專利名稱：雙探針基因芯片信號放大方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利申請是下面相關(guān)專利申請技術(shù)內(nèi)容的擴(kuò)展和補(bǔ)充中國發(fā)明專利申請基因芯片聯(lián)合處理系統(tǒng)及相關(guān)技術(shù)，申請?zhí)?1126990.1。申請日2001年10月11日；基因芯片分子探針及相關(guān)技術(shù)，申請?zhí)?1142654.3。申請日2001年12月14日。
微陣列信號放大方法，申請?zhí)?3129124.4。申請日2003年7月23日。
國際專利申請基因芯片分子探針及相關(guān)技術(shù)，國際申請?zhí)朠CT/CN02/00887。申請日2002年12月13日。
引用的學(xué)術(shù)及專利文獻(xiàn)Harlow，E.和Lane，D.，1988，″AntibodiesA Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.Fliss等人，1993，App.Environ.Microb.59(8)2698-2705Stollar等人，1987，Anal.Biochem.161387-394Coutlee等人，1989，Anal.Biochem.18196-105.
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Kaufman等人的美國專利US PAT 6,383,754。May 7，2002Linsley等人的美國專利US Pat 6,232,068，May 15，2001Carrico美國專利U.S.Pat.No.4,833,084，May 23，1989所屬領(lǐng)域 本發(fā)明屬于基因芯片應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到基因芯片的雜交，標(biāo)記，洗脫，信號檢測及數(shù)據(jù)分析技術(shù)。
本發(fā)明技術(shù)背景 基因芯片是利用平行分析原理將大量不同序列的核酸分子，作為分析樣品中靶基因的基因探針，以微點(diǎn)陣方式固化在硅片，玻璃，尼龍膜等基質(zhì)上，從而制成通常意義上的基因芯片，或稱為DNA微陣列(1-2)。至目前，基因芯片在信號標(biāo)記方面仍然以CY3/CY5等熒光染料標(biāo)記為主。這種標(biāo)記試劑價(jià)格昂貴，而且靈敏度不高，在使用過程中對操作人員技術(shù)的要求也很高。另外，中國專利申請如本人的“基因芯片分子探針及相關(guān)技術(shù)，申請?zhí)?1142654.3”和“微陣列信號放大方法，申請?zhí)?3129124.4”雖提出了高荷信號載體進(jìn)行信號放大的標(biāo)記技術(shù)，通過雜交后對雜交雙鏈核酸進(jìn)行特異性標(biāo)記，但這種方法對于來自不同樣品的基因必須分兩次基因芯片實(shí)驗(yàn)才能比較出不同樣品中的基因含量。這種比較法在基因芯片的表達(dá)譜研究中尤為常見。目前通行的技術(shù)路線是用CY3[光激發(fā)后產(chǎn)生蘭色熒光]、CY5[光激發(fā)后產(chǎn)生紅色熒光]分別標(biāo)記不同樣品中的基因組，再將此不同標(biāo)記的靶基因溶液在同一個基因芯片上進(jìn)行雜交。通過最終顯示出來的熒光顏色來確定某一基因在不同樣品中的表達(dá)水平的差異。
但由于CY3/CY5在基因芯片檢測中出現(xiàn)靈敏度不足和價(jià)格昂貴的問題，而且不適合于基因芯片在臨床診斷方面的應(yīng)用，所以，目前基因芯片在臨床診斷領(lǐng)域的普及應(yīng)用過程進(jìn)展緩慢。
一種用來檢測差異表達(dá)基因的方法是首先分別從處于健康和疾病狀態(tài)的細(xì)胞、組織或器官用特異性的引物從樣本中通過PGR擴(kuò)增制備靶基因，或cDNA靶。在制備靶基因的合成中摻入了核苷單體dNTP及一部分與同位素[32P，33P，35S，125I]或熒光基團(tuán)[如香豆素(coumarin)及其衍生物；青色素染料[cyaninedyes]Cy3和Cy5]共價(jià)偶聯(lián)的核苷單體dNTP。從而合成帶有各種信號標(biāo)記并被擴(kuò)增的cDNA靶基因。來自不同的組織標(biāo)本的靶基因擴(kuò)增選用不同發(fā)射光波長的信號標(biāo)記物。然后將帶有標(biāo)記物來自不同細(xì)胞組織標(biāo)本的cDNA靶雜交到基因芯片上固定的探針片段上。雜交結(jié)果將被檢測并比較用來與相應(yīng)的疾病相關(guān)聯(lián)。目前的熒光標(biāo)記大多費(fèi)時而且過程煩瑣，還存在著靈敏度不足和形成靶-探針的二級結(jié)構(gòu)的問題。
