專利名稱：無細胞蛋白質合成用胚芽的分選和無細胞蛋白質合成用胚芽提取物的制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及無細胞蛋白質合成用胚芽的分選和無細胞蛋白質合成用胚芽提取物的制造方法，并且詳細介紹了高效率制造高合成效率無細胞蛋白質合成用胚芽提取物所需胚芽的分選方法，用該分選方法所得胚芽來制造胚芽提取物的方法，以及由該制造方法所得到的胚芽提取物。
背景技術：
在細胞內發(fā)生的蛋白質合成反應是按照下列工序進行的，首先是從具有遺傳信息的DNA中將其信息復制給mRNA，然后核糖體將此mRNA的信息轉換，進行蛋白質合成。把細胞內的蛋白質合成在試管內等生物體以外進行的方法，例如將核糖體從生物體內提取出來，然后用這些核糖體在試管內進行無細胞蛋白質合成，現在對此方法的研究非常盛行(特開平6-98790號公報，特開平6-225783號公報，特開平7-194號公報，特開平9-291號公報，特開平7-147992號公報等)。在這些方法中，核糖體的原料使用了大腸桿菌、胚芽、家兔網狀紅血球等。
無細胞蛋白質合成類是非常有用的，它在鈦合成反應速度和轉換反應的正確性上保持了與活細胞相匹配的性能，并且可以不用實施復雜的精細工程就可以得到目標蛋白質。因此，為了將該合成類更好地利用于產業(yè)上，已經公布了幾項關于提高合成效率的發(fā)明。但是，為了提高對產業(yè)的有用性，不單單是合成效率，還需要使合成類中所使用的各種物質在保持穩(wěn)定的高品質的同時，保持大量供給。
傳統(tǒng)上，關于無細胞類蛋白質合成效率低下的現象，主要可以考慮以下三個原因，即(1)伴隨著從生物體提取細胞液的操作蛋白質合成因子活性降低、(2)在體外合成反應中，參與蛋白質合成的各種因子活性和基質濃度降低、(3)上述(1)和(2)所產生的結果復合起來造成轉換活性降低等。
A.S.Spirin等報告了在以傳統(tǒng)的方法調制的無細胞蛋白質合成類中，通過介于限外過濾膜連續(xù)供給原料氨基酸和ATP、GTP(連續(xù)式無細胞類)，成功使得反應時間持續(xù)20小時以上，達到了超越傳統(tǒng)20倍的蛋白質合成收量。(A.S.Spirin et al.(1988)，Science，242，1162-1164)。還有，橫山等在含有濃縮大腸桿菌提取液的反應溶液中，使用透析膜嘗試連續(xù)式無細胞合成，以反應類每1ml 3～5mg的高收量成功地合成了CAT和Ras等較小分子的蛋白質(木川等、第21屆日本分子生物學會、WID6)這些成果表明了上述(2)的基質濃度降低是無細胞類蛋白質合成效率低下現象的原因之一。換句話說，也可以說明在防止氨基酸和能源下降的同時(反應中的基質濃度下降是因為有混在這些基質的代謝酶群的參與)，通過排除AMP和GMP等代謝物的積蓄，使得蛋白質合成效率提高。
另一方面，從對蓖麻種子中含有的細胞毒素蛋白質蛋白酶的核糖體非活性化原理的研究，說明了植物產生的一群抗病毒蛋白質和蛋白酶A鏈是同一RNA N-糖甙(Y.Endo et al.(1988)Biochem.Biophys.Acta，954，224-226)。這種酶是一種核糖體非活性化酶，它作用于核糖體，其RNA(大腸桿菌為23SrRNA，真核生物為28SrRNA)的肽鏈伸長因子對結合特定部位存在的一個N-糖甙結合的加水分解起催化作用，所以此反應的結果是，核糖體由于一個分子的腺嘌呤的分解造成肽鏈伸長功能消失。(Y.Endo.et al.(1992)，TIBS，17，266-269)。小麥種子的胚乳里大量存在著名叫三苯甲基的RNA N-糖甙(W.K.Roberts et al.(1989)Biochemistry，18，2615-2621)。還有，眾所周知作為抗菌物質被離析的名叫硫堇的蛋白質以小麥為首廣泛分布于植物界中，最近證實了小麥硫堇局部存在于胚乳中，以及因為這種蛋白質阻礙轉換開始反應，所以強烈阻礙蛋白質合成(J.Brummer et al.(1994)Eur.J.Biochem，219，425-433，P. Hughes et al.(1997)Plant Physiol.，114，1568)。并且，小麥種子的胚乳中含有高濃度的RNA分解酶、DNA分解酶、蛋白質分解酶等。
以前，無細胞蛋白質合成用小麥胚芽的調制都是根據埃里克松、布羅貝爾等人(A.H.Erikson and G.Blobel(1983)，Methods in Enzymol.，96，38-50)的方法進行的，不過，這種方法混入含有白質合成阻礙物質的胚乳是不可避免的。
因此，作為上述(1)的改善手段，特開平7-203984號公報中登載了以下蛋白質合成方法，即在無細胞蛋白質合成系統(tǒng)中，通過抑制活性阻礙因子的活性使得反應效率提高的方法，這些活性阻礙因子是伴隨細胞破壞所誘發(fā)的，是阻礙核酸合成以及蛋白質合成活性的一種因子。在此公報中作為抑制活性阻礙因子活性的，列舉了將其從蛋白質合成系統(tǒng)中去除和在蛋白質合成系統(tǒng)中阻礙其活性的手段，不過一般考慮到從蛋白質合成系統(tǒng)中有選擇的去除活性阻礙因子非常困難，所以推薦使用特異阻礙劑的方法。具體一點就是，通過三苯甲基抗體來抑制小麥胚芽中存在的名叫三苯甲基的阻礙因子。
