凝血酶結(jié)合抗體分子及其用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及分離的抗體，其識(shí)別凝血酶的exosite1表位，并選擇性抑制凝血酶，而不促進(jìn)出血。這些抗體分子可用于治療和預(yù)防血栓形成、栓塞及其他由凝血酶介導(dǎo)的病癥。
【專(zhuān)利說(shuō)明】凝血酶結(jié)合抗體分子及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抑制凝血酶的抗體分子。

【背景技術(shù)】
[0002]血液凝固是防止受損血管出血(止血)的重要過(guò)程。然而，阻塞血液流經(jīng)血管(血栓形成)或脫落后沉積在身體內(nèi)別處的血管(血栓栓塞)的血凝塊對(duì)健康是嚴(yán)重的威脅。
[0003]有很多抗凝血療法可供治療病理性血液凝固。這些療法的通病是增加的出血風(fēng)險(xiǎn)(Mackman (2008)Nature451 (7181):914-918)。許多抗凝劑治療窗口狹窄，介于阻止血栓形成和引起出血的劑量之間。該窗口經(jīng)常進(jìn)一步受限于個(gè)體病人中的反應(yīng)差異。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明涉及預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)，即識(shí)別凝血酶exositel表位的抗體分子選擇性抑制凝血酶，而不促進(jìn)出血。這些抗體分子可用于治療和預(yù)防血栓形成、栓塞及其他由凝血酶介導(dǎo)的病癥。
[0005]本發(fā)明一方面提供了分離的抗體分子，其特異性結(jié)合凝血酶的exositel。
[0006]分離的抗exositel抗體分子可在體內(nèi)抑制凝血酶，而不促進(jìn)或大幅促進(jìn)出血(bleeding)或溢血(haemorrhage),即該抗體分子不抑制或大幅抑制對(duì)血管損傷的正常生理反應(yīng)(即止血)。例如，止血不會(huì)被抗體分子抑制或會(huì)被其最低程度地抑制(即微小程度地抑制，不會(huì)影響病人的健康或需要進(jìn)一步干預(yù))。出血不會(huì)被抗體分子增加或會(huì)被其最低程度地增加。
[0007]exositel (又名“陰離子結(jié)合exositel”和“纖維蛋白原識(shí)別exosite”)是凝血酶分子上典型的次級(jí)結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)例如James A.Huntington, 2008, StructuralInsights into the Life History of Thrombin,in Recent Advances in Thrombosisand Hemostas i s2008, editors ； K.Tanaka and E.W.Davi e, Springer JapanKK, Tokyo, pp.80-106)。exositel形成于成熟凝血酶中，但不形成于凝血酶原中(參見(jiàn)例如Anderson et al (2000)JBC277516428-16434)。
[0008]exositel參與識(shí)別凝血酶底物，例如纖維蛋白原，但遠(yuǎn)離催化活性位點(diǎn)。多種凝血酶結(jié)合因子結(jié)合exositel,包括抗凝十二肽水蛭原(hirugen) (Naski et al1990JBC26513484-13489)、因子V、因子VII1、血栓調(diào)解蛋白(蛋白C和TAFI激活的輔因子)、纖維蛋白原、PARl和纖維蛋白(因子X(jué)III激活的輔因子)。
[0009]抗exositel抗體可與成熟的人凝血酶exositel結(jié)合。人前凝血酶原(preprothrombin)的序列如SEQ ID NO:1所示。人凝血酶原具有SEQ ID NO:1的44-622殘基的序列。成熟的人凝血酶原具有314-363殘基(輕鏈)和364-622殘基(重鏈)的序列。
[0010]在一些實(shí)施方案中，抗exositel抗體也可結(jié)合來(lái)自其他物種的成熟凝血酶的exositel。來(lái)自其他物種的凝血酶序列是本領(lǐng)域已知的,并可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)如Genbank中獲得。來(lái)自其他物種的凝血酶序列中的對(duì)應(yīng)殘基可利用序列比對(duì)工具很容易地鑒別。
[0011]本文所示凝血酶殘基的編號(hào)方案是本領(lǐng)域常規(guī)的，基于糜蛋白酶模板(Bode W etal EMBO J.1989Nov ；8(11):3467-75)。凝血酶具有相對(duì)于糜蛋白酶的插入環(huán)，用小寫(xiě)字母順序標(biāo)出。
[0012]成熟的人凝血酶exositel在SEQ ID NO:1中以下劃線(xiàn)標(biāo)出，可包括如下殘基:M32、F34、R35、K36、S36a、P37、Q38、E39、L40、L65、R67、S72、R73、T74、R75、Y76、R77a、N78、E80、K81、I82、S83、M84、K109、K110、K149e、G150、Q151、S153 和 V154。在一些實(shí)施方案中，位于這些殘基中任一個(gè)附近(即0.5nm或Inm內(nèi))的其他凝血酶殘基也可被認(rèn)為是exositel的部分。
[0013]抗exositel 抗體可結(jié)合表位，其包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20或多于20個(gè)exositel殘基。優(yōu)選地，抗exositel抗體結(jié)合全部由exositel殘基組成的表位。
[0014]例如，抗exositel抗體可結(jié)合表位，其包含選自人凝血酶的M32、F34、S36a、P37、Q38、E39、L40、L65、R67、R73、T74、R75、Y76、R77a、182 和 Q151 的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15或全部16個(gè)殘基，或來(lái)自其他物種的凝血酶的等價(jià)殘基。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，表位可以包含凝血酶殘基Q38、R73、T74、Y76和R77a以及任選地一個(gè)或多個(gè)其他殘基。
[0015]本文所述的抗exositel抗體分子特異性針對(duì)凝血酶exositel,并且相對(duì)于其他表位，例如來(lái)自成熟凝血酶之外的哺乳動(dòng)物蛋白的表位，該抗體與該表位以高親和力結(jié)合。例如，抗exositel抗體分子對(duì)凝血酶exositel的親和力比對(duì)其他表位高至少500倍,至少1000倍或至少2000倍。
[0016]優(yōu)選地,本文所述的特異性針對(duì)exositel的抗體分子可以結(jié)合成熟凝血酶,但與凝血酶原不結(jié)合或基本不結(jié)合。
[0017]不受任何理論約束,抗exositel抗體可能無(wú)法接近止血性血塊核心內(nèi)的凝血酶，因此無(wú)法通過(guò)破壞血管損傷位點(diǎn)的正常凝血酶功能影響止血。然而，由于抗exositel抗體仍然結(jié)合血塊表面上和外殼里的凝血酶，血栓形成被阻止，即非止血性血塊蔓延被阻止。
[0018]抗exositel抗體分子對(duì)exositel的解離常數(shù)可小于50nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于1nM或小于InM。例如，抗體分子對(duì)exositel的親和力可以是0.1_50ηΜ,例如0.5-10nM。適合的抗exositel抗體分子對(duì)凝血酶exositel的親和力可以是例如約InM。
[0019]抗exositel抗體分子的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力(以平衡解離常數(shù)Kd表示)可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如表面離子共振，如使用BIAcore分析來(lái)確定。
[0020]本文所述的抗exositel抗體分子可以是免疫球蛋白或其片段，并且可以是天然或者部分或全部合成產(chǎn)生的例如重組分子。
