng)用的制作方法
發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結(jié)合蛋白質(zhì)或多肽，更具體地說，本發(fā)明涉及抗人4-1BBL單克隆抗體1F1，其制備方法以及這些單克隆抗體在誘導(dǎo)樹突狀細胞擴增和白血病分型鑒定中的應(yīng)用。
發(fā)明的背景共刺激信號及參與相關(guān)信號發(fā)生與傳遞的共刺激分子是1970年首先由Brestcher和Cohn在T細胞激活雙信號學(xué)說的基礎(chǔ)上提出并證實的。未致敏的T細胞通過“抗原肽-MHC-TCR”三元結(jié)合體得到抗原信號(第一信號)后，進一步借助共刺激分子提供激活信號(第二信號)被活化(Noelle RJ，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.896550，1992；Allen RC et al.，Science.259990，1993)。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，可將共刺激分子分為兩類(1)TNF-TNFR超家族，包括CD27-CD27L、CD30-CD30L、CD40-CD40L、OX40-OX40L、4-1BB-4-1BBL、RANK-RANKL、Fas-FasL等；和(2)免疫球蛋白超家族，如LAF1-ICAM-1/ICAM2/ICAM3、CD28-B7-1/B7-2、CTLA4-B7-1/B7-2、PD-1-PDL1/PDL2、ICOS-GL50等。
4-1BBL是重要的共刺激分子，屬TNF超家族成員，為II型跨膜糖蛋白。編碼人4-1BBL的基因位于19p13.3，其編碼產(chǎn)物包括254個氨基酸。表達于各種活化的抗原遞呈細胞(APC)表面上的4-1BBL作用于4-1BB受體后，通過TRAF2、TRAF1和MAPK等途徑傳遞信號(Alderson，M.R.，1994；Eur.J.Immunol.242219)。
研究發(fā)現(xiàn)，共刺激分子中多個TNF/TNF受體家族成員，如4-1BBL、CD27L、CD30L、CD40L、CD137L和TNF-a等除了通過受體傳遞正向信號外，還可通過配體傳遞逆向信號，產(chǎn)生包括刺激細胞因子的分泌再內(nèi)的一系列生物學(xué)效應(yīng)，從而參與一系列的免疫應(yīng)答。由此，共刺激分子受體與配體之間的界限變得模糊同時也意味著共刺激分子介導(dǎo)的免疫過程比我們了解的更為復(fù)雜。例如，Langstein等人發(fā)現(xiàn)，采用4-1BB-Fc融合蛋白刺激單核細胞，通過膜4-1BBL傳遞的逆向信號誘導(dǎo)單核細胞的活化和擴增，促進細胞因子的分泌，并增強其功能。據(jù)此作者認為，4-1BB是已知的唯一可以在體外擴增單核細胞的細胞因子(Joachim Langstein，et al，Blood 943161-3168，1999)?？梢?，4-1BBL逆向信號在單核細胞的分化、發(fā)育及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。
樹突狀細胞(DC)是目前已知的功能最強大并可由單核細胞分化發(fā)育形成的抗原遞呈細胞。4-1BBL逆向信號可能同樣參與DC分化、發(fā)育成熟和免疫功能調(diào)節(jié)(Kim YJ et al.，J Hematother Stem Cell Res 2002 Dec；11(6)895-903)。
腫瘤的發(fā)生是逃避免疫監(jiān)視的變異細胞惡性增殖所致，其逃避機制之一是由于機體抗原遞呈細胞在數(shù)量和功能上的異常，致使機體的腫瘤抗原特異性T細胞處于免疫耐受狀態(tài)。因此，通過改變T細胞免疫耐受狀態(tài)并激發(fā)機體特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而清除和控制腫瘤殘留細胞，成為腫瘤免疫治療的重要手段。樹突狀細胞(DC)是體內(nèi)專業(yè)的抗原遞呈細胞，且較單核和巨噬細胞的抗原遞呈能力強100倍以上。在體外誘導(dǎo)并經(jīng)抗原刺激的DC回輸入體內(nèi)也可遷移到淋巴組織，并致敏T細胞，激發(fā)細胞免疫反應(yīng)。因此，采用DC體外激發(fā)或同時負載腫瘤抗原，可有效的激發(fā)機體的特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，對腫瘤產(chǎn)生特異性殺傷作用。
