用于防治青枯病的泛菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株用于防治青枯病的泛菌及其應(yīng)用。該菌株的名稱為泛菌(Pantoea coffeiphila)GZ?33，保藏編號為CCTCC M 2016352，于2016年6月27日保藏于位于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心。該泛菌菌株在LB培養(yǎng)基中生長良好，菌株細胞桿狀，在LB瓊脂平板上培養(yǎng)時菌落表面光滑半透明，邊緣整齊；該泛菌菌株對青枯菌具有明顯的拮抗作用，又為防治青枯病提供了一種途徑。CCTCC NO: M 201635220160627
【專利說明】
用于防治青枯病的泛菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株用于防治青枯病的泛菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物細菌性青枯病是由青枯勞爾氏菌Ralstonia solanacearum引起的一種維管 束毀滅性±傳細菌性病害，在亞熱帶、熱帶和溫帶地區(qū)發(fā)生普遍系統(tǒng)侵染的毀滅性±傳病 害，俗稱"植物攝病"。青枯勞爾氏菌寄主廣泛，可侵染54個科的450余種植物。目前，細菌性 青枯病的防治是世界公認的一大難題，它廣泛分布于世界各地，在我國南方省市發(fā)生嚴重， 尤其在浙江，近年來不但茄科、瓜類受害，大面積發(fā)生的桑青枯病更對蠶業(yè)生產(chǎn)造成嚴重損 失。
[0003] 青枯菌有很多小種，根據(jù)青枯菌的寄主范圍分為5個生理小種，小種1主要危害多 數(shù)茄科植物，包括番茄、馬鈴馨、茄子和煙草等，還危害其他科植物;小種2能侵染香蕉、海里 康化eliconais)和大蕉等植物;小種3主要危害馬鈴馨，也可弱侵染煙草和番茄;小種4侵染 姜W及弱侵染馬鈴馨等其他植物。另有研究人員將從我國南方桑樹上分離到的青枯病菌株 命名為小種5。侵染馬鈴馨的青枯病菌主要是小種1和小種3。
[0004] 目前，青枯病的防治方法主要有加強田間管理、培育抗病品種、使用化學(xué)藥劑和施 用生防菌劑等，但實踐證明，田間管理難W有效控制青枯病發(fā)生，抗性材料的選育耗時長， 而化學(xué)防治污染環(huán)境、破壞生態(tài)平衡，且化學(xué)藥劑的長期使用易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。因 此，利用生防菌株及其活性產(chǎn)物防治生姜青枯病越來越受到人們的重視。大量研究表明，部 分細菌、放線菌是較理想的青枯病括抗菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一株用于防治青枯病的 泛菌。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述的用于防治青枯病的泛菌的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一株用于防治青枯病的泛菌，名稱為泛菌 (Pantoea coffei地ila)GZ-33,保藏編號為CCTCC Μ 2016352,于2016年6月27日保藏于位 于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、。
[0008] 所述用于防治青枯病的泛菌在防治青枯病中的應(yīng)用。
[0009] 所述用于防治青枯病的泛菌在防治青枯病中的應(yīng)用，是將泛菌菌液施加于培養(yǎng)農(nóng) 作物的±壤中或是噴灑在農(nóng)作物的表面。
[0010] 所述的農(nóng)作物為易于被青枯菌感染的農(nóng)作物;優(yōu)選為茄科作物;更優(yōu)先為茄子。
[0011] 所述的農(nóng)作物可為已被青枯菌感染的農(nóng)作物，或是未被青枯菌感染的農(nóng)作物。
[0012] -種青枯病生物防治菌劑，含有上述用于防治青枯病的泛菌。
[0013] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:本發(fā)明提供了一株對青枯勞爾氏 菌具有括抗作用的泛菌，為青枯病的防治又提供了一種途徑。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明中青枯病括抗菌生防試驗效果圖。
[0015] 圖2是本發(fā)明中菌株GZ-33單菌落的照片圖。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0017] 實施例1:細菌進行分離純化：
[001引 1、培養(yǎng)基
[0019] LB瓊脂培養(yǎng)基仙固體培養(yǎng)基）：蛋白腺lOg，酵母提取物5g，化C1 1 Og，瓊脂15g，用 出0定容至 1000ml，PH 7.0-7.2。121°C滅菌20分鐘。
[0020] 2、實驗步驟
[0021] (1)樣品采集:選擇具代表性的地點（青枯病發(fā)病田地中健康植株根系±壤，地點 廣東?。寥ケ韺印?，用采±工具采取距離地表下5~10厘米深度的±層中的±壤，每個地 點采5個樣本，裝入袋中并作好記錄。