[0021]抗exositel抗體分子可以包括包含抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的任意多肽或蛋白，其包括Fab、Fab2, Fab3>雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微小抗體和單域抗體，包括納米抗體，以及任意亞型或子類(lèi)的全抗體。抗體分子及其構(gòu)建和使用的方法在例如Ho 11 i ger&Hudson, Nature B1technology23 (9): 1126-1136 (2005)中有記載。
[0022]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中,抗exositel抗體分子可以是全抗體。例如,抗exositel抗體分子可以是IgG、IgA、IgE或IgM或任意亞型子類(lèi),尤其是IgGl和IgG4。抗exositel抗體分子可以是單克隆抗體。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，抗exositel抗體分子可以是抗體片段。
[0023]抗exositel抗體分子可以是嵌合的、人源化的或人抗體。
[0024]本文所述的抗exositel抗體分子可以是分離的，即不含污染物，例如能夠結(jié)合其他多肽的抗體和/或血清成分。盡管多克隆抗體也可使用，但出于某些目的，優(yōu)選單克隆抗體。
[0025]抗exositel抗體分子可以使用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得。生產(chǎn)抗體的方法包括用蛋白或其片段免疫哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔子、馬、山羊、綿羊或猴子)。抗體可用任意的本領(lǐng)域已知的多種方法從免疫動(dòng)物獲得，并進(jìn)行篩選，優(yōu)選通過(guò)抗體與感興趣的抗原的結(jié)合。例如，可用免疫印跡技術(shù)(Western blotting techinques)或免疫沉淀法(Armitage et al., 1992, Nature357:80-82)。從動(dòng)物中分離抗體和/或抗體產(chǎn)生細(xì)胞后可伴隨處死動(dòng)物的步驟。
[0026]作為用肽免疫哺乳動(dòng)物的替代或補(bǔ)充，特異性針對(duì)蛋白的抗體可由重組產(chǎn)生的表達(dá)免疫球蛋白可變區(qū)的文庫(kù)獲得，例如使用λ噬菌體或絲狀噬菌體，其在表面展示功能性免疫球蛋白結(jié)合域，例如參見(jiàn)W092/01047。該文庫(kù)可以是天然的，即由獲自未經(jīng)任何蛋白(或片段)免疫的有機(jī)體的序列構(gòu)建，或可以是使用獲自已經(jīng)接觸感興趣的抗原的有機(jī)體的序列構(gòu)建的文庫(kù)。
[0027]其他抗exositel抗體分子可以通過(guò)篩查病人血清中結(jié)合exositel的抗體來(lái)鑒定。
[0028]在一些實(shí)施方案中，抗凝血酶抗體分子可通過(guò)任意便捷的方式生產(chǎn)，例如上述方法，繼而篩選與成熟凝血酶的差異結(jié)合(相對(duì)于帶有exositel突變的凝血酶、Y凝血酶(R75和R77a處的自溶導(dǎo)致exositel缺陷)或凝血酶原)。適合的篩選方法是本領(lǐng)域熟知的。
[0029]抗體，其相對(duì)于非凝血酶蛋白、帶有exositel突變的凝血酶、Y凝血酶或凝血酶原，顯示出對(duì)成熟凝血酶的增強(qiáng)結(jié)合，例如抗體，其結(jié)合成熟凝血酶，但不結(jié)合帶有exositel突變的凝血酶、Y凝血酶或凝血酶原，可被鑒定為抗exositel抗體分子。
[0030]產(chǎn)生和/或分離后，可檢測(cè)抗exositel抗體分子的生物活性。例如，可確定抗體分子抑制凝血酶底物、輔因子或抑制劑結(jié)合和/或凝血酶切割的能力，和/或可確定抗體分子抑制血栓形成、而不促進(jìn)出血的能力。
[0031]適合的抗體分子的活性可使用纖維蛋白原凝結(jié)或凝血酶時(shí)間分析進(jìn)行檢測(cè)。適合的分析是本領(lǐng)域熟知的。
[0032]抗體分子對(duì)凝固和出血的效果可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定。例如，抗體分子對(duì)血栓形成的效果可在動(dòng)物模型，例如血管中帶有氯化鐵誘導(dǎo)的血塊的小鼠模型中確定。對(duì)止血的效果也可在動(dòng)物模型中確定，例如通過(guò)測(cè)量小鼠尾巴出血。
[0033]抗體分子通常包含抗原結(jié)合區(qū)，其包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)，盡管也有僅包含重鏈可變區(qū)(VH)的抗原結(jié)合區(qū)(例如駱駝或鯊魚(yú)抗體)。
[0034]每個(gè)VH和VL區(qū)通常包含三個(gè)由框架區(qū)間隔的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)，負(fù)責(zé)抗原結(jié)合。
[0035]在一些實(shí)施方案中，與exositel的結(jié)合可完全或大體通過(guò)抗exositel抗體分子的VHCDR3進(jìn)行。
[0036]例如，抗exositel抗體分子可包含VH區(qū)，其包含具有SEQ ID NO:5序列或帶有I或多個(gè)，例如2、3、4或5或更多氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO:5序列的HCDR3。取代可以是保守取代。在一些實(shí)施方案中，HCDR3可以包含SEQ ID NO:5位點(diǎn)4_9的氨基酸殘基(SEFEPF)，或更優(yōu)選地，SEQ ID NO: 5位點(diǎn)2和4_10的氨基酸殘基(D和SEFEPF)，SEQID NO:5中一個(gè)或多個(gè)其他位點(diǎn)具有取代、缺失或插入。HCDR3可以是抗體分子與凝血酶exositel相互作用的唯一區(qū)域,或大體上的唯一區(qū)域。因此HCDR3可決定抗體分子對(duì)凝血酶exositel區(qū)的特異性和/或親和力。
[0037]抗exositel抗體分子的VH區(qū)可另外包含具有SEQ ID NO: 4序列或帶有I或多個(gè)，例如2、3、4或5或更多氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID N0:4序列的HCDR2。在一些實(shí)施方案中，HCDR2可以包含SEQ ID N0:4位點(diǎn)3-7的氨基酸殘基(DPQDG)，或SEQ ID N0:4位點(diǎn)2和4-7的氨基酸殘基(L和PQDG)，SEQ ID NO:4中一個(gè)或多個(gè)其他位點(diǎn)具有取代、缺失或插入。
[0038]抗exositel抗體分子的VH區(qū)可進(jìn)一步包含具有SEQ ID NO:3序列或帶有I或多個(gè)，例如2、3、4或5或更多氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO:3序列的HCDRl。在一些實(shí)施方案中，HCDRl可以包含SEQ ID N0:3位點(diǎn)5的氨基酸殘基T，SEQ ID NO:3中一個(gè)或多個(gè)其他位點(diǎn)具有取代、缺失或插入。
[0039]在一些實(shí)施方案中，抗體分子可包含VH區(qū)，其包含分別具有序列SEQ IDN0:3、4和5的HCDRl、HCDR2和HCDR3。例如，抗體分子可包含VH區(qū)，其具有序列SEQ ID NO: 2或在SEQ10勵(lì):2中具有一或多個(gè)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多氨基酸取代、缺失或插入的序列 SEQ ID NO: 2。
[0040]抗exositel抗體分子可進(jìn)一步包含VL區(qū)，例如包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL區(qū)，所述LCDRl、LCDR2和LCDR3分別具有序列SEQ ID N0:7、8和9，或分別各自具有一個(gè)或多個(gè)，例如2、3、4或5或更多氨基酸取代、缺失或插入的序列SEQ IDN0:7、8和9。取代可以是保守取代。例如，抗體分子可包含VL區(qū)，其具有序列SEQ ID NO:6或在SEQ ID NO:6中具有一個(gè)或多個(gè)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多氨基酸取代、缺失或插入的序列SEQ IDN0:6。