應(yīng)用DC進行腫瘤治療的關(guān)鍵技術(shù)之一是在體外獲得大量于治療目的的DC細胞。傳統(tǒng)的體外擴增DC的方法是在體外培養(yǎng)的外周白單核細胞培養(yǎng)物中加入粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子(TNF-α)刺激的CD34+造血前體細胞，以誘導(dǎo)DC細胞生成；或者在體外培養(yǎng)的外周白單核細胞培養(yǎng)物中加入GM-CSF、白細胞介素4(IL-4)和TNF-α，以獲得GM-CSF依賴性的DC。但傳統(tǒng)方法獲得的DCs數(shù)量有限，難以滿足臨床需要。因此，本領(lǐng)域希望建立一種能夠更為有效地擴充DC細胞的方法，為某些免疫系統(tǒng)疾病的臨床治療提供足夠的DC和活化的細胞毒性T淋巴細胞。
白血病是一種造血組織的惡性疾病，特點是某一類型的白血病細胞在骨髓或其他造血組織中的惡性增生，可浸潤各器官和組織，使臟器的功能受損，產(chǎn)生相應(yīng)的癥狀和體征。對白血病的分型診斷可以更有利于指導(dǎo)治療及估計預(yù)后。然而，由于白血病造血細胞在分化過程中停滯于某一分化階段，并且惡性增殖細胞的形態(tài)復(fù)雜多變不易識別，從而給常規(guī)的白血病的分型診斷帶來困難。為了克服現(xiàn)有技術(shù)的這一缺陷，本發(fā)明人試圖在廣泛研究造血系統(tǒng)各類型細胞的表面標記的基礎(chǔ)上，應(yīng)用本發(fā)明的抗人4-1BBL單克隆抗體或基于該抗體的試劑盒，免疫分型鑒別M4和M5白血病，以提高白血病的診斷率。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供一株具有SEQ ID NO1和2所限定的重鏈和輕鏈氨基酸序列的抗人4-1BBL功能型單克隆抗體1F1。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，所說的單克隆抗體1F1是由包藏登記號為CGMCC No.1159的雜交瘤細胞分泌的。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備如上限定的抗人4-1BBL單克隆抗體的方法，該方法包括(1)用預(yù)制備的高表達人4-1BBL分子的轉(zhuǎn)基因細胞作為免疫原免疫動物；(2)分離被免疫動物的脾淋巴細胞并在適于產(chǎn)生雜交瘤細胞的條件下與適當?shù)墓撬枇黾毎诤希?3)篩選并培養(yǎng)如上得到的雜交瘤細胞；(4)從細胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細胞的動物的腹水液中分離并純化所需的單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，其中所說的作為免疫原的轉(zhuǎn)基因細胞是L929/4-1BBL細胞。
本發(fā)明的再一個目的是提供抗人4-1BBL單克隆抗體1F1在大量擴增成熟DC細胞中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個目的是提供抗人4-1BBL單克隆抗體在干預(yù)T細胞和內(nèi)皮細胞相互作用中的應(yīng)用。
附圖簡要說明

圖1顯示L929/4-1BBL轉(zhuǎn)基因細胞的構(gòu)建示意圖。
圖2顯示單克隆抗體1F1對轉(zhuǎn)基因細胞L929/4-1BBL表達4-1BBL分子的流式細胞分析圖。A攜帶4-1BBL基因的小鼠成纖維細胞株L929(L-4-1BBL)。B不攜帶4-1BBL基因的小鼠成纖維細胞株L929。其中1是細胞株的散點圖，橫坐標給出側(cè)像散射熒光強度，縱坐標給出前像散射熒光強度；2是陰性對照(一抗為小鼠IgG1同型，二抗為熒光素FITC標記的羊抗鼠IgG)；3是陽性對照(一抗為4-1BBL單抗C65-485，二抗為熒光素FITC標記的羊抗鼠IgG)；4是1F1單抗實驗樣品(一抗為1F1，二抗為熒光素FITC標記的羊抗鼠IgG)。
圖3顯示單克隆抗體1F1激發(fā)單核細胞增殖的實驗結(jié)果(×1000倍)。
圖4顯示單克隆抗體1F1激發(fā)單核細胞增殖的3H-TdR摻入實驗的結(jié)果。其中縱坐標為cpm值；橫坐標為不同反應(yīng)組，依次為IgG1同型對照、GM-CSF、4-1BB-Fc、1F1。分別于孵育的第1-8天每天進行細胞的3H摻入測定(cpm值)。
圖5顯示單克隆抗體1F1誘導(dǎo)單核細胞形成DC的體外細胞學(xué)觀察結(jié)果(×1000倍)。
圖6顯示單克隆抗體1F1誘導(dǎo)單核細胞形成DC的3H-TdR摻入實驗結(jié)果。1陰性對照(RPMI1640培養(yǎng)基)；2陽性對照(細胞因子IL-4+GM-CSF+TNF-α)；3本發(fā)明的1F1抗體+細胞因子IL-4+GM-CSF和TNF-α。
