一種基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的 探針及其檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)在生物研宄和藥物診斷領(lǐng)域起著非常重要的作用。然而，由于 蛋白質(zhì)經(jīng)常處于非常低的濃度，往往需要高靈敏的分析檢測(cè)法才能將其檢測(cè)出來(lái)，因此能 夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)分子高靈敏性、高選擇性、簡(jiǎn)單快捷的檢測(cè)一直是人們研宄的方向。目前，在蛋 白質(zhì)的定量檢測(cè)方法中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)是最常用的方法，該方法雖然可以達(dá) 到定量分析的目的，但受酶-底物反應(yīng)的限制，其檢測(cè)靈敏度仍無(wú)法對(duì)微量的蛋白質(zhì)分子 進(jìn)行檢測(cè)，因而限制了其在疾病早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值，又由于其操作步驟比較復(fù)雜，導(dǎo) 致影響結(jié)果的因素較多，如操作時(shí)間和操作過(guò)程要求比較嚴(yán)格；線性范圍較窄；特異性較 差，血清中各種物質(zhì)的干擾會(huì)影響反應(yīng)結(jié)果；陰陽(yáng)性的界定比較模糊，需要重復(fù)試驗(yàn)；手工 操作繁瑣，難以自動(dòng)化和批量化；不同批次的反應(yīng)差異較大，結(jié)果難歸一化。因此，現(xiàn)在經(jīng) 常將信號(hào)擴(kuò)增策略用于蛋白質(zhì)分子檢測(cè)的生物傳感器的構(gòu)建中。在過(guò)去的幾十年里，相 當(dāng)一部分的擴(kuò)增策略已被結(jié)合到蛋白質(zhì)的檢測(cè)中，例如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)，連接酶鏈反 應(yīng)（LCR)，滾環(huán)擴(kuò)增（RCA)。這些擴(kuò)增技術(shù)極大地提高了蛋白質(zhì)檢測(cè)的靈敏性，但由于他們 嚴(yán)重依賴于模板復(fù)制，增加了在擴(kuò)增過(guò)程中出現(xiàn)交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn) (J. Dong, X. Cui, Y. Deng, Z. Tang, Biosens. Bioelectron.，2012)。所以，對(duì)于蛋白質(zhì)傳感擴(kuò) 增策略的開發(fā)仍然是需要進(jìn)一步的探索研宄。
[0003] 最近，目標(biāo)催化發(fā)夾自組裝作為一種有前景的酶免信號(hào)擴(kuò)增策略被報(bào)道用于生物 分子的檢測(cè)，而依據(jù)酶免信號(hào)擴(kuò)增策略設(shè)計(jì)的光學(xué)生物傳感器中常常使用到DNA酶。DNA酶 (也稱脫氧核酶或催化DNA)是單鏈寡脫氧核苷酸，具有催化化學(xué)反應(yīng)的能力，與傳統(tǒng)的蛋 白質(zhì)酶相比較，DNA酶具有高的熱穩(wěn)定性，核酸合成的簡(jiǎn)易性，將識(shí)別區(qū)域編入DNA酶序列 的靈活性，這些性質(zhì)使得DNA酶成為生物傳感的理想選擇。在過(guò)去十年里，G-四鏈體DNA酶 已被廣泛地設(shè)計(jì)應(yīng)用到許多的光學(xué)生物傳感器。G-四鏈體可以結(jié)合輔因子氯化血紅素，形 成G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶，在H 202介導(dǎo)下催化氧化5-氨基-2, 3-二氯-1，4-苯二 甲酰肼（魯米諾），2, 2' -聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS2》，或硫胺素，并伴 隨有化學(xué)光發(fā)射，顏色改變或熒光發(fā)射。因此，基于G-四鏈體DNA酶建立起了化學(xué)發(fā)光，比 色或熒光的生物傳感系統(tǒng)。其中，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)引起了更多的關(guān)注，這主要取決于其操作簡(jiǎn) 便，靈敏度高，并且不需要昂貴的分析儀器。至今，一些基于該策略的生物傳感器被成功地 開發(fā)出來(lái)，然而這其中大部分的生物傳感器主要針對(duì)于核酸的檢測(cè)。
