專利名稱：用基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增DNA目標(biāo)的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法。
核酸擴(kuò)增方法應(yīng)用于分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)領(lǐng)域。這些方法用于增加特異核酸序列的拷貝數(shù)，這些特異核酸序列少量存在并常常存在于同時(shí)也存在有多種其他核酸序列(包括RNA和DNA)的環(huán)境中。使用核酸擴(kuò)增方法尤其有助于核酸的檢測(cè)和定量，其對(duì)于診斷例如傳染病、遺傳病和各種類型的癌癥是重要的。核酸擴(kuò)增方法也應(yīng)用于其他領(lǐng)域，在這些領(lǐng)域中研究其中可能微量存在核酸的樣品，例如法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)或者確定親權(quán)。
已知幾種核酸擴(kuò)增技術(shù)基于不同的作用機(jī)制。在歐洲專利申請(qǐng)EP200362和EP 201148中描述了一種核酸擴(kuò)增的方法，其稱為“聚合酶鏈反應(yīng)”(PCR)。
本發(fā)明涉及一種不同類別的核酸擴(kuò)增方法，即“基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增技術(shù)”。采用這些方法可以從含有可被RNA聚合酶識(shí)別的功能啟動(dòng)子的DNA模板獲得多重RNA拷貝。將這些RNA拷貝作為目標(biāo)，從中可以獲得新的DNA模板等等。Gingeras等人在WO88/10315中和Burg等人在WO89/1050中描述了這些方法。Davey等人在EP 323822(涉及NASBA方法)中，Gingeras等人在EP 373960中和Kacian等人在EP 408295中描述了基于等溫轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增技術(shù)?；谵D(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)也可以用熱穩(wěn)定的酶來(lái)進(jìn)行。基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增通常在大約41攝氏度的溫度進(jìn)行。熱穩(wěn)定的酶使得反應(yīng)能夠在更高的溫度進(jìn)行。在以ToyoBoseki KK的名義申請(qǐng)的EP 682121中描述了這種熱穩(wěn)定方法。
EP 323822、EP 373960和EP 408295中描述的方法是等溫連續(xù)方法。采用這些方法需要四種酶活性來(lái)完成擴(kuò)增依賴RNA的DNA聚合酶活性、依賴DNA的DNA聚合酶活性、RNA酶(H)活性和RNA聚合酶活性。這些活性中的一些可以聯(lián)合在一種酶中，所以通常只有2或3種酶是必需的。逆轉(zhuǎn)錄酶如AMV(禽成肌細(xì)胞瘤病毒)或MMLV(莫洛尼鼠白血病病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶具有依賴RNA和DNA的DNA聚合酶活性以及固有的RNA酶H活性。另外，也可以向基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)混合物中加入RNA酶，例如大腸桿菌(E.coli)RNA酶H。
依賴DNA的RNA聚合酶從含有可被RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子的DNA模板合成多重RNA拷貝。RNA聚合酶的例子為來(lái)自大腸桿菌和噬菌體T7、T3和SP6的聚合酶。通常與基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法一起使用的RNA聚合酶的例子為T7聚合酶。因此，結(jié)合入用于產(chǎn)生RNA多重拷貝的模板中的啟動(dòng)子為T7-啟動(dòng)子。含有啟動(dòng)子的模板通常必須從含有目標(biāo)序列的核酸開(kāi)始來(lái)產(chǎn)生。該核酸可能存在于用作擴(kuò)增反應(yīng)輸入的起始材料中。在起始材料中存在的核酸通常含有目標(biāo)序列，該目標(biāo)序列作為長(zhǎng)得多的序列的一部分。額外的核酸序列可以存在于目標(biāo)序列的3′和5′末端?？梢酝ㄟ^(guò)將下列物質(zhì)放在一起來(lái)開(kāi)始擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)自起始材料的該核酸；適當(dāng)?shù)拿福@些酶一起提供上述的活性；和至少一種(但通常為兩種)寡核苷酸。這些寡核苷酸中至少一種應(yīng)當(dāng)含有RNA聚合酶啟動(dòng)子的序列。雖然單鏈或雙鏈DNA同樣可用作輸入材料，但是如果輸入材料為單鏈RNA，則基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法就特別有用。當(dāng)基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法應(yīng)用于含有單鏈RNA(附加序列位于目標(biāo)序列的3′末端和5′末端)的樣品時(shí)，適宜用于現(xiàn)有技術(shù)中所描述的方法的寡核苷酸對(duì)由下列組成-第一寡核苷酸(通常稱為“啟動(dòng)子-引物”或“正向-引物”)，其能夠與目標(biāo)序列的3′末端雜交，并具有連接到其5′末端上的啟動(dòng)子序列(優(yōu)選的為T7啟動(dòng)子)(該寡核苷酸的雜交部分具有與用作輸入材料的目標(biāo)RNA相反的極性)。
-第二寡核苷酸(通常稱為“反向引物”)，其含有目標(biāo)序列的5′末端(該寡核苷酸具有與目標(biāo)RNA相同的極性)。
當(dāng)將這樣的寡核苷酸對(duì)、同具有適當(dāng)活性的所有的酶和足夠量的必需的核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸一起構(gòu)成一個(gè)反應(yīng)混合物，并在適當(dāng)?shù)臈l件下(即在適當(dāng)?shù)木彌_條件下和于適當(dāng)?shù)臏囟认?保持足夠的時(shí)間時(shí)，等溫連續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)就將開(kāi)始。上述主題的許多變體已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行了描述。基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)包括從模板合成單鏈RNA轉(zhuǎn)錄物，該模板含有可被RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)識(shí)別的啟動(dòng)子(例如T7啟動(dòng)子)。含有啟動(dòng)子序列的正向引物可作為引物來(lái)起始與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的DNA鏈的合成。