圖7顯示以流式細胞術(shù)檢測單克隆抗體1F1對DC分化成熟的促進作用。灰色峰顯示常規(guī)方法誘導(dǎo)的DC與PE標記的不同直標單抗(CD86-PE、CD83-PE、HLA-DR)的反應(yīng)；透明峰顯示單克隆抗體1F1誘導(dǎo)的DC與PE標記的不同直標單抗(CD86-PE、CD83-PE、HLA-DR)的反應(yīng)。
圖8顯示單克隆抗體1F1對DC的細胞因子分泌的影響，1第五天培養(yǎng)上清中細胞因子的含量，2第8天培養(yǎng)上清中細胞因子的含量。
圖9顯示DC激發(fā)自體T細胞活化和增殖的MTT實驗的結(jié)果。1陰性對照，2陽性對照，3實驗組。
圖10顯示新鮮白血病細胞表面上4-1BBL分子的表達。
發(fā)明的具體內(nèi)容本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結(jié)合蛋白質(zhì)或多肽，更具體地說，本發(fā)明涉及抗人4-1BBL單克隆抗體1F1，其制備方法以及所說的單克隆抗體在體外大量擴增樹突狀細胞DC并促進其成熟、以及增強其激發(fā)T細胞的效應(yīng)和M4、M5白血病免疫分型中的應(yīng)用。
本說明書中所說的“4-1BB受體”是指抗原活化的T細胞表面上表達的蛋白質(zhì)；4-1BB配體(4-1BBL)是某些哺乳動物細胞上表達的可與4-1BB受體特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“4-1BBL”包括完整的4-1BB配體、可溶性4-1BB配體及包括4-1BB配體之功能活性部分的融合蛋白。術(shù)語“抗4-1BBL抗體”可以是4-1BB特異性單克隆或多克隆抗體或它們的免疫學(xué)活性部分。本發(fā)明中，優(yōu)選的是單克隆抗體，特別是小鼠抗人4-1BBL抗體。
術(shù)語“功能性抗體”是指能夠阻斷4-1BBL傳遞的共刺激信號，或介導(dǎo)4-1BBL逆向信號的抗體。
可以按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法制備本發(fā)明的抗人4-1BBL單克隆抗體1F1.必要時，也可以按照美國專利5,585,089中所述的原則和方法制備相應(yīng)的人源化形式的抗4-1BBL單克隆抗體(參見Kohler and Milrtein，Nature 256495-96，1975；Harlow and Lane，Aatibodies，A Laboratory，Cold Spring Harbor Laboritory，1988)。簡單地說，首先用轉(zhuǎn)基因細胞L929/4-1BBL免疫BALB/C小鼠。當被免疫動物的血清抗體水平達到峰值時，分離動物的脾細胞并制備單細胞懸液。必要時，可使用免疫吸附方法篩選脾細胞。例如，可以將脾細胞懸液加到4-1BBL抗原蛋白質(zhì)包被的平板或小孔內(nèi)，表達4-1BBL多肽特異性免疫球蛋白的B細胞即結(jié)合到平板上，而不能被其余的懸液洗掉。然后可以收集所得到的B細胞或所有解離的脾細胞，并在適當?shù)娜诤蟿├缇垡叶嫉恼T導(dǎo)下與骨髓瘤融合以形成雜交瘤，并在選擇性培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)以篩選融合的雜交瘤細胞。然后，用流式細胞術(shù)、Western印跡法、免疫沉淀法等方法鑒定所需的陽性抗性細胞株。于體外(例如在組織培養(yǎng)瓶或多孔纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(作為小鼠腹水)培養(yǎng)所選擇的分泌抗人4-1BBL抗體的雜交瘤，并從細胞培養(yǎng)液或小鼠腹水液中收集和純化所需的抗體。
因此，本發(fā)明進一步提供了生產(chǎn)如上限定的抗人4-1BBL單克隆抗體的方法，該方法包括(1)用預(yù)制備的高表達人4-1BBL分子的轉(zhuǎn)基因細胞作為免疫原免疫動物。
(2)分離被免疫動物的脾淋巴細胞并在適于產(chǎn)生雜交瘤細胞的條件下與適當?shù)墓撬枇黾毎诤希?3)篩選并培養(yǎng)如上得到的雜交瘤細胞；(4)從細胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細胞的動物的腹水液中分離并純化所需的單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，最好使用被攜帶人4-1BBL基因的表達載體轉(zhuǎn)化的并可在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下高效表達人4-1BBL多肽的重組體細胞作為制備本發(fā)明單克隆抗體的免疫原。
