專利名稱：通過乳酸菌和雙歧桿菌結(jié)合內(nèi)毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用具有疏水性質(zhì)的乳酸菌和/或雙歧桿菌制備一種用于預(yù)防或治療因內(nèi)毒素引起的和/或與內(nèi)毒素有關(guān)的病癥的食物組合物。本發(fā)明還涉及用具有疏水性質(zhì)的乳酸菌和/或雙歧桿菌制備的組合物。
背景技術(shù)：
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)敗血癥的毒素與病原菌、病毒、植物和毒液有關(guān)。記載較完備的細菌毒素是革蘭氏陰性細菌的內(nèi)毒素或脂多糖(LPS)。這些分子是所有革蘭氏陰性細菌外膜中普遍存在的糖脂，被認為與革蘭氏陰性敗血癥有關(guān)。這類敗血癥是極其常見的病癥，并且是經(jīng)常致命的。
已經(jīng)進行過許多治療敗血癥的嘗試。這些包括使用LPS的抗體、使用腫瘤壞死因子的抗體、使用可溶解的腫瘤壞死因子(TNF)受體、使用可溶解的白細胞間介素-1(IL-1)受體，僅舉幾個例子。雖然每種方法達到一些效果，但總的說來結(jié)果令人失望。
其它人曾嘗試設(shè)計和研究結(jié)合LPS/內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的工作，并且將這些嘗試的說明性報告發(fā)表在Rustic，A.等，Science(1993)259361-364；Matsuzaki，K.等，Biochemistry(1993)3211704-11710；Hoess，A.等，EMBO J(1993)123351-3356；以及Elsbach，P.等，Current Opinion in Immunology(1993)5103-107。事實上，一旦LPS進入血液，可結(jié)合在稱為脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)的一種蛋白質(zhì)上。抑制LBP，如用抗LBP抗體，已被建議作為治療內(nèi)毒素引起的敗血癥的療法(國際專利申請?zhí)朠CT/US90/04250，申請日1990年6月30日)。同時，幾個實驗室的工作表明血漿脂蛋白，特別是高密度脂蛋白(HDL)可結(jié)合并中和LPS(Skarnes等，1968，J.Bacteriology 952031；Flegel等，1993，Infect.Immunol.61(12)5140)，而且還表明這些粒子可在血漿中產(chǎn)生LPS中和活性。
以前對于因內(nèi)毒素引起和/或有關(guān)的疾病的治療是追補性的(即在出現(xiàn)臨床病癥之后的治療)，并限于化學(xué)治療法介入。這些治療方法不能達到預(yù)防的目的。
因此，為了預(yù)防或減輕敗血癥和膿毒性休克的癥狀，需要一種有效的藥物中和革蘭氏陰性內(nèi)毒素(即LPS)。
本發(fā)明的疏水性的乳酸菌和雙歧桿菌提供了能夠結(jié)合內(nèi)毒素并改善/預(yù)防其作用的補充化合物。
發(fā)明概要因此，本發(fā)明涉及用具有疏水表面性質(zhì)的乳酸菌和/或雙歧桿菌中的至少一種菌株制備預(yù)防或治療內(nèi)毒素引起和/或有關(guān)病癥的組合物。
事實上，已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)一些特別是具有疏水表面的乳酸菌和雙歧桿菌能夠結(jié)合內(nèi)毒素。因此，它們可作為有效的制劑，預(yù)防內(nèi)毒素性休克和消化道起源的敗血癥、細菌移位、壞死性小腸結(jié)腸炎、炎癥性腸病、腸內(nèi)的感染、慢性內(nèi)毒素血癥有關(guān)的或促進分解代謝的和全身的炎癥。
優(yōu)選的，疏水性的乳酸菌或雙歧桿菌的疏水性百分比(％H)至少為80，更優(yōu)選為85-100％H。
在優(yōu)選的實施方案中，菌株選自約氏乳桿菌、路氏乳桿菌、類于酪乳桿菌、動物乳桿菌、瘤胃乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種、雙歧桿菌屬、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、假長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌。
在另一個方面，發(fā)明涉及分離出的一種具有疏水表面性質(zhì)的乳酸菌或雙歧桿菌菌株，這種菌株因其具有與內(nèi)毒素結(jié)合或與革蘭氏陰性細菌共聚集的能力而被選擇。
又一方面，本發(fā)明為人類或?qū)櫸锾峁┝祟A(yù)防或治療因內(nèi)毒素引起和/或有關(guān)的疾病的食物組合物，該組合物含有至少一種具有上述特性的乳酸菌和/或雙歧桿菌菌株以及可吸收藥物載體或基質(zhì)。