還有，在特開平2000-236896號公報中登載了可以通過機械、化學的處理方法來更好的去除上述阻礙小麥種子胚乳中局部存在的蛋白質合成反應的內因性特異阻礙物質。在這種方法中，為了得到不含胚乳的胚芽，可以在水溶液中進行超聲波處理。
從植物種子中取得無細胞蛋白質合成用細胞提取物通常是按下列方法進行，即通過對植物種子的粉碎、篩選、重液分選、目視等取得去除種皮、胚乳碎片的粗胚芽碎片，再通過洗凈去除胚乳成分后進行粉碎提取分離。
但是，由于植物種子粉碎物中混有胚芽、細小種皮碎沫、胚乳等所以通過目視等方法很難只分選到胚芽，并且還要花費大量的時間，所以要想在短時間內取得大量的胚芽是很困難的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為工業(yè)性高效率制造無細胞蛋白質合成類中使用的細胞提取物，以提供在短時間內從植物種子中取得大量胚芽的方法。
本發(fā)明者等人為了達成上述課題銳意商討的結果得出，根據胚芽的光學信息分選胚芽、比如說使用色彩分選機和圖片分選機來分選胚芽，就可以有效得到高純度的植物種子胚芽，這樣用這種胚芽碎片就可以有效制造無細胞蛋白質合成用胚芽提取物。本發(fā)明就是根據這些想法形成的。
也就是說根據本發(fā)明(1)可以提供無細胞蛋白質合成用胚芽的分選方法，該分選方法以下列內容為特征即從通過對植物種子施加機械力得到的胚芽和胚乳破碎物的混合物中，根據胚芽的光學信息來進行胚芽分選。
根據這點發(fā)明的樂觀形態(tài)可以提供以下方法，(2)光學信息指色彩信息上述(1)中所提到、(3)根據光學信息進行胚芽分選通過色彩分選機來進行上述(1)中所提到、(4)色彩分選機至少是有以下功能的裝置，即對粗胚芽碎片進行光照射、檢驗出粗胚芽碎片的反射光或者透過光、檢驗值與基準值相比較、以此來分選去除基準內的或者偏離基準的上述(1)中所提到。
還有，根據這點發(fā)明的另一樂觀形態(tài)可以提供以下方法，(5)光學信息指圖片信息上述(1)中所提到、(6)根據光學信息進行胚芽分選通過圖片分選機來進行上述(1)中所提到、(7)圖片分選機至少是具有以下功能的裝置，即取得植物種子破碎物片的圖像數據、通過所得數據來辨別植物種子破碎物片的形狀、根據所得形狀的不同來分選去除基準內的或者偏離基準的上述(6)中所提到、(8)形狀的不同指植物種子破碎物片的面積、外周長、圓度、伸長度等方面的不同(7)中所提到。
根據本發(fā)明的另外一方面，(9)可以提供胚芽提取物的制造方法，該方法包括植物種子的粉碎、植物胚芽的分選、洗凈、微粉碎、以及提取工序，其特征是植物胚芽的分選是根據胚芽的光學信息來進行的。
根據這點發(fā)明的樂觀形態(tài)可以提供下列方法(10)光學信息指色彩信息上述(9)中所提到、(11)根據光學信息進行胚芽分選通過色彩分選機來進行上述(9)中所提到、(12)色彩分選機至少是有以下功能的裝置，即對粗胚芽碎片進行光照射、檢驗出粗胚芽碎片的反射光或者透過光、檢驗值與基準值相比較、以此來分選去除基準內的或者偏離基準的上述(11)中所提到、(13)光學信息指圖片信息上述(9)中所提到。
另外，根據這點發(fā)明的另一樂觀形態(tài)可以提供下列方法，(14)根據光學信息進行胚芽分選通過圖片分選機來進行上述(9)中所提到、(15)圖片分選機至少是具有以下功能的裝置，即取得植物種子破碎物片的圖像數據、通過所得數據來辨別植物種子破碎物片的形狀、根據所的形狀的不同來分選去除基準內的或者偏離基準的上述(14)中所提到、(16)形狀的不同指植物種子破碎物片的面積、外周長、圓度、伸長度等方面的不同(15)中所提到。
根據這些發(fā)明的形態(tài)(17)可以提供(1)～(16)中所提到的任意一種方法，植物種子指小麥、大麥、或者是水稻的種子。
并且，根據本發(fā)明的另一方面，(18)可以提供由上述(9)～(16)所提到的任何方法所制造的無細胞蛋白質合成用胚芽提取物。


圖1是表示小麥種子胚乳的RGB輝度的頻率分布(鹵燈照射下)。圖中，縱軸表示度數，橫軸表示輝度。
圖2是表示小麥種子胚芽的RGB輝度的頻率分布(鹵燈照射下)。圖中，縱軸表示度數，橫軸表示輝度。
圖3是表示小麥種子種皮的RGB輝度的頻率分布(鹵燈照射下)。圖中，縱軸表示度數，橫軸表示輝度。
圖4是一例模式化的從粗胚芽碎片中分選胚芽的裝置概略圖。圖中符號1表示粗胚芽碎片供給方法、2表示粗胚芽碎片、3表示傳送帶、4表示光源、5表示CCD傳感器、6表示吸引噴嘴。
圖5是用CCD照相機下拍攝到的小麥種子胚芽的照片。
圖6是用CCD照相機下拍攝到的胚芽以外的粉碎物的照片。
圖7是分析用圖片處理裝置模式化的概略圖。圖中，符號7表示CCD照相機、8表示透鏡、9表示樣品、10表示載片、11表示照明、12表示圖片處理用計算機。