因此，為了制備本發(fā)明的抗人4-1BBL單克隆抗體，首先構(gòu)建高表達人4-1BBL的轉(zhuǎn)基因細胞(L929/4-1BBL)。高表達人4-1BBL分子的轉(zhuǎn)基因細胞L929/4-1BBL具有較強的免疫原性，并且所表達的抗原分子的空間構(gòu)型能以自然狀態(tài)暴露于細胞膜表面，從而可更有效地激發(fā)機體的免疫反應(yīng)。另外，由于L929細胞是鼠源性的成纖維細胞，細胞表面其他分子具有相對較弱的抗原性，因此用該細胞作為免疫原將會減少非特異性抗體的產(chǎn)生，使單克隆抗體的篩選更為方便并大大提高陽性檢出率。
為了制備L929/4-1BBL細胞，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的DNA操作技術(shù)(例如參見Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbour，1989)完成基因的分離、核苷酸片段的切割與連接、克隆和表達載體的構(gòu)建及擴增、核苷酸序列的分析與鑒定、細胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等操作。例如，可以首先借助RT-PCR技術(shù)從成熟的樹突狀細胞中擴增出人4-1BBL基因。將4-1BBL基因裝入逆轉(zhuǎn)錄載體pEGZ-Term，得到重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/4-1BBL。然后，使用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/4-1BBL與輔助病毒pHIT456和pHIT60一起共轉(zhuǎn)染293T細胞。48小時后，收集含病毒顆粒的293T細胞培養(yǎng)物上清，以其感染L929細胞，連續(xù)感染3天。然后，用含Zeocin的選擇培養(yǎng)基篩選陽性細胞株。最后，培養(yǎng)篩選得到的陽性細胞，待陽性抗性單克隆生長至足夠大時，挑取單克隆集落進行擴大培養(yǎng)。按上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因細胞的4-1BBL表達率高達90％以上。
本發(fā)明的抗人4-1BBL的雜交瘤細胞株被命名為1F1，并已按照布達佩斯條約和中國專利法實施細則第25條的規(guī)定，于2004年6月2日將該細胞株樣品保藏在中國北京中國微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，其保藏編號分別為CGMCC No.1159。
氨基酸序列分析結(jié)果顯示，本發(fā)明的純化的1株抗人4-1BBL單克隆抗體1F1多肽具有如序列表中SEQ ID NO1和2所示的推測的重鏈和輕鏈氨基酸序列(均以單字母表示)。
流式細胞儀分析結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的抗人4-1BBL單克隆抗體1F1能不同程度地識別不同細胞表面表達的4-1BBL分子。
為了鑒定本發(fā)明的抗人的4-1BBL單克隆抗體的生物學(xué)功能，本發(fā)明首先進行了誘導(dǎo)單核細胞增殖的實驗。實驗結(jié)果顯示1F1可介導(dǎo)逆向信號，大量誘導(dǎo)單核細胞的增殖(有關(guān)方法學(xué)參見Ju SW et al.，Hybrid Hybridomics，2003 Oct；Vol.22(5)，pp.333-8)。
腫瘤的發(fā)生是逃避免疫監(jiān)視的變異細胞惡性增殖所致，其逃避機制之一是由于機體抗原遞呈細胞在數(shù)量和功能上的異常，致使機體的腫瘤抗原特異性T細胞處于免疫耐受狀態(tài)。因此，通過改變T細胞免疫耐受狀態(tài)并激發(fā)機體特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，清除和控制腫瘤殘留細胞，達到腫瘤免疫治療的目的。樹突狀細胞(DC)是體內(nèi)專業(yè)的抗原遞呈細胞，且較單核和巨噬細胞的抗原遞呈能力大100倍以上。將體外誘導(dǎo)并經(jīng)抗原刺激的DC回輸入體內(nèi)也可遷移到淋巴組織，并致敏T細胞，激發(fā)細胞免疫反應(yīng)。因此，采用DC體外激發(fā)或同時負載腫瘤抗原，可有效的激發(fā)機體的特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，對腫瘤產(chǎn)生特異性殺傷作用(例如參見Romani，et al.，J.Exp.Med.18083，1994)。