這些組合物能減少小腸細菌滋生并減少內(nèi)毒素從消化道滲漏到體內(nèi)環(huán)境，這是寵物發(fā)的常見病，可能引起例如腹瀉的發(fā)作、營養(yǎng)不良以及腸內(nèi)的和全身的炎癥。
最后一方面，本發(fā)明涉及了預(yù)防或治療內(nèi)毒素引起和/或有關(guān)病癥的方法，包括讓人或動物攝食一種組合物的步驟，該組合物含有至少一種具有疏水表面性質(zhì)的乳酸菌和/或雙歧桿菌以及可吸收載體或藥用基質(zhì)。
發(fā)明詳述在下面的描述中，″NCC″指Nestlé菌種保藏(Nestlé研究中心，Vers-chez-les-Blanc，瑞士洛桑市)。
關(guān)于本發(fā)明第一個目的，是關(guān)于用至少一種具有疏水表面性質(zhì)的乳酸菌和/或雙歧桿菌制備預(yù)防或治療內(nèi)毒素引起和/或有關(guān)病癥的組合物。
事實上，已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌和雙歧桿菌，特別是具有疏水表面的乳酸菌和雙歧桿菌能夠結(jié)合內(nèi)毒素。
的確，根據(jù)本發(fā)明的菌株能夠?qū)?nèi)毒素結(jié)合在其疏水性的細胞壁上，因此清除了這些革蘭氏陰性菌的前炎癥產(chǎn)物，否則其可從腸道進入血液內(nèi)，從而引起炎癥反應(yīng)，嚴重時，引起內(nèi)毒素性休克。
根據(jù)本發(fā)明的乳酸菌或雙歧桿菌選自適于動物消耗的菌株，它們的疏水性百分比(％H)參見A.G.Zavaglia等，Journal of Foodprotection，61卷，第7期，1998，865-873頁。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的菌株的％H至少是80，更優(yōu)選的是85-100％H。
使用前述MATH方法(Pérez，P.F.等，1998，Appl.Environ.Microbiol.6421-26)確定表面疏水性。簡言之，用0.4ml二甲苯經(jīng)渦流混合120秒抽提2毫升細菌懸液(約108CFU/ml，PBS)。用傾析法分相，測定水相的A600。用下式計算細胞表面疏水性(％H)H％＝[(A0-A)/A0]×100，其中A0和A分別是用二甲苯提取前后的吸光度。
在優(yōu)選的實施方案中，菌株可選自約氏乳桿菌、路氏乳桿菌、類于酪乳桿菌、動物乳桿菌、瘤胃乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種、雙歧桿菌屬、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、假長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌。
在最優(yōu)選的實施方案中，菌株可以是例如嗜酸乳桿菌NCC 2463(CNCM-I 2623)、雙歧雙歧桿菌NCC 189(原名CIDCA 536，CNCM-I-2333)、雙歧雙歧桿菌NCC 235(原名CIDCA 533，CNCM-I-2335)、青春雙歧桿菌NCC 251(CNCM I-2168)、乳雙歧桿菌(ATCC27536)。
在根據(jù)本發(fā)明選擇的多種菌株中，以下菌株按照布達佩斯條約分別被保藏在國立微生物保藏中心(CNCM)，Institut Pasteur，28ruedu Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，F(xiàn)rance，嗜酸乳桿菌NCC2463，保藏日2001.2.02，保藏號CNCM I-2623、雙歧雙歧桿菌NCC189和NCC 235，保藏日1999.10.12，保藏號CNCM-I-2333和CNCMI-2335。青春雙歧桿菌NCC 251，保藏日1999.03.15，保藏號CNCMI-2168。
乳雙歧桿菌菌株(Bb12)(ATCC27536)，由Hansen提供(Chr.Hansen A/S，10-12Boege Alle，P.O.Box 407，DK-2970 Hoersholm，Danemark)。其疏水性為89％H。
根據(jù)本發(fā)明的菌株可以用于制備改善人類或動物健康情況的組合物，特別是預(yù)防或治療人類和寵物中與內(nèi)毒素有關(guān)系的病癥。該菌株可以用作有效的制劑，預(yù)防內(nèi)毒素性休克和消化道起源的敗血癥、細菌移位、壞死性小腸結(jié)腸炎、炎癥性腸病、腸內(nèi)感染，以及慢性內(nèi)毒素血癥有關(guān)的或促進分解代謝的和全身的炎癥。
根據(jù)本發(fā)明的菌株可以按其活的形式或無活性形式使用。
在優(yōu)選的實施方案中，乳酸菌株在其發(fā)酵生長培養(yǎng)基中使用。所述培養(yǎng)基可以例如單獨消毒或與食物一起消毒、擠出或噴霧干燥、冷卻或者存放。