圖8表示實施例1和3中所得胚芽以及胚芽以外的粉碎物的圓度和伸長度。
具體實施例方式
適用于本發(fā)明中的種子，并沒有任何特別的限制只要可以得到胚芽即可，一般用從小麥、大麥、水稻等稻科植物中所選的植物種子來舉例說明。其中，以非常適合的植物種子小麥為例來說明。
本發(fā)明，從植物種子中取得以無損傷胚芽為主要成分的胚芽碎片。在這里，所謂的無損傷胚芽是指至少還具有發(fā)芽能力的胚芽，胚芽碎片是指以無損傷胚芽為主要成分，利用它可以進行無細胞蛋白質合成所用的細胞提取物的調制。由于植物種子中含有的胚芽量比較少，所以為了有效從種子中得到胚芽，最好是盡量去除胚芽以外的部分。一般，首先是通過對植物種子施加機械力得到含有胚芽、胚乳破碎物、種皮破碎物的混合物，然后從該混合物中去除胚乳破碎物和種皮破碎物得到粗胚芽碎片。這里，所謂的粗胚芽碎片是指以胚芽為主要成分，含有胚乳破碎物和種皮破碎物的混合物。給植物種子所施加力的強度只要是能將胚芽從植物種子中分離出來即可。
一般，使用眾所周知的粉碎裝置，通過粉碎植物種子，得到含有胚芽、胚乳破碎物和種皮破碎物的混合物。
植物種子的粉碎，可以使用一般眾所周知的粉碎裝置，但是最好使用軋棍、軋錘等對被粉碎物有沖擊力類型的裝置。粉碎的程度，根據所使用的植物種子胚芽的大小適當選擇即可。比如用小麥種子的情況，一般粉碎大小，最長4mm以下、最好是長2mm以下。另外最好是干式粉碎。
接著是從得到的植物種子粉碎物中，用一般公認的分離裝置，例如用篩子取得粗胚芽碎片。例如，用小麥種子時，通常取得的粗胚芽碎片，網眼尺寸是0.5mm～2.0mm最好是0.7mm～1.4mm。并且，根據需要，可以通過利用風力和靜電去除所得粗胚芽碎片中含有的種皮、胚乳以及雜質等。
本發(fā)明，是從上述所得粗胚芽碎片中，根據胚芽的光學信息比如色彩信息和圖片信息來分選胚芽。根據胚芽的光學信息進行胚芽的分選，可以使用比如根據色彩進行分選的色彩分選機和根據圖片進行分選的圖片分選機。這樣，可以使胚芽碎片更加精純。從種子粉碎物中也可以根據胚芽的光學信息進行胚芽的分選，但是由于種子粉碎物中含有大量的胚芽以外的成分，效率很低，所以最好是從胚芽碎片中分選。
首先，就使用根據胚芽的色彩信息進行分選的色彩分選機的方法作一說明。
粗胚芽碎片，比如小麥種子粗胚芽碎片的情況，如圖1～3所示例如由于胚乳和胚芽的RGB輝度的頻率分布不同，所以可以利用這點不同來區(qū)分胚乳和胚芽。這里，RGB是分別對應光的3種原色紅(Red)綠(Green)藍(Blue)。所謂的輝度是顏色信息的表現方式就像有RGB模型一樣，是彩色攝像機和計算機圖表系統(tǒng)所采用的方式，是通過把色彩信息分解到R，G，B的各成分中時分別用輝度表現出來。輝度一般是8比特，也就是說可以從0到255共有256個階調來表示。圖1是將胚乳、圖2是將胚芽、圖3是將種皮分別用彩色CCD照相機拍攝，就適當拍攝區(qū)域內的各畫素分解到RGB各成分中，得到輝度的頻率分布。胚芽和胚乳相比整體上輝度的分布比較低，尤其是藍色的輝度分布特別低。這說明藍色光大部分被胚芽所吸收。作為結果胚芽看起來是藍色的補色黃色。所以，在藍色光的照射下，胚芽和胚乳的輝度差異變大。這樣，比如胚芽和胚乳的色彩差異從RGB輝度的頻率分布不同中檢驗出來，根據這些就可以分選出胚芽和胚乳。還有，胚芽與種皮相比較就RGB所有成分來說輝度呈現高分布，所以，如果用白色光照射，輝度測試卡輝度會呈現差異，但是從胚芽和種皮綠色輝度差最高這一點來說，使用綠色光照射二者輝度差將更明顯。或者，由于胚芽和種皮紅色的輝度分布也能看出差別，所以使用綠色光和紅色光的混合色即黃色光時兩者的輝度差會變大。
本發(fā)明中可以使用的色彩分選機，使用什么裝置都無所謂，只要具有利用色彩的不同來分選胚芽的功能即可。例如，可以舉出至少有以下功能的裝置，給粗胚芽碎片提供光照射，可以檢測出來自于粗胚芽碎片的反射光或者透過光，檢測值和基準值可以相比較，可以分選去除基準值之內的或偏離基準值的。
照射光可以使用可是光或者紅外光。光源可以使用白熱燈、熒光燈、鹵燈等。
檢測反射光或者透過光可以使用CCD傳感器、硅輻透傳感器、鍺輻透傳感器和InGaAs震裂傳感器等受光傳感器。
實際上構成分選機除了上述功能以外，還需要粗胚芽碎片的運送裝置，因此，例如可以使用利用傾斜靠重力運送的滑行道或者是傳送帶。
例如，把粗胚芽碎片放到傳送帶上供給，可以給傳送帶運送中的粗胚芽碎片或者從傳送帶一端放出的粗胚芽碎片照射光，還可以對從供給口落下的粗胚芽碎片照射光。光源的種類、背景色(使用傳送帶時是傳送帶的顏色，使用背景時是背景的顏色)、還有受光傳感器的種類，可根據要分選的種子的種類或者要去除的東西(胚芽或胚芽以外的東西)來適當選擇。例如說，去除種皮時，可以采用和胚芽同程度輝度和色彩的背景色(比如米黃色)，可以采用綠色系或黃色系(比如燈泡)的光源。還有，去除胚乳時，可以采用比胚芽深的背景色和藍色系的光源。
根據從粗胚芽碎片檢測出的反射光或者透過光，比較檢測值和基準值，可以判斷對象物是應該分選的還是應該去除的。根據這個判斷，粗胚芽碎片接受分選去除，這樣就可以得到去除了胚芽以外部分的胚芽碎片。檢測值和基準值相比較的裝置可以使用其本身已知的。
