專利名稱：具有將甾醇轉(zhuǎn)化為雄-4-烯-3，17-二酮/雄-1，4-二烯-3，17-二酮能力的微生物及其制備 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物——偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortivtum)EUG-119，它具有極好的將甾醇轉(zhuǎn)化為雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮的能力，及其制備方法和用途，更具體的說，是一種具有比以前所知的微生物的轉(zhuǎn)化率高4倍甚至更多的微生物，和微生物的制備方法及其在制備雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮中的用途。
現(xiàn)有技術(shù)甾醇類是一種由腎上腺皮質(zhì)、睪丸、卵巢、胎盤或黃體釋放的分泌性激素，皆由膽固醇合成。根據(jù)它們的生理活性大約可分為如下5類雄性性激素(雄酮，睪酮等)和雌性性激素(雌二醇等)，它們分別在男性和女性的第二性征發(fā)育中起關(guān)鍵作用，孕激素(孕酮等)刺激和維持懷孕，糖皮質(zhì)激素(可的松，氫化可的松等)通過分解蛋白質(zhì)來刺激糖異生作用和提高肝糖原水平，鹽皮質(zhì)激素(脫氧皮質(zhì)酮，醛固酮等)在維持體內(nèi)電解質(zhì)和水的平衡中發(fā)揮重要作用。
隨著文明的進(jìn)步，出現(xiàn)了許多疾病，由于在這些疾病的治療中廣泛使用類固醇激素，人們生活壓力的增加和暴露在環(huán)境激素之下都導(dǎo)致體內(nèi)上述激素水平的不平衡。特別是合成雌激素基本上用于人工受精和不育癥患者的治療，以及糖皮質(zhì)激素在減輕多種炎癥，如虹膜炎、關(guān)節(jié)炎等引起的疼痛中起作用。此外，致命的阿狄森氏癥也可通過施用脫氧皮質(zhì)酮和氫化可的松治療。
為滿足上述增長的需求，已有大批研究者致力于類固醇激素的體外合成，而其中之一涉及用微生物制備類固醇激素前體。Mamoli和Vercellone(Ber.70470和Ber.702079，1937)報(bào)道通過酵母發(fā)酵將17-酮-類固醇還原成17-β-羥類固醇。還有，Peterson和Murray在美國專利No.2,602,769中公開了一種用根霉屬真菌產(chǎn)生孕酮的11-α-羥化方法，以及Kraychy在美國專利No.3,684,657中公開了一種用分枝桿菌屬從包含17-烷基的類固醇生成雄-4-烯-二烯-3，17-二酮，雄-1，4-二烯-3，17-二酮和20α-羥甲基孕-1，4-二烯-3-酮的方法。
為了大量生產(chǎn)類固醇激素產(chǎn)物，試圖使用甾醇為唯一碳源分離微生物和改變甾醇結(jié)構(gòu)用作發(fā)酵的底物，還用能防止甾醇核降解的化學(xué)添加劑(如金屬、金屬吸和金屬還原劑)來提高類固醇的收得率，這一努力已獲得很大進(jìn)展(Marsheck等，Applied microbiology.23(1).72-77，1972)。此外，還開展了通過物理和化學(xué)手段對從土壤中分離出的微生物進(jìn)行突變來提高類固醇前體產(chǎn)率的研究，特別是Upjohn公司在美國專利No.4,293,644中描述了一種通過一分枝桿菌(ATCC 29472)的突變株從多種類固醇中得到以高產(chǎn)量的雄-4-烯-3，17-二酮(在下文用AD表示)為主，并有少量雄-1，4-二烯-3，17-二酮(在下文用ADD表示)的產(chǎn)物的方法。
為與類固醇激素藥物需求的增長相適應(yīng)，就需要大量生產(chǎn)上述的激素前體，尤其是AD和ADD，它們是體外合成類固醇的重要前體化合物。然而，以前已知的微生物合成AD和ADD的產(chǎn)率低。從這一點(diǎn)考慮，急需開發(fā)具有從甾醇到AD和ADD的高轉(zhuǎn)化率的微生物。
發(fā)明的公開本發(fā)明的發(fā)明者所進(jìn)行的許多實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，偶發(fā)分枝桿菌(ATCC 29472)的突變株偶發(fā)分枝桿菌EUG-119具有極好的從甾醇到AD和ADD的轉(zhuǎn)化效率，本發(fā)明也是在這一結(jié)果的基礎(chǔ)上完成的。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種具有極好的從甾醇到AD和ADD的轉(zhuǎn)化效率的突變微生物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備具有極好的從甾醇到AD和ADD的轉(zhuǎn)化效率的突變微生物的方法。