[0022] (2)±壤稀釋液的制備:稱取10曰±壤，放入裝有90mL無菌水的Ξ角瓶中充分振蕩， 制成1:10濃度的上壤稀釋液。待上粒沉淀后，吸取1ml上清液，移入盛有9ml滅菌水的試管 中，制成1:100濃度的±壤懸浮液，依次類推，制成1:1000和1:10000的±壤懸浮液，制成10 -2、1 〇-3、1 〇-4、1 〇-5和1 〇-6倍的±壤溶液備用。
[002；3] (3)細菌分離:選擇ιοΛιοΛιο-哺10-6四個濃度各0.11111，將稀釋的±壤懸浮液分 別倒入LB培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，將涂布棒在酒精燈火焰充分灼燒滅菌，待冷卻后涂布平板。將接 種完的培養(yǎng)皿倒置，30攝氏度恒溫培養(yǎng)，設(shè)置Ξ個重復(fù)。
[0024] (4)結(jié)果:分離得到細菌384株。
[0025] 實施例2:分離得到的細菌對青枯菌的平板括抗試驗
[0026] 1、培養(yǎng)基
[0027] TTC固體培養(yǎng)基：①蛋白腺lOg，酸水解酪蛋白（Casein Acid Hy化olysateHg，葡 萄糖5g，瓊脂15g，用出0定容至1000ml，P冊.8-7.2; 121°C滅菌20分鐘，得到溶液I;②TTC(2， 3,5 -氯化Ξ苯四氮挫）用蒸饋水配成質(zhì)量百分比1%的溶液，用0.22WI1濾膜過濾除菌，得到 溶液II;③在溶液I冷卻至約45°C時，每lOOmL溶液I加入0.5mL溶液II，即可倒平板。
[00巧]TTC液體培養(yǎng)基：不加瓊脂和TTC即可。
[0029] 2、實驗步驟
[0030] 2.1平板括抗試驗--初篩
[0031] 2.1.1菌種活化
[0032] 青枯菌和細菌進行菌種活化:青枯菌GMI1000 (ATCC)和實施例1分離得到的384株 細菌分別轉(zhuǎn)接至TTC固體培養(yǎng)基平板和LB固體培養(yǎng)基平板，分別于28Γ培養(yǎng)2天W及于3(TC 培養(yǎng)1天，備用。
[0033] 2.1.2青枯菌平板的制備
[0034] 活化的青枯菌接入TTC液體培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，28°C，200rpm培養(yǎng)2天，得到青 枯菌發(fā)酵液。隔天WTTC固體培養(yǎng)基倒平板，等培養(yǎng)基凝固后每個平板中加入O.lmKODsoo約 2.0) 青枯菌發(fā)酵液，涂布均勻，吹干備用，得到青枯菌平板。
[00巧]2.1.3平板括抗試驗初篩
[0036] 用滅菌的牙簽挑取活化的384株細菌單菌落，點接在青枯菌平板上，每個平板接30 株不同的括抗菌，3個重復(fù)，28 °C培養(yǎng)，24h、3化和4她分別觀察實驗結(jié)果，主要觀察抑菌圈的 有無。
[0037] 2.2平板括抗試驗--復(fù)篩 [003引 2.2.1菌種活化
[0039] 同2.1.1，活化選擇初篩有抑菌圈的分離細菌。
[0040] 2.1.2青枯菌平板的制備
[0041 ]活化的青枯菌接入TTC液體培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，28°C，200rpm發(fā)酵2天，得到青 枯菌發(fā)酵液。隔天WTTC固體培養(yǎng)基倒平板，等培養(yǎng)基凝固后每個平板中加入O.lmKODsoo約 2.0) 青枯菌發(fā)酵液，涂布均勻，吹干后打孔器（〇5mm)打孔，每個平板打一個孔備用。
[0042] 2.2.3分離細菌液體發(fā)酵
[0043] 在青枯菌液體搖瓶培養(yǎng)的第二天，活化的分離細菌轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中進行搖瓶 培養(yǎng)，30°C，200巧m培養(yǎng)24小時（0〇6日日約2.0)。
[0044] 2.2.4平板括抗試驗復(fù)篩
[0045] 用移液槍吸取10μ1分離細菌發(fā)酵液放入青枯菌平板的孔中，吹干，3個重復(fù)，28°C 培養(yǎng)。24h、3化和4她分別觀察實驗結(jié)果，主要觀察抑菌圈的有無和大小。
[0046] 3、結(jié)果
[0047] 通過初篩試驗得到有括抗效果的細菌53株，通過平板括抗試驗打孔復(fù)篩，抑菌圈 越明顯，說明括抗作用越好。復(fù)篩得到括抗效果較好的細菌6株，菌株GZ-33就是其中一株， 其對青枯菌的抑菌圈明顯。
[004引實施例3:菌株GZ-33的生物防治效果試驗
[0049]為了檢驗菌株GZ-33的生防效果，將菌株GZ-33發(fā)酵液在盆栽上對青枯病進行生防 效果試驗。
[(K)加]實驗步驟：
[00引]1.1買茄子苗
[0052] 買在大棚中育好的茄子苗。
[0053] 1.2苗移栽
[0054] 在花盆(規(guī)格170mm*160mm)裝滿基質(zhì)±，略壓緊，然后每盆移入1株茄子苗，誘水后 兩指在根部略壓緊，在大棚中培養(yǎng)?；ㄅ柚信囵B(yǎng)4周左右。
[0055] 1.3青枯菌和括抗菌活化和發(fā)酵液制備
[0056] 青枯菌GMI1000和括抗菌GZ-33分別活化，然后挑單菌落分別接入TTC液體培養(yǎng)基 和LB液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，分別于28°C和30°C，200巧m，培養(yǎng)約兩天(到0〇6日日都約2.5)。