作為分選去除基準值之內的或偏離基準值的手段比如可以采取空氣等流體的噴射或者吸引來實施分選去除的方法。
圖4是一例模式化的從粗胚芽碎片中分選胚芽的裝置概略圖。在圖4中1表示粗胚芽碎片供給方法、2表示粗胚芽碎片、3表示傳送帶、4表示光源、5表示CCD傳感器、6表示吸引噴嘴。例如，從粗胚芽碎片供給裝置1中供給到傳送帶3上，通過對由傳送帶3運送中的粗胚芽碎片2照射光，再通過CCD傳感器5檢測出反射光，檢測值和基準值相比較后通過吸引噴嘴6去除出偏離基準值的東西，來進行胚芽的分選。
小麥胚芽縱長2mm，橫寬1mm，厚約0.5mm，重約0.5～0.6mg非常小非常輕。所以，為了提高分選精度最好采用下列方法，把粗胚芽碎片供給到傳送帶上，對由傳送帶一般是以5～100m/分，最好是10～90m/分的速度運送中的粗胚芽碎片進行光照射，來進行分選。另外，雖然傳送帶上供給的粗胚芽碎片量沒有特別的限制，但是供給量的下限是一般是10粒/m2，最好是1000粒/m2，上限是1000粒/m2，更好是7000粒/m2，最好是1000～5000粒/m2。這樣，可以提高分選精度。
吸引去除盡量要在短時間瞬間內完成，這樣可以避免對去除物周邊的胚芽的誤吸引，可以提高分選精度。這時的吸引力，比如說可以用電磁閥門通過給噴射器供給空氣壓就可以產生。噴射器的動作時間也就是電磁閥門的打開時間要求盡量要短，給電磁閥門的打開信號通常是0.5～10毫秒，最好是0.5～2毫秒。另外還需要使用應答速度快的電磁閥門。
胚芽的分選方法，比如首先，從粗胚芽碎片中去除種皮等比胚芽顏色深的東西，然后去除胚乳等比胚芽淺的東西。這些操作也可以按相反的順序進行，這些操作也可以多次重復進行。另外也可以只分選回收胚芽。
然后，就使用根據胚芽的圖片信息進行分選的圖片分選機的方法作一說明。
由于胚芽比胚芽以外的部分要堅硬，所以上述粉碎處理時胚芽以外的部分被粉碎，胚芽卻未被粉碎而保持原狀被分離出來。
本發(fā)明，從如上面所述得到含有胚芽、胚乳破碎物和種皮破碎物的粗胚芽碎片中，使用圖片分選機根據形狀的不同來分選胚芽。從種子粉碎物中可以分選胚芽，但是由于種子粉碎物中含有大量胚芽以外的成分，效率很低，所以最好從粗胚芽碎片中來分選。
粗胚芽碎片，比如小麥種子的情況，如圖5和圖6所示胚芽和胚芽以外的粉碎物由于其形狀不同，利用從這些不同所獲得的光學信息即圖片信息，可以分辨胚芽和胚乳。
圖5是將胚芽、圖6是將胚芽以外的粉碎物分別用CCD照相機拍攝的。胚芽與胚芽以外的粉碎物相比比較接近橢圓形狀。所以把根據形狀的不同所得光學信息的不同，例如，作為面積、外周長、圓度、伸長度等圖片信息的不同來判別，這樣就可以來分選胚芽和胚芽以外的粉碎物。
本發(fā)明中可以使用的色彩分選機，可以為任何裝置，只要具有根據形狀的不同來分選胚芽的功能即可。比如，可以列舉出圖片分選機至少是具有以下功能的裝置，即取得植物種子破碎物片的圖像數據、通過所得數據來辨別植物種子破碎物片的形狀、根據所得形狀的不同來分選去除基準值內的或者是偏離基準值的。
具體來說，比如，將胚芽供給到傳送帶上，對由傳送帶運送中的粗胚芽碎片照射由白幟燈，熒光燈、鹵燈等發(fā)出的可視光或者紅外光，粗胚芽碎片的反射光或者透過光通過CCD傳感器、CMOS傳感器等受光傳感器取得圖片數據。光源的種類、背景色(使用傳送帶時是傳送帶的顏色，使用背景時是背景的顏色)、還有受光傳感器的種類，可根據要分選的種子的種類或者要去除的東西(胚芽或胚芽以外的東西)來適當選擇容易辨別形狀差異的組合。
從所得到的圖片數據來辨別植物種子粉碎物形狀的差異。所得到的圖片數據通過圖片處理求得表示形狀驗出值，通過將此驗出值與提前設定好的基準值相比較來辨別形狀的不同。作為表示形狀的驗出值可以列舉出面積、外周長、圓度、伸長度。辨別裝置可以使用其本身已知的。
比如，使用適當的計算機系統(tǒng)，針對所的圖片數據進行2進制處理以及實行噴嘴去除后，例如通過探測解析處理等解析手段來演算圓度和伸長度。根據探測解析處理圓度和伸長度分別可以按如下公式來求取。
這里，上述圖片處理(圖像解析處理)可以使用市場上銷售的軟件，比如National Instruments公司制作的計測、控制軟件[LabVIEW 6.0版本]和LabVIEW用的置位圖片處理工具[MAQ版本6.0.1]。探測解析的詳細內容在IMAQ Vision使用說明書[IMAQ Vision Concept Manual](October2000 Edition)中的第九章[Binary Morphology]、第十章[Particle Manual]中有記載。
上述解析處理演算的圓度越是接近于圓形越接近1。伸長度越是細長形狀值越大。
預先求得胚芽的圓度和伸長度，其值作為基準值和驗出值相比較。面積、外周長、圓度、伸長度等表示形狀的驗出值可以單獨應用，通過多變量解析組和應用更加提高分選精度。