[0004] 如，中國(guó)專利文獻(xiàn)CN102827836A公開了一種寡核苷酸探針以及用其對(duì)靶分子進(jìn) 行檢測(cè)的方法，上述探針為基于靶分子設(shè)計(jì)的具有粘性末端的DNA-對(duì)發(fā)夾序列，實(shí)質(zhì)是 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)夾序列與G-四鏈體序列相結(jié)合的產(chǎn)物。當(dāng)反應(yīng)體系中不存在靶分子時(shí)， 兩個(gè)發(fā)夾序列保持亞穩(wěn)態(tài)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶分子時(shí)，靶分子便可與第一個(gè) 發(fā)夾序列特異性結(jié)合，破壞其二級(jí)結(jié)構(gòu)并釋放剩余的G-四鏈體序列，第一個(gè)發(fā)夾釋放的自 由的G-四鏈體序列可與第二個(gè)發(fā)夾序列雜交，破壞第二個(gè)發(fā)夾并釋放出與靶分子具有相 同作用的核酸序列，也可與第一個(gè)發(fā)夾的靶分子特異性識(shí)別部分特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致兩 個(gè)發(fā)夾級(jí)聯(lián)雜交，如此周而復(fù)始，最終形成類似雙鏈DNA的大分子聚合物，被釋放的大量自 由的G-四鏈體序列即可與氯化血紅素（hemin)結(jié)合，催化氧化H 202介導(dǎo)的ABTS，從而檢測(cè) 靶分子。但是上述探針檢測(cè)靶分子時(shí)，存在以下問(wèn)題：
[0005] (1)背景噪聲較大、靈敏度較差。具體而言，在反應(yīng)體系中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)與未形成發(fā) 夾結(jié)構(gòu)的直鏈?zhǔn)潜３謩?dòng)態(tài)平衡的，直鏈未形成閉合的環(huán)而被保護(hù)，導(dǎo)致G-四鏈體序列并不 全是靶分子打開第一個(gè)發(fā)夾而釋放、進(jìn)而與第二個(gè)發(fā)夾雜交形成的，也有部分是直鏈的序 列與第二個(gè)發(fā)夾直接雜交，從而形成自由的G-四鏈體序列的，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn)較為靈敏的檢 測(cè)；
[0006] (2)利用堿基的雜交配位進(jìn)行靶分子的檢測(cè)，實(shí)際上僅能實(shí)現(xiàn)DNA的檢測(cè)，而無(wú)法 實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的檢測(cè)。
[0007] 鑒于此，目前亟待提出一種操作簡(jiǎn)單、成本低、低背景噪聲同時(shí)具有高靈敏度的檢 測(cè)蛋白質(zhì)分子的探針。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于現(xiàn)有技術(shù)中用于檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的探針靈 敏度低，背景噪聲大，進(jìn)而提供一種靈敏度高、低背景噪聲的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增 的探針。
[0009] 本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、 操作復(fù)雜和成本高，進(jìn)而提供一種操作簡(jiǎn)單、低成本的檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的方法。
[0010] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針， 包括第一發(fā)夾、第二發(fā)夾和第三發(fā)夾；所述第一發(fā)夾、第二發(fā)夾以及第三發(fā)夾均為單鏈線形 分子自身回折后，折疊區(qū)域內(nèi)的互補(bǔ)堿基配對(duì)雜交而成，其局部區(qū)域形成雙鏈結(jié)構(gòu)的部分 為莖干區(qū)，未形成雙鏈結(jié)構(gòu)并回折的部分為環(huán)狀區(qū)。
[0011] 所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，所述第一發(fā)夾包括：可特異性識(shí)別 目標(biāo)蛋白質(zhì)的適配體區(qū)（I)以及與所述適配體區(qū)（I)部分雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第一莖 干區(qū)（II);
[0012] 所述第二發(fā)夾包括：可與所述第一發(fā)夾的適配體區(qū)（I )部分雜交的第一堿基互 補(bǔ)區(qū)（I '）、可與所述第一莖干區(qū)（II)雜交的第二堿基互補(bǔ)區(qū)（II'），以及與所述第一堿 基互補(bǔ)區(qū)（I '）和第二堿基互補(bǔ)區(qū)（II'）部分雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第二莖干區(qū)（III);
[0013] 所述第三發(fā)夾包括：可與所述第二莖干區(qū)（III)部分雜交的第三堿基互補(bǔ)區(qū) (III'）以及與所述第三堿基互補(bǔ)區(qū)（III'）部分雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的G-四鏈體序列區(qū)（IV)。
