大菱鲆生長(zhǎng)相關(guān)位點(diǎn)Sma-USC114及檢測(cè)引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及大菱鲆生長(zhǎng)相關(guān)位點(diǎn)Sma-USC114及檢 測(cè)引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)隨著生物技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用分子遺傳學(xué)原理和基因工程、分子 標(biāo)記輔助育種技術(shù)，對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)與生長(zhǎng)相關(guān)的功能基因進(jìn)行篩選和克隆，取得了一系列成 果，為進(jìn)一步選育快速生長(zhǎng)的魚(yú)類(lèi)新品種奠定了基礎(chǔ)。其中，微衛(wèi)星分子標(biāo)記，因其具有多 態(tài)性豐富、方法簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)（徐莉等，2002)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)性狀 的篩選工作中。王美玉等（2012)檢測(cè)半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis)半同胞家系， 篩選出12個(gè)與全長(zhǎng)、體高、體重顯著或極顯著相關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)；葉華等（2014)利用51個(gè) 大黃魚(yú)微衛(wèi)星標(biāo)記，以一個(gè)匕家系為實(shí)驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)了 9個(gè)與體長(zhǎng)、體高、體質(zhì)量顯著或極 顯著相關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)；賈志武等（2012)分析鯽微衛(wèi)星標(biāo)記與幾個(gè)生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，獲 得了 4個(gè)標(biāo)記及基因型。以上所得的微衛(wèi)星標(biāo)記在分子輔助育種方面起到了重要的指導(dǎo)作 用。本實(shí)驗(yàn)室許可等（2009)采用分群分離分析法，以同一批受精卵孵化的同池養(yǎng)殖大菱鲆 生長(zhǎng)性狀發(fā)生分離的群體為材料，進(jìn)行微衛(wèi)星遺傳分析，發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)Smc09在226bp的等位 基因片段與生長(zhǎng)性狀的正相關(guān)性顯著，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.354。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用此引物進(jìn)行了 長(zhǎng)期的大菱鲆快速生長(zhǎng)品系的選育工作，取得良好效果。然而，由于不斷近交，家系后代中 具有此片段的大菱鲆個(gè)體越來(lái)越多，繼續(xù)應(yīng)用此引物評(píng)估新建家系的生長(zhǎng)性能變得相對(duì)困 難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供大菱鲆生長(zhǎng)相關(guān)位點(diǎn)Sma-USC114及檢測(cè)引物， 所述位點(diǎn)與大菱鲆生長(zhǎng)性能具有極其顯著的相關(guān)性，并用得到的引物檢測(cè)與指導(dǎo)大菱鲆生 長(zhǎng)性狀選育，從而為快速生長(zhǎng)大菱鲆的選育工作提供科學(xué)的輔助工具。
[0004] 本發(fā)明是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0005] 大菱鲆生長(zhǎng)相關(guān)位點(diǎn)Sma-USC114,其與快速生長(zhǎng)極顯著正相關(guān)的155bp處擴(kuò)增片 段A的序列為
[0006] TAAGGTTGTGAGTGTTTGGTGGCAGGGGCTCTTCTTCTGACTCTATCTGTCTATCTGTCTATCTATC TATCTATCTATCTATCTATCCTTCCTTCCTTCCTTGCATCCATCCAATAGATTATTCTACCTCCTTTTACTCGAC ACCAACAGGGGATAGA〇
[0007] 大菱鲆生長(zhǎng)相關(guān)位點(diǎn)Sma-USC114的檢測(cè)引物，其序列為
[0008] R:TCTATCCCCTGTTGGTGTC，F(xiàn):AAGGTTGTGAGTGTTTGGTG。