菌株的使用量可以是每人每日相當于大約103-1014cfu(菌落形成單位)。此量取決于個體重量，對于人類來說優(yōu)選大約為109-1012cfu/日，對于寵物為107-1010cfu/日。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種分離出的具有疏水表面性質(zhì)并能夠結(jié)合內(nèi)毒素或與革蘭氏陰性細菌共聚集的乳酸菌或雙歧桿菌菌株。
本發(fā)明菌株結(jié)合內(nèi)毒素的能力可以使用FITC-標記的內(nèi)毒素容易地測定出，測量放射性同位素標記的內(nèi)毒素與細菌細胞的結(jié)合，在這種情況下內(nèi)毒素的分子結(jié)構(gòu)是不變的，而與FITC綴合后分子可能會改變(見實施例)。
優(yōu)選測量菌株將內(nèi)毒素從溶液中除去的能力，該溶液中的內(nèi)毒素含量是模仿人類腸中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)毒素量。用微量分析法檢查內(nèi)毒素水平，如檢測革蘭氏陰性細菌的脂多糖中的2-酮-3-脫氧辛酸酯(2-keto-3-deoxyoctonate)基團(Karkhanis Y D，等，AnalyticalChemistry(1978)85595-601)。優(yōu)選選用可由此溶液中除去30％以上內(nèi)毒素含量的細菌。在此分析中，被檢測為非疏水性的細菌不會改變內(nèi)毒素的初始含量(見實施例)。
這類菌株可以用作如上所述的用途，特別是作為有效的制劑，預(yù)防例如內(nèi)毒素性休克和消化道起源的敗血癥、細菌性移位、壞死性小腸結(jié)腸炎、炎癥性腸病、腸內(nèi)感染，以及慢性內(nèi)毒素血癥有關(guān)的或促進分解代謝的和全身的炎癥。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種人類或?qū)櫸锸澄锝M合物，其含有至少一種分離出的具有上述特性的菌株的乳酸菌和/或雙歧桿菌以及可吸收的載體或藥物基質(zhì)。
所述菌株可以按如上所述進行選擇。
優(yōu)選該乳酸菌或雙歧桿菌可以作為日常飲食的補充而服用，或作為人類或?qū)櫸餇I養(yǎng)完全的食物的成分而服用。
如上所述人類或?qū)櫸锸澄锝M合物可以至少包含如上所述的乳酸菌和/或雙歧桿菌菌株，使菌株的使用量是每人每日相當于大約103-1014cfu。此量取決于個體重量，對于人類來說優(yōu)選大約為109-1012cfu/日，對于寵物為107-1010cfu/日。
人類食物的形式可以例如是營養(yǎng)制劑、嬰兒制劑、以奶為基礎(chǔ)的產(chǎn)品、乳制品、以谷類為基礎(chǔ)的產(chǎn)品等形式。為了制備這種食品產(chǎn)品或組合物，如上所述菌株可以在制造時引入在食物，比如谷類粉末、奶粉、酸乳酪之中。
在一個實施方案中，可以制備包括蛋白質(zhì)來源和至少一種根據(jù)本發(fā)明的菌株的營養(yǎng)制劑。膳食蛋白質(zhì)優(yōu)選用作蛋白質(zhì)的來源。膳食蛋白質(zhì)可以是任何適當?shù)纳攀车鞍踪|(zhì)；例如動物性蛋白質(zhì)(比如牛乳蛋白質(zhì)、肉蛋白質(zhì)和卵蛋白質(zhì))、植物蛋白質(zhì)(比如大豆、小麥、大米或豌豆蛋白質(zhì))、游離氨基酸混合物或以上膳食蛋白質(zhì)的組合。牛乳蛋白質(zhì)比如酪蛋白、乳清蛋白和大豆蛋白質(zhì)是特別優(yōu)選的。組合物還可含有碳水化合物來源和脂肪源。
如果營養(yǎng)制劑包括脂肪源，該脂肪源優(yōu)選提供大約營養(yǎng)制劑中大約5％-55％的能量；例如大約20％-50％的能量。組成脂肪源的脂類可以是任何適當?shù)闹净蛑净旌衔?。植物脂肪是特別適合的；例如大豆油、棕櫚油、椰子油、紅花油、向日葵油、玉米油、菜籽油、卵磷脂等。如需要，也可加入動物脂肪，如奶油。
如果營養(yǎng)制劑包括碳水化合物源，該碳水化合物源優(yōu)選提供大約營養(yǎng)制劑中40％-80％的能量?？梢允褂萌魏芜m當?shù)奶妓衔铮缯崽?、乳糖、葡萄糖、果糖、淀粉糖漿干粉，及麥芽糖糊精和上述碳水化合物的混合物。
如需要，也可以加入膳食纖維素。許多類型的膳食纖維素是可用的。其它的適當膳食纖維素源可以包括大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜耳豆膠和阿拉伯樹膠。如果使用膳食纖維素，優(yōu)選包括相當于營養(yǎng)制劑中最多至大約5％的能量。適當?shù)木S生素和礦物質(zhì)可以以通常的方式包括在此營養(yǎng)制劑中以符合相應(yīng)的指標。如需要，一種或多種食物級乳化劑可以加入此營養(yǎng)制劑；例如二乙酰酒石酸的單和二甘油酯、卵磷脂及單和二甘油酯。同樣地，可以包括適當?shù)柠}和穩(wěn)定劑。
營養(yǎng)制劑優(yōu)選經(jīng)腸道服用；例如以粉末、液態(tài)濃縮液或即飲的飲料形式。
