專利名稱：一種提高pcr技術(shù)檢測植物病原細(xì)菌靈敏度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明“一種提高PCR技術(shù)檢測植物病原細(xì)菌靈敏度的方法”，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專用于對病原細(xì)菌進(jìn)行檢測，提高傳統(tǒng)PCR技術(shù)檢測病原細(xì)菌的靈敏度。
在植物病原細(xì)菌檢測和鑒定中應(yīng)用最多、也是最重要的是專化性引物PCR技術(shù)。所謂PCR檢測技術(shù)是利用相應(yīng)的引物，在DNA聚合酶催化下對目標(biāo)DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無來判斷檢測結(jié)果。PCR技術(shù)發(fā)展至今，無論從理論和實(shí)際應(yīng)用方面都有長足的發(fā)展。然而，PCR技術(shù)也有其不可否認(rèn)的局限性，使得其靈敏度往往不高。尤其是檢測無癥狀植物材料上的病原細(xì)菌，由于細(xì)菌含量低，樣品液中存在大量PCR反應(yīng)抑制物質(zhì)，實(shí)際檢測靈敏度往往比較低，限制了其在植物病原檢測中的實(shí)際應(yīng)用。原因在于1)直接對樣品進(jìn)行擴(kuò)增，由于植物組織中含有大量酚類物質(zhì)、碳水化合物等PCR反應(yīng)抑制物，嚴(yán)重影響了PCR反應(yīng)的靈敏度。2)加入PCR反應(yīng)體系中的樣品體積非常小，通常只有1-5ul，如果用cell/ml表示，該數(shù)字將會(huì)很大。
雖然已經(jīng)有報(bào)道，利用免疫磁珠吸附植物病原細(xì)菌，然后利用一定的裝置，對吸附有病原細(xì)菌的磁珠進(jìn)行回收，進(jìn)行PCR反應(yīng)，可以提高利用PCR技術(shù)檢測植物病原細(xì)菌的靈敏度。但該方法需要一定的設(shè)備，操作較為復(fù)雜，而且成本較高。
技術(shù)方案一種提高PCR技術(shù)檢測植物病原細(xì)菌靈敏度的方法，包括1)病原細(xì)菌特異性抗血清的制備利用傳統(tǒng)的抗血清制備方法，用戊二醛固定的細(xì)菌全菌體或提取并純化的細(xì)菌脂多糖，免疫家兔，制備抗植物病原細(xì)菌全菌體或脂多糖(LPS)的?；钥寡?技術(shù)方法成熟，可參考相關(guān)文獻(xiàn))，瓊脂雙擴(kuò)散方法(ODD)測定效價(jià)，選擇效價(jià)達(dá)到或超過1∶32的抗血清；2)PCR反應(yīng)管的包被配制包被緩沖液Na2CO31.59g；NaHCO32.93g，加蒸餾水至1000ml，pH9.6
選取沒有經(jīng)過硅烷化的薄壁PCR反應(yīng)管(普通PCR管)，用包被緩沖液將抗血清稀釋500倍，每管加入50μl稀釋抗血清，37℃孵育2小時(shí)或4℃過夜；3)PCR反應(yīng)管的洗滌配制0.01M PBST溶液NaCl 8.0g；Na2HPO42.9g；KH2PO40.2g；KCl 0.2g；Tween-20 0.5ml；加蒸餾水定容至1000ml用滅菌的0.01MPBST溶液洗管三次，每次加入100μl，每次五分鐘，最后一次加入100μl的滅菌水，甩干；4)樣品中目標(biāo)細(xì)菌的吸附配制0.01M PBS溶液NaCl 8.0g；Na2HP042.9g；KH2PO40.2g；KCl 0.2g；定容至1000ml每克植物材料加2ml滅菌的0.01M PBS溶液，制備待測樣品懸液；將制備的樣品懸液加入包被過的PCR反應(yīng)管中，每管50μl，37℃孵育2小時(shí)或4℃過夜，用滅菌的0.01M PBST洗管二次，每次加入100μl，每次五分鐘，最后一次加入100μl的滅菌水，甩干，直接用于免疫吸附PCR擴(kuò)增。
本發(fā)明提高PCR技術(shù)檢測植物病原細(xì)菌靈敏度的方法，其特征在于，將上述包被過的PCR反應(yīng)管直接用于梨火疫病菌的免疫吸附PCR擴(kuò)增方法為梨火疫病菌的特異性引物引物A(5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’)引物B(5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’)免疫吸附PCR擴(kuò)增采用上述包被過的PCR反應(yīng)管，50μl反應(yīng)體系，其中10×PCR buffer 5μl；5mM MgCl23μl；10mM dNTPs0.5μl；20pmol/μl的上、下游引物各0.5μl；Taq酶0.25μl；25μg/ml的BSA 2.5μl；Twen-20 0.5μl；超純無菌水37.25μl；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?3℃預(yù)變性5min，93℃變性1min；53℃退火1min；72℃延伸2min；37個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸3min。