為了適用多變量解析，可以按下列順序進行。預先對復數的胚芽以及應該去除的胚芽以外的碎片進行探測解析，用所得m種類的驗出值作下列回歸式(3)。作為驗出值，可以是一些值組合起來，例如除了上述的面積、外周長、圓度、伸長度以外，還有探測范圍的最長軸、等面積橢圓長軸、動水半徑或者是這些值的四則運算(比如說等面積橢圓長軸/等面積橢圓單軸)所得值等。
Y＝A0+A1×驗出值1+A2×驗出值2+…+Am×驗出值m(3)這里的回歸式(3)中，Y假如是已經進行了探測解析的樣品，進行回歸胚芽為1、胚芽以外的為0，來求得各驗出值的重復A1～Am以及定數項A0。回歸的方法可以用所知的線性重復回歸，但是如果用所知的PLS部分最小2次方的話可以進一步提高分選的精度。
決定A0～Am后，對未知樣品進行探測解析，從上述回歸式(3)中求取Y值，因為其樣品如果是胚芽將顯示接近1的數值、如果不是胚芽將顯示接近0的數值，所以可以進行分選。
根據上述方法所得形狀的差異，通過分選去除基準值之內的或偏離基準值的，這樣就可以得到去除胚芽以外部分的胚芽碎片。
作為分選去除基準值之內的或偏離基準值的方法，可以使用通過空氣等流體的噴射或吸引來實施分選排除的方法。
具有上述功能的裝置，例如以與圖4表示的一例模式化的從粗胚芽碎片中分選胚芽的相同裝置為例。在圖4中1表示粗胚芽碎片供給方法、2表示粗胚芽碎片、3表示傳送帶、4表示光源、5表示CCD傳感器、6表示吸引噴嘴。例如，從粗胚芽碎片供給裝置1中供給到傳送帶3上，通過對由傳送帶3運送中的粗胚芽碎片2照射光，再通過CCD傳感器5取得圖片數據，從圖片數據中所得檢測值和基準值相比較后通過吸引噴嘴6吸引去除出偏離基準值的東西，來進行胚芽的分選。
如前面所述，小麥胚芽縱長2mm，橫寬1mm，厚約0.5mm，重約0.5～0.6mg非常小非常輕。所以，為了提高分選精度最好采用下列分選方法，把粗胚芽碎片供給到傳送帶上，對由傳送帶一般是以5～100m/分，最好是10～90m/分的速度運送中的粗胚芽碎片進行光照射，來進行分選。另外，雖然傳送帶上供給的粗胚芽碎片量沒有特別的限制，但是供給量的下限是一般是10粒/m2，最好是1000粒/m2，上限是1000粒/m2，更好是7000粒/m2，最好是5000粒/m2左右。供給量的具體范圍通常是10～10000粒/m2，更好是1000～7000粒/m2，最適當的是1000～5000粒/m2左右。這樣，可以提高分選精度。
根據需要這些操作也可以多次重復進行。另外也可以只分選回收胚芽。
如前面所述，吸引去除盡量在短時間瞬間內完成，這樣可以避免對去除物周邊的胚芽的誤吸引，可以提高分選精度。這時的吸引力，比如說可以用電磁閥門通過給噴射器供給空氣壓就可以產生。噴射器的動作時間也就是電磁閥門的打開時間要求盡量要短，給電磁閥門的打開信號通常是0.5～10毫秒，最好是0.5～2毫秒。另外還需使用應答速度快的電磁閥門。
如上所講，根據胚芽的光學信息可以有效地大量地凈化分選胚芽。
這樣所得的胚芽碎片中，有時候會沾有胚乳成分，所以通常為了實行胚芽凈化，最好進一步進行洗凈處理。
洗凈處理，一般是在10℃以下，最好是在4℃以下的冷卻水中或者水溶液中使胚芽碎片分散·懸濁，最好一直洗到洗凈液變成白濁為止?；蛘?，更好的是一般在10℃以下，最好是在4C以下的界面活性劑中使胚芽碎片分散·懸濁，最好一直洗到洗凈液變成白濁為止。所使用界面活性劑最好是非離子性的界面活性劑，其中，比較適合的比如有聚氧化乙烯誘導體Brij、氚核(Triton)、Nonidet P40、Tween。其中最適合的是NonidetP40。這些非離子性界面活性劑可以按0.5％左右的濃度使用。
用水或水溶液的洗凈處理以及用界面活性劑的洗凈處理，這兩種任何一種都可以，兩者都實施也可以。還有，這些洗凈處理和超聲波處理組合起來實施也可以。
以上所得胚芽通過洗凈、微粉碎、以及提取處理就可以得到胚芽提取物。取得胚芽提取物的方法，可以按傳統(tǒng)公認的方法進行。例如，將液體氮所冷凍的胚芽微粉碎，加入提取溶劑攪拌后，通過將胚芽提取物含有液進行離心分離便可回收。然后根據需要通過凝膠過濾來精制也可以。
提取溶劑可以使用含有緩沖液、鉀離子、鎂離子以及硫醇基酸化防酸劑的水溶液。另外，根據需要可以再添加一些鈣離子、L型氨基酸等。比如，提取溶劑可以使用含有N-2-水凝膠二乙烯二胺-N’-2-乙烷磺基酸(HEPES)-KON、醋酸鉀、醋酸鎂、L型氨基酸以及硫磺內脂的溶液，或者是部分改變Patterson等人方法的溶液((HEPES)-KON、醋酸鉀、醋酸鎂、氫化鈣、L型氨基酸以及硫磺內脂的溶液)。提取溶劑中各成分的組成、濃度其本身已知，只要使用在無細胞蛋白質合成用胚芽的制造法中一般通用的即可。
凝膠過濾可以預先在溶液(含有(HEPES)-KON、醋酸鉀、醋酸鎂、硫磺內脂以及L型氨基酸的溶劑)中進行平衡，然后使用已放置好的凝膠過濾裝置來進行。凝膠過濾溶液中各成分的組成、濃度都是本身已知的，只要使用在無細胞蛋白質合成用胚芽的制造法中一般通用的即可。
凝膠過濾可以預先在溶液(含有(HEPES)-KON、醋酸鉀、醋酸鎂、硫磺內脂以及L型氨基酸的溶劑)中進行平衡，然后再使用已放置好的凝膠過濾裝置來進行。凝膠過濾溶液中各成分的組成、濃度都是本身已知的，只要使用在無細胞蛋白質合成用胚芽的制造法中一般通用的即可。