營養(yǎng)制劑可以用任何適當?shù)姆绞街苽?。例如，營養(yǎng)制劑可以將膳食蛋白質(zhì)源、碳水化合物源和脂肪源以適當?shù)谋壤旌显谝黄鸲苽?。如果使用乳化劑，可以在混合時加入。維生素和礦物質(zhì)可以在混合時加入，但是通常后加入，避免熱降解。任何親脂性的維生素、乳化劑等等可以在混合之前溶解到脂肪源中。然后將水，優(yōu)選是經(jīng)反向滲透的水混合，形成液體混合物。水的溫度通常是大約50℃-80℃，以有助于組分的分散。市場上可買到的液化劑可用于形成液體混合物。例如用兩個步驟配制時，將液體混合物均勻化。
然后，液體混合物可以進行熱處理，以減少細菌存在。如液體混合物可以被迅速加熱到大約80℃-150℃的溫度范圍并維持大約5秒-5分鐘。這可以用注入蒸汽、高壓釜或熱交換器，例如用平板式熱交換器進行。然后將液體混合物冷卻至大約60℃-大約85℃，如通過瞬間冷卻。然后可將液體混合物再均勻化；例如在兩段法中，第一階段的壓力大約在7MPa-40MPa，第二階段大約在2MPa-14MPa。如果要加入任何熱敏感的成分，如維生素和礦物質(zhì)，均勻化的混合物可以進一步冷卻。均勻化混合物的pH和固體含量通常是標準化的。
如果欲生產(chǎn)粉末狀的營養(yǎng)制劑，將均勻的混合物轉(zhuǎn)入到適當?shù)母稍镌O(shè)備，比如噴霧干燥器或冷凍干燥機中，制成粉末。粉末的含濕量應(yīng)小于大約5％(按重量計算)。
如果欲生產(chǎn)液體制劑，均勻化的混合物優(yōu)選無菌充入適當?shù)娜萜髦?。無菌灌裝入容器可以通過以下方法進行預(yù)熱均勻化的混合物(例如大約75-85℃)，然后將蒸汽注入均勻化的混合物，以提高溫度至大約140-160℃，例如在大約150℃。然后將均勻化的混合物冷卻，如通過瞬間冷卻至溫度大約75-85℃。然后可將均勻化的混合物均勻化。進一步冷卻至大約室溫并充入容器中。進行此種性質(zhì)的無菌灌裝的適當裝置是市場上可買到的。液體制劑可以是即可服用的制劑形式，具有大約10-14％(按重量計算)固體含量或可以是濃縮液的形式；通常的固體含量大約在20-26％(按重量計)?？稍谝后w制劑中加入香料，以便配制成為方便、香濃、即飲的飲料。
在另一個實施方案中，通常的食品可以富含本發(fā)明所述的菌株。例如發(fā)酵牛奶、酸奶、鮮乳酪、凝乳、糕餅條、早餐谷類薄餅或條、飲料、奶粉、大豆制品、非奶發(fā)酵產(chǎn)品或用于臨床營養(yǎng)的營養(yǎng)增補劑。
在另一實施方案中，可以制備全營養(yǎng)寵物食物組合物。該組合物可以是粉末狀、干的形式、半潮濕的或濕的、冷卻的或儲藏穩(wěn)定的寵物食物產(chǎn)品。它還可以是用于寵物的營養(yǎng)增補劑或藥物組合物。這些寵物食物可以按常規(guī)方法生產(chǎn)。除該菌株外，這些寵物食物可以包括任何一種或多種淀粉源、蛋白質(zhì)源和脂肪源。
適當?shù)牡矸墼词枪阮愇锖投诡?，比如玉米、大米、小麥、大麥、燕麥、大豆和它們的混合物。適當?shù)牡鞍踪|(zhì)源可以選自任何適當?shù)膭游锘蛑参锏鞍自?，例如肉類和肉粉、家禽粉、魚粉、大豆蛋白質(zhì)濃縮物、牛乳蛋白質(zhì)、面筋等。對于年長的動物，更優(yōu)選的是包含高質(zhì)量蛋白質(zhì)的蛋白源。適當?shù)闹驹窗ㄈ忸悺游镏竞椭参镏?。另外，還可有各種其它組分，例如糖、鹽、香料、調(diào)味品、維生素、礦物質(zhì)、調(diào)味劑、脂肪等等都可按需要加入寵物食物。
制備干的寵物食物適當?shù)姆椒ㄊ菙D出烹制，雖然可以使用烘焙及其他適當?shù)姆椒?。當進行擠出烹制時，通常得到碎塊形式的干的寵物食物。如果使用前生物(prebiotic)，可在加工之前將該前生物與干的寵物食物的其他組分混合。適合的方法參見歐洲專利申請0850569的描述，該專利申請的公開引入作為參考。如果使用前微生物，最好將該有機體覆蓋在干寵物食物上，或充入干寵物食物中。適合的方法參見歐洲專利申請No 0862863的描述，該專利申請的公開引入作為參考。
對于濕的食物，美國專利4,781,939和5,132,137所述的方法可用于生產(chǎn)人造肉制品。這些專利的公開在此引入作為參考。對于生產(chǎn)塊型產(chǎn)品的其它加工方法也可以使用，例如在蒸汽灶上烹制?；蛘?，塊型產(chǎn)品可以用下法生產(chǎn)，將適當?shù)娜忸愒先榛陨a(chǎn)肉糜，在裝入罐或其它容器之前加適當?shù)哪z凝劑，并且加熱肉糜。
前生物在寵物食物中的量優(yōu)選大約是20％(按重量計算)；尤其大約10％(按重量計算)。例如，寵物食物可以包含大約0.1％-5％(按重量計算)的前生物。對于寵物食物，用菊苣作為前生物時，飼料混合物中可以包含大約0.5％-10％(按重量計算)的菊苣；更優(yōu)選大約含1％-5％(按重量計算)。
如果使用前微生物，每克寵物食物中優(yōu)選含有大約104-1010前微生物細胞；更優(yōu)選每克寵物食物含有大約106-108前微生物細胞。寵物食物可以含有大約0.5％-20％(按重量計算)前微生物的混合物；優(yōu)選大約1％-6％(按重量計算)，例如大約3％-6％(按重量計算)。