有益效果 本發(fā)明所提供的一種提高PCR技術(shù)檢測植物病原細(xì)菌靈敏度的方法，根據(jù)抗體與抗原的特異性反應(yīng)原理，利用植物病原細(xì)菌的特異性抗血清直接包被PCR反應(yīng)管，然后將檢測樣品加入PCR管中，包被于管壁的抗血清就可以特異性吸附目標(biāo)細(xì)菌，經(jīng)洗滌后，除去了所有PCR反應(yīng)的抑制物質(zhì)，只保留了被吸附的目標(biāo)細(xì)菌，在反應(yīng)管中加入相應(yīng)的PCR反應(yīng)成分，按照常規(guī)的PCR反應(yīng)條件，就可以對植物細(xì)菌病害樣品直接進(jìn)行檢測。具體優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在靈敏、快速、準(zhǔn)確、簡便(1)免疫-吸附PCR技術(shù)，將血清學(xué)和PCR技術(shù)結(jié)合起來，可以完全消除樣品中的PCR反應(yīng)抑制物質(zhì)，同時(shí)由于加樣量的增加(傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)中樣品最大加樣量為10μl，而該技術(shù)的加樣量可達(dá)50μl)，從而大大提高了對樣品實(shí)施檢測的靈敏度，克服了常規(guī)PCR技術(shù)直接檢測樣品的低靈敏度的缺點(diǎn)。
(2)應(yīng)用該技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)PCR技術(shù)，可在1天之內(nèi)達(dá)到對植物病原細(xì)菌的檢測?？梢允筆CR檢測細(xì)菌病害樣品的靈敏度提高1000倍；檢測純菌的靈敏度提高10倍。
(3)原位免疫吸附PCR技術(shù)的信號強(qiáng)度比標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)要強(qiáng)很多，原位免疫吸附PCR技術(shù)的檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。
(4)病原細(xì)菌的抗血清制備方法成熟、簡單，不需復(fù)雜的設(shè)備和條件。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室可以自行制備。由于不需要對樣品中的病原菌進(jìn)行分離和純化；步驟簡單易操作，這對于該項(xiàng)技術(shù)的推廣和應(yīng)用有重要意義。用免疫吸PCR技術(shù)植物細(xì)菌病害樣品具重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。該技術(shù)穩(wěn)定、有效、成本低廉、可以在我國口岸大規(guī)模推廣。
5)PCR擴(kuò)增本發(fā)明以梨火疫病菌為靶標(biāo)細(xì)菌，利用已經(jīng)發(fā)表的擴(kuò)增梨火疫病菌的特異性引物進(jìn)行了該項(xiàng)試驗(yàn)引物A(5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’)引物B(5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’)a.免疫吸附PCR擴(kuò)增采用50μl反應(yīng)體系，其中10×PCR buffer 5μl；MgCl2(5mM)3μl；dNTPs(10mM)0.5μl；上、下游引物(20pmol/μl)各0.5μl；Taq酶0.25μl；25μg/ml的BSA 2.5μl；Twen-20 0.5μl；超純無菌水37.25μl。
b.作為對照比較的常規(guī)PCR擴(kuò)增采用50μl反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)管不進(jìn)行包被，其中加入10μl樣品，超純無菌水27.25μl，其余成分用量相同。