[0041]在一些實(shí)施方案中，VL區(qū)可包含Tyr49。
[0042]抗exositel抗體分子可例如包含一或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入,其改善該抗體的一或多個(gè)性能，例如親和力、功能半衰期、結(jié)合和解離速率。
[0043]用于在⑶R、抗體VH或VL區(qū)和抗體的氨基酸序列中弓丨入取代、缺失或插入的技術(shù)是本領(lǐng)域常用的。可制備變體序列，其具有可能或不能預(yù)期對(duì)活性具有最低或有益效果的取代、缺失或插入，并檢測(cè)其結(jié)合凝血酶exositel的能力和/或任何其他期望的性能。
[0044]在一些實(shí)施方案中，抗exositel抗體分子可包含VH區(qū),其包含分別具有序列SEQID N0:3、4和5的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及VL區(qū)，其包含分別具有序列SEQ ID N0:7、8和 9 的 LCDRl、LCDR2 和 LCDR3。
[0045]例如，VH和VL區(qū)可分別具有序列SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:6 ;或者可具有各自包含一或多個(gè)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO:2SEQ ID NO:6的氨基酸序列。取代可以是保守取代。
[0046]在一些實(shí)施方案中，抗體可包含一或多個(gè)去除糖基化位點(diǎn)的取代、缺失或插入。例如，SEQ ID NO:6VL區(qū)內(nèi)的糖基化位點(diǎn)可經(jīng)在N28或S30引入取代而突變掉。
[0047]抗exositel抗體分子可為如上所述的任意形式。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，抗exositel抗體分子可以是全抗體,例如IgG(如IgGl或IgG4)、IgA、IgE或IgM0
[0048]本發(fā)明的抗exositel抗體分子可以是與上述抗體分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合exositel的抗體分子，例如抗體分子，其
[0049](i)結(jié)合凝血酶exositel且
[0050](ii)包含 SEQ ID NO: 2 的 VH 區(qū)和 / 或 SEQ ID NO: 6 的 VL 區(qū);SEQ ID NO: 5 的 HCDR3 ；分別為 SEQ ID N0:3、4、7、8 或 9 的 HCDRU HCDR2、LCDRU LCDR2 或 LCDR3 ;包含分別為序列SEQ IDN0:3、4和5的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH區(qū);和/或包含分別為序列SEQ ID NO: 3、4和5的HCDRUHCDR2和HCDR3的VH區(qū)以及包含分別為序列SEQ ID N0:7、8和9的LCDR1、LCDR2 和 LCDR3 的 VL 區(qū)。
[0051]抗體分子間的競(jìng)爭(zhēng)可以很容易地在體外分析，例如使用ELISA和/或用特異性報(bào)告分子標(biāo)記一個(gè)抗體分子，其可在一或多個(gè)其他未標(biāo)記的抗體分子存在時(shí)被檢測(cè)，從而能夠鑒定結(jié)合相同或交叉表位的抗體分子。此類(lèi)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。因此，本發(fā)明另一方面提供了抗體分子，其包含與抗體分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，例如抗體分子，其包含VH和/或VL區(qū)，結(jié)合凝血酶exositel的上述親本抗體的⑶R如HCDR3或CDR組。適合的抗體分子可包含抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合exositel，其中所述抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)由VH區(qū)和VL區(qū)組成，并且其中VH和VL區(qū)包含分別為SEQ ID N0:3、4和5的HCDRl、HCDR2和HCDR3序列以及分別為SEQ ID N0:7、8和9的LCDRl、LCDR2 和 LCDR3 序列，例如 SEQ ID NO: 2 和 6 的 VH 和 VL 區(qū)。
[0052]本文所述的抗exositel抗體分子可抑制凝血酶結(jié)合因子的結(jié)合，包括結(jié)合exositel的因子。例如，抗體分子可競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制fV、fVII1、血栓調(diào)節(jié)蛋白、纖維蛋白原或纖維蛋白、PARl和/或水蛭原和水蛭素類(lèi)似物中的一或多個(gè)與凝血酶結(jié)合。
[0053]本文所述的抗exositel抗體分子可以抑制凝血酶的一種或多種活性。例如，抗exositel抗體分子可抑制一種或多種凝血酶底物，例如纖維蛋白原、血小板受體PAR-1和凝血因子FVIII的水解切割。例如，抗體分子與凝血酶的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致在纖維蛋白以及血栓調(diào)節(jié)蛋白蛋白C和/或TAFI存在時(shí)，纖維蛋白原、PAR-1、凝血因子FVIII和/或其他凝血酶底物例如因子V、因子X(jué)IIII的水解降低至少5倍、至少10倍或至少15倍。在一些實(shí)施方案中，抗exositel抗體分子與凝血酶的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)不到凝血酶對(duì)凝血酶底物的切割。
[0054]測(cè)量凝血酶活性的技術(shù)，例如測(cè)量凝血酶底物在體外的水解是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，并在本文中記載。
[0055]抗exositel抗體分子可進(jìn)一步被化學(xué)修飾,如聚乙二醇化,或整合入脂質(zhì)體所改性，從而改善其藥物性能，例如增加體內(nèi)半衰期。
[0056]抗exositel抗體分子對(duì)凝固和出血的效果可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定。例如,可測(cè)定抗體對(duì)血栓形成模型的效果。適合的模型包括小鼠模型血管中的氯化鐵血塊誘導(dǎo)，接著通過(guò)尾巴出血檢測(cè)正常的止血。其他適合的血栓形成模型是本領(lǐng)域熟知的(參見(jiàn)例如Westricket al ATVB (2007)27:2079-2093)。
[0057]抗exositel抗體分子可包含在具有藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物中。
[0058]藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是融入藥物組合物的化合物或化合物的組合，其不激發(fā)次級(jí)反應(yīng)，并例如有助于抗exositel抗體分子的施用，增加其在體內(nèi)的有效期和/或效力，或增加其在溶液中的溶解度。這些藥學(xué)上可接受的載體是眾所周知，并會(huì)被本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)抗exositel抗體分子的施用方式使用。
[0059]在一些實(shí)施方案中，抗exositel抗體分子可以?xún)龈尚问教峁?，在施用前重溶。例如，凍干的抗體分子在向個(gè)體施用前，可在無(wú)菌水中重溶并與生理鹽水混合。
[0060]抗exositel抗體分子通常以藥物組合物的方式施用，其可包含除抗體分子外的至少一種成分。因此，除抗抗體分子外，藥物組合物可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的材料。此類(lèi)材料應(yīng)當(dāng)是無(wú)毒的，并且不應(yīng)干擾抗exositel抗體分子的效力。載體或其他材料的準(zhǔn)確性質(zhì)將取決于給藥途徑,其可以經(jīng)丸劑、輸液、注射或任何其他適合的途徑，如下文所討論。