引物通過(guò)依賴RNA的DNA聚合酶活性進(jìn)行延伸。所形成的RNA-cDNA雜化物通過(guò)RNA酶H來(lái)降解。這使得特異的反向引物與cDNA雜交。該引物通過(guò)依賴RNA的DNA聚合酶進(jìn)行延伸直至cDNA的5′末端，結(jié)果導(dǎo)致雙鏈啟動(dòng)子序列的形成，由此作為正向引物一部分的啟動(dòng)子序列被用作模板。然后通過(guò)依賴DNA的RNA聚合酶將該雙鏈啟動(dòng)子用于產(chǎn)生許多新的RNA分子，這些RNA分子與目標(biāo)RNA互補(bǔ)。在該起始階段之后，擴(kuò)增進(jìn)入循環(huán)階段。
實(shí)際上，從樣品中的單鏈RNA開(kāi)始，一旦將所有的成分放在一起，并將混合物置于適當(dāng)?shù)臏囟纫宰屆付加谢钚?，整個(gè)一系列事件就會(huì)發(fā)生。該方法的操作者不需要通過(guò)干預(yù)來(lái)完成這些步驟中的任何一個(gè)。
正如上面所解釋的，基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法對(duì)于從單鏈RNA開(kāi)始的擴(kuò)增特別有用。含有將要擴(kuò)增的核酸的起始材料可以不含有以指定長(zhǎng)度的RNA的形式存在的目標(biāo)核酸。當(dāng)對(duì)于含有目標(biāo)序列(只以雙鏈DNA的形式存在，環(huán)狀或線性)的起始材料施行基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法時(shí)，必須將DNA轉(zhuǎn)變成單鏈核酸。這可以通過(guò)在應(yīng)用升高的溫度(直至100攝氏度)的條件而分離雙鏈DNA的鏈來(lái)完成。然后可以將在擴(kuò)增中用作引物的第一寡核苷酸與單鏈中的一條進(jìn)行退火。在通常的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法中使用的酶不能耐受如此的高溫，因此其只能在分離DNA鏈之后加入。當(dāng)一個(gè)寡核苷酸與單鏈DNA進(jìn)行退火并進(jìn)行延伸時(shí)，就再次形成雙鏈DNA，然后必須將反應(yīng)混合物經(jīng)歷升高的溫度，該溫度足夠高以將雙鏈DNA再次分解成其分離的鏈。酶將會(huì)再次失活，在實(shí)施加熱步驟之后要加入新的酶?，F(xiàn)在可以加入第二寡核苷酸，并與從在第一步中延伸的第一寡核苷酸所形成的鏈進(jìn)行退火。由于一個(gè)寡核苷酸含有依賴DNA的RNA聚合酶的5′啟動(dòng)子序列(見(jiàn)上)，所以獲得含有雙鏈功能啟動(dòng)子的雙鏈DNA模板，從中可以發(fā)生RNA產(chǎn)生的第一步。結(jié)果產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物可以進(jìn)入擴(kuò)增的循環(huán)階段，并且該過(guò)程進(jìn)一步將等溫進(jìn)行。
從上述中明顯的是，從雙鏈DNA開(kāi)始基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法會(huì)是一個(gè)繁瑣的過(guò)程。其要求操作者進(jìn)行幾個(gè)特殊的操作，樣品必須反復(fù)加熱和冷卻，以及酶必須在每次加熱步驟之后進(jìn)行補(bǔ)充。
一些研究已經(jīng)進(jìn)入開(kāi)發(fā)能夠從dsDNA開(kāi)始的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法，而避免上述的將dsDNA轉(zhuǎn)變成ssRNA的繁瑣的程序，ssRNA可以用作循環(huán)等溫的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增的輸入。
在WO9925868中公開(kāi)了相當(dāng)簡(jiǎn)單的用于dsDNA的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法。
根據(jù)WO9925868所描述的方法，樣品中的dsDNA可以直接采用基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方案來(lái)擴(kuò)增，而根本不需任何的加熱處理步驟[超過(guò)90℃]，或者在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中只需一個(gè)起始的加熱步驟。相對(duì)短的dsDNA在該方法中優(yōu)選。實(shí)際上，該方法并沒(méi)有根本上不同于用來(lái)擴(kuò)增ssRNA的常規(guī)的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方案。
作為另一種選擇，起始材料中的雙鏈DNA可以在擴(kuò)增開(kāi)始之前轉(zhuǎn)錄成RNA。這一額外的步驟可以依靠酶來(lái)進(jìn)行，例如大腸桿菌RNA聚合酶，該酶可在無(wú)啟動(dòng)子序列(也稱為聚合酶結(jié)合位點(diǎn))存在的情況下將雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄成RNA。這一具有額外步驟的方法有助于通過(guò)基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法來(lái)擴(kuò)增雙鏈DNA，其已在PCT專利申請(qǐng)no.WO9602668中進(jìn)行了描述。在該程序中所描述額外步驟不僅包括額外的處理步驟和處理時(shí)間，而且包括附加成分即大腸桿菌RNA聚合酶的使用。
在EP 397269中描述了制備用于基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法的合適模板的另一種方法。
在該專利中描述了一種方法，由此dsDNA用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行預(yù)處理。在用限制性內(nèi)切酶處理之后，只需一個(gè)加熱分離步驟就可形成單鏈DNA(ssDNA)。在該方法中使用正向引物(啟動(dòng)子-引物)，其3′部分含有與DNA單鏈中的一條的準(zhǔn)確3′末端互補(bǔ)的序列，以及5′末端含有可被RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)識(shí)別的啟動(dòng)子序列。當(dāng)啟動(dòng)子-引物與DNA單鏈的3′末端雜交時(shí)，就形成了雙鏈復(fù)合物，其中正向引物的5′啟動(dòng)子序列可以作為用于從DNA鏈3′末端開(kāi)始延伸反應(yīng)的模板。因此，通過(guò)依賴DNA的DNA聚合酶可形成雙鏈啟動(dòng)子，結(jié)果產(chǎn)生的復(fù)合物可以作為對(duì)于依賴DNA的RNA聚合酶的模板從而合成RNA的多重拷貝。