提供一種用具有極好的從甾固醇到AD和ADD的轉(zhuǎn)化效率的突變微生物來制備AD和ADD的方法也是本發(fā)明的一個(gè)目的。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種制備偶發(fā)分枝桿菌EUG-119(于2001年4月14日保藏在韓國微生物培養(yǎng)中心(KCCM)，登記號(hào)為NO.KCCM-10259)的方法該方法包括以下步驟(a)在含甾醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)偶發(fā)分枝桿菌ATCC 29472株；(b)用亞硝基鳥胍(NTG)處理培養(yǎng)的偶發(fā)分枝桿菌；(c)使經(jīng)亞硝基胍處理的細(xì)菌在補(bǔ)充甾醇或者AD和ADD(濃度為0.1-0.2g/L)的培養(yǎng)基中生長，借此可篩選出在加甾醇培養(yǎng)基中生長迅速而在加AD和ADD的培養(yǎng)基中生長緩慢的突變株。
制備本發(fā)明AD和ADD的方法包括在含甾醇的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)突變微生物偶發(fā)分枝桿菌EUG-119和從培養(yǎng)基中回收AD和AD的步驟。
附圖簡述

圖1是在偶發(fā)分枝桿菌EUG-119的培養(yǎng)基中AD和ADD的高效液相色譜圖。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方案根據(jù)本發(fā)明，使用偶發(fā)分枝桿菌(ATCC 29472)，它能通過發(fā)酵從膽固醇轉(zhuǎn)化為類固醇。
為制備本發(fā)明的偶發(fā)分枝桿菌EUG-119，首先使偶發(fā)分枝桿菌(ATCC 29472)生長至O.D.0.6到0.8，然后用能殺死99.95生物的量的亞硝基胍(NTG)處理。NTG是一種常用于產(chǎn)生微生物突變株的化合物，它通過將鳥嘌呤的C6位甲基化在DNA復(fù)制時(shí)通過AT對替換GC對來誘導(dǎo)突變。NTG的量是每5ml培養(yǎng)基300至400μg，優(yōu)選的量為每5ml 330μg。此外，突變還可由紫外線照射、INH(異煙肼)或其它的致突變化合物完成。
從經(jīng)NTG處理過的菌株中選出在加甾醇固體培養(yǎng)基中生長迅速而在加AD和ADD的固體培養(yǎng)基中生長緩慢的突變株，最后通過燒瓶培養(yǎng)得到具有最高轉(zhuǎn)化率的突變株偶發(fā)分枝桿菌EUG-119。
任選地，在篩選菌株時(shí)所用的甾醇或AD和ADD以0.1到0.2g/L，優(yōu)選0.4到0.6g/L的量加入培養(yǎng)基中。甾醇可選自谷固醇、膽固醇、豆固醇和菜油固醇，優(yōu)選的是膽固醇。
通過上述方法制備的偶發(fā)分枝桿菌EUG-119于2001年4月14日保藏在韓國微生物培養(yǎng)中心(KCCM)，登記號(hào)為NO.KCCM-10259。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)了最終選出的突變株偶發(fā)分枝桿菌EUG-119，并分析它從膽固醇到AD和ADD的轉(zhuǎn)化率，在小規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，該突變株的轉(zhuǎn)化率比野生型菌株高約2.3倍，而在大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)則約高4.2倍。從經(jīng)一般分離和純化操作的2L突變菌株培養(yǎng)基中回收到純化率約為80％的AD和ADD。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)2天后，突變株產(chǎn)生了比野生株濃度高的AD和ADD。
因此，本發(fā)明的偶發(fā)分枝桿菌EUG-119可用于大量生產(chǎn)AD和ADD。這種方法包括在含甾醇的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)偶發(fā)分枝桿菌EUG-119和從培養(yǎng)基中回收AD和ADD的步驟。
當(dāng)本發(fā)明的偶發(fā)分枝桿菌EUG-119用于制備用作類固醇激素合成的前體的AD和ADD時(shí)，可獲得高產(chǎn)量的AD和ADD。