某些T細胞能夠識別靶細胞上與I類MHC結(jié)合的抗原肽片段。在對攜帶抗原肽的抗原遞呈細胞的反應(yīng)中，誘導(dǎo)了識別抗原肽的T細胞的分化和增殖。已知樹突狀細胞是能夠通過在細胞表面I和II類MHC分子上遞呈抗原而激活T細胞、NK細胞及其他免疫細胞的最強有力的抗原遞呈細胞(Banchereau andSchmit，Advances in Experimental Medicine and Biology(Back et al.，eds)volume378，Plenum Press，NY)。除了向T細胞和NK細胞遞呈抗原外，樹突狀細胞還可通過產(chǎn)生T細胞有絲分裂原來刺激T細胞的有絲分裂。
盡管樹突狀細胞在免疫治療中的價值是已知的，但在實際應(yīng)用中仍存在著難于從外周血中分離到足夠用于治療目的的樹突狀細胞的問題。為了成功地進行自體免疫治療中，必須首先由病人外周血中分離足夠的單核細胞并由之誘導(dǎo)分化生成樹突狀細胞，于體外負載特定抗原后再回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，最終用于腫瘤或其他免疫系統(tǒng)疾病的治療目的。
傳統(tǒng)的體外擴增DC的方法是在體外培養(yǎng)的外周血單核細胞培養(yǎng)物中加入粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子(TNF-α)刺激的CD34+造血前體細胞，以誘導(dǎo)DC細胞生成；或者在體外培養(yǎng)的外周血單核細胞培養(yǎng)物中加入GM-CSF、白細胞介素4(IL-4)和TNF-α等細胞因子，以獲得GM-CSF依賴性DC細胞。然而，使用傳統(tǒng)方法獲得的DC數(shù)量有限，難以滿足臨床需要。因此，本領(lǐng)域希望建立一種能夠更為有效地擴充DC細胞的方法，為某些免疫系統(tǒng)疾病的臨床治療提供足夠的DC和活化的細胞毒性T淋巴細胞。
因此，本發(fā)明進一步涉及使用抗4-1BBL單克隆抗體提高樹突狀細胞體外擴增數(shù)量的的方法和組合物。我們的實驗表明，在誘導(dǎo)單核細胞分化發(fā)育為DC的過程中，投用含本發(fā)明單抗1F1的組合物可有效地擴充DC細胞的數(shù)量，并可使如此擴充的DC細胞的IL-12的分泌增加，并減少其IL-10的分泌，同時上調(diào)CD86和CD83的表達，從而可進一步促進DC的成熟和功能活性的發(fā)揮。
另一方面，本發(fā)明人在深入研究造血系統(tǒng)各類型細胞的表面標記的基礎(chǔ)上，試圖應(yīng)用本發(fā)明的抗人4-1BBL抗體1F1分析各類型白細胞特別是M4和M5白血病細胞表面上的4-1BBL表達水平，并使用基于本發(fā)明的單克隆抗體1F1的試劑盒完成M4、M5白血病的免疫分型，為這些白血病的免疫治療和預(yù)后提供依據(jù)。
因此，本發(fā)明的再一個目的是提供抗人4-1BBL單克隆抗體在急性粒一單核細腦白血病(M4)和急性單核細胞白血病(M5)分型診斷中的應(yīng)用。急性白血病(AL)可分為急性淋巴細胞白血病和急性非淋巴細胞白血病兩大類。急性非淋巴細胞白血病又可進一步分為M0，M1，M2，M3，M4，M5，M6和M7型。準確地區(qū)分白血病的類型直接關(guān)系到白血病的治療效果和預(yù)后判斷。傳統(tǒng)白血病診斷分型采用形態(tài)學(xué)FAB分型和細胞化學(xué)染色診斷。但由于白血病系造血細胞在分化過程中阻滯于某一分化階段，并呈惡性增殖，惡性增殖的白血病細胞形態(tài)復(fù)雜多變，尤其是分化早期的急性白血病細胞，更不易識別。因此，采用免疫分型結(jié)合形態(tài)學(xué)及遺傳學(xué)診斷比單純的形態(tài)學(xué)分型和細胞化學(xué)染色診斷將更準確，從而可避免FAB分型的人為誤差和重復(fù)性差的缺點。我們在成功地制備了抗人4-1BBL單克隆抗體的基礎(chǔ)上，進一步成功地組建了4-1BB配體檢測試劑盒，并將其用于M4和M5白血病細胞的分型。我們的初步實驗結(jié)果表明，1F1可以靈敏的識別不同腫瘤細胞表達的4-1BBL分子及其相對水平，因而可用于區(qū)分M4和M5型白血病。
以下借助非限制性實施例舉例詳細描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明的基本精神和原則前提下，改變或改動本說明書中描述的某些技術(shù)內(nèi)容或技術(shù)環(huán)節(jié)。但人們可以理解到，這些平行的改變或改動均將包括在本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實施例實施例1抗人4-1BBL單克隆抗體的制備本實施例描述本發(fā)明的抗人4-1BBL單克隆抗體1F1的制備。