在WO9104340中也公開(kāi)了幾個(gè)對(duì)于單鏈DNA開(kāi)始基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)的方法?？梢栽俅斡孟拗菩詢?nèi)切酶在DNA上形成適當(dāng)?shù)?′末端，其能夠與啟動(dòng)子引物的3′序列雜交。
在WO9104340中公開(kāi)了怎樣可以用切割ssDNA的限制性內(nèi)切酶形成ssDNA上指定的3′末端。在同樣方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，切割dsDNA的限制性內(nèi)切酶和能夠與目標(biāo)ssDNA雜交的限制性寡核苷酸一起使用，因此形成雙鏈DNA片段，其可用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割從而形成適當(dāng)?shù)?′末端。在這種方法中，限制性內(nèi)切酶切割雙鏈復(fù)合物之后會(huì)剩下小片段的限制性寡核苷酸?？墒?，根據(jù)WO9104340的公開(kāi)內(nèi)容，顯然以這樣的方式挑選限制性寡核苷酸，使其在消化之后剩下的片段太小而不能保持與ssDNA 3′末端的雜交，因此將掉下去而為啟動(dòng)子寡核苷酸讓出空間。可是，雖然用現(xiàn)有技術(shù)方法中所使用的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行預(yù)處理可以導(dǎo)致靈敏的基于轉(zhuǎn)錄的測(cè)定，但是其需要許多額外的處理步驟和處理時(shí)間。
本發(fā)明也涉及包括限制性內(nèi)切酶消化的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法。
本發(fā)明提供了基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法，該方法使得能夠進(jìn)行靈敏和特異的DNA擴(kuò)增(以及隨后的檢測(cè))。使用本發(fā)明的方法，能夠比使用現(xiàn)有技術(shù)的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法更有效地?cái)U(kuò)增和檢測(cè)DNA。與現(xiàn)有技術(shù)方法相比較，使用限制性內(nèi)切酶不使擴(kuò)增程序變得復(fù)雜。
本發(fā)明提供了基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的方法，該方法從可選地存在于樣品中的DNA開(kāi)始，其包括下列步驟
-在擴(kuò)增緩沖液中溫育樣品，該溫育體系中含有一種或多種能夠在所選限制位點(diǎn)切割DNA的限制性內(nèi)切酶，該限制性內(nèi)切酶在DNA鏈中的一條上形成指定的3′末端，和啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物具有包含被依賴DNA的RNA聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子序列的5′區(qū)域和與指定的DNA鏈的3′末端互補(bǔ)的3′區(qū)域，第二引物，其具有與啟動(dòng)子引物相反的極性且含有目標(biāo)序列的5′末端，和在ssDNA的情況下，含有限制性引物；-將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行限制性內(nèi)切酶的消化；-將樣品以一定的溫度和時(shí)間進(jìn)行加熱處理，該溫度和時(shí)間足以失活限制性內(nèi)切酶和/或?qū)е码p鏈的單鏈化；-向樣品中加入下列試劑，具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶具有RNA酶H活性的酶具有RNA聚合酶活性的酶；和-將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行擴(kuò)增。必需的(適當(dāng)?shù)?三磷酸核苷可以在用限制性內(nèi)切酶溫育步驟期間就已經(jīng)存在，例如作為該擴(kuò)增緩沖液的一部分?？墒牵鼈円部梢栽谠摮绦蛑械纳院箅A段加入，例如在加熱處理之后與酶一起加入。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道用于基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法的酶和實(shí)行基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法的條件，并且知道所有可以作出的優(yōu)化基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)的通常修飾。例如，正向引物即啟動(dòng)子引物，可以在位于引物5′末端的啟動(dòng)子序列和位于引物3′末端的雜交序列之間含有嘌呤區(qū)域。
引物的序列主要由所選擇的限制位點(diǎn)的位置來(lái)決定。正向引物的3′末端應(yīng)當(dāng)與緊接著限制位點(diǎn)的目標(biāo)序列進(jìn)行退火。引物的長(zhǎng)度可以變化，只要其長(zhǎng)足夠能在擴(kuò)增反應(yīng)所使用的條件下進(jìn)行雜交。引物的雜交部分一般由大約10至大約35個(gè)核苷酸組成。
如果目標(biāo)為ssDNA，根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的限制性引物要求它們所顯示的與正向引物的重疊區(qū)為最?。徊⑶乙允瓜拗菩詢?nèi)切酶可以真正有效地切割DNA的方式結(jié)合入限制位點(diǎn)序列。
限制性內(nèi)切酶是能夠在所選的位點(diǎn)(即被該酶識(shí)別的特異的核苷酸序列)切割dsDNA的酶。在為本發(fā)明的方法選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意挑選在目標(biāo)DNA的所有變體中都存在的限制位點(diǎn)(例如，如果進(jìn)行擴(kuò)增是為了檢測(cè)樣品中的病毒DNA，則應(yīng)挑選在該特定病毒的所有基因型中都存在的限制位點(diǎn))。限制位點(diǎn)應(yīng)當(dāng)不存在于引物之間的DNA序列之內(nèi)。