將通過引用以下實(shí)施例并結(jié)合附圖更詳細(xì)的解釋本發(fā)明。然而舉以下實(shí)施例僅為說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1突變株的制備為誘導(dǎo)突變，將分枝桿菌(ATCC 29472)接種到Y(jié)NG培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)至O.D.0.6到0.8，然后離5ml培養(yǎng)液，得到一個(gè)細(xì)胞團(tuán)。用含0.5％Tween 80的0.1M無菌檸檬酸鈉緩沖液(pH5.6)洗滌細(xì)胞團(tuán)兩次，并重懸于5ml緩沖液中，然后將濃度為330μg/ml的NTG加入細(xì)胞懸浮液中。將經(jīng)NTG處理的細(xì)胞懸浮液于37℃振蕩培養(yǎng)90分鐘，然后離心，得到一細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)用0.1M無菌磷酸鈉緩沖液(pH7.0)洗滌三次，并重懸于該緩沖液中。將最終的細(xì)胞懸浮液加到SM1固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)3-4天以形成克隆。
實(shí)施例2突變株的篩選將實(shí)施例1所得的克隆接種到MS1，MS1+膽固醇，MS1+ADD(或AD)和YNG固體培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)3天以選出在含膽固醇培養(yǎng)基(MS1+膽固醇培養(yǎng)基)中生長迅速而在含ADD(或AD)的培養(yǎng)基中生長緩慢的菌株，所選出的菌株稱為偶發(fā)分枝桿菌EUG-119。MS1培養(yǎng)基是極限無機(jī)培養(yǎng)基，用作對照，表1列出了培養(yǎng)基的組成。
表1

實(shí)施例3偶發(fā)分枝桿菌EUG-119k從膽固醇到AD和ADD轉(zhuǎn)化率的研究將實(shí)施例2中選出的突變株偶發(fā)分枝桿菌EUG-119在5ml YNG培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)，然后于30℃，200rpm培養(yǎng)120小時(shí)，培養(yǎng)基為100ml含1g葡萄糖，0.5g酵母提取物，0.01g Tween80和各種無機(jī)鹽的SM4發(fā)酵培養(yǎng)基(見表1)。由于膽固醇在培養(yǎng)基中不能很好的溶解，而溶于丙酮，因此將丙酮溶中的膽固醇懸液以每100ml0.1g膽固醇的量加入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)后，用乙醚和石油醚抽提培養(yǎng)液，并用2-丙醇溶解提取物，然后用HPLC分析該溶液中由偶發(fā)分枝桿菌EUG-119從膽固醇產(chǎn)生AD和ADD的量。從膽固醇到AD和ADD的轉(zhuǎn)化率由AD和ADD的摩爾濃度與加入的膽固醇的摩爾濃度的比值計(jì)算的產(chǎn)率來表示。還研究了野生菌株偶發(fā)分枝桿菌(ATCC 29472)的AD和ADD的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率。結(jié)果列于表2中。
表2

注產(chǎn)率＝產(chǎn)生的AD和ADD的摩爾濃度/加入的膽固醇的摩爾濃度如表2所示，突變株偶發(fā)分枝桿菌EUG-119顯示比野生菌株偶發(fā)分枝桿菌(ATCC 29472)高2.3倍的從膽固醇到AD和ADD的轉(zhuǎn)化率。
實(shí)施例4將用實(shí)施例3相同的方法制備的、在100ml培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)的突變株接種到含有2.5L無菌培養(yǎng)基(pH8.0)的5L發(fā)酵罐，并于1vvm(通氣流量)，30℃，600rpm振蕩培養(yǎng)120小時(shí)。以5g/L的量加入丙酮中溶解的膽固醇。用與實(shí)施例3相同的方法分析AD和ADD的產(chǎn)量及從膽固醇到AD和ADD的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果列于表3中。
表3

如表3所示，突變株偶發(fā)分枝桿菌EUG-119顯示比野生菌株高4.2倍的轉(zhuǎn)化率。
實(shí)施例5從實(shí)施例4制備的培養(yǎng)液中純化AD和ADD。將2.5L培養(yǎng)液調(diào)至pH3.0，并于4℃下以5000rpm離心10分鐘。通過懸浮于70％丙酮提取所得的生物量團(tuán)，并過濾丙酮蒸發(fā)后，保持在5-10℃，使激素沉淀。所得沉淀物經(jīng)過濾并于55℃干燥，將干燥的測定物加入己烷中以除去殘余膽固醇，然后再過濾和干燥，回收所得的粗激素中間物。激素中間物的回收率列于表4中。
表4

如表4所示，突變株偶發(fā)分枝桿菌EUG-119的2.5L培養(yǎng)液中得到的激素中間物的純化率約為80％。
實(shí)施例6用HPLC測量由野生型偶發(fā)分枝桿菌和突變株偶發(fā)分枝桿菌EUG-119產(chǎn)生的激素中間物濃度。含野生型或突變型偶發(fā)分枝桿菌的培養(yǎng)液用四倍體積的按1∶l的雙乙醚和石油醚的混合液抽提2次，然后將溶劑蒸發(fā)。提取的激素懸浮于異丙基乙醇，并借助HPLC以Pegasil ODS(4.6×250，5μm，120，Senshu Pak，Japan)作為層析柱，在流速1.0ml/min，2,700psi和250nm的條件下作定量分析，流動(dòng)相用50％的THF(見圖1)分析。