PCR擴(kuò)增程序?yàn)?3℃預(yù)變性5min，93℃變性1min；53℃退火1min；72℃延伸2min；37個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸3min。
實(shí)施結(jié)果1)標(biāo)準(zhǔn)PCR和原位免疫吸附PCR反應(yīng)檢測模擬樣品靈敏度的分析用新鮮的梨枝條樣品的PBS浸出液系列稀釋的菌液經(jīng)PCR反應(yīng)管作免疫吸附技術(shù)處理檢測梨火疫病菌的靈敏度比直接將用新鮮的梨枝條樣品無菌水浸出液系列稀釋的菌液加入PCR反應(yīng)管檢測梨火疫病菌的靈敏度提高了1000倍，[傳統(tǒng)PCR方法在第7泳道(5×103cfu/ml)就沒有信號，而免疫吸附PCR在第9’泳道(5×101cfu/ml)仍有可見條帶]。見

圖1。2)標(biāo)準(zhǔn)PCR和原位免疫吸附PCR反應(yīng)檢測純菌靈敏度的分析用0.01M PBS系列稀釋的菌液經(jīng)PCR反應(yīng)管作免疫吸附技術(shù)處理，檢測梨火疫病菌的靈敏度比直接將用無菌水系列稀釋的菌液加入PCR反應(yīng)管檢測梨火疫病菌的靈敏度提高了10倍，[傳統(tǒng)PCR方法在第8泳道(5×102cfu/ml)就沒有信號，而免疫吸附PCR在第8’泳道(5×102cfu/ml)仍有可見條帶]。見圖2。3)原位免疫吸附PCR技術(shù)從混合細(xì)菌液中和發(fā)病樣品中檢測梨火疫病菌的試驗(yàn)將梨火疫病菌和相關(guān)參試菌株(見表1)分別配制成約5×108cfu/ml的細(xì)菌懸液(分別用0.01M PBS和無菌水配制)，各取50μl制備混合菌液；將人工接種發(fā)病的梨樹枝條分別用0.01M PBS和無菌水制備了樣品浸出液；進(jìn)行原位免疫吸附PCR檢測，并與標(biāo)準(zhǔn)的PCR技術(shù)進(jìn)行了比較，結(jié)果見圖3。
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，無論是標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)還是原位免疫吸附PCR技術(shù)，其?；跃芎?，沒有目標(biāo)細(xì)菌的混合菌液和健康枝條中均未擴(kuò)增出信號，對含有目標(biāo)細(xì)菌的混合菌液和人工接種的梨樹枝條樣品，兩者均有信號，但原位免疫吸附PCR技術(shù)的信號強(qiáng)度比標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)要強(qiáng)很多。
本發(fā)明以PCR技術(shù)和免疫吸附技術(shù)相結(jié)合的方法，以梨火疫病菌為靶標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行了實(shí)施，即利用梨火疫病菌特異抗血清包被PCR管，吸附靶標(biāo)細(xì)菌，可除去樣品中PCR反應(yīng)抑制因子，同時(shí)增加了檢測樣品體積，大大提高了PCR擴(kuò)增的靈敏度。
由于這種方法具有簡便、快速和成本低廉的特點(diǎn)，在植物檢疫和植物病原細(xì)菌檢測中有廣泛的應(yīng)用前景。表1.參試菌株*細(xì)菌種名或試樣 菌株代號或樣品部位 來源Curtobacteriun flaccumfaciens BR10 本系陳永芳E.coli S17-1本研究室Erwinia amylovora 0056(NCPPB1605) 植物檢疫實(shí)驗(yàn)所 張樂Erwinia carotovora ssp.carotovora Ecc 本系分子植病研究室Erwinia chrysanthemi Ech 本研究室Erwinia herbicola Eh 河北農(nóng)科院Pseudomonas fluorescence Pf 本研究室Pseudomonas syringae pv.syringae Pssy 中國農(nóng)科院 何禮遠(yuǎn)Ralstonia solanacearum ZH6 本研究室X.axonopodis pv.citri Xac 本研究室X.oryzae pv.oryzae OS14 本研究室人工接種梨火疫病菌(0056)發(fā)病 枯死部位下0-10cm 本研究室枝條(接種后30天)健康梨枝條 一年生枝條 本研究室*所有菌株均為標(biāo)準(zhǔn)菌株或?qū)嶒?yàn)室經(jīng)過驗(yàn)證的常用參試菌株