限制性內(nèi)切酶的添加導(dǎo)致指定的DNA目標(biāo)鏈3′末端的形成，其可用于結(jié)合啟動(dòng)子引物的雜交部分。另外的方面是，由于消化，DNA那部分的變性將會(huì)得到改善，因此有助于引物的結(jié)合。含有T7-啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)子寡核苷酸應(yīng)當(dāng)以使雜交部分與正位于限制位點(diǎn)上游的模板相互作用的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)。具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶(通常為逆轉(zhuǎn)錄酶，如MMLV-RT或AMV-RT)能夠用引物作為模板來(lái)延伸由限制性內(nèi)切酶消化所形成的DNA目標(biāo)鏈的3′末端。將會(huì)形成雙鏈T7-啟動(dòng)子序列，從而能夠開(kāi)始形成擴(kuò)增子RNA。
令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶能夠在適宜于和適合于基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增程序的環(huán)境中有效地進(jìn)行使用。換言之，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以使用限制性內(nèi)切酶來(lái)切割用作基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增的輸入材料的DNA，這不會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜的和額外的樣品處理。將限制性內(nèi)切酶的使用合并入那些通常已經(jīng)是基于轉(zhuǎn)錄的DNA擴(kuò)增方案的一部分的步驟之中從而成為其中的一部分。
所有的現(xiàn)有技術(shù)方法都描述了限制性內(nèi)切酶在制備用于基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增的DNA模板中的用途，其作為真正的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增之前的分離的預(yù)處理。因此，現(xiàn)有技術(shù)的在制備DNA模板中限制性內(nèi)切酶的使用導(dǎo)致對(duì)樣品的額外處理，如分離的限制性內(nèi)切酶失活步驟和分離的DNA純化步驟。其使得整個(gè)擴(kuò)增程序變得復(fù)雜，尤其是自動(dòng)化的過(guò)程，并增加了污染的風(fēng)險(xiǎn)。
雖然在WO9104340中已經(jīng)公開(kāi)了與限制性內(nèi)切酶一起添加限制性寡核苷酸，但其沒(méi)有先于本發(fā)明公開(kāi)怎樣能夠?qū)⑾拗菩詢?nèi)切酶(和寡核苷酸)的使用與基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增有效地聯(lián)合在一起。
在現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有公開(kāi)以哪種方式能夠?qū)⑾拗菩詢?nèi)切酶的使用與基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增聯(lián)合在一起而無(wú)需額外的樣品處理和試劑添加步驟。
本發(fā)明的方法提供了這種聯(lián)合而沒(méi)有使現(xiàn)有技術(shù)的基于轉(zhuǎn)錄的DNA擴(kuò)增過(guò)程變得復(fù)雜。
本發(fā)明的方法幾乎沒(méi)有不同于一般的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法。僅有的所采取的附加步驟為用限制性內(nèi)切酶對(duì)樣品進(jìn)行“內(nèi)置溫育(built inincubation)”，這就是表示使用限制性內(nèi)切酶的方式，不會(huì)使實(shí)際的樣品處理不同于常規(guī)的/現(xiàn)有技術(shù)的基于轉(zhuǎn)錄的DNA擴(kuò)增過(guò)程。
在本發(fā)明方法中所使用的優(yōu)選的限制性內(nèi)切酶當(dāng)然是在將其添加到含有擴(kuò)增緩沖液(含有相對(duì)較高濃度的鹽)的反應(yīng)混合物中的條件下仍相對(duì)穩(wěn)定和保持高活性的酶。
在添加限制性內(nèi)切酶之后，需要將樣品在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行溫育以使酶起作用，并保持合適的時(shí)間?？梢詫悠泛拖拗菩詢?nèi)切酶進(jìn)行溫育相對(duì)較短的時(shí)間，優(yōu)選地溫育大約10-20分鐘，更優(yōu)選于大約35至大約45℃，更特別于大約37-41℃溫育大約15分鐘，這顯然依賴于所使用的限制性內(nèi)切酶的特性。事實(shí)上，當(dāng)與常規(guī)的基于轉(zhuǎn)錄的DNA擴(kuò)增方法相比較，這是要采取的僅有的附加措施。
本發(fā)明的方法包括在用限制性內(nèi)切酶溫育之后加熱樣品的步驟。在該加熱期間，使得限制性內(nèi)切酶失活和導(dǎo)致雙鏈DNA變成單鏈[至少部分地]。該加熱步驟已經(jīng)是進(jìn)行基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法的流程中的一部分。這些方法包括在引物添加之后樣品的加熱處理，從而形成對(duì)于引物退火最佳的環(huán)境(核酸伸展開(kāi)來(lái)，核酸的鏈或內(nèi)環(huán)分離開(kāi)，和在冷卻期間促進(jìn)引物和模板的雜交)。
在用酶溫育之后的加熱步驟可以在較低溫度進(jìn)行，但是其優(yōu)選地于超過(guò)90℃(優(yōu)選于95+/-3℃)的溫度通過(guò)短時(shí)間的溫育(大約5分鐘)來(lái)進(jìn)行。
此后，可以將樣品冷卻至對(duì)于進(jìn)行基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)適當(dāng)?shù)臏囟?通常為大約41℃)。
由于加熱，一些雙鏈DNA變成單鏈。如果引物(尤其是啟動(dòng)子寡核苷酸)在樣品加熱之前已經(jīng)存在，加熱處理也可以有助于引物與DNA的退火。
因此，在樣品經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶的處理之后不需從樣品中純化出DNA。在加熱處理中可簡(jiǎn)單地將酶失活，該加熱處理已經(jīng)成為基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增程序的一部分。用本發(fā)明的方法已經(jīng)證明這足夠消除限制性內(nèi)切酶干擾實(shí)際的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法的風(fēng)險(xiǎn)。