該寵物食物可以含有其它活性劑，如長鏈脂肪酸。適當?shù)拈L鏈脂肪酸包括α-亞油酸、γ亞油酸、亞油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。魚油是適當?shù)亩嘉逑┧嵩春投剂┧嵩?。琉璃苣籽油、blackcurrent籽油和月見草油是適當?shù)摩脕営退嵩?。紅花油、向日葵油、玉米油和大豆油是適當?shù)膩営退嵩?。必要時，在寵物食物中補充礦物質(zhì)和維生素以使營養(yǎng)完全。
此外，如需要，可將菌株用膠囊包裹；例如置于糖基質(zhì)、脂肪基質(zhì)或多糖基質(zhì)中。
寵物消耗該寵物食物以獲得有益的效果的消耗量取決于寵物的大小或?qū)櫸锏念愋图澳挲g。然而能提供每日量大約為至少一種乳酸菌或雙歧桿菌菌株的103-1014cfu(菌落形成單位)的寵物食物的通常是合適的。優(yōu)選對于狗，大約服用109-1010cfu/日，貓107-1010cfu/日。
根據(jù)本發(fā)明的組合物特別適于預(yù)防或治療與革蘭氏陰性細菌、產(chǎn)生內(nèi)毒素的細菌如螺桿菌屬、沙門氏菌屬有關(guān)的感染，以及與小腸細菌滋生(SIBO)有關(guān)的感染，所有這些感染臨床上表現(xiàn)為腹瀉、腸道或全身發(fā)炎的病癥，或異化作用和營養(yǎng)不良。
根據(jù)最后方面，發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療內(nèi)毒素引起和/或有關(guān)病癥的方法，該方法包括的步驟是讓人或動物攝食含有至少一種具有疏水表面性質(zhì)的乳酸菌和/或雙歧桿菌菌株以及有關(guān)的可吸收的載體或藥用基質(zhì)的組合物。
此方法特別適于預(yù)防或治療與革蘭氏陰性細菌、產(chǎn)生內(nèi)毒素的細菌，如螺桿菌屬、沙門氏菌屬有關(guān)的感染，以及與小腸細菌滋生(SIBO)有關(guān)的感染，所有這些感染臨床上表現(xiàn)為腹瀉、腸道或全身發(fā)炎的病癥，或異化作用和營養(yǎng)不良。
以下給出的實施例僅為了說明，而決不應(yīng)理解為對本申請發(fā)明的限制。除非另有說明，所有給出的百分比均為重量百分比。實施例前有以下附圖的簡述。
附1雙歧雙歧桿菌菌株NCC 189(原名CIDCA 536，CNCM I-2333)直方圖，顯示結(jié)合了FITC-LPS。A無FITC-LPS的對照。B用50微升/mlFITC-LPS培養(yǎng)。至少分析16000次結(jié)果。
圖2白蛋白對乳酸菌和雙歧桿菌結(jié)合FITC-LPS的影響。A雙歧雙歧桿菌菌株NCC 200(原名CIDCA 538，CNCM I-2334)。B嗜酸乳桿菌菌株NCC 2463(CNCM I-2623)。C雙歧雙歧桿菌菌株NCC 189(原名CIDCA 536，CNCM I-2333)。
圖3雙歧雙歧桿菌菌株NCC 189(原名CIDCA 536，CNCM I-2333)生長和FITC-LPS結(jié)合動力學(xué)。數(shù)值來自兩次獨立實驗的平均數(shù)。
圖4LPS被雙歧桿菌菌株結(jié)合，用微量分析法確定脂多糖中的2-酮-3-辛酸酯基團(KDO)。溶液的初濃度是100μg/ml。矩形顯示溶液用疏水性的雙歧桿菌菌株NCC 189和NCC 251(CNCM I-2168)培養(yǎng)后與用非疏水性的雙歧桿菌菌株(NCC 200(CNCM I-2334))培養(yǎng)后的終濃度比較。
圖5用疏水性的細菌預(yù)培養(yǎng)的LPS溶液在HT-29人上皮細胞上的前炎活性(IL-8(ng/mL))。
檢測對照樣品DMEM、人乳(HM)2％、單獨的LPS(2.5μg/ml)、單獨的雙歧雙歧桿菌屬菌株NCC 189(1.5e8cfu/ml)的基礎(chǔ)刺激活性。LPS+人乳(sCD14的來源)的試液與用雙歧雙歧桿菌菌株NCC189(1.5e8cfu/ml)預(yù)培養(yǎng)的含2.5μg/ml LPS+2％人乳的溶液比較。
實施例實施例1選擇本發(fā)明的疏水性的乳酸菌菌株疏水性的細菌基于細菌細胞在有機(疏水性的)相和水相的分配百分比進行最初的選擇。利用以前所述的MATH方法確定表面疏水性(Pérez，P.F.等，1998，Appl.Environ.Microbiol.6421-26)。簡言之，2ml細菌懸液(約108CFU/ml，PBS)用0.4毫升的二甲苯進行渦流混合抽提120秒。用傾析法分離不同的相并測量水相A600。用下式計算細胞表面疏水性(％H)H％＝[(A0-A)/A0]×100，其中A0和A是分別用二甲苯提取前后的吸光度。
隨后根據(jù)細菌將內(nèi)毒素從模仿人腸道內(nèi)毒素含量的溶液中除去的能力，選擇乳酸菌或雙歧桿菌。用微量分析法檢測革蘭氏陰性細菌的脂多糖中的2-酮-3-辛酸酯基團，以測定內(nèi)毒素水平。(Karkhanis Y D，等，Analytical Chemistry(1978)85595-601)。