[0057] 1.4青枯菌和括抗菌接種
[0化引本實驗設(shè)置2個對照組，即CK1和CK2，CK1:不加任何菌，只加入5ml TTC液體培養(yǎng) 基;CK2:只加5ml青枯菌發(fā)酵液，不加括抗菌發(fā)酵液。菌株GZ-33處理:按照體積比青枯菌:括 抗菌為1:1、1:2.5和1:5，做3個處理，每個處理5盆，每株根部先誘5ml青枯菌發(fā)酵液，然后再 誘5ml、12.5ml、25ml括抗菌發(fā)酵液。
[0059] 1.5 記錄
[0060] 隔一天記錄發(fā)病植株數(shù)和發(fā)病嚴重程度。
[0061] 2、結(jié)果
[0062] 如圖1所示，人工接種后，只接TTC液體培養(yǎng)基的對照組CK1不發(fā)病，死亡率0,直接 青枯菌GMI1000發(fā)酵液的對照組CK2全部發(fā)病，死亡率100%，接種青枯菌GMI1000發(fā)酵液和 括抗菌GZ-33發(fā)酵液的處理組1:1、1:2.5、1:5死亡率分別為20%、0、0，由此可見，括抗菌GZ- 33發(fā)酵液處理能使茄子植株青枯病的發(fā)生得到有效控制。
[0063] 實施例4:對分離得到的細菌進行鑒定
[0064] 經(jīng)廣東省微生物分析檢測中屯、檢測，其檢測依據(jù)為《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東 秀珠主編科學(xué)出版社)《伯杰細菌鑒定手冊》第九版W及《分子克隆實驗指南》第二版黃培堂 譯2002科學(xué)出版社），鑒定結(jié)果為：菌種GZ-33的16S rDNA序列與化ntoea coffei地ila(泛 菌）的同源性達98.06%，其形態(tài)特征及生理生化特性與化ntoeacoffei地ila(泛菌)最相 似。具體檢測結(jié)果如下：
[0065] (1)該保藏菌株的形態(tài)、培養(yǎng)、生理、生化等特征如下：
[0066] Pantoea coffeiphila GZ-33:屬泛菌（Pantoea coffeiphila);在LB培養(yǎng)基中生 長良好，菌株細胞桿狀，在LB瓊脂平板上培養(yǎng)時菌落表面光滑半透明，邊緣整齊（如圖2所 示)。
[0067] (2)菌株GZ-33的理化實驗結(jié)果，如表1所示。
[0068] 表1菌株GZ-33理化實驗結(jié)果
[0069]
[0071] 注：'V'表示陽性，表示陰性。
[0072] (3)菌株GZ-33 16S rRNA基因序列測定結(jié)果如下：
[0073]

[0074] 將16S rRNA基因序列進行Blast結(jié)果分析，得到與化ntoea coffeiphila相似度達 98.06%，其形態(tài)特征及生理生化特性與化ntoea coffeiphila最相似，因此根據(jù)16S rRNA 基因序列測定和形態(tài)特征、生理生化特性結(jié)果來看，該菌株可W歸為泛菌（Pantoea coffeiphila)。
[00巧]將GZ-33命名為泛菌(Pantoea coffei地ila)GZ-33,保藏編號為CCTCC M2016352， 于2016年6月27日保藏于位于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、。
[0076]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一株用于防治青枯病的泛菌，其特征在于：名稱為泛菌(Pantoea coffeiphila)GZ-33,保藏編號為CCTCC Μ 2016352,于2016年6月27日保藏于位于中國武漢武漢大學(xué)的中國 典型培養(yǎng)物保藏中心。2. 權(quán)利要求1所述用于防治青枯病的泛菌在防治青枯病中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述用于防治青枯病的泛菌在防治青枯病中的應(yīng)用，其特征在于:是 將泛菌菌液施加于培養(yǎng)農(nóng)作物的土壤中或是噴灑在農(nóng)作物的表面。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于防治青枯病的泛菌在防治青枯病中的應(yīng)用，其特征在于： 所述的農(nóng)作物為易于被青枯菌感染的農(nóng)作物。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于防治青枯病的泛菌在防治青枯病中的應(yīng)用，其特征在于： 所述的農(nóng)作物為茄科作物。6. -種青枯病生物防治菌劑，其特征在于：含有權(quán)利要求1所述用于防治青枯病的泛 菌。
【文檔編號】C12N1/20GK106011032SQ201610614076
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月29日
【發(fā)明人】鄧音樂, 宋施豪, 尹文芳, 張春燕, 楊春喜, 崔朝宇
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)