在加熱處理之后，以通常的方式加入用于基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增的其他擴(kuò)增試劑，然后基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增可以技術(shù)人員已知的通常方式來(lái)進(jìn)行。
擴(kuò)增酶只是在加熱處理之后加入以防止在加熱處理期間酶的降解(當(dāng)然除非使用熱穩(wěn)定的酶)。
本發(fā)明方法的主要優(yōu)點(diǎn)為，盡管使用了額外的試劑(例如限制性內(nèi)切酶)，但這不會(huì)導(dǎo)致要進(jìn)行額外的(分離的)反應(yīng)步驟或操作。
不需額外的樣品處理的事實(shí)尤其重要，因?yàn)槊總€(gè)額外的樣品處理都會(huì)增加污染風(fēng)險(xiǎn)，這是無(wú)論如何都要避免的，尤其是在擴(kuò)增反應(yīng)中。此外，如果需要額外的樣品處理，這將會(huì)使得方法的自動(dòng)化操作復(fù)雜化。
本發(fā)明的方法也可用于單鏈DNA。當(dāng)DNA是單鏈時(shí)，限制性寡核苷酸或限制性引物含有與包括目標(biāo)DNA的限制位點(diǎn)的區(qū)域互補(bǔ)的序列，將其和限制性內(nèi)切酶一起添加。
限制性寡核苷酸[限制性引物]與單鏈DNA雜交，并形成能夠被限制性內(nèi)切酶切割的雙鏈復(fù)合物。又一試劑的添加(限制性寡核苷酸)不會(huì)使得實(shí)踐者進(jìn)行額外的步驟。限制性寡核苷酸可以簡(jiǎn)單地和限制性內(nèi)切酶及其他對(duì)于擴(kuò)增所必需的寡核苷酸一起添加。因此，不需打開(kāi)擴(kuò)增系統(tǒng)來(lái)再次添加試劑。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，限制性寡核苷酸的功能可以合并入也含有可被依賴DNA的RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子序列的寡核苷酸(聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性引物)。采用這種方式，對(duì)于擴(kuò)增只需兩種寡核苷酸即啟動(dòng)子-引物，其合并有與包含限制位點(diǎn)的區(qū)域互補(bǔ)的序列，和第二引物(反向引物)。包含該優(yōu)選[聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性]引物的限制位點(diǎn)的序列應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地以這種方式配置，即-在消化之后，引物的剩余部分會(huì)在加熱期間從目標(biāo)上變性，-目標(biāo)雜交序列的剩余部分足夠長(zhǎng)以用于結(jié)合新的聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性引物，-如果對(duì)于限制性內(nèi)切酶的活性是必需的，那么限制位點(diǎn)周圍的額外核苷酸包括在雜交之內(nèi)。
因此，聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性引物的一部分現(xiàn)在將作為限制性寡核苷酸；其將與目標(biāo)DNA進(jìn)行退火，從而導(dǎo)致含有可被限制性內(nèi)切酶識(shí)別的限制位點(diǎn)的dsDNA。隨后限制性內(nèi)切酶將切割該dsDNA，從而提供出指定的DNA上的3′末端。
優(yōu)選，相對(duì)于目標(biāo)DNA的存在數(shù)量，應(yīng)當(dāng)存在至少1000倍過(guò)量的聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性引物，這對(duì)于基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增反應(yīng)中的常規(guī)啟動(dòng)子引物也已是通常水平。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法對(duì)于來(lái)自乙型肝炎病毒(HBV)的DNA的擴(kuò)增和檢測(cè)特別有用，但是本發(fā)明的方法可以用于任何類型的DNA、樣品中將要檢測(cè)的病毒DNA以至基因組DNA。
附圖簡(jiǎn)述

圖1包括限制性內(nèi)切酶消化的DNA NASBA的圖解顯示。限制性內(nèi)切酶(箭頭)只是在NASBA的起始階段有活性。在消化之后，正向引物與模板雜交。AMV RT將會(huì)用正向引物來(lái)延伸包含T7啟動(dòng)子序列(暗灰色)作為模板的DNA目標(biāo)鏈(黑色)的3′末端。T7 DdRp會(huì)識(shí)別出雙鏈T7啟動(dòng)子序列，于是開(kāi)始產(chǎn)生RNA擴(kuò)增子(淺灰色)。RNA擴(kuò)增子序列與目標(biāo)DNA鏈互補(bǔ)。在循環(huán)階段期間，可用分子信標(biāo)技術(shù)來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)RNA擴(kuò)增子。只是在循環(huán)階段期間需要RNA酶H和反向引物。
圖2有和沒(méi)有XbaI消化的HBV DNA聯(lián)合正向引物S-p3.8的NASBA。在用XbaI消化之后，S-p3.8可用作目標(biāo)DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信標(biāo)S-WT2用作探針。沒(méi)有模板的樣品(NT)作為負(fù)對(duì)照。
圖3有和沒(méi)有BssSI消化的HBV DNA聯(lián)合正向引物S-p3.10的NASBA。在用BssSI消化之后，S-p3.10可用作目標(biāo)DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信標(biāo)S-WT2用作探針。沒(méi)有模板的樣品(NT)作為負(fù)對(duì)照。
圖4有和沒(méi)有XbaI消化的HBV DNA聯(lián)合正向引物S-p3.10的NASBA。在用XbaI消化之后，S-p3.10不可用作目標(biāo)DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信標(biāo)S-WT2用作探針。沒(méi)有模板的樣品(NT)作為負(fù)對(duì)照。