[0061]對(duì)于不經(jīng)腸道，例如皮下或靜脈給藥，例如通過(guò)注射，包含抗exositel抗體分子的藥物組合物可以是不經(jīng)腸道可接受的水溶液的形式，其不含熱原，并具有適合的pH、等滲性和穩(wěn)定性。具有本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)的人員完全能夠用例如等滲載體，如氯化鈉注射液、林格注射液O、乳酸化林格注射液制備適合的溶液。防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、抗氧化劑和/或其他添加劑可根據(jù)需要使用，包括緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑如抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨(Octadecyldimethylbenzylammonium chloride);六甲氯銨(hexamethonium chloride);氯化苯甲經(jīng)銨(benzalkoniumchloride);節(jié)索氯銨(benzethonium chloride);苯酹、丁醇或節(jié)醇；對(duì)輕苯甲酸烷基酯(alkyl paraben),如對(duì)輕苯甲酸甲基或丙基酯；鄰苯二酹；間苯二酹；環(huán)己醇；3’ _戍醇和間甲酚)；低分子量多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯眺咯燒酮(polyvinylpyrrolidone);氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖、二糖和其他糖類(lèi)包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA ;糖類(lèi)如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成反離子如鈉離子；金屬?gòu)?fù)合物(如鋅-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEEN?、PLUR0NICS?或聚乙二醇(PEG)。
[0062]包含抗exositel抗體分子的藥物組合物可單獨(dú)給藥,或與其他治療聯(lián)合,根據(jù)待治療的病癥同時(shí)或順序給藥。
[0063]本文所述的抗exositel抗體分子可用于治療人或動(dòng)物體的方法，包括預(yù)防性(prophylactic or preventative)治療(如在個(gè)體中病癥發(fā)作前治療，以降低個(gè)體發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)；推遲其發(fā)作；或減小其發(fā)作后的嚴(yán)重性)。治療方法可包括向有需要的個(gè)體施用抗exositel抗體分子。
[0064]給藥通常是“治療有效量”的，其足以使病人受益。此益處可以至少改善至少一種癥狀。給藥的實(shí)際用量，以及給藥的速率和時(shí)間進(jìn)程將取決于接受治療的性質(zhì)和嚴(yán)重性、接受治療的具體哺乳動(dòng)物、個(gè)體病人的臨床狀況、病因、組合物遞送位點(diǎn)、給藥方法、給藥安排及其他醫(yī)師所知的因素。治療處方，例如劑量等的確定由全科醫(yī)師和其他醫(yī)生負(fù)責(zé)，并且可取決于接受治療的癥狀的嚴(yán)重性和/或疾病的發(fā)展。抗體分子的適當(dāng)劑量是本領(lǐng)域熟知的(Ledermann J.A.et al.(1991) Int.J.Cancer47:659-664 ；Bagshawe K.D.et al.(1991)Antibody, Immunoconjugates and Rad1pharmaceuticals4:915-922).具體用量可在本文或Physician’s Desk Reference (2003)中指定,其適于特定類(lèi)型的藥物的施用?？贵w分子的治療有效量或適合劑量可通過(guò)比較其體外活性和動(dòng)物模型中的體內(nèi)活性來(lái)確定。由小鼠和其他測(cè)試動(dòng)物推斷人的有效劑量的方法是已知的。準(zhǔn)確劑量將取決于多種因素，包括該抗體用于預(yù)防還是治療，接受治療的區(qū)域的尺寸和位置，抗體的準(zhǔn)確性質(zhì)(如全抗體、片段)和與抗體連接的任意可檢測(cè)標(biāo)簽或其他分子的性質(zhì)。
[0065]用于全身施用的典型的抗體劑量為100μ g至lg，用于局部施用的典型的抗體劑量為Iyg至lmg。也可以最初施用較高負(fù)荷劑量，接著施用一或多個(gè)較低劑量。通常抗體是全抗體，如IgGl或IgG4亞型。這是用于成年病人一次治療的劑量，其可針對(duì)兒童和嬰兒成比例地調(diào)整，也可按照分子量的比例對(duì)其他抗體形式進(jìn)行調(diào)整。治療可以按照醫(yī)師的決定，以每天、每周兩次、每周或每月的間隔重復(fù)。個(gè)體的治療日程表可取決于抗體組合物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)性能、給藥途徑和接受治療的病癥性質(zhì)。
[0066]治療可以是周期性的，給藥間隔周期可以是約兩周或更久，如約三周或更久、約四周或更久、約一個(gè)月或更久、約五周或更久、或約六周或更久。例如，治療可以是每2-4周或每4-8周一次。可以在手術(shù)前和/或后進(jìn)行治療，和/或在手術(shù)治療或侵入性操作的解剖部位直接給藥或?qū)嵤＿m合的劑型和給藥途徑如上所述。
[0067]在一些實(shí)施方案中，本文所述的抗exositel抗體分子可以由皮下注射給藥。皮下注射可以使用自動(dòng)注射器給藥，例如用于長(zhǎng)期預(yù)防/治療。
[0068]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中,抗exositel抗體分子的治療效果可持續(xù)幾個(gè)半衰期,這取決于劑量。例如，單劑量抗exositel抗體分子的治療效果可在個(gè)體中持續(xù)I個(gè)月或更久、2個(gè)月或更久、3個(gè)月或更久、4個(gè)月或更久、5個(gè)月或更久、或6個(gè)月或更久。
[0069]本文所述的抗exositel抗體分子抑制凝血酶，并可用于治療凝血酶介導(dǎo)的病癥。
[0070]止血是正常的凝固反應(yīng)，即阻止例如受損血管的出血或溢血。止血使體內(nèi)血管的出血和溢血停止。
[0071]抗exositel抗體分子可以對(duì)止血無(wú)效果，或基本無(wú)效果，即它們不促進(jìn)出血或溢血。
[0072]本發(fā)明的方面提供了:本文所述的抗exositel抗體分子用于人或動(dòng)物體治療的方法；本文所述的抗exositel抗體分子用于治療凝血酶介導(dǎo)的疾病的方法；本文所述的抗exositel抗體分子在制備用于治療凝血酶介導(dǎo)的病癥的藥物中的用途；以及治療凝血酶介導(dǎo)的病癥的方法，包括向有需要的個(gè)體施用本文所述的抗exositel抗體分子。
[0073]本文所述的抗exositel抗體分子對(duì)凝血酶的抑制可以在對(duì)任意凝血酶介導(dǎo)的病癥的治療中具有臨床獲益。凝血酶介導(dǎo)的病癥可以包括與凝血酶形成或活性相關(guān)的疾病。
[0074]凝血酶在止血、凝固和血栓形成中起重要作用。凝血酶介導(dǎo)的病癥包括血栓形成病癥,例如血栓形成和栓塞。
[0075]血栓形成是超出止血所需的凝固(即過(guò)度凝固)，或止血所不需的凝固(即額外止血或非止血凝固)。
[0076]血栓形成是血管腔內(nèi)的血液凝固。其特征在于超出止血所需或止血不需的血塊(血栓)形成。血塊會(huì)阻礙血液在血管內(nèi)的流通，導(dǎo)致醫(yī)療并發(fā)癥。血塊會(huì)從其形成位點(diǎn)脫離，在循環(huán)系統(tǒng)中的其他位置形成栓塞。在動(dòng)脈系統(tǒng)中，血栓形成通常是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂的結(jié)果。
[0077]在一些實(shí)施方案中，血栓形成可在最初的生理學(xué)止血反應(yīng)，如血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后發(fā)生。在其他實(shí)施方案中，血栓形成可在不存在任何生理學(xué)止血反應(yīng)時(shí)發(fā)生。
[0078]血栓形成可在具有血栓形成內(nèi)在傾向(即血栓形成傾向)的個(gè)體中發(fā)生，或在不具有血栓形成內(nèi)在傾向的“正?！眰€(gè)體中例如應(yīng)對(duì)外部刺激時(shí)發(fā)生。