選擇由此溶液中除去30％以上內(nèi)毒素的細菌。在此分析中測定為非疏水性的細菌不能改變內(nèi)毒素的初始含量。
實施例2乳酸菌作為內(nèi)毒素清除劑的體外效果選擇80％H以上細菌和一些非疏水性的″陰性″對照，對來自大腸桿菌的LPS和不同的表面性質(zhì)的乳酸菌之間相互作用進行了研究，用流式細胞術(shù)完成與熒光標記的內(nèi)毒素相互作用的測定。
材料和方法菌株和生長條件嗜酸乳桿菌菌株NCC 2463(CNCM I-2623)來自Nesteccollection(Lausanne，Switzerland)。雙歧雙歧桿菌NCC 189(原名CIDCA 536，I-2333)和雙歧雙歧桿菌NCC 200(原名CIDCA 538，(CNCMI-2334))菌株來自collection of the Centro de Investigacion yDesarrollo en Criotecnologia de Alimentos(La plata，Argentina)。用10％(體積/體積)甘油保存的冷凍懸浮液(-80℃)在實驗之前在MRS肉湯中再活化一次。所有培養(yǎng)在37℃厭氧狀態(tài)下進行(BBL GasPak Plus)。
FITC-LPS結(jié)合脂多糖和FITC-標記的脂多糖來自Escherichia coli血清型0111B4(Skelly，R.R等，1979，Infect.Immun.23287293)購自Sigma。合1000μl/ml的儲備液用蒸餾水制備并進行適當稀釋。
細菌培養(yǎng)物用PBS洗3次，將懸浮液標定為107CFU/ml。取400μl與不同的量的FITC-LPS或LPS混合，獲得從0到50μg/ml濃度范圍的反應(yīng)混合物。在4℃或37℃下在溫育30分鐘，然后用PBS洗細胞2次，并用1％(體積/體積)多聚甲醛在4℃下固定30分鐘。使用藍綠激發(fā)光(FACScanTM)進行流式細胞分析。
表面疏水性用前述MATH方法(Pérez，P.F.等，1998，Appl.Environ.Microbiol.6421-26)確定表面疏水性。簡言之，用0.4ml二甲苯經(jīng)渦流混合抽提2毫升細菌懸液(約108CFU/ml，PBS)。用傾析方法分離不同的相并測量水相的A600。用下式計算細胞表面疏水性(％H)H％＝[(A0-A)/A0]×100，其中A0和A分別是用二甲苯提取前后的吸光度。
結(jié)果所研究的菌株表面疏水性結(jié)果見表1。嗜酸乳桿菌NCC 2463(CNCMI-2623)和雙歧雙歧桿菌NCC 189(CNCM I-2333)菌株表面疏水性值分別是93和96％，而嬰兒雙歧桿菌NCC200菌株(CNCM I-2334)不是疏水性的，顯示值約為3％。
表1所研究的菌株疏水性，表中數(shù)值是至少3次測定的平均值。
用50μg/ml FITC標記的LPS培養(yǎng)的菌株NCC 189細菌群落顯然進入熒光區(qū)之內(nèi)。位于圖右側(cè)(標記M1)的結(jié)果代表90％的控制的菌群(

圖1b)。對于未用FITC-LPS培養(yǎng)的懸浮液，僅有2％不同結(jié)合能力的結(jié)果。
表2(下)顯示FITC-LPS結(jié)合是劑量依賴性的。NCC200菌株發(fā)現(xiàn)有5％-15％的FITC(+)細胞。另一方面，菌株NCC 189顯示出約95％的FITC(+)細胞。約在10μg/ml FITC LPS時出現(xiàn)飽和。加入白蛋白，一種脂肪結(jié)合物，明顯減少在所有研究的菌株中FITC(+)的比率(圖2)。而在有0.4％白蛋白和50μg/ml的FITC-LPS存在時，菌株CIDCA 536顯示出約30％的FITC(+)細胞(圖2C)。此外對于此菌株，用濃度高達3％白蛋白時，發(fā)現(xiàn)有10％的FITC(+)細胞。二價陽離子(Ca2+0.9mM和Mg2+0.5mM)不改變結(jié)合能力(數(shù)據(jù)未顯示)。
表2在不同的濃度FITC-LPS時FITC(+)細菌百分比。
至少分析30000個實例。
FITC-LPS對于雙歧雙歧桿菌NCC 189菌株(原名為CIDCA 536，CNCM I-2333)的結(jié)合強烈依賴于生長期(圖3)。在穩(wěn)定期收獲的細菌顯示出高比率的FITC(+)細胞。這些數(shù)值在延滯期顯著地下降，在生長期逐步的恢復(fù)。在4℃-37℃之間，該結(jié)合發(fā)現(xiàn)無差異。
總之，對于菌株NCC 189這樣的高度疏水性的菌株顯示出達到約95％的FITC(+)細胞。非疏水性的菌株NCC 200從未達高于5％的值。這些結(jié)果表明LPS的結(jié)合與表面疏水性關(guān)聯(lián)。