圖5有和沒(méi)有BssSI消化的HBV DNA聯(lián)合正向引物S-p3.8的NASBA。在用BssSI消化之后，S-p3.8可作用作目標(biāo)DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信標(biāo)S-WT2用作探針。沒(méi)有模板的樣品(NT)作為負(fù)對(duì)照。
圖6有和沒(méi)有AvrII消化的HBV DNA聯(lián)合正向引物S-p3.5的NASBA。在用AvrII消化之后，S-p3.5可用作目標(biāo)DNA延伸的模板。引物S-p4.4用作反向引物而分子信標(biāo)S-WT4用作探針。沒(méi)有模板的樣品(NT)作為負(fù)對(duì)照。
圖7有和沒(méi)有MspI消化的DNA聯(lián)合正向引物U1a-p1的NASBA。在用MspI消化之后，U1a-p1可用作目標(biāo)DNA延伸的模板。引物U1a-p2用作反向引物而分子信標(biāo)U1a-MB用作探針。沒(méi)有模板的樣品(NT)作為負(fù)對(duì)照。
本發(fā)明通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的舉例說(shuō)明。
實(shí)施例實(shí)施例1HBV DNA的擴(kuò)增兩個(gè)保守的限制性位點(diǎn)(XbaI和BssSI)編碼于HBV DNA的S-gen的保守區(qū)域(根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的nt 244-285)內(nèi)。當(dāng)S-區(qū)域的這部分能夠成為負(fù)極性的單鏈DNA時(shí)，加入與包含限制位點(diǎn)序列的區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸(“限制性引物”(RP))，從而為所有存在的基因組DNA形成雙鏈限制位點(diǎn)。用Nuclisens Extractor(Organon Teknika)從被3×109geq/ml的HBV基因型A感染的血漿的一系列稀釋液中分離出HBV DNA。按照所述對(duì)于分離RNA的標(biāo)準(zhǔn)程序(Operator ManualExtractor，41001-9，rev A，1999)可獲得50μl的提取液。每次測(cè)定用5μl的提取液。限制性內(nèi)切酶消化在下列條件下進(jìn)行NASBA緩沖液(40mM Tris-HCl pH8.5，12mM MgCl2，70mM KCl，15％ v/v DMSO，5mM DTT，1mM的各種dNTP，2mM ATP，2mM CTP，2mM UTP，1.5mM GTP，0.5mM ITP，0.2μM正向引物(對(duì)于XbaI為S-p3.8，對(duì)于BssSI為S-p3.10，表1)，0.2μM反向引物(S-p4.5，表1)，0.1μM分子信標(biāo)探針(S-WT2，表1)，0.17μM限制性引物(RP-3，表1))和0.2單位的限制性內(nèi)切酶BssSI(New England BioLabs，Inc.，Beverly，MA，USA)或3.0單位的限制性內(nèi)切酶XbaI(New England BioLabs，Inc.，Beverly，MA，USA)。在于41℃溫育15分鐘之后，加熱失活限制性內(nèi)切酶，并將DNA模板于95℃變性5分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻至41℃并保持3分鐘，在此期間發(fā)生引物的雜交。隨后加入NASBA酶(2.1μg BSA，0.08單位的RNA酶H，32單位的T7 RNA聚合酶和6.4單位的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)，并通過(guò)輕輕地敲打和短時(shí)間的離心將反應(yīng)混合物混和，然后開(kāi)始擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)。將反應(yīng)混合物在NucliSensEasyQ Analyzer(Organon Teknika)中于41℃溫育120分鐘，并每分鐘進(jìn)行熒光監(jiān)測(cè)。反應(yīng)物于485nm激發(fā)，于518nm測(cè)量到發(fā)射信號(hào)。
實(shí)施例1.1包括XbaI消化的HBV DNA的擴(kuò)增進(jìn)行有和沒(méi)有使用限制性內(nèi)切酶XbaI處理的NASBA測(cè)定。在NASBA條件下的最佳XbaI濃度這樣確定即能夠消化109拷貝的含有HBV DNA的擴(kuò)增子區(qū)域的PCR片段，且結(jié)果顯示為3個(gè)單位。S-p3.8用作正向引物，并能夠在XbaI消化之后被AMV RT用作模板來(lái)延伸模板DNA。沒(méi)有消化時(shí)獲得3×106geq/ml的靈敏度，而消化之后靈敏度為3×103geq/ml，這表明靈敏度增加了1000倍(圖2)。另外，沒(méi)有消化時(shí)到達(dá)陽(yáng)性的時(shí)間(TTP)為大約16分鐘，而在XbaI消化之后其為大約6分鐘，這表明TTP減少了大約10分鐘(圖2)。這兩者都是擴(kuò)增反應(yīng)改善的指標(biāo)。
實(shí)施例1.2包括BssSI消化的HBV DNA的擴(kuò)增用同樣的HBV DNA提取物和與上述同等的反應(yīng)條件來(lái)進(jìn)行有和沒(méi)有使用限制性內(nèi)切酶BssSI處理的NASBA反應(yīng)。在NASBA條件下的最佳BssSI濃度這樣確定即能夠消化109拷貝的含有HBV DNA的擴(kuò)增子區(qū)域的PCR片段，結(jié)果顯示為0.2個(gè)單位。S-p3.10用作正向引物，并能夠在BssSI消化之后被AMV RT用作模板來(lái)延伸模板DNA。用限制性內(nèi)切酶BssSI處理的結(jié)果再次獲得了顯著的測(cè)試改善(圖3)。沒(méi)有消化時(shí)只獲得3×107geq/ml的靈敏度，而消化之后靈敏度為3×104geq/ml，這再次表明作為消化的結(jié)果靈敏度增加了1000倍(圖3)。另外，沒(méi)有消化時(shí)到達(dá)陽(yáng)性的時(shí)間(TTP)為大約21分鐘，而在BssSI消化之后其為大約11分鐘，這再次表明TTP減少了大約10分鐘(圖3)。這些結(jié)果證明在NASBA反應(yīng)之前用限制性內(nèi)切酶消化HBV DNA能夠在相當(dāng)程度上改善HBV DNA的擴(kuò)增并因此改善HBV DNA的檢測(cè)。