凝膠過濾后的胚芽提取物含有液中，有時候會混入微生物、特別是線狀菌(霉)等的孢子，最好是去除這些微生物。特別是長時間的(1天以上)無細胞蛋白合成反應中可以看到微生物的繁殖，所以阻止它很重要。微生物的去除手段沒有特別的規(guī)定，不過最好用過濾滅菌過濾器。過濾器的孔徑尺寸一般是0.1至1微米、最好是0.2至0.5微米。順便講一下，小部類的枯草菌孢子的尺寸為0.5μm×1μm，所以使用0.20微米的過濾器(例如Sartorius公司生產的MinistartTM等)對于孢子的去除也是很有效的。在過濾時，最好是首先使用孔徑較大的過濾器過濾，然后再使用可以去除有可能混入的微生物孔徑尺寸的過濾器過濾。
這樣所得的細胞提取物，是非常精純的，是不含胚乳成分的細胞提取物?；旧贤耆蝗コ呐呷槌煞种泻邢铝形镔|，原料細胞自身含有或者存有抑制蛋白質合成功能的物質即三苯甲基、硫堇、RNA分解酶、DNA分解酶、蛋白質分解酶等作用于核糖體抑制其機能的物質。這里所說的不含胚乳成分的細胞提取物是指去除胚乳成分的胚芽提取物，這可以通過核糖體實質上沒有被三苯甲基上脫腺嘌呤化來判別。另外，所說的[核糖體實質上沒有被脫腺嘌呤化]是指核糖體的脫腺嘌呤率未到7％，希望是1％以下，更好是0.1％，最好是脫腺嘌呤率在驗出界限之下。
由無細胞蛋白質合成類所進行的蛋白質合成，除了使用上述方法所得的胚芽提取物這一點外，其它可以以與傳統(tǒng)相同的方法來進行。這方法可以是公認的分批法，還可以是前面所提到的斯皮林等人的連續(xù)式無細胞蛋白質合成系統(tǒng)的氨基酸、能源的連續(xù)供給方法。
分批法因為有時候長時間進行蛋白質合成反應會停止，所以通過使用后者氨基酸、能源連續(xù)供給的連續(xù)供給法，可以使反應長時間維持，可以更有效率。
另外，用連續(xù)供給法進行蛋白質合成時，最好可以使用透析法。比如，使用限外過濾膜透析法，把本發(fā)明的胚芽提取物作為透析內液，把含有能源和氨基酸的混合液用作透析外液，可以連續(xù)地大量調制蛋白質。透析法中，以透析膜為介能源和氨基酸等的合成基質供給給透析內液，反應副生物等排出到透析外液。透析膜可以使用其本身已知的通常使用的。透析膜的分子量界限可以根據要合成的蛋白質分子量來使用適當的。
這里所說的能源，可以舉出腺甙5’-三磷酸(ATP)、鳥甙5’-三磷酸(ATP)、以及磷酸肌酸，氨基酸可以舉出20種L型氨基酸。
無細胞類合成的蛋白質，根據需要，也可以通過其本身已知的通常所用方法來從反應系統(tǒng)中進行分離、精制。蛋白質的分離、精制例如通過吸引色層分離法、凝膠過濾色層分離法和離子交換色層分離法等來進行就可以。
下面的實施例將對本發(fā)明作進一步的解釋，但是本發(fā)明并不僅僅局限于這些實施例，這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領域的技術人員在權利要求的范圍內所做出的某些改變和調整也應認為屬于本實施例1 粗胚芽碎片的調制將北海道產的CHIHOKU小麥種子(未消毒)90kg按1分鐘200g的比例添加到磨機(Fritsch公司生產的Rotor Speed Mill pulverisette 14型)中，以7,000rpm的轉速將種子柔和地破碎。由于第1次的破碎還殘留很多胚芽未被分離的小麥，所以重復進行了4次。通過篩選回收含有具有發(fā)芽能力的胚芽的碎片(網眼尺寸0.71mm～1.00mm)后，通過使用扇車的風力分選去除掉種皮等不純物。然后通過使用四氫化碳和環(huán)己烷的混合液[四氫化碳∶環(huán)己烷＝2.4∶1(容量比)]的重液分選，將含有具有發(fā)芽能力的胚芽的上浮碎片回收，通過室溫干燥去除有機溶劑后，再通過使用扇車的風力分選去除種皮等不純物來得到粗胚芽碎片。通過以上步驟，粗胚芽碎片中胚芽占有的重量比例為6成。
實施例2 RGB彩色空間的色彩信息提取使用KEYENCE公司生產的數碼微觀測器VH-7000和遠距離變焦距鏡頭對實施例1中所得粗胚芽碎片進行拍攝，取得彩色圖片。拍攝條件是鹵燈輝度為最大，白色平衡設定為3200K、快門速度為1/120秒、鏡頭倍數為50倍。
拍攝的圖片使用National Instruments公司制作的軟件LabVIEW版本6.0和IMAQ Vision版本6.0.1，通過RGB彩色空間進行彩色解析。首先，通過目視從所拍圖片中剪切出可以判斷為胚芽部分的圖片，剪切的圖片中含有的全畫素作為母集團來演算R，G，B各成分輝度的直方圖。胚乳、種皮也以同樣的演算直方圖，這樣就得出圖1到圖3所顯示的結果。
從這些結果上顯示出，如[發(fā)明實施的形態(tài)]中所述，通過適當選擇照明等拍攝條件根據色彩信息的差別來分選胚芽是可行的。
實施例3 用色彩分選機進行胚芽分選使用傳送帶式色彩分選機BLM-300K(制造商株式會社安西制作所、銷售商株式會社安西總業(yè))，如下所述，利用色彩的差異來從粗胚芽碎片中分選胚芽。這種色彩分選機的概要，如圖4模式所顯示的裝置相同。
