專利名稱：中國對蝦s33微衛(wèi)星標記的檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中國對蝦DNA分子遺傳標記技術(shù)，是一種檢測中國對蝦S33微衛(wèi)星標記技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明做出之前，國內(nèi)外有類似的研究報道，國內(nèi)中科院海洋所徐鵬等(2001a，2001b)發(fā)表的《用PCR法快速篩選中國對蝦含微衛(wèi)星的重組陽性克隆》和《中國對蝦微衛(wèi)星DNA的篩選》等論文，曾報道了中國對蝦部分基因組文庫的構(gòu)建、含微衛(wèi)星序列的篩選等內(nèi)容，并依據(jù)Weber(1990)提出的標準對微衛(wèi)星核心序列進行了評價，但他的這些研究結(jié)果僅限于研究微衛(wèi)星序列的獲得，沒有進一步應(yīng)用開發(fā)。法國海洋開發(fā)研究院(IFREMER)1999年已經(jīng)從藍對蝦種群中找到10個微衛(wèi)星標記，從斑節(jié)對蝦中找到3個微衛(wèi)星標記，這些標記在識別混養(yǎng)的不同家系時發(fā)揮了作用，但未見公布微衛(wèi)星標記序列和引物序列。目前，尚未見中國對蝦微衛(wèi)星多態(tài)性圖譜的構(gòu)建、特異性遺傳標記和系譜認證等方面應(yīng)用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明其目的是提出一種中國對蝦DNA分子遺傳標記技術(shù)，主要利用建立的中國對蝦部分基因組文庫中的含有微衛(wèi)星核心序列，在其兩端設(shè)計特異性引物進行PCR檢測，從而快速地檢測中國對蝦每個個體在此微衛(wèi)星區(qū)的遺傳變異，獲得該引物對中國對蝦多態(tài)性圖譜，通過圖譜直觀地檢測出每個個體的基因型。
本發(fā)明是按照以下操作技術(shù)方案完成的首先提取中國對蝦基因組DNA并稀釋備用；再利用中國對蝦基因組文庫中的含有微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引物；然后使用該引物對中國對蝦不同地理群或中國對蝦群內(nèi)個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行檢測；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，并獲得中國對蝦的遺傳多態(tài)性圖譜。
提取中國對蝦基因組DNA，將其稀釋為50ng/μl，每個PCR反應(yīng)中加入2μl，反應(yīng)總體積為25μl。
S33微衛(wèi)星核心序列的特異性引物序列分別為正鏈5’-CCT TGA CACGGC ATT GAT TGG-3’，負鏈5’-TAC GTT GTG CAA ACG CCA AGC-3’，使用該引物時的退火溫度為64℃。
PCR擴增的加樣參數(shù)為每個PCR反應(yīng)總體積為25μl，包括100ng中國對蝦基因組DNA；10X PCR Buffer，2.5μl；Mg++2.0mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；本發(fā)明的引物各0.2μmol/L；加ddH2O至25μl。使用該引物時設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為94℃變性2min；94℃40sec，64℃1min，72℃，1min，25個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
PCR產(chǎn)物的檢測將PCR產(chǎn)物在8％的變性聚丙烯酰胺凝膠，12W恒功率電泳1-1.5小時進行分離。將膠板通過10％的冰醋酸溶液20min→蒸餾水6min→0.1％的硝酸銀溶液25min→3％的碳酸鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即可得到中國對蝦在S33基因座位的多態(tài)性圖譜。
應(yīng)用該引物和所述的技術(shù)方法，可以檢測中國對蝦的每個個體在此微衛(wèi)星核心區(qū)的遺傳變異，通過圖譜即可讀出其基因型，方便、快捷、準確。其次，相對于其它分子遺傳標記技術(shù)而言微衛(wèi)星標記符合孟德爾遺傳模式，呈共顯性遺傳，因此，可以區(qū)分個體是純合子和雜合子狀態(tài)。
本發(fā)明適用于中國對蝦群體遺傳標記、系譜認證、遺傳圖譜構(gòu)建等應(yīng)用。PCR引物是本發(fā)明的核心，在中國對蝦總?cè)簷z測中呈現(xiàn)多態(tài)性。
本發(fā)明技術(shù)具有以下特點(1)本發(fā)明可快捷的獲得中國對蝦的S33遺傳標記基因座位的遺傳變異圖譜，方法簡便，所得結(jié)果可直觀地檢測出中國對蝦每個個體的基因型；(2)本發(fā)明主要應(yīng)用于中國對蝦群體間遺傳標記、系譜認證和遺傳圖譜的構(gòu)建等。


圖1本發(fā)明的S33引物對中國對蝦60個個體的檢測圖譜，編號1-60是中國對蝦的60個個體，M是DL2000標準分子量。
具體實施例方式
下面通過實施例詳細敘述本發(fā)明在中國對蝦S33微衛(wèi)星核心序列DNA分子遺傳標記技術(shù)方法。首先提取中國對蝦基因組DNA并稀釋備用；再利用中國對蝦基因組文庫中的含有微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引物；然后使用該引物對中國對蝦不同地理群或中國對蝦群內(nèi)個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行檢測；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，并獲得中國對蝦的遺傳多態(tài)性圖譜。
1、中國對蝦基因組DNA的提取取對蝦肌肉組織100mg，剪碎后放入1.5ml離心管中，加入pH8.0的TE溶液(10mmol/L Tris-CI，10mmol/L EDTA)500μl，用研磨棒研磨。加入10％SDS溶液25μl，混勻。加入20mg/ml蛋白酶K 4μl，混勻，55℃消化2.5～3h。重蒸酚抽提兩次，每次10min，12000轉(zhuǎn)/min離心5min，取上清；酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，10min，12000轉(zhuǎn)/min離心5min，取上清；氯仿抽提一次5min，5000g離心5min，取上清。加入1/25體積的5mol/L NaCl溶液，混勻后再加入兩倍體積的-20℃的無水乙醇沉淀DNA 15min；挑出的DNA，用70％的乙醇洗滌數(shù)十分鐘，使DNA干燥，用滅菌水500μl充分溶解后，定量將其稀釋成50ng/μl的濃度備用。