[0079]血栓形成和栓塞可在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的任意血管、動(dòng)脈或其他血管中發(fā)生，并可包括微血管血栓形成。
[0080]血栓形成和栓塞可與手術(shù)(術(shù)中或術(shù)后)或向病人插入外物，如冠脈支架相關(guān)。
[0081]例如，本文所述的抗exositel抗體可用于手術(shù)和其他血管接觸人造表面的過(guò)程中，例如開(kāi)心手術(shù)和透析。
[0082]血栓形成病癥可包括血栓形成傾向、血栓性中風(fēng)和冠狀動(dòng)脈閉塞。
[0083]適于本文所述的治療的病人包括具有病癥的病人，其中血栓形成是癥狀或治療的副作用，或其呈現(xiàn)增加的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，或者相對(duì)于普通人群具有血栓形成傾向或風(fēng)險(xiǎn)增加的病人。例如，本文所述的抗exositel抗體分子也可用于治療或預(yù)防癌癥病人的靜脈血栓形成，以及治療或預(yù)防醫(yī)院獲得性血栓形成，其導(dǎo)致了 50%的靜脈血栓栓塞病例。
[0084]本文所述的抗exositel抗體分子可對(duì)凝血酶介導(dǎo)的病癥，例如血栓性病癥發(fā)揮治療或其他有益效果，而不會(huì)顯著抑制或妨礙止血。例如，相對(duì)于未經(jīng)治療的個(gè)體，經(jīng)抗exositel抗體分子治療的病人中溢血的風(fēng)險(xiǎn)不會(huì)增加或顯著增加。
[0085]經(jīng)常規(guī)抗凝血?jiǎng)?，如天然及合成肝素、華法令、直接絲氨酸蛋白酶抑制劑(如阿加曲班、達(dá)比加群、阿哌沙班和利伐沙班)、水蛭素及其衍生物(如來(lái)匹盧定和比伐盧定)以及抗血小板藥物(如氯吡格雷、噻氯匹定和阿昔單抗)治療的個(gè)體會(huì)造成出血。相對(duì)于經(jīng)常規(guī)抗凝血?jiǎng)┲委煹膫€(gè)體，經(jīng)本文所述的抗exositel抗體分子治療的病人出血的風(fēng)險(xiǎn)降低。
[0086]凝血酶介導(dǎo)的病癥包括與凝血酶活性相關(guān)的非血栓形成病癥，包括炎癥、感染、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、器官排斥和癡呆(血管性和非血管性的，例如阿爾茨海默病MLicari etal J Vet Emerg Crit Care (San Anton1).2009Feb ； 19 (I):11-22 ；Tsopanoglou et al EurCytokine Netw.2009Decl ；20(4):171-9)。
[0087]本文所述的抗exositel抗體分子也可用于體外檢測(cè)，例如凝固分析和表征，例如在犾自病人的樣品中。
[0088]抗exositel抗體分子可用于測(cè)量凝血酶產(chǎn)生。凝血酶產(chǎn)生的分析存在技術(shù)問(wèn)題，因?yàn)槔w維蛋白原向纖維蛋白的轉(zhuǎn)化造成渾濁，從而無(wú)法使用簡(jiǎn)單的顯色終點(diǎn)法
[0089]向血液樣品中添加本文所述的抗exositel抗體分子阻止或抑制纖維蛋白的形成及渾濁，并使得凝血酶生成可用顯色底物進(jìn)行測(cè)量，無(wú)需脫纖維步驟。
[0090]例如，測(cè)量凝血酶生成的方法可包含在本文所述的抗exositel抗體分子存在下，使血液樣品與顯色凝血酶底物接觸，并測(cè)量來(lái)自底物的顯色信號(hào)；其中，顯色信號(hào)指示樣品中的凝血酶產(chǎn)生。
[0091]顯色信號(hào)可直接測(cè)量，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行脫纖維。
[0092]適合的底物是本領(lǐng)域熟知的，包括S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNa)、β -Ala-Gly-Arg-對(duì)硝基苯胺雙醋酸酯(β-Ala-Gly-Arg-p-nitroanilidediacetate) (Prasa,D.et al.(1997)Thromb.Haemost.78, 1215 ；Sigma Aldrich Inc)和Tos-Gly-Pro-Arg-pNa.AcOH (B1phen CS-01 (81) ；Aniara Inc OH USA)。
[0093]抗exositel抗體分子也可用于在體外循環(huán)，例如血液透析和體外膜式氧合中抑制或阻止上述血液凝固。
[0094]例如，體外或離體抑制或阻止血液凝固的方法可包含將本文所述的抗exositel抗體分子引入血液樣品。血液樣品可在引入抗exositel抗體之前、同時(shí)或之后引入體外循環(huán)系統(tǒng)，并任選地接受諸如血液透析或氧合的處理。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)處理的血液隨后可被注入個(gè)體。其他實(shí)施方案提供了本文所述的抗exositel抗體分子用于抑制或阻止離體血液樣品中的血液凝固的方法，以及本文所述的抗exositel抗體分子在制備用于抑制或阻止離體血液樣品中的血液凝固的藥物中的用途。
[0095]發(fā)明的其他方面涉及抗體分子的生產(chǎn)，其結(jié)合凝血酶的exositel表位，并可用于例如病理性血液凝固或血栓形成的治療。
[0096]生產(chǎn)針對(duì)凝血酶的exositel表位的抗體的抗原結(jié)合域的方法，可包括:
[0097]通過(guò)在包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的親本VH區(qū)的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一或多個(gè)氨基酸，提供作為親本VH區(qū)的氨基酸序列變體的VH區(qū)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分別具有氨基酸序列SEQ ID NO: 3、4和5 ;以及
[0098]任選地，將由此提供的VH區(qū)域與一或多個(gè)VL區(qū)組合，以提供一或多個(gè)VH/VL組合；以及
[0099]檢測(cè)作為親本VH區(qū)的氨基酸序列變體的所述VH區(qū)或VH/VL組合或它們二者的結(jié)合，以鑒定針對(duì)凝血酶的exositel表位的抗體的抗原結(jié)合域。
[0100]作為親本VH區(qū)的氨基酸序列變體的VH區(qū)可以具有SEQ ID NO: 5的HCDR3序列或添加、缺失、取代或插入1、2、3或更多氨基酸的變體。
[0101]作為親本VH區(qū)的氨基酸序列變體的VH區(qū)可以具有分別為SEQ IDN0:3和4的HCDRl和HCDR2序列，或添加、缺失、取代或插入1、2、3或更多氨基酸的這些序列的變體。
[0102]生產(chǎn)特異性結(jié)合凝血酶的exositel表位的抗體分子的方法，可包括:
[0103]提供編碼VH區(qū)的起始核酸或各自編碼VH區(qū)的起始核酸集合，其中一個(gè)或者多個(gè)VH區(qū)或者包含將被取代的HCDRl、HCDR2和/或HCDR3，或者缺少HCDRl、HCDR2和/或HCDR3編碼區(qū)；
[0104]將所述起始核酸或起始核酸集合與供體核酸組合，所述供體核酸編碼分別具有氨基酸序列SEQ ID N0:3、4和5的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3的氨基酸序列或其突變氨基酸序列，這樣，所述供體核酸被插入起始核酸或起始核酸集合的CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)中，以提供編碼VH區(qū)的核酸產(chǎn)物集合；
[0105]表達(dá)所述產(chǎn)物集合的核酸以生產(chǎn)產(chǎn)物VH區(qū)；
[0106]可選地，將所述產(chǎn)物VH區(qū)與一或多個(gè)VL區(qū)組合；
[0107]選擇結(jié)合凝血酶exositel的抗體分子，該抗體分子包含產(chǎn)物VH區(qū)和任選地VL區(qū)；以及
[0108]回收所述抗體分子或編碼它的核酸。
[0109]適合的抗體分子成熟和優(yōu)化技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
[0110]針對(duì)凝血酶exositel表位的抗體的抗原結(jié)合域和抗體分子可如上所述進(jìn)行檢測(cè)。例如可確定結(jié)合凝血酶和/或抑制凝血酶底物切割的能力。