實(shí)施例1.3包括XbaI消化的HBV DNA的擴(kuò)增-2為了測(cè)試由其本身消化還是限制性內(nèi)切酶與所選引物的聯(lián)合是改善的測(cè)定結(jié)果的基本原因，用引物S-p3.10代替S-p3.8再次進(jìn)行包括XbaI消化的測(cè)定。在XbaI消化之后，AMV RT不能用S-p3.10作為模板來(lái)延伸目標(biāo)序列。正如能夠在圖4中所見(jiàn)的，在聯(lián)合S-p3.10的XbaI消化之后只獲得了靈敏度的輕微增加(10倍)和TTP的少量減少(大約5分鐘，從21至16分鐘)。這表明在NASBA起始期間模板的延伸是獲得改善的結(jié)果的原因，這些改善的結(jié)果可用XbaI與引物S-p3.8和用BssSI與引物S-p3.10來(lái)獲得。
實(shí)施例1.4包括BssSI消化的HBV DNA的擴(kuò)增-2為了測(cè)試目標(biāo)的延伸是否的確為測(cè)定結(jié)果改善的基本原因，用引物S-p3.8代替S-p3.10再次進(jìn)行包括BssSI消化的測(cè)定。在BssSI消化之后，AMV RT能夠用S-p3.8作為模板來(lái)延伸目標(biāo)序列?？墒牵贐ssSI消化之后只有17個(gè)核苷酸參與了引物和目標(biāo)序列的雜交，而其通常為大約20個(gè)核苷酸。盡管有這些差異，但是在BssSI消化之后再次獲得了明顯的測(cè)試改善(圖5)。可以使用引物S-p3.8與S-p4.5、限制性引物RT-3和分子信標(biāo)S-WT2，用NASBA中包括的XbaI和BssSI來(lái)進(jìn)行雙消化，這與單消化NASBA測(cè)定相比并沒(méi)有降低擴(kuò)增效率。
實(shí)施例1.5包括AvrII消化的HBV DNA的擴(kuò)增限制位點(diǎn)(AvrII)編碼于HBV DNA的S-gen的另一個(gè)保守區(qū)域(根據(jù)EcoRI位點(diǎn)的nt 177-192)內(nèi)。如在NASBA中一樣使用正向引物S-p3.5、反向引物S-p4.4、分子信標(biāo)S-WT4和限制性引物RT-1(表1)。在AvrII消化之后，AMV RT能夠用S-p3.5作為模板來(lái)延伸HBV DNA的目標(biāo)鏈。使用與上述同樣的反應(yīng)條件。使用與上述同樣的HBV DNA提取物來(lái)進(jìn)行有和沒(méi)有使用限制性內(nèi)切酶AvrII處理的NASBA反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)使用2單位的AvrII。沒(méi)有消化時(shí)獲得＞108geq/ml的靈敏度，而消化之后靈敏度為1×105geq/ml，這表明作為消化的結(jié)果靈敏度增加了＞103倍(圖6)。這些結(jié)果再次證明在NASBA反應(yīng)中包括的HBV DNA的限制性內(nèi)切酶消化能夠在相當(dāng)程度上改善HBV DNA的擴(kuò)增。
實(shí)施例1.6包括MspI消化的U1a DNA的擴(kuò)增設(shè)計(jì)對(duì)于U1a DNA并包括正向引物U1a-p1、反向引物U1a-p2和分子信標(biāo)U1a-MB的NASBA反應(yīng)(表2)。NASBA在NASBA緩沖液(40mM Tris-HCl pH8.5，12mM MgCl2，70mM KCl，15％ v/vDMSO，5mM DTT，1mM的每種dNTP，2mM ATP，2mM CTP，2mM UTP，2mM GTP，0.2μM正向引物，0.2μM反向引物和0.05μM分子信標(biāo)探針)中添加或不添加限制性內(nèi)切酶MspI的條件下進(jìn)行。對(duì)于包括限制性內(nèi)切酶消化的NASBA，加入1.5單位的MspI。在于37℃溫育25分鐘之后，將DNA模板于95℃變性3分鐘。引物的雜交發(fā)生在冷卻至41℃并保持3分鐘的期間。隨后加入NASBA酶(0.08單位的RNA酶H，32單位的T7 RNA聚合酶和6.4單位的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶置于375mM山梨糖醇中，以及2.1μg BSA)，并通過(guò)輕輕地敲打和短時(shí)間的離心將反應(yīng)混合物混和，然后開(kāi)始擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)。將反應(yīng)混合物于41℃溫育90分鐘，并每45秒進(jìn)行熒光監(jiān)測(cè)。反應(yīng)物于485nm激發(fā)，并在熒光計(jì)(Applied Biosystems)中于530nm測(cè)量到發(fā)射信號(hào)。沒(méi)有MspI消化時(shí)不能檢測(cè)出10倍的稀釋，而用MspI消化時(shí)103倍的稀釋也可檢測(cè)到，這表明靈敏度至少增加了100倍(圖7)。該結(jié)果證明以這種方式用限制性內(nèi)切酶消化U1a DNA，使正向引物能夠直接作為對(duì)于AMV RT的模板而起作用，能夠在相當(dāng)程度上改善U1a DNA的擴(kuò)增并因此改善U1a DNA的檢測(cè)。另外，MspI消化能夠包括在NASBA反應(yīng)中。
表1 引物和探針序列
*T7-啟動(dòng)子序列用斜體表示，嘌呤序列用小寫字母表示，探針的主干序列用加下劃線的斜體表示，并標(biāo)明了限制位點(diǎn)。
表2 引物和探針序列*
*T7-啟動(dòng)子序列用粗斜體表示，探針的主干序列用加下劃線的斜體表示。
序 列 表序列表SEQUENCE LISTING<110>Akzo Nobel NV<120>用基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)DNA的方法<130>2001.632<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1aattctaata cgactcacta tagggagact cgtggtggac ttctctca 48<210>2<211>50
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400> 2aattctaata cgactcacta tagggagaag gtggacttct ctcaattttc50<210>3<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3aattctaata cgactcacta tagggagagg acccctgctc gtgttacagg c 51<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>4gaaccaacaa gaagatgagg ca 22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5gggactgcga attttggcca20<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>6cgatcgaggg actgcgaatt ttggccgatc g 31<210>7<211>39