2、微衛(wèi)星引物的設(shè)計在中國對蝦基因組文庫基礎(chǔ)上，利用微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列在同一物種相對于核心序列的高度保守性，據(jù)此在其兩端設(shè)計特異性引物，用其擴增出該位點的微衛(wèi)星片段。由于微衛(wèi)星核心序列突變率相對較高，造成微衛(wèi)星DNA核心序列重復次數(shù)的增加或減少，即微衛(wèi)星DNA序列長度的變化，這是檢測微衛(wèi)星多態(tài)性的根源。本發(fā)明的的微衛(wèi)星區(qū)核心序列兩端的特異性引物序列為正鏈5’-CCT TGA CAC GGC ATT GAT TGG-3’，負鏈5’-TAC GTT GTG CAA ACG CCA AGC-3’，使用該引物時，其退火溫度是64℃。
3、PCR擴增首先加樣，加樣量如下中國對蝦基因組DNA(50ng/μl)，2μl；10XPCR Buffer，2.5μl；Mg++(25mmol/L)，2μl；Tag酶(5u/μl)，0.2μl；dNTP(各2.5mmol/L)，2μl；本發(fā)明的引物(各10Pmol/μl)，2μl；加滅菌水至25μl。其次，進行PCR反應(yīng)，其PCR擴增儀程序參數(shù)為94℃變性2min；94℃40sec，64℃1min，72℃，1min，25個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
5、PCR產(chǎn)物的檢測PCR反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物在8％的變性聚丙烯酰氨的凝膠中進行電泳，電泳儀的的功率為12瓦，電泳的時間在1-1.5小時左右，即可終止。將膠板通過10％的冰醋酸溶液20min→蒸餾水6min→0.1％的硝酸銀溶液25min→3％的碳酸鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即得到如圖1所示的多態(tài)性圖譜。
權(quán)利要求
1.一種中國對蝦S33微衛(wèi)星標記的檢測技術(shù)，其特征在于它的技術(shù)操作程序是首先提取中國對蝦基因組DNA并稀釋備用；再利用中國對蝦基因組文庫中含有微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引物；然后使用該引物對中國對蝦不同地理群或中國對蝦群內(nèi)個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行檢測；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，并獲得中國對蝦的遺傳多態(tài)性圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中國對蝦S33微衛(wèi)星標記的檢測技術(shù)，其特征在于提取中國對蝦基因組DNA，將其稀釋為50ng/μl，每個PCR反應(yīng)中加入2μl，反應(yīng)總體積為25μl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中國對蝦S33微衛(wèi)星標記的檢測技術(shù)，其特征在于在其S33微衛(wèi)星核心序列兩端設(shè)計的特異性引物序列分別為正鏈5’-CCT TGA CAC GGC ATT GAT TGG-3’，負鏈5’-TAC GTT GTG CAAACG CCA AGC-3’，使用該引物時的退火溫度為64℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中國對蝦S33微衛(wèi)星標記的檢測技術(shù)，其特征在于對中國對蝦不同地理群或中國對蝦群內(nèi)個體的基因組DNA進行的PCR擴增，其加樣參數(shù)為每個PCR反應(yīng)總體積為25μl，包括100ng中國對蝦基因組DNA；10X PCR Buffer，2.5μl；Mg++2.0mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；本發(fā)明的引物各0.2μmol/L；加ddH2O至25μl；使用該引物時設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為94℃變性2min；94℃40sec，64℃1min，72℃，1min，25個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中國對蝦S33微衛(wèi)星標記的檢測技術(shù)，其特征在于對PCR產(chǎn)物進行檢測將PCR產(chǎn)物在8％的變性聚丙烯酰胺凝膠，12W恒功率電泳1-1.5小時進行分離。將膠板通過10％的冰醋酸溶液20min→蒸餾水6min→0.1％的硝酸銀溶液25min→3％的碳酸鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即可得到中國對蝦在S33基因座位的多態(tài)性圖譜。
全文摘要
一種中國對蝦S33微衛(wèi)星標記的檢測技術(shù)首先提取中國對蝦基因組DNA；再利用中國對蝦基因組文庫中的含有微衛(wèi)星序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引物；并對中國對蝦的基因組DNA進行PCR擴增，將獲得的PCR產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；對產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進行分析，并獲得中國對蝦的遺傳多態(tài)性圖譜。本發(fā)明適用于中國對蝦群體遺傳標記、系譜認證、遺傳圖譜構(gòu)建等檢測技術(shù)。方便、快捷、準確，可直觀地檢測出中國對蝦每個個體的基因型。
文檔編號C12Q1/68GK1488765SQ0213571
公開日2004年4月14日 申請日期2002年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月9日
發(fā)明者劉萍, 孟憲紅, 孔杰, 王偉繼, 張慶文, 費日偉, 王清印, 劉 萍 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所