[0009] 本發(fā)明還提供一種大菱鲆快速生長(zhǎng)個(gè)體的快速檢測(cè)方法，包括提取大菱鲆基因組 DNA，利用所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度55°C。
[0010] 本發(fā)明還提供一種上述位點(diǎn)在大菱鲆生長(zhǎng)性狀選育中的應(yīng)用，利用上述引物對(duì)大 菱鲆DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷為154-174bp，共出現(xiàn)3個(gè)擴(kuò)增片段，根據(jù)片段由小到大，依次 命名為A、B、C，其中，具有155bp處擴(kuò)增片段A的個(gè)體為快速生長(zhǎng)個(gè)體，具有170bp處擴(kuò)增 片段C的個(gè)體為慢速生長(zhǎng)個(gè)體。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
[0012] 本發(fā)明的微衛(wèi)星位點(diǎn)Sma-USC114與大菱鲆生長(zhǎng)性能具有極其顯著的相關(guān)性，用 來(lái)檢測(cè)大菱鲆生長(zhǎng)性能，從而為大菱鲆快速生長(zhǎng)選育工作提供科學(xué)的輔助工具。該發(fā)明所 得標(biāo)記與之前報(bào)道的分子標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1)該標(biāo)記多態(tài)性并不十分豐富，僅僅具有 三個(gè)擴(kuò)增片段，檢測(cè)時(shí)方便快捷。（2)該標(biāo)記同時(shí)有兩個(gè)擴(kuò)增片段與生長(zhǎng)性狀極顯著相關(guān)， 155bp處擴(kuò)增片段A與快速生長(zhǎng)性狀成極顯著正相關(guān)性，170bp處擴(kuò)增片段C與快速生長(zhǎng)性 狀成極顯著負(fù)相關(guān)性。（3)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的二次驗(yàn)證，且二次驗(yàn)證采用的大菱鲆為相距較遠(yuǎn)的日 照普通養(yǎng)殖群體，具有較強(qiáng)的說(shuō)服力。（4)對(duì)155bp處擴(kuò)增片段A進(jìn)行切膠回收，克隆測(cè)序， 將測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，證實(shí)該片段序列和大菱鲆發(fā)布的基因組一段高度 吻合，同源性達(dá)到97%，基因登陸號(hào)為DQ810914. 1，使得該標(biāo)記更具有研宄意義，并且在快 速生長(zhǎng)個(gè)體鑒定中更具科學(xué)性；魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)性狀作為數(shù)量性狀，可量可測(cè)，驗(yàn)證方便，對(duì)實(shí) 際生產(chǎn)的增產(chǎn)增收具有重要意義。因此研宄與快速生長(zhǎng)性狀相關(guān)的標(biāo)記具有重要價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 下面通過(guò)實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受 實(shí)施例任何形式上的限制。
[0014] 圖1 :300條？3同一家系大菱鮮體長(zhǎng)的正態(tài)分布圖譜，偏度系數(shù)為_(kāi)0. 715,峰度系 數(shù)為0. 141，兩個(gè)系數(shù)都小于1，可認(rèn)為近似于正態(tài)分布；
[0015] 圖2 :300條？3同一家系大菱鲆體重的正態(tài)分布圖譜：偏度系數(shù)為-0. 166,峰度系 數(shù)為0. 175,兩個(gè)系數(shù)都小于1，可認(rèn)為近似于正態(tài)分布；
[0016] 圖3 :Sma-USC114引物對(duì)匕同一家系大菱鲆60個(gè)個(gè)體PCR擴(kuò)增結(jié)果圖譜；圖中， M :50bp Maker，A為Sma-USC114的擴(kuò)增片段A，C為擴(kuò)增片段C
[0017] 圖4 :300條日照同齡同池孵化喂養(yǎng)的普通養(yǎng)殖大菱鲆體長(zhǎng)的正態(tài)分布圖譜，偏度 系數(shù)為〇. 005,峰度系數(shù)為0. 349,兩個(gè)系數(shù)都小于1，可認(rèn)為近似于正態(tài)分布；
[0018] 圖5 :300條日照同齡同池孵化喂養(yǎng)的普通養(yǎng)殖大菱鲆體重的正態(tài)分布圖譜，偏度 系數(shù)為_(kāi)〇. 255,峰度系數(shù)為-0. 684,兩個(gè)系數(shù)都小于1，可認(rèn)為近似于正態(tài)分布；