這些結(jié)果清楚地表明了疏水性的細菌結(jié)合FITC-標記的內(nèi)毒素，從而變?yōu)橛袩晒獾?。用流式細胞術(shù)進行檢測時，內(nèi)毒素濃度為10μg/ml時，超過90％的疏水性的細胞培養(yǎng)物變?yōu)橛袩晒獾?；相反，在類似的?nèi)毒素濃度下，非疏水性的細菌細胞中，小于10％的細胞變?yōu)殛栃浴?br> 當疏水性的培養(yǎng)物被放入含濃度范圍在30和90μg/ml之間內(nèi)毒素的培養(yǎng)基中時，濃度在107-108細菌/ml的細菌培養(yǎng)物，至少消除20％的內(nèi)毒素。使用放射性同位素標記的內(nèi)毒素證實了這些數(shù)據(jù)。
實施例3對人免疫活性細胞的實驗對消除在疏水菌株培養(yǎng)系統(tǒng)存在下內(nèi)毒素誘導(dǎo)的人免疫活性細胞的前炎癥反應(yīng)，就培養(yǎng)系統(tǒng)中存在疏水菌株與非疏水性的細菌進行了對比研究。
疏水性雙歧雙歧桿菌NCC 189(CNCM I-2333)和非疏水性嬰兒雙歧桿菌NCC 200(CNCM I-2334)在含規(guī)定量內(nèi)毒素(用KDO方法測定)的溶液中培養(yǎng)(見實施例1)(圖4)。
用疏水細菌懸浮液培養(yǎng)后，存在的內(nèi)毒素明顯減少，而對于非疏水菌株則未觀察到變化。
實施例4疏水細菌功能研究材料和方法洗滌過的細菌再懸浮在DMEM-高葡萄糖(AMIMED)中，并用終濃度為2.5μg/ml的大腸桿菌0111B4(Sigma)的LPS預(yù)培養(yǎng)。離心后，200μl的上清液或再懸浮細菌小粒用于刺激HT 29上皮細胞。
在37℃培養(yǎng)20小時后，使用酶聯(lián)免疫吸附方法檢查HT-29細胞培養(yǎng)物上清液中是否存在IL-8。
結(jié)果結(jié)果見圖5。當LPS溶液用疏水細菌預(yù)培養(yǎng)時，LPS的前炎活性顯著降低。離心后，加至人上皮的細胞培養(yǎng)物中(在人乳存在下，因為LPS刺激依賴于sCD14存在)的上清液比沒有用疏水細菌預(yù)培養(yǎng)的上清液顯著減少。
實施例5嬰兒制劑為獲得嬰兒制劑食品，我們制備了以下混合物的制劑，其中每100ml制劑含有0.5-5％，優(yōu)選2％的縮氨酸、0.2-10％，優(yōu)選4％的脂肪、1-25％，優(yōu)選8％的非果聚糖碳水化合物(包括乳糖65％、麥芽糖糊精20％、淀粉15％)，和至少106cfu/ml的以下菌株嗜酸乳桿菌NCC2463(CNCM I-2623)，雙歧雙歧桿菌NCC189(CNCM I-2333)，雙歧雙歧桿菌CNCM I-2335，青春雙歧桿菌CNCM I-2168，并配合少量的維生素和微量元素，以適應(yīng)每日需要，及0.01-2％，優(yōu)選0.3％的礦物質(zhì)，和50-90％，優(yōu)選75％的水。
實施例6在乳制品中使用本發(fā)明的疏水性的乳酸菌菌株雙歧雙歧桿菌(CNCM I-2333)、嗜酸乳桿菌NCC 2463(CNCM I-2623)、雙歧雙歧桿菌NCC235(CNCM I-2335)或青春雙歧桿菌NCC251(CNCM I-2168)中的一種或多種菌株，根據(jù)本發(fā)明可以用于制造發(fā)酵的酸奶樣奶產(chǎn)品。
為此，制備了含2.8％的脂肪和補充了2％脫脂奶粉和6％蔗糖的1升乳制品，在96℃巴氏殺菌30分鐘，然后將其溫度降至42℃。在含10％重新配制的牛奶粉和0.1％市售的酵母抽提物的無菌MSK培養(yǎng)基中，對非增稠的嗜熱鏈球菌和非粘性的保加利亞乳桿菌菌株的預(yù)培養(yǎng)物進行再活化。
同時，在含10％重配的牛奶粉末和0.1％市售的酵母抽提物與1％蔗糖的培養(yǎng)基中使一種或多種菌株的預(yù)培養(yǎng)物再活化。將每個再活化的預(yù)培養(yǎng)物按1％的接種量接入經(jīng)巴氏殺菌的乳制品中，然后將這些乳制品在32℃發(fā)酵，直到pH達到4.5。用此法生產(chǎn)發(fā)酵酸奶樣產(chǎn)品，并在4℃貯藏。
實施例7干的狗糧一種飼料混合物，由大約58％(按重量計算)玉米、大約5.5％(按重量計算)玉米面筋、大約22％(按重量計算)雞粉、2.5％干的菊苣、嗜酸乳桿菌NCC 2463(CNCM-I 2623)的菌株發(fā)酵乳組成，對于狗的量相當于大約109-1010cfu/日，其余成分是鹽維生素和礦物質(zhì)。
飼料混合物被送入預(yù)調(diào)節(jié)器并浸濕，然后將濕潤的飼料送入擠出機-烹制機，制成凝膠狀。從擠出機擠出的凝膠狀基質(zhì)通過沖模沖壓并擠出。壓出物被切割成適合喂給家犬的小片，在大約110℃干燥約20分鐘，冷卻形成小粒。
此干的狗糧能改善寵物健康情況，特別是能預(yù)防寵物的與內(nèi)毒素有關(guān)的病癥。
權(quán)利要求
1.具有疏水表面性質(zhì)的乳酸菌和/或雙歧桿菌中的至少一種菌株在制備預(yù)防或治療內(nèi)毒素引起和/或有關(guān)病癥的組合物中的用途。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其中乳酸菌或雙歧桿菌的疏水性百分比(％H)至少為80，更優(yōu)選為85-100％H。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中乳酸菌和雙歧桿菌具有結(jié)合內(nèi)毒素或與革蘭氏陰性細菌共聚集的能力。