(1)轉(zhuǎn)基因細胞L929/4-1BBL和L929/mock的建立(a)人4-1BBL基因的克隆基本上按照圖1所示的流程構(gòu)建用于本發(fā)明的L929/4-1BBL轉(zhuǎn)基因細胞。簡單地說，使用TRIZOL試劑(Gibco，BRL)抽提單核細胞總RNA。按照MBI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書推薦的方法，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取5μl cDNA作為模板，使用上游引物5’-TCG TCA TGG AATACG CCT CTG-3’(SEQ ID NO3)，和下游引物5’-TTC CGA CCT CGG TGAAGG GAG TC-3’(SEQ ID NO4)進行PCR擴增(94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，30個循環(huán)后72℃延伸5分鐘)。純化后，在T4DNA連接酶作用下直接將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接過夜。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌TOP10，并對篩選的陽性克隆進行PCR和酶切鑒定以及DNA測序。結(jié)果顯示，所獲得的cDNA序列與GenBank中注冊的人4-1BBL cDNA序列完全一致。
(b)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建取1μl 10倍稀釋的測序正確的pMD18-T/4-1BBL質(zhì)粒為模板，用含有酶切位點ECRI的上游引物5’-TCT CGAATT CAT GGA ATA CGC CTC TG-3’(SEQ ID NO5)和含有酶切位點BamHI下游引物5’-TTC TGG ATC CTT ATT CC GAC CTC GGT G-3’P(SEQ ID NO6)進行PCR擴增(94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，30個循環(huán)后72℃延伸5分鐘)。分別用核酸內(nèi)切酶EcorI和BamHI消化PCR擴增產(chǎn)物和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term(現(xiàn)代免疫學(xué)，2004，24(2)99-103)(37℃，4小時)?；厥蘸康幕虻钠魏?，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化適當?shù)母惺軕B(tài)大腸桿菌細胞。從所得重組體細胞培養(yǎng)物中分離并用上述方法鑒定證實后，將所獲得的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體定名為pEGZ-Term/4-1BBL。
(c)穩(wěn)定表達人4-1BBL的L929轉(zhuǎn)基因細胞的構(gòu)建按照圖1所示的流程，首先以試劑盒操作手冊推薦的脂質(zhì)體法，用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/4-1BBL和輔助病毒pHIT456與pHIT60(現(xiàn)代免疫學(xué)，2004，24(2)99-103)(體積比2∶1∶1)共轉(zhuǎn)染6孔板中60-70％匯合生長成片的293T細胞。48小時后收集含病毒顆粒的293T培養(yǎng)上清，以其感染L929細胞。加入polybrene至終濃度為8ng/ml，繼續(xù)37℃感染6小時。再加入含10％胎牛血清(FCS)的1640培養(yǎng)基(2ml/孔，隔天換液)。重復(fù)感染3次后收集細胞，將1∶6稀釋的細胞培養(yǎng)物置于含Zeocin(Invitrogen，500μg/ml)的選擇培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)2周。待抗性單克隆生長至足夠大，挑取單克隆菌落進行擴大培養(yǎng)。同時制備用作陰性對照的轉(zhuǎn)基因細胞L929/mock。流式細胞儀檢測顯示，L929/4-1BBL細胞膜上人4-1BBL蛋白的表達率約為90％。
(2)功能型抗人4-1BBL單克隆抗體的制備方法基本上按照Ju等人所述的方法(Ju SW et al.，Hybrid Hybridomics，；Vol.22(5)，pp.333-8，2003 Oct)制備本發(fā)明的功能型抗人4-1BBL單克隆抗體1F1。所得到的雜交瘤細胞經(jīng)體外持續(xù)傳代(40代)后，仍能穩(wěn)定地分泌特異性抗體。對雜交瘤細胞株1F1(CGMCC No.1159)的染色體分析顯示，這株雜交瘤細胞的染色體數(shù)目為104(圖2)。