將實施例1中所得粗胚芽碎片大約5000粒/m2供給到米黃色的傳送帶上，然后用熒光燈給傳送帶上的粗胚芽碎片進行光照射，檢測出反射光。傳送帶的運送速度為50m/分、受光傳感器使用單色的CCD線傳感器(2048畫素)。
首先，為了從胚芽中去除黑色成分(種皮等)，選用米黃色的傳送帶，照明選用燈泡色的熒光燈，在胚芽的輝度和種皮的輝度之間設定基準值，偏離基準值的通過吸引去除。將這些重復了6次。接著，為了分選胚乳，分別將傳送帶換用深綠色，照明換用藍色的熒光燈，在胚芽的輝度和胚乳的輝度之間設定基準值，偏離基準值的通過吸引去除。這些重復作了7次。吸引去除使用了在傳送帶的皮帶輪前方約1厘米的位置上設置的吸引噴嘴30個(長1厘米左右1個吸引噴嘴所排列的)，是通過將傳送帶端部放出落下中的種皮或者胚乳吸引的方法來進行。最后通過色彩分選工序破碎變小的胚乳用網眼尺寸為0.71mm的篩子去除。
以上的方法中色彩分選工序用15個小時，得到了重量比為98.3％純度的小麥胚芽500g。
實施例4 用圖片處理來分選胚芽用圖7所示的圖片處理裝置對實施例3中所得胚芽樣品123點和實施例1中所得粗胚芽碎片中的胚芽以外的樣品83點的形狀差異作了評定。
將準備好的胚芽樣品或者胚芽以外的樣品裝到載片上，在超過載片處照射，然后用35萬像素單色CCD照相機對樣品的影子進行了拍攝。
圖5和圖6中顯示了拍攝圖片的例子。
拍攝的圖片使用National Instruments公司制作的軟件LabVIEW版本6.0和IMAQ Vision版本6.0.1，來進行圖片處理。首先進行2進位制處理和去除噪音后，通過探測解析處理演算出了圓度以及伸長度。
越是接近圓的形狀圓度就越接近1。越是細長形狀伸長度值就越大。
關于胚芽和胚芽以外的所有樣品所求得的圓度和伸長度的結果如圖8所示。胚芽之間由于形狀相似，所以圓度、伸長度都集中在某一范圍內。而胚芽以外的樣品粉碎時形成了不規(guī)則的形狀，所以圓度、伸長度都不均衡。利用這個差異，胚芽的分選變得可能。例如，圓度和伸長度如圖8所示3條境界線所圍成的范圍內，胚芽是106樣品，胚芽以外的只有3樣品。也就是說圖片處理前的在粗胚芽碎片中占60％的胚芽純度經過圖片處理分選后可以提高到大約97％。
如果想進一步提高胚芽的純度，只要使境界線圍成的范圍變窄小就行，想降低胚芽的純度提高回收率時，只要使境界線圍成的范圍變寬大就行。
實施例5 通過目視來進行胚芽的分選從實施例1所得粗胚芽碎片中通過目視進行了判別，使用竹簽分選了小麥胚芽。60分鐘獲得小麥胚芽1g。
實施例6 小麥胚芽提取物含有液的調制將實施例3中所得小麥胚芽碎片懸濁于4℃的蒸餾水中，使用超聲波洗凈器洗到洗凈液變白濁為止。然后懸濁于Nonidet P4的容量比為0.5％的溶液中，使用超聲波洗凈器洗到洗凈液變白濁為止，取得了小麥胚芽。
小麥胚芽提取物含有液的調制，以通常的方法(Erickson，A.H.etal.(1996)Meth.in Enzymol.，96，38-50)為準。以下的操作在4攝氏度進行。首先，將液體氮中凍結的小麥胚芽在乳缽中微粉碎。在所得每1g的粉碎體中加入1ml的把Patterson等人的方法部分改變的提取溶劑(HEPES-KOH(PH7.6)80毫克分子/升、醋酸鉀200毫克分子/升、醋酸鎂2毫克分子/升、氫化鈣4毫克分子/升、L型氨基酸20種各0.6毫克分子/升、以及硫磺內脂8毫克分子/升)中，邊注意不要起泡邊攪拌。通過15分鐘的離心所得30000g上清作為胚芽提取液回收，預先在溶液中((HEPES-KOH(PH7.6)40毫克分子/升、醋酸鉀100毫克分子/升、醋酸鎂5毫克分子/升、L型氨基酸20種各0.3毫克分子/升、以及硫磺內脂4毫克分子/升)平衡后在交聯(lián)匍聚糖柱中進行了凝膠過濾。樣品濃度調制到了，260nm的光學密度(O.D)為170～250(A260/A280＝1.5)。
實施例7 通過透析法進行連續(xù)式小麥胚芽無細胞蛋白質合成連續(xù)式小麥胚芽無細胞蛋白質合成是以Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech，25，221-230中記載的方法為準進行的。
將實施例6中所得小麥胚芽提取物含有液放入DISPODIARAIZA(Spectra/PorRCE，MWCO25k，volume0.5ml)中，用反應液10倍容量的透析外液(HEPES-KOH(PH7.6)20毫克分子/升、醋酸鉀95毫克分子/升、醋酸鎂2.65毫克分子/升、硫磺內脂4毫克分子/升、ATP1.2毫克分子/升，GTP0.25毫克分子/升，肌酸磷酸16毫克分子/升，L型氨基酸20種各0.3毫克分子/升、以及0.005％氮化鈉1毫克分子/升)來透析的方法，反應是在20℃條件下進行的。
在以上方法所得條件下，試著進行Green fluorescent Protein(GFP)的合成，觀察到490nm勵起波長的510nm的熒光，確認了GTP正在合成。