4.權(quán)利要求1-3中任何一項所述的用途，其中乳酸菌菌株或雙歧桿菌選自約氏乳桿菌、路氏乳桿菌、類干酪乳桿菌、動物乳桿菌、瘤胃乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種、雙歧桿菌屬、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、假長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌。
5.權(quán)利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述菌株是嗜酸乳桿菌NCC 2463(CNCM-I 2623)、雙歧雙歧桿菌NCC 189(CNCM-I-2333)、雙歧雙歧桿菌NCC 235(CNCM-I-2335)、青春雙歧桿菌NCC 251(CNCMI-2168)、乳雙歧桿菌(ATCC27536)。
6.權(quán)利要求1-5中任一項所述的用途，其中乳酸菌的使用量是使每人每日可得到大約103-1014cfu的量。
7.一種分離出的具有疏水表面性質(zhì)的乳酸菌或雙歧桿菌菌株，其已經(jīng)根據(jù)結(jié)合內(nèi)毒素或與革蘭氏陰性細菌共聚集的能力而被選擇。
8.權(quán)利要求7所述的菌株，其中乳酸菌或雙歧桿菌至少從濃度類似于腸道中內(nèi)毒素含量的溶液中結(jié)合30％的內(nèi)毒素。
9.權(quán)利要求7或8所述的菌株，其選自約氏乳桿菌、路氏乳桿菌、類于酪乳桿菌、動物乳桿菌、瘤胃乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種、雙歧桿菌屬、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、假長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌。
10.權(quán)利要求7-9中任一項所述的菌株，其為嗜酸乳桿菌NCC2463(CNCM-I 2623)、雙歧雙歧桿菌NCC 189(CNCM-I-2333)、雙歧雙歧桿菌NCC 235(CNCM-I-2335)、青春雙歧桿菌NCC 251(CNCMI-2168)、乳雙歧桿菌(ATCC27536)。
11.一種人類或?qū)櫸锸澄锝M合物，其含有權(quán)利要求7-10中任一項所述的乳酸菌和/或雙歧桿菌中的至少一種菌株以及一種可吸收的載體或藥用基質(zhì)。
12.權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述菌株可以用其活的形式或無活性形式使用。
13.權(quán)利要求11或12所述的組合物，其中乳酸菌菌株選自約氏乳桿菌、路氏乳桿菌、類干酪乳桿菌、動物乳桿菌、瘤胃乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種、雙歧桿菌屬、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、假長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌。
14.權(quán)利要求11-13中任一項所述的組合物，其中菌株是嗜酸乳桿菌NCC 2463(CNCM-I 2623)、雙歧雙歧桿菌NCC 189(CNCM-I-2333)、雙歧雙歧桿菌NCC 235(CNCM-I-2335)、青春雙歧桿菌NCC251(CNCM I-2168)、乳雙歧桿菌(ATCC27536)。
15.權(quán)利要求11-14中任一項所述的組合物，其中乳酸菌菌株的使用量是使每人每日可得到大約相當于103-1014cfu的量。
16.權(quán)利要求11-15中任一項所述的組合物，它可以減少、預(yù)防或治療內(nèi)毒素引起和/或有關(guān)的病癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用具有疏水表面性質(zhì)的乳酸菌和/或雙歧桿菌中的至少一種菌株制備一種用于預(yù)防或治療因內(nèi)毒素引起的和/或與內(nèi)毒素有關(guān)的病癥的組合物，及用具有疏水表面性質(zhì)的乳酸菌菌株和/或雙歧桿菌中的至少一種菌株制備的人類或?qū)櫸锸澄锝M合物。
文檔編號A23L1/28GK1501805SQ02807884
公開日2004年6月2日 申請日期2002年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月6日
發(fā)明者E·施夫林, E 施夫林, G·科丘賓斯基, 鴇鏊夠 申請人:雀巢制品公司