權(quán)利要求
1.一種提高PCR技術(shù)檢測植物病原細(xì)菌靈敏度的方法，包括1)病原細(xì)菌特異性抗血清的制備利用傳統(tǒng)的抗血清制備方法，用戊二醛固定的細(xì)菌全菌體或提取并純化的細(xì)菌脂多糖，免疫家兔，制備抗植物病原細(xì)菌全菌體或脂多糖(LPS)的?；钥寡?技術(shù)方法成熟，可參考相關(guān)文獻(xiàn))，瓊脂雙擴(kuò)散方法(ODD)測定效價(jià)，選擇效價(jià)達(dá)到或超過1∶32的抗血清；2)PCR反應(yīng)管的包被配制包被緩沖液Na2CO31.59g；NaHCO32.93g，加蒸餾水至1000ml，pH9.6選取沒有經(jīng)過硅烷化的薄壁PCR反應(yīng)管(普通PCR管)，用包被緩沖液將抗血清稀釋500倍，每管加入50μl稀釋抗血清，37℃孵育2小時(shí)或4℃過夜；3)PCR反應(yīng)管的洗滌配制0.01M PBST溶液NaCl 8.0g；Na2HPO42.9g；KH2PO40.2g；KCl 0.2g；Tween-20 0.5ml；加蒸餾水定容至1000ml用滅菌的0.01MPBST溶液洗管三次，每次加入100μl，每次五分鐘，最后一次加入100μl的滅菌水，甩干；4)樣品中目標(biāo)細(xì)菌的吸附配制0.01M PBS溶液NaCl 8.0g；Na2HPO42.9g；KH2PO40.2g；KCl 0.2g；定容至1000ml每克植物材料加2ml滅菌的0.01M PBS溶液，制備待測樣品懸液；將制備的樣品懸液加入包被過的PCR反應(yīng)管中，每管50μl，37℃孵育2小時(shí)或4℃過夜，用滅菌的0.01M PBST洗管二次，每次加入100μl，每次五分鐘，最后一次加入100μl的滅菌水，甩干，直接用于免疫吸附PCR擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高PCR技術(shù)檢測植物病原細(xì)菌靈敏度的方法，其特征在于，將上述包被過的PCR反應(yīng)管直接用于梨火疫病菌的免疫吸附PCR擴(kuò)增方法為梨火疫病菌的特異性引物引物A(5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’)引物B(5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’)免疫吸附PCR擴(kuò)增采用上述包被過的PCR反應(yīng)管，50μl反應(yīng)體系，其中10×PCR buffer 5μl；5mM MgCl23μl；10mM dNTPs 0.5μl；20pmol/μl的上、下游引物各0.5μl；Taq酶0.25μl；25μg/ml的BSA 2.5μl；Twen-20 0.5μl；超純無菌水37.25μl；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?3℃預(yù)變性5min，93℃變性1min；53℃退火1min；72℃延伸2min；37個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸3min。
全文摘要
本發(fā)明“一種提高PCR技術(shù)檢測植物病原細(xì)菌靈敏度的方法”，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專用于對病原細(xì)菌進(jìn)行檢測。以梨火疫病菌為靶標(biāo)細(xì)菌，包括病植物原細(xì)菌特異性抗血清的制備；PCR反應(yīng)管的包被；PCR反應(yīng)管的洗滌；樣品中目標(biāo)細(xì)菌的吸附；PCR擴(kuò)增程序。該技術(shù)可以穩(wěn)定地從純菌、混合菌液和發(fā)病樣品中擴(kuò)增出病原細(xì)菌的目標(biāo)片段，排除了樣品中PCR抑制物質(zhì)的干擾，使檢測靈敏度(直接檢測樣品)提高了1000倍。為提高PCR技術(shù)檢測病原細(xì)菌的靈敏度提供了簡便、廉價(jià)和高效的技術(shù)方法。
文檔編號C12Q1/04GK1456686SQ0313764
公開日2003年11月19日 申請日期2003年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者胡白石, 許志剛, 盧玲, 劉鳳權(quán) 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)