[0111]抗體分子對(duì)凝固和出血的效果可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定。例如，可使用小鼠血管，例如股靜脈或頸動(dòng)脈中的氯化鐵血塊誘導(dǎo)的血栓形成模型，接著通過(guò)尾巴出血檢測(cè)正常的止血。
[0112]基于本文，本發(fā)明各種進(jìn)一步的方面和實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
[0113]在說(shuō)明書(shū)中提及的所有文獻(xiàn)均通過(guò)引用而整體并入本文。
[0114]除非另有說(shuō)明，本文的抗體殘基按照kabat編碼制編號(hào)。
[0115]本文使用的“和/或”應(yīng)被理解為兩個(gè)指明特征或要素中每個(gè)的明確公開(kāi)，無(wú)論是否有另一特征或要素。例如“A和/或B”應(yīng)變理解為具體公開(kāi)了(i)A、(ii)B和(iii)A和B，如同每一種在本文單獨(dú)記載。除非文中另有規(guī)定，上述特征的描述和定義不限于發(fā)明的任何具體方面或?qū)嵤┓桨?，并可同等用于所述的所有方面和?shí)施方案。因此，上述特征以所有排列組合的方式公開(kāi)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0116]現(xiàn)在通過(guò)實(shí)施例，并參考下述附圖和表格對(duì)發(fā)明的某些方面和實(shí)施方案進(jìn)行說(shuō)明。
[0117]圖1示出IgA在人凝血酶-瓊脂糖凝膠(Sepharose,商品名)柱子上的結(jié)合和洗脫。圖1A示出利用pH梯度(中性到低pH，如向上的傾斜線(xiàn)所示)使IgA(窄峰)從凝血酶-瓊脂糖凝膠柱子上洗脫的圖譜。圖1B示出藍(lán)綠溫和膠O顯示的總IgA上樣、從人凝血酶柱子上的流過(guò)物和低PH洗脫后的洗脫物。
[0118]圖2示出非還原十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis)膠(SDS-PAGE),其表明 IgA 與凝血酶、但不與凝血酶原結(jié)合。在該下拉(pul l-down)分析中，在凝血酶或凝血酶原存在下，凝集素瓊脂糖被用于結(jié)合IgA。繼而將上清跑SDS膠。I道是大小標(biāo)準(zhǔn),2道示出凝血酶從上清中清除,3道示出該清除依賴(lài)于IgA的存在，3道和4道示出凝血酶原不被清除，因此其不與IgA結(jié)合。
[0119]圖3示出IgA存在或不存在下凝血酶對(duì)S2238切割的相對(duì)速率(即S2238水解的405nm吸光值O對(duì)時(shí)間的單斜率)。這表明IgA不結(jié)合于凝血酶的活性位點(diǎn)。
[0120]圖4示出結(jié)合研究的結(jié)果，其表明IgA與熒光標(biāo)記的十二肽水蛭原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合凝血酶。
[0121]圖5示出IgA對(duì)凝血酶切割S2238的影響。該分析可以評(píng)價(jià)Kd為12nM的IgA-凝血酶相互作用。
[0122]圖6示出還原和非還原(ox)條件下完整IgA和Fab片段的SDS-PAGE膠。非還原IgA顯示具有100-200kDa的分子量，非還原Fab具有約50kDa的分子量。
[0123]圖7示出凝血酶-Fab復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),其表明凝血酶exositel和Fab片段的HCDR3間的相互作用。
[0124]圖8示出晶體結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)，其表明凝血酶exositel和Fab片段的HCDR3的特定殘基之間的相互作用。
[0125]圖9示出在C57BL/6小鼠股靜脈損傷中FeCl3誘導(dǎo)的血凝塊的熒光顯微圖像，小鼠注射FITC標(biāo)記的纖維蛋白原，于2-30分鐘之間拍照。施用10ul的PBS(溶劑對(duì)照)。
[0126]圖10示出在C57BL/6小鼠股靜脈損傷中FeCl3誘導(dǎo)的血凝塊的熒光顯微圖像，小鼠注射FITC標(biāo)記的纖維蛋白原和40nM (小鼠血液中的終濃度，相當(dāng)于約0.6mg/Kg的劑量)抗 exositellgA(100 μ 1，溶于 PBS)。
[0127]圖11示出在C57BL/6小鼠股靜脈損傷中FeCl3誘導(dǎo)的血凝塊的熒光顯微圖像，小鼠注射FITC標(biāo)記的纖維蛋白原和80nM(小鼠血液中的終濃度，相當(dāng)于約1.2mg/Kg的劑量)抗exositelIgA(100 μ I,溶于PBS),損傷位點(diǎn)外的區(qū)域用作對(duì)照。
[0128]圖12示出在C57BL/6小鼠股靜脈損傷中FeCl3誘導(dǎo)的血凝塊的熒光顯微圖像，小鼠注射FITC標(biāo)記的纖維蛋白原和200nM(小鼠血液中的終濃度，相當(dāng)于約3mg/Kg的劑量)抗exositelIgA(100 μ I,溶于PBS),損傷位點(diǎn)外的區(qū)域用作對(duì)照。
[0129]圖13示出在C57BL/6小鼠股靜脈損傷中FeCl3誘導(dǎo)的血凝塊的熒光顯微圖像，小鼠注射FITC標(biāo)記的纖維蛋白原和400nM(小鼠血液中的終濃度，相當(dāng)于約6mg/Kg的劑量)抗 exositellgA(100 μ 1，溶于 PBS)。
[0130]圖14示出在C57BL/6小鼠股靜脈損傷中FeCl3誘導(dǎo)的血凝塊的熒光顯微圖像，小鼠注射FITC標(biāo)記的纖維蛋白原和4μ M(小鼠血液中的終濃度，相當(dāng)于約60mg/Kg的劑量)抗 exositellgA(100 μ 1，溶于 PBS)。
[0131]圖15示出圖9-13的熒光圖像中對(duì)抗exositellgA的劑量反應(yīng)的定量。
[0132]圖16示出對(duì)照C57BL/6小鼠和以增加劑量的抗exositellgA處理的小鼠中尾巴出血的時(shí)間。二次平均排除異常值。
[0133]圖17示出野生型雄性C57BL/6小鼠(η = 5)經(jīng)尾靜脈注射IgA或PBS后的尾夾分析結(jié)果。注射后15分鐘，在直徑3mm處剪掉尾巴，監(jiān)視失血10分鐘。
[0134]圖18A至18D示出9周大野生型C57BL/6小鼠在以5% FeCl3損傷2分鐘之前，如前注射400nM抗凝血酶IgA (血液中的終濃度，相當(dāng)于約6mg/Kg的劑量)或PBS的FeCl3頸動(dòng)脈閉塞模型的結(jié)果。圖18A示出典型的注射PBS的小鼠的結(jié)果(20分鐘內(nèi)閉塞)，圖18B、18C和18D示出以400nM抗凝血酶IgA處理的小鼠的結(jié)果示例(無(wú)閉塞)。
[0135]圖19示出在添加20nM人凝血酶時(shí)，隨著增加濃度的本發(fā)明的IgG和IgA的凝血酶時(shí)間(即混合血漿凝結(jié))。
[0136]圖20示出合成IgG與固定凝血酶(ForteB1 Octet Red儀器上)的結(jié)合。
[0137]圖21示出24nMS195A凝血酶與固定IgG結(jié)合的典型Octet跡線(xiàn)，其示出結(jié)合相，隨后是解離相。黑線(xiàn)是擬定(fit)。
[0138]圖22示出500nM凝血酶原與載有固定IgG的表面的Octet跡線(xiàn)。使用圖21中與凝血酶實(shí)驗(yàn)相同的條件。即便是在高濃度，也無(wú)結(jié)合的跡象。

【具體實(shí)施方式】
[0139]實(shí)驗(yàn)
[0140]1.杭體分離和表征
[0141]對(duì)來(lái)自病人的血漿樣品進(jìn)行凝固篩選。對(duì)頭部損傷后患有硬膜下血腫的病人進(jìn)行凝固檢測(cè)。血腫未經(jīng)干預(yù)自發(fā)溶解。之前沒(méi)有出血病史，并且自該病人就診的過(guò)去4年內(nèi)，沒(méi)有進(jìn)一步的出血發(fā)作。結(jié)果如下表1所示。
[0142]與對(duì)照相比,病人的前凝血酶時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶時(shí)間(TT)均延長(zhǎng)，但蛇毒凝血酶時(shí)間正常。
[0143]凝血酶時(shí)間并未被肝素酶修正，表明肝素治療或污染并非其原因。根據(jù)ELISA和蛇毒凝血酶分析，病人的纖維蛋白原水平正常。克勞斯法(Clauss assay)產(chǎn)生人為的低纖維蛋白原水平，這緣于凝血酶抑制劑的存在。在用50:50與來(lái)自正常個(gè)體的混合血漿的混合物進(jìn)行混合檢測(cè)后，PT和APTT凝血時(shí)間仍保持延長(zhǎng)。這表明病人樣品中存在抑制劑。