[0019] 圖6 :Sma-USC114引物對(duì)日照普通養(yǎng)殖群體大菱鲆60個(gè)個(gè)體PCR擴(kuò)增結(jié)果圖譜， 圖中M :50bp Maker，A為Sma-USC114的擴(kuò)增片段A，C為擴(kuò)增片段C。
【具體實(shí)施方式】 [0020] 實(shí)施例1
[0021] 利用所述引物對(duì)大菱鲆樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的Sma-USC114引物序列如 T;R:TCTATCCCCTGTTGGTGTC，F(xiàn):AAGGTTGTGAGTGTTTGGTG
[0022] 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0023] 所述的PCR反應(yīng)體系：
[0024] 15yl 體系如下：包括 lOXbuffer 1.3yl、dNTP 1. lyl、上下游引物各 0.7yl、 模板DNA 1. 0 y 1、ddH20 10 y 1，rTaq酶0? 2 y 1。
[0025] PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，復(fù)性溫度根據(jù)引物退火溫度設(shè) 定，退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7min，4°C保存。
[0026] 所述變性反應(yīng)程序：95°C 5min，在PCR每個(gè)樣品中加入4. 5yl的變性buffer，它 包括甲酰胺，〇. 5XEDTA，溴酚藍(lán)，二甲苯氰化。
[0027] 所述聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)：
[0028] PAGE膠的制備包括：8%丙烯酰胺40ml，它包括尿素，硼酸，Tris堿，EDTA，PAGE， ddH 20 ; 1 %過(guò)硫酸銨溶液 400 y 1 ;TEMED 40 y 1。
[0029] 電泳程序：電泳儀（DYY-10C)電壓500V，電流60mA，功率30W，電泳2-3h。
[0030] PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：將PCR變性后產(chǎn)物在濃度為8 %變性聚丙烯酰胺凝膠中，30W恒 功率電泳。將帶有PAGE膠的板放入AgN03溶液輕搖染色，超純水快速?zèng)_洗膠板；把膠板轉(zhuǎn) 移到氫氧化鈉與甲醛混合而成的顯色液中輕搖至帶紋出現(xiàn)；用超純水清洗玻璃板兩次；將 膠板置于室溫下自然干燥；終反應(yīng)即得到PCR結(jié)果圖譜，收集數(shù)據(jù)，用SPSS16. 0軟件分析等 位基因與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：155bp處擴(kuò)增片段A與快速生長(zhǎng)性狀成極顯著正 相關(guān)性，170bp處擴(kuò)增片段C與快速生長(zhǎng)性狀成極顯著負(fù)相關(guān)。通過(guò)切膠回收，克隆測(cè)序獲 得Sma-USC114位點(diǎn)的擴(kuò)增片段A的基因序列為：
[0031] TAAGGTTGTGAGTGTTTGGTGGCAGGGGCTCTTCTTCTGACTCTATCTGTCTATCTGTCTATCTATC TATCTATCTATCTATCTATCCTTCCTTCCTTCCTTGCATCCATCCAATAGATTATTCTACCTCCTTTTACTCGAC ACCAACAGGGGATAGA
[0032] 實(shí)施例2大菱鲆生長(zhǎng)快組與生長(zhǎng)慢組的挑選
[0033] 取2013年于煙臺(tái)構(gòu)建的快速生長(zhǎng)品系F3的一個(gè)同池飼養(yǎng)的8月齡大菱鲆家系， 測(cè)量記錄此家系中300尾大菱鲆的體長(zhǎng)、體重?cái)?shù)據(jù)，建立體長(zhǎng)、體重正態(tài)分布圖，見(jiàn)圖1和圖 2,舍去90 %的體長(zhǎng)與體重的中間類(lèi)型，最終確定應(yīng)用此家系中體長(zhǎng)大于19cm，且體重高于 144g的個(gè)體構(gòu)建F (fast)組；體長(zhǎng)小于10cm，且體重低于78g的個(gè)體構(gòu)建S (slow)組。兩 個(gè)組各取30尾，活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，剪取尾鰭，提取DNA，保存于-20°C中。以備用于生長(zhǎng)快與 生長(zhǎng)慢個(gè)體進(jìn)行SSR分析。
[0034] (l)PCR反應(yīng)：
[0035] 15 y 1體系如下：包括lOXbuffer 1. 3 y 1、dNTP 1. 1 y 1、上下游引物 (R:TCTATCCCCTGTTGGTGTC，F(xiàn):AAGGTTGTGAGTGTTTGGTG)
[0036]各0? 7 y 1、模板DNA 1. 0 y 1、ddH20 10 y 1，rTaq酶0? 2 y 1。