(a)采用本室建立的腹水體內(nèi)誘生方法生產(chǎn)單克隆抗體。取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，腹腔內(nèi)注入Pristane(0.5ml/只)。一周后腹腔內(nèi)接種雜交瘤細胞(1×107/只)，同時再次腹腔內(nèi)注射Pristane與福氏不完全佐劑的等體積混合物(0.2ml/只)。5-10天后收獲腹水，并離心取上清于-80℃保存。
(b)腹水型單抗的純化和定量。腹水液經(jīng)去除纖維蛋白和鹽析處理后，以蛋白G親和柱層析法純化。收集蛋白峰流出液，對磷酸鹽緩沖液(PBS)透析后用751紫外分光光度計測定抗體蛋白濃度為0.8～10mg/ml。間接免疫熒光法分析結(jié)果顯示，純化后單抗的效價為1∶1000以上。
(c)Ig亞類鑒定。采用試紙快速測定(Argen公司)法鑒定本發(fā)明單克隆抗體的Ig亞類分類，結(jié)果顯示該抗體為小鼠IgG1型。
(f)間接免疫熒光法分析顯示，本發(fā)明的1F1可以識別不同細胞表達的4-1BBL分子，Western blot鑒定顯示，本發(fā)明的抗體1F1具有識別4-1BBL分子的良好特異性。生物學(xué)活性鑒定結(jié)果顯示，本發(fā)明的抗體1F1能激發(fā)單核細胞大量增殖，且效能超過4-1BB-Fc和GM-CSF對單核細胞的激發(fā)效應(yīng)。(參見附圖3～4)。
實施例2(1)功能性抗人4-1BBL單克隆抗體1F1體外擴增樹突狀細胞和激發(fā)T細胞實驗以下所有實驗均以RPMI1640作為陰性對照，并以IL-4、GM-CSF和TNF-α的混合物作為陽性對照。
取單抗1F1(1～10μg/mL，PBS稀釋)包被24孔或6孔塑料培養(yǎng)板，4℃過夜或37℃孵育2小時后，吸去包被液，PBS洗滌兩遍備用。取腫瘤患者或供血員新鮮外周血50-100mL用淋巴細胞分離液(Ficoll/Paque)分離得到外周血單個核細胞(PBMNC)。將PBMNC貼壁培養(yǎng)后去除非貼壁細胞，PBS(4℃)反復(fù)吹洗獲得貼壁細胞。將貼壁細胞加入包被有抗體1F1的培養(yǎng)板中，同時加入IL-4(100U/mL)和GM-CSF(1000U/mL)，培養(yǎng)4～5天后加入TNF-α(100U)，繼續(xù)培養(yǎng)3天后收獲成熟的DC。用相差顯微鏡觀查細胞的形態(tài)變化，結(jié)果如圖5所示。第5天3H摻入法測定cpm值，以分析1F1促進DCs增殖的效應(yīng)，結(jié)果如圖6所示。收獲培養(yǎng)至第八天的DC，以免疫熒光法分析所獲得的DC的表型，結(jié)果如圖7所示。收集第五天的培養(yǎng)物上清并收集加入TNF-α培養(yǎng)3天的培養(yǎng)物上清，以ELISA方法分析細胞因子的分泌水平，結(jié)果如圖8所示。
由圖5至8所示的結(jié)果可以看出，使用本發(fā)明的1F1協(xié)同細胞因子GM-CSF大量擴增DC，其擴增效率遠遠高于常規(guī)方法，而且還可借助1F1促進DC的增殖并提高其細胞因子的分泌水平。由于1F1可抑制IL-10的分泌，所以能夠間接增強DC的功能。因此，可以聯(lián)合使用本發(fā)明的1F1和GM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC功能活性的提高，并用于體外擴增DC細胞和/或細胞毒性T淋巴細胞。
(2)DC激活自體T細胞實驗以常規(guī)Ficoll密度梯度離心法獲得健康人新鮮外周血單個核細胞。將誘導(dǎo)的DC細胞與磁株陰性選擇(去除CD56、CD14陽性細胞)新鮮外周血單個核細胞獲得的T細胞1∶20(1×104∶2×105)混合物于96孔板的各小孔中。單獨培養(yǎng)的T細胞為陰性對照、以混合培養(yǎng)的DC(常規(guī)方法誘導(dǎo)獲得)和T細胞為陽性對照。5％CO2、37℃培養(yǎng)72小時后，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)6小時。培養(yǎng)后吸去上清，加入酸化異丙醇溶解的甲贊紫顆粒并測定570nm下的OD值。按下列公式計算刺激指數(shù)(SI)SI＝實驗組OD值/對照組OD值由圖8所示的結(jié)果可以看出，采用本發(fā)明的抗體1F1聯(lián)合細胞因子GM-CSF誘導(dǎo)的DC激發(fā)自體T細胞的能力明顯增強。因此，采用這種方法誘導(dǎo)的DC可以介導(dǎo)更強的抗腫瘤免疫應(yīng)答，在臨床應(yīng)用中具有更明顯的優(yōu)勢。