[0144]病人的血漿被發(fā)現(xiàn)具有高滴度的IgA。該IgA分子被發(fā)現(xiàn)與人凝血酶柱子結(jié)合(圖1)。在該IgA存在時(shí)，結(jié)合IgA的凝集素瓊脂糖將凝血酶拉下，在該IgA不存在時(shí)則不然。該IgA存在時(shí)凝血酶原并未被凝集素瓊脂糖拉下，表明該IgA與凝血酶，而非凝血酶原特異性結(jié)合(圖2)。
[0145]接著對(duì)該IgA在凝血酶分子上的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析。
[0146]該IgA存在時(shí)測(cè)量到凝血酶對(duì)S2238稍微更高的切割速率，表明該IgA并不封閉凝血酶的活性位點(diǎn)(圖3)。
[0147]700nM的IgA存在時(shí)，熒光標(biāo)記的水蛭原與凝血酶的結(jié)合被抑制，表明凝血酶針對(duì)抗體的表位與水蛭原在凝血酶上的結(jié)合位點(diǎn)，即凝血酶的exositel重疊(圖4)。
[0148]檢測(cè)IgA對(duì)某些凝血酶的促凝血底物的水解的效果。結(jié)果示于表2。這些結(jié)果表明，分離自病人的IgA分子抑制凝血酶的多種促凝血活性。
[0149]IgA存在時(shí)抗凝血酶(AT)對(duì)凝血酶的抑制在肝素存在和不存在時(shí)僅受到輕微影響(表3)。
[0150]基于S2238的水解速率，IgA對(duì)凝血酶的解離常數(shù)(Kd)最初估計(jì)為約12nM(圖5)。IgA與S195A凝血酶(因催化絲氨酸突變而失活)結(jié)合的Kd經(jīng)ForteB1 Octet Red儀器確定為2nM(表4) ο
[0151]純化IgA被木瓜蛋白酶切割(圖6)，分離Fab片段，與人PPACK-凝血酶(PPACK是共價(jià)活性位點(diǎn)抑制劑)組合。人PPACK-凝血酶-FAB復(fù)合物經(jīng)結(jié)晶并用于結(jié)構(gòu)分析。獲得的結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下:分辨率為1.9A, Rfactor = 19.43%,Rfree = 23.42%,不對(duì)稱(chēng)單元內(nèi)的一個(gè)復(fù)合物，Ramachandran:favoured = 97.0%,異常值=0%。晶體結(jié)構(gòu)顯示IgAFab的HCDR3與凝血酶exositel之間的緊密結(jié)合(圖7)。
[0152]特別地，exositel的 M32、F34、Q38、E39、L40、L65、R67、R73、T74、R75、Y76、R77a和182殘基均與IgA Fab的HCDR3環(huán)直接相互作用(圖8)。
[0153]對(duì)抗體-凝血酶連接的PISA分析表明，復(fù)合物中總的隱藏表面積是1075 A2。
IgA 重鏈中的接觸殘基是(Kabat 編碼):30、51、52a、53_55、96、98、99、100、100a、100b、100c、100d。其均在 CDR 中。CDRH1-GYTLTEAAIH、CDRH2-GLDPQDGETVYAQQFKG、CDRH3-GDFSEFEPFSMDYFHF(下劃線(xiàn)的殘基接觸)。CDRH3被發(fā)現(xiàn)最為重要，其提供抗體上85%的隱藏表面積。輕鏈與Tyr49發(fā)生輕微接觸，就在⑶RL2之前(與凝血酶的Ser36a)。
對(duì)隱藏表面積的某些獨(dú)立貢獻(xiàn)有:G1u99 54A2、PhelOO 134.8 A2、GlulOOa 80.6 A2,PhelOOc 141.7 A2。
[0154]凝血酶中的接觸殘基為(糜蛋白酶編號(hào)):32、34、36a-40、65、67、73_76、77a、82和151。對(duì)隱藏表面積最重要的獨(dú)立貢獻(xiàn)為:Gln38 86.4 A2、Arg73 44.5 A2、Thr74 60.1 A2、Tyr76 78.4 A2、Arg77a 86.9 A2。
[0155]盡管該IgA的流通水平達(dá)3g/l，但病人并未顯示出增加或異常的出血或溢血，這表明抗體抑制凝血酶，但不影響正常止血。
[0156]2.1gA對(duì)動(dòng)物血栓形成的效果
[0157]C57BL/6小鼠接受麻醉。在頸動(dòng)脈中插入導(dǎo)管(用于化合物注射)。FITC標(biāo)記的纖維蛋白原(2mg/ml)經(jīng)頸動(dòng)脈注射。PBS(對(duì)照)或IgA也經(jīng)頸動(dòng)脈注射。暴露股靜脈，并用10% FeCl3 (長(zhǎng)3mm的飽和吸墨紙)敷3分鐘引發(fā)凝血。
[0158]使用熒光顯微技術(shù)在FeCl3損傷后的0、5、10和20min，沿?fù)p傷位點(diǎn)的長(zhǎng)度拍攝熒光顯微圖像。
[0159]股靜脈中的血塊(纖維蛋白沉積)在亮視野下清晰可見(jiàn)(圖9)。最低劑量的抗體經(jīng)觀(guān)察能造成對(duì)凝血的顯著抑制，但隨著劑量增加，凝血消失(圖10-15)。
[0160]對(duì)小鼠出血時(shí)間也進(jìn)行了測(cè)量。出血時(shí)間以剪尾后血流停止的時(shí)間來(lái)評(píng)估。盡管存在單個(gè)異常樣品，但出血時(shí)間被發(fā)現(xiàn)不受抗exositellgA處理的影響(圖16)。
[0161]這些結(jié)果表明，抗exositellgA抗體是血栓形成的有效抑制劑,但不影響出血時(shí)間。
[0162]3.尾夾分析
[0163]野生型雄性C57BL/6小鼠注射400nM IgA(血液中的終濃度，相當(dāng)于約6mg/Kg的劑量)或PBS后的進(jìn)行尾夾分析。注射后15分鐘，在直徑3mm處剪掉尾巴，監(jiān)視失血10分鐘?？偸а拷?jīng)發(fā)現(xiàn)不受抗exositellgA抗體處理的影響(圖17)。
[0164]4.FeCl2損傷頸動(dòng)脈閉塞
[0165]對(duì)9周大野生型C57BL/6小鼠進(jìn)行FeClj^傷頸動(dòng)脈閉塞研究。小鼠在以5%FeCl3損傷2分鐘之前,注射400nM抗exositellgA(血液中的終濃度,相當(dāng)于約6mg/Kg的劑量)或PBS。繼而用Doppler監(jiān)測(cè)血流，并測(cè)量閉塞時(shí)間?！把獕K”定義為穩(wěn)定的閉塞血栓，該處血流量通常降低至小于0.lml/min，并保持降低。在對(duì)照小鼠中，損傷后約20分鐘觀(guān)察到穩(wěn)定血塊的形成(圖18A)。然而,大多數(shù)經(jīng)400nM抗IIa IgA處理的小鼠無(wú)法形成穩(wěn)定血塊，并產(chǎn)生血塊迅速溶解、反復(fù)溶解或根本不會(huì)形成的跡線(xiàn)。三個(gè)有代表性的跡線(xiàn)如圖18B-18D所示。
[0166]5.抗.exositellgG
[0167]使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將上述在病人中鑒定的IgA分子重構(gòu)為IgG。
[0168]在添加20nM人凝血酶時(shí)，隨著加入增加濃度的原始IgA和新IgG，對(duì)混合人血漿的凝固時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)(圖19)。親本IgA和合成IgG均以相同的濃度依賴(lài)方式增加血塊形成的時(shí)間，暗示對(duì)凝血酶相同的親和力。
[0169]通過(guò)使用ForteB1? Octet Red儀器測(cè)量合成IgG與固定S195A凝血酶的結(jié)合，對(duì)該結(jié)果進(jìn)行了確認(rèn)。凝血酶與探針連接，對(duì)抗體結(jié)合(不同濃度)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。確定結(jié)合和解離速率。兩種抗體均產(chǎn)生相似的約的結(jié)合速率和約δχΙΟΛ—1的解離速率，解離常數(shù)(Kd)約2ηΜ。對(duì)IgA和IgG的平衡狀態(tài)分析也獲得了約2ηΜ的Kd。有代表性的平衡狀態(tài)曲線(xiàn)如圖20所示。IgA的性能在IgG框架上得到重現(xiàn)。
[0170]使用固定IgG的Octet系統(tǒng)對(duì)凝血酶原與IgG抗體的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。凝血酶與固定IgG結(jié)合，并具有與用固定凝血酶所得到的相似的速率和親和力(表4);凝血酶原不與IgG結(jié)合。圖21是24nM凝血酶與固定IgG結(jié)合和解離的跡線(xiàn)。圖22是使用500nM凝血酶原的相同實(shí)驗(yàn)，并未顯示結(jié)合跡象。