[0037] PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，復(fù)性溫度（視具體引物Tm值定） 退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7min，4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行變 性，變性反應(yīng)程序：95°C 5min。在PCR每個(gè)樣品中加入4. 5yl的變性buffer，它包括甲酰 胺，0. 5XEDTA，溴酚藍(lán)，二甲苯氰化。
[0038] (2) SSR差異擴(kuò)增片段的檢測(cè)
[0039] 變性結(jié)束后，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)呈現(xiàn)結(jié)果，見(jiàn)圖3,根據(jù)膠體上出現(xiàn)片 段由小到大，分別命名為A、B、C，對(duì)比F組與S組中出現(xiàn)頻率差距較大的擴(kuò)增片段，收集數(shù) 據(jù)。
[0040] (3)差異擴(kuò)增片段的統(tǒng)計(jì)分析
[0041] 使用SPSS采用卡方檢驗(yàn)對(duì)SSR位點(diǎn)在生長(zhǎng)快速組和生長(zhǎng)慢速組中的出現(xiàn)頻率差 距較大的擴(kuò)增片段進(jìn)行分析。進(jìn)行皮爾遜檢驗(yàn)（Pearson correlation)對(duì)差異擴(kuò)增片段與 大菱鲆生長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果如下表1-表2
[0042] 表1位點(diǎn)Sma_USC114在大菱鲆F組和S組中差異擴(kuò)增片段的頻率分布
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 大菱鲆生長(zhǎng)相關(guān)位點(diǎn)Sma-USC114,其特征在于所述位點(diǎn)與快速生長(zhǎng)極顯著正相關(guān) 的155bp處擴(kuò)增片段A的序列為 TAAGGTTGTGAGTGTTTGGTGGCAGGGGCTCTTCTTCTGACTCTATCTGTCTATCTGTCTATCTATCTATC TATCTATCTATCTATCCTTCCTTCCTTCCTTGCATCCATCCAATAGATTATTCTACCTCCTTTTACTCGACACCAA CAGGGGATAGAo
2. 檢測(cè)權(quán)利要求1所述的大菱鲆生長(zhǎng)相關(guān)位點(diǎn)Sma-USClM的引物，其特征在于它的序 列為R:TCTATCCCCTGTTGGTGTC，F(xiàn):AAGGTTGTGAGTGTTTGGTG。
3. -種大菱鲆快速生長(zhǎng)個(gè)體的快速檢測(cè)方法，其特征在于它包括提取大菱鲆基因組 DNA，利用權(quán)利要求2所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度55°C。
4. 一種權(quán)利要求1所述位點(diǎn)在大菱鲆生長(zhǎng)性狀選育中的應(yīng)用，其特征在于利用權(quán)利要 求2所述引物對(duì)大菱鲆DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷為154-174bp，共出現(xiàn)3個(gè)擴(kuò)增片段，根據(jù)片 段由小到大，依次命名為A、B、C，其中，具有155bp處擴(kuò)增片段A的個(gè)體為快速生長(zhǎng)個(gè)體，具 有170bp處擴(kuò)增片段C的個(gè)體為慢速生長(zhǎng)個(gè)體。
5. 權(quán)利要求2所述引物在大菱鲆生長(zhǎng)性狀選育中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】大菱鲆生長(zhǎng)相關(guān)位點(diǎn)Sma-USC114及檢測(cè)引物，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，所述位點(diǎn)與大菱鲆生長(zhǎng)性能具有極其顯著的相關(guān)性，用得到的引物檢測(cè)與指導(dǎo)大菱鲆生長(zhǎng)性狀選育，從而為快速生長(zhǎng)大菱鲆的選育工作提供科學(xué)的輔助工具。
【IPC分類(lèi)】C12N15-11, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104789679
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510194011
【發(fā)明人】馬愛(ài)軍, 田岳強(qiáng)
【申請(qǐng)人】中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月23日