[0014] 所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，所述第一莖干區(qū)（II )和所述第二 莖干區(qū)（III)的3'端為不易被外切酶剪切的穩(wěn)定序列。
[0015] 所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，所述第一莖干區(qū)（II )為從3'端開 始的第1_4堿基為T-T-T-T的序列；所述第二莖干區(qū)（II )為從3'端開始的第1-4堿基為 T-T-A-A的序列。
[0016] 所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，所述第一莖干區(qū)（II )的5'端部分 序列與所述適配體區(qū)（I )3'端連接形成所述第一發(fā)夾的環(huán)狀區(qū)。
[0017] 所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，所述第一莖干區(qū)（II )的5'端位于 所述環(huán)狀區(qū)的部分為從3'端開始的第1-4堿基為T-T-T-T的序列。
[0018] 所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，所述G-四鏈體序列區(qū)（IV )具有如 SEQIDNo.1所示的序列結(jié)構(gòu)。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的方法，利用所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信 號(hào)擴(kuò)增的探針進(jìn)行熒光檢測(cè)。
[0020] 所述的方法，包括如下步驟：
[0021] 分別取所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針和外切酶III加入到待測(cè)溶液 中，20-40°C下孵育80-100分鐘，隨后向其中加入氯化血紅素和HEPES緩沖液，20-40°C下孵 育50-70分鐘，然后向其中加入魯米諾和H 202，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)量，觀察或檢測(cè)混合液的發(fā) 光或變色情況。
[0022] 所述的方法，分別取所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針和外切酶III加入 到待測(cè)溶液中，37°C下孵育90分鐘，隨后向其中加入氯化血紅素和HEPES緩沖液，30°C下孵 育60分鐘，然后向其中加入魯米諾和H 202，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)量，觀察或檢測(cè)混合液的發(fā)光或 變色情況。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針在檢測(cè)蛋白質(zhì) 分子或光電檢測(cè)系統(tǒng)領(lǐng)域的用途。
[0024] 所述的用途，所述蛋白質(zhì)分子為能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。
[0025] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)，
[0026] (1)本發(fā)明所述的基于目標(biāo)觸發(fā)的雙重信號(hào)擴(kuò)增的探針，包括第一發(fā)夾、第二發(fā)夾 和第三發(fā)夾，所述第一發(fā)夾、第二發(fā)夾以及第三發(fā)夾均為單鏈線形分子自身回折后，折疊區(qū) 域內(nèi)的互補(bǔ)堿基配對(duì)雜交而成，其局部區(qū)域形成雙鏈結(jié)構(gòu)的部分為莖干區(qū)，未形成雙鏈結(jié) 構(gòu)并回折的部分為環(huán)狀區(qū)；第一發(fā)夾包括：可特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白質(zhì)的適配體區(qū)I以及與 適配體區(qū)I部分雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第一莖干區(qū)II ;第二發(fā)夾包括：可與第一發(fā)夾的適配 體區(qū)I部分雜交的第一堿基互補(bǔ)區(qū)I '、可與第一莖干區(qū)II雜交的第二堿基互補(bǔ)區(qū)II'，以 及與第一堿基互補(bǔ)區(qū)I '和第二堿基互補(bǔ)區(qū)II '部分雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第二莖干區(qū)III ;所 述第三發(fā)夾包括：可與第二莖干區(qū)III部分雜交的第三堿基互補(bǔ)區(qū)III'以及與第三堿基互補(bǔ) 區(qū)III'部分雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的G-四鏈體序列區(qū)IV ;上述