結(jié)果表明，培養(yǎng)2天后，突變株偶發(fā)分枝桿菌EUG-119產(chǎn)生AD和ADD的水平高于野生菌株偶發(fā)分枝桿菌ATCC 29472。
實(shí)施例7用已知方法研究突變株偶發(fā)分枝桿菌EUG-119的真菌學(xué)特性，結(jié)果如下。
偶發(fā)分枝桿菌EUG-119可在30-35℃下利用糖包括葡萄糖、多糖、甘油、脂肪酸等作為碳源。同時(shí)，偶發(fā)分枝桿菌EUG-119作為革蘭氏陽性菌株，其細(xì)胞壁中含有大量脂肪并生長形成黃色克隆。
總之，本發(fā)明的偶發(fā)分枝桿菌EUG-119顯示與已知偶發(fā)分枝桿菌ATCC 29472類似的形態(tài)學(xué)和物理特性，但具有極好的通過發(fā)酵作用將甾醇轉(zhuǎn)化成AD和ADD的能力。
工業(yè)應(yīng)用如上所述，本發(fā)明的偶發(fā)分枝桿菌EUG-119與以前已知的微生物，特別是偶發(fā)分枝桿菌ATCC 29472相比，具有極好的從甾醇到AD和ADD的轉(zhuǎn)化率。因此，本發(fā)明的偶發(fā)分枝桿菌EUG-119對類固醇激素的大量生產(chǎn)是很有用的。
權(quán)利要求
1.偶發(fā)分枝桿菌EUG-119(KCCM-10259)衍生自偶發(fā)分枝桿菌(ATCC 29472)，能將甾醇轉(zhuǎn)化為雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮。
2.如權(quán)利要求1所述的偶發(fā)分枝桿菌EUG-119，其特征在于，所述甾醇選自谷固醇、膽固醇、豆固醇和菜油固醇。
3.制備偶發(fā)分枝桿菌EUG-119(于2001年4月14日保藏在韓國微生物培養(yǎng)中心(KCCM)，登記號(hào)為NO.KCCM-10259)的方法包括以下步驟(a)在含甾醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)偶發(fā)分枝桿菌ATCC 29472株；(b)用亞硝基胍處理培養(yǎng)的偶發(fā)分枝桿菌；(C)使經(jīng)亞硝基胍處理的細(xì)菌在補(bǔ)充甾醇或者以濃度為0.1-0.2g/L的雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮的培養(yǎng)基中生長，借此可篩選出在加甾醇培養(yǎng)基中生長迅速而在加雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-烯-3，17-二酮的培養(yǎng)基中生長緩慢的突變株。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述甾醇選自谷固醇、膽固醇、豆固醇和菜油固醇。
5.制備雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮的方法，所述方法包括在含甾醇的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)偶發(fā)分枝桿菌EUG-119和從培養(yǎng)基中回收雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮的步驟。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述甾醇選自谷固醇、膽固醇、豆固醇和菜油固醇。
全文摘要
公開的是一種具有極好的將甾醇轉(zhuǎn)化為雄－4－烯－3，17－二酮(AD)和雄－1，4－二烯－3，17－二酮(ADD)能力的微生物，和微生物的制備方法及其用途，更具體的說，是偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)ATCC 29472的突變株——偶發(fā)分枝桿菌EUG－119，和制備突變株的方法及其在制備AD和ADD中的用途。本發(fā)明的突變株與已知微生物相比，具有極好的將甾醇轉(zhuǎn)化為AD和ADD的能力，AD和ADD是類固醇激素前體，因此，對類固醇激素的大量生產(chǎn)非常有用。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1507489SQ02809664
公開日2004年6月23日 申請日期2002年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月11日
發(fā)明者盧承權(quán), 金明國, 尹源泰, 樸敬文, 樸相玉 申請人:優(yōu)俊科學(xué)公司