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(10)<223>n＝肌苷<400>7ggatccctng aaaattgaga gaagtccacc acgggatcc39<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8aataccgcag agtctagact cgtgg 25<210>9
<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9catcaggayt cctagga17<210>10<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10aattctaata cgactcacta tagggagagg cccggcatgt ggtgcataa 49<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>11ttccttacat ctctcacccg cta 23<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>12gcatgctgta accacgcact ctcctcgcat gc 3權(quán)利要求
1.基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的方法，該方法從可選存在于樣品中的DNA開(kāi)始，其包括下列步驟-在擴(kuò)增緩沖液中溫育樣品，該溫育體系中含有一或多種能夠在所選限制位點(diǎn)切割DNA的限制性內(nèi)切酶，該限制性內(nèi)切酶在該DNA鏈上形成指定的3′末端，及啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物的5′區(qū)域包含被依賴DNA的RNA聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子序列且其3′區(qū)域與該DNA鏈的指定的3′末端互補(bǔ)，第二引物，其具有與啟動(dòng)子引物相反的極性且含有目標(biāo)序列的5′末端，以及在ssDNA作為目標(biāo)核酸序列的情況下，含有限制性引物；-將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行限制性內(nèi)切酶的消化；-將樣品以足以失活限制性內(nèi)切酶和/或?qū)е码p鏈的單鏈化的溫度和時(shí)間進(jìn)行加熱處理；-向樣品中加入下列試劑，具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶具有RNA酶H活性的酶具有RNA聚合酶活性的酶；并且-將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中DNA為單鏈且以使用聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性引物而聯(lián)合啟動(dòng)子引物的功能和限制性引物的功能，該聯(lián)合型啟動(dòng)子和限制性引物含有與包括目標(biāo)ssDNA的限制位點(diǎn)的區(qū)域互補(bǔ)的序列和可被依賴DNA的RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中在加熱處理之前向初始的溫育混合物中加入適當(dāng)?shù)娜姿岷塑铡?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所用逆轉(zhuǎn)錄酶聯(lián)合了具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶和具有依賴DNA的DNA活性的酶的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中使用本身具有RNA酶H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶而代替以下3種酶，即具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶、具有依賴DNA的DNA活性的酶以及具有RNA酶H活性的酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中溫育溫度為35℃至大約45℃，優(yōu)選為大約37-41℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中加熱步驟在92-98℃的溫度進(jìn)行，優(yōu)選在大約95℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的方法，該方法從可選存在于樣品中的DNA開(kāi)始，其包括下列步驟在擴(kuò)增緩沖液中溫育樣品，該溫育體系中含有一或多種能夠在所選限制位點(diǎn)切割DNA的限制性內(nèi)切酶，該限制性內(nèi)切酶在該DNA鏈上形成指定的3′末端，及啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物的5′區(qū)域包含被依賴DNA的RNA聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子序列且其3′區(qū)域與該DNA鏈的指定的3′末端互補(bǔ)，第二引物，其具有與啟動(dòng)子引物相反的極性且含有目標(biāo)序列的5′末端，以及在ssDNA作為目標(biāo)核酸序列的情況下含有限制性引物；將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行限制性內(nèi)切酶的消化；將樣品以一定的溫度和時(shí)間進(jìn)行加熱處理，該溫度和時(shí)間足以失活限制性內(nèi)切酶和/或?qū)е码p鏈的單鏈化；向樣品中加入下列試劑，具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶，具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶，具有RNA酶H活性的酶，具有RNA聚合酶活性的酶；并且將如此形成的反應(yīng)混合物在適當(dāng)?shù)臈l件下保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行擴(kuò)增。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1582339SQ02807706
公開(kāi)日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2002年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月7日
發(fā)明者B·A·L·M·戴曼, I·M·弗蘭森, A·M·W·斯特里普 申請(qǐng)人:拜奧默里克斯有限公司