產業(yè)上的利用可能性根據本發(fā)明的方法，可以有效大量地進行胚芽分選，利用這些胚芽碎片還可以有效制造高品質的胚芽提取物。本發(fā)明的方法，蛋白質在無細胞類中的調制，例如，對遺傳因子機能解析方面的蛋白質的發(fā)現以及進化分子工學領域中調制新酶和抗體等所用的無細胞蛋白質合成用胚芽提取物的制造非常有用。
本申請是基于2001年5月18日的日本專利申請(專利申請?zhí)?001-149274、2001-149275)和2002年2月20日的日本專利申請(專利申請?zhí)?002-043704)，其內容在這里拿過來作為參考。
權利要求
1.一種無細胞蛋白質合成用胚芽的分選方法，其特征在于，從對植物種子施加機械力得到的胚芽和胚乳破碎物的混合物中，根據胚芽的光學信息來進行胚芽分選。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述光學信息即色彩信息。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述根據光學信息進行的胚芽分選是通過色彩分選機進行的。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述色彩分選機至少有以下功能的裝置，即對粗胚芽碎片進行光照射、檢驗出粗胚芽碎片的反射光或者透過光、檢驗值與基準值相比較、以此來分選去除基準內的或者偏離基準的。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述光學信息即圖片信息。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述根據光學信息進行的胚芽分選，是通過圖片分選機進行的。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述圖片分選機至少是具有以下功能的裝置，即取得植物種子破碎物片的圖像數據、通過所得數據來辨別植物種子破碎物片的形狀、根據所得形狀的不同來分選去除基準內的或者偏離基準的。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述形狀的不同是指植物種子破碎物片的面積、外周長、圓度、伸長度等方面的不同。
9.一種無細胞蛋白質合成用胚芽提取物的制造方法，該方法包括植物種子的粉碎、植物胚芽的分選、洗凈、微粉碎、以及提取工序，其特征是所述植物胚芽的分選是根據胚芽的光學信息來進行的。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述光學信息即色彩信息。
11.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述根據光學信息進行的胚芽分選通過色彩分選機進行的。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述色彩分選機至少是有以下功能的裝置，即對粗胚芽碎片進行光照射、檢驗出粗胚芽碎片的反射光或者透過光、檢驗值與基準值相比較、以此來分選去除基準內的或者偏離基準的。
13.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述光學信息即圖片信息。
14.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述根據光學信息進行的胚芽分選通過圖片分選機進行的。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述圖片分選機至少是具有以下功能的裝置，即取得植物種子破碎物片的圖像數據、通過所得數據來辨別植物種子破碎物片的形狀、根據所得形狀的不同來分選去除基準內的或者偏離基準的。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述形狀的不同是指植物種子破碎物片的面積、外周長、圓度、伸長度等方面的不同。
17.如權利要求1～16任意一項所述的方法，其特征在于，所述植物種子是指小麥、大麥或者水稻的種子。
18.如權利要求9～16中的任何一項的方法所制造出的無細胞蛋白質合成用胚芽提取物。
全文摘要
本發(fā)明提供有效制造高效率無細胞蛋白質合成用胚芽提取物胚芽分選方法和無細胞蛋白質合成用胚芽提取物的制造方法。本發(fā)明的要旨在于無細胞蛋白質合成用胚芽的分選方法和胚芽提取物的制造方法。其分選方法的特征是從通過對植物種子施加機械力得到的胚芽和胚乳破碎物的混合物中，根據胚芽的光學信息比如色彩信息或者圖片信息來進行胚芽分選。其胚芽提取物制造方法的特征是將按以上分選方法所分選的胚芽洗凈、微粉碎后進行提取。
文檔編號C12P21/02GK1511254SQ0280970
公開日2004年7月7日 申請日期2002年5月16日 優(yōu)先權日2001年5月18日
發(fā)明者遠藤彌重太, 巖橋茂雄, 野村一雄, 雄 申請人:遠藤彌重太