[0171]

【權(quán)利要求】
1.分離的抗體分子，其特異性結(jié)合凝血酶的exositel區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體分子，其抑制凝血酶活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體分子，其對(duì)止血和/或出血造成最低程度的抑制。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的抗體分子，其不抑制止血和/或造成出血。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體分子，其中，抗體分子包含HCDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO: 5或帶有一或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列SEQ ID NO: 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體分子，其中，抗體分子包含HCDR2，其具有氨基酸序列SEQID NO:4或帶有一或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列SEQ ID NO:4。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗體分子，其中，抗體分子包含HCDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或帶有一或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列SEQ ID NO:3。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的抗體分子，其中，抗體分子包含VH區(qū)，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或帶有一或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的抗體分子，其中，抗體分子包含IXDR1、IXDR2和IXDR3，其分別具有序列SEQ ID N0:7、8和9，或分別帶有一或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的序列 SEQ ID N0:7、8 和 9。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的抗體分子，其中，抗體分子包含VL區(qū)，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:6或帶 有一或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列SEQ ID NO:6。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的抗體分子，其包含VH區(qū)，所述VH區(qū)包含分別具有序列SEQ ID N0:3、4和5的HCDRU HCDR2和HCDR3，以及VL區(qū)，所述VL區(qū)包含分別具有序歹Ij SEQ ID N0:7、8 和 9 的 LCDRl、LCDR2 和 LCDR3。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗體分子，其包含具有氨基酸序列SEQID NO:2的VH區(qū)和具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的VL區(qū)。
13.抗體分子，其與權(quán)利要求5-12中任一項(xiàng)所述的抗體分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合exositel。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的抗體分子，其是全抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體分子，其是IgA或IgG。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的抗體分子，其是抗體片段。
17.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的抗體分子和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的所述抗體分子，用于治療人或動(dòng)物體的方法。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗體分子，用于治療凝血酶介導(dǎo)的病癥的方法。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗體分子在制備用于治療凝血酶介導(dǎo)的病癥的藥物中的用途。
21.治療凝血酶介導(dǎo)的病癥的方法，包含向有需要的個(gè)體施用權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的抗體分子。
22.權(quán)利要求19的抗體分子、權(quán)利要求20的用途或權(quán)利要求21的方法，其中凝血酶介導(dǎo)的病癥是血栓形成病癥。
23.權(quán)利要求22的抗體分子、用途或方法，其中，血栓形成病癥是血栓形成或栓塞。
24.權(quán)利要求19的抗體分子、權(quán)利要求20的用途或權(quán)利要求21的方法，其中，凝血酶介導(dǎo)的病癥是炎癥、感染、腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤轉(zhuǎn)移或癡呆。
25.生產(chǎn)針對(duì)凝血酶的exositel表位的抗體的抗原結(jié)合域的方法，所述方法包括: (i)通過(guò)在包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的親本VH區(qū)的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一或多個(gè)氨基酸，提供作為親本VH區(qū)的氨基酸序列變體的VH區(qū)，其中親本VH區(qū)的HCDRl、HCDR2和HCDR3分別具有氨基酸序列SEQ ID NO: 3、4和5 ; (ii)任選地，將由此提供的VH區(qū)與一或多個(gè)VL區(qū)組合，以提供一或多個(gè)VH/VL組合；以及 (iii)檢測(cè)作為親本VH區(qū)的氨基酸序列變體的所述VH區(qū)或VH/VL組合或它們的組合，以鑒定針對(duì)凝血酶的exositel表位的抗體的抗原結(jié)合域。
26.生產(chǎn)特異性結(jié)合凝血酶的exositel表位的抗體分子的方法，所述方法包括: 提供編碼VH區(qū)的起始核酸或各自編碼VH區(qū)的起始核酸集合，其中，VH區(qū)或者包含將被取代的HCDRl、HCDR2和/或HCDR3，或者缺少HCDRl、HCDR2和/或HCDR3編碼區(qū)； 將所述起始核酸或起始核酸集合與供體核酸組合，所述供體核酸編碼分別具有序列SEQ ID NO: 3、4和5的HCDRl、HCDR2和/或HCDR3的氨基酸序列或其突變氨基酸序列，這樣，所述供體核酸被插入起始核酸或起始核酸集合的CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)中，以提供編碼VH區(qū)的核酸產(chǎn)物集合； 表達(dá)所述產(chǎn)物集合的核酸以生產(chǎn)產(chǎn)物VH區(qū)； 可選地，將所述產(chǎn)物VH區(qū)與一或多個(gè)VL區(qū)組合； 選擇結(jié)合凝血酶exositel的抗體分子,該抗體分子包含產(chǎn)物VH區(qū)和任選地VL區(qū)；以及 回收所述抗體分子或編碼它的核酸。
【文檔編號(hào)】C07K16/36GK104053673SQ201280061294
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月14日
【發(fā)明者】詹姆斯·安德魯·亨廷頓, 特雷弗·巴格蘭, 喬納森·蘭當(dāng) 申請(qǐng)人:劍橋企業(yè)有限公司