實施例3本發(fā)明的單克隆抗體1F1在白血病分型中的應(yīng)用取少量白血病患者外周血(0.5～1mL)，1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄血清，加入2mL紅細胞裂解液(200mM NH4Cl，10mM NaHCO3，10mM EDTA，pH7.4)，37℃放置2分鐘，加入PBS終止反應(yīng)，離心棄上清，獲得腫瘤患者外周血白血病細胞。間接免疫熒光法(陰性對照一抗為小鼠IgG1同型對照作，二抗為熒光素FITC或PE標記的羊抗鼠IgG，4-1BBL的表達一抗為1F1，二抗為熒光素FITC或PE標記的羊抗鼠IgG)，流式細胞儀分析4-1BBL分子的表達，結(jié)果如表1和圖10所示。
表1 4-1BBL分子在白血病細胞表面表達的陽性率
●P＞0.05，**P＜0.01由表1和圖10所示的結(jié)果可以看出，不同類型腫瘤細胞表面4-1BBL分子的表達率不同，并且與其他類型的腫瘤細胞性比，M4和M5型白血病細胞有相對較高的4-1BBL表達率。由于這種4-1BBL分子在不同類型腫瘤細胞表達的差異性，所以有可能借助本發(fā)明的識別不同腫瘤細胞表達的4-1BBL分子的單克隆抗體1F1作為診斷試劑，用于白血病尤其是M4、M5白血病的鑒定和診斷。
序列表<110>蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所<120>抗人4-1BBL單克隆抗體及其應(yīng)用<140>
<141>
<160>5<210>1<211>115<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)合成的單克隆抗體1F1的核甘酸編碼序列推測的重鏈氨基酸序列。
<400>1VKLQQSGPEL VKPGASVKMS CKASGYTFTS YVIQWVKQKP GQGLEWIGSINPYNDYTKYN EKFKGKATLT SDKSSITAYM EFSSLTSEDS ALYYCARWGDGNYWGQGTTL TVSSA<210>2<211>111<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)合成的單克隆抗體1F1的核甘酸編碼序列推測的輕鏈氨基酸序列。
<400>2DIEMTQSPAS LAVSLGQRAT ISYRASKSVS TSGYSYMHWN QQKPGQPPRLLIYLVSNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHIRELTR SEGGPSWRSNN<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。
<400>3TCGTCATGGAB ATACGCCTCT G<210>4<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。
<400>4TTCCGACCTC GGTGAAGGGA GTC<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。
<400>5TCTCGAATTC ATGGAATACG CCTCTG<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。
<400>6TTCTGGATCC TTATTCCGAC CTCGGTG
權(quán)利要求
1.分別具有EQ ID NO1和EQ ID NO2所示的重鏈和輕鏈氨基酸序列的抗人4-1BBL功能型單克隆抗體1F1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體1F1是由保藏編號為CGMCC No.1159的雜交瘤細胞分泌的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體1F1在大量擴增成熟DC細胞中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體1F1在M4、M5白血病分型診斷中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結(jié)合蛋白質(zhì)或多肽，更具體地說，本發(fā)明涉及抗人4－1BBL單克隆抗體1F1，其制備方法以及這些單克隆抗體在誘導(dǎo)樹突狀細胞擴增和白血病分型鑒定中的應(yīng)用。
文檔編號C12N5/16GK1844149SQ20051003873
公開日2006年10月11日 申請日期2005年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月7日
發(fā)明者張學(xué)光, 居頌文, 居頌光 申請人:蘇州大學(xué)