本發(fā)明的目的 本發(fā)明的目的之一，是為基因芯片產(chǎn)品提供一套大幅度提升檢測靈敏度，經(jīng)濟(jì)實(shí)用性和可實(shí)現(xiàn)自動化運(yùn)行的信號放大標(biāo)記技術(shù)及試劑盒。
本發(fā)明與背景技術(shù)相比所產(chǎn)生的積極效果 本發(fā)明中所提供的方法不僅極大提高了基因芯片檢測靈敏度，處理時效，降低成本，同時還使非專業(yè)技術(shù)人員經(jīng)過簡短操作培訓(xùn)或指導(dǎo)，可以利用這種高度自動化的設(shè)備進(jìn)行高水平和高效率的基因分析。這一切都為基因芯片的普及化應(yīng)用提供了技術(shù)推動力。另外，作為一般性方法，無論是被應(yīng)用于固相[如基片式基因芯片等]還是液相溶液條件下[微流體芯片，毛細(xì)管電泳芯片，實(shí)驗(yàn)室芯片等]，該信號放大技術(shù)，有著PCR[聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，基因擴(kuò)增技術(shù)]技術(shù)和用于其他基因檢測中所用到的信號放大技術(shù)所不具備的諸多優(yōu)點(diǎn)。由于該技術(shù)不依賴基因擴(kuò)增，依靠簡單的生物、化學(xué)或電化學(xué)標(biāo)記，所以，該技術(shù)可以準(zhǔn)確定量、不易造成污染、可以避免假陽性檢測結(jié)果、試劑盒成本低廉、容易實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)，而且樣品制備簡易。這一切是PCR技術(shù)所達(dá)不到的。因此，它可以作為一般性的信號放大方法應(yīng)用在其他形式的核酸檢測中。歸納起來，本發(fā)明所帶來的有益效果有如下幾個方面1、為一般的基因芯片技術(shù)產(chǎn)品提供了超靈敏檢測的技術(shù)基礎(chǔ)，同時由此信號放大技術(shù)支持的處理儀器也可以產(chǎn)生很高的信噪比，滿足科研和臨床診斷等實(shí)用領(lǐng)域?qū)Τ`敏基因芯片檢測技術(shù)的需求，有利于推動基因芯片技術(shù)在臨床診斷、工商檢疫和環(huán)境檢測等方面的普及應(yīng)用，
2、本發(fā)明所提供的信號放大技術(shù)有利于實(shí)現(xiàn)自動化，使處理系統(tǒng)的集成化程度進(jìn)一步提高，系統(tǒng)處理過程進(jìn)一步簡化，使專業(yè)技術(shù)人員的處理效率提高，同時也降低了對非專業(yè)技術(shù)人員的專業(yè)技術(shù)要求，提高了基因芯片使用中結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性，3、本發(fā)明中使用雙探針也有利于提高基因芯片的檢測的特異性，4、本發(fā)明也為降低基因芯片處理系統(tǒng)的成本及運(yùn)行成本提供了技術(shù)支持，有利于基因芯片的普及應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)原理 本發(fā)明提出一種基因芯片雙探針放大標(biāo)記技術(shù)，這種基因芯片由基底及其表面的鍍層或涂層和固定在基底[縮寫為S]或鍍層[縮寫為C]表面的不少于兩個陣列式排列的探針組成，用于檢測樣品中的生物或化學(xué)靶物質(zhì)。基底和/或鍍層或涂層的材料可以由但不限于如下材料中任意一種或一種以上不同材料組合制成(1)無機(jī)片狀或平板狀材料類如玻璃、石英、云母，透明導(dǎo)電材料如透明導(dǎo)電氧化物類[TCO]，如氧化銦錫[indium tin oxide，ITO，或?qū)憺镮n2O3:Sn]、InAs、SnO2:F、砷化鎵[GaAs]、氧化鎂等鍍層，氧化錫[tin oxide，SnO]，ZnO，CdO，Cdln2O4，Cd2SnO4，Zn2SnO4和In2O3-ZnO等，以及碳/陶復(fù)合導(dǎo)電陶瓷，各種半導(dǎo)體材料等，以及多孔板模式，如微孔板、微滴板，(2)單質(zhì)類鉑、金、銀、鋁、鉻[Au，Ag，Pt，Cu，Rh，Pd，Al，Cr]等金屬以及硅等非金屬，(3)有機(jī)物類各種有機(jī)分子及其由此制成的自組裝單分子膜或自組裝多分子膜，(4)高分子類尼龍膜、塑料、橡膠、樹脂，硝酸纖維素膜。
基底的結(jié)構(gòu)可以是但不限于如下種類(1)薄片/平板式如玻璃片、硅片、尼龍膜、塑料片、(2)多孔板式如微孔板，微滴板式等，(3)電極式在薄片式基因芯片上以一定規(guī)律排列而成的各種電極陣列，如在半導(dǎo)體、絕緣體等基底上制成的鉑電極、金電極等，(4)微管式由毛細(xì)管或有毛細(xì)管管狀內(nèi)腔結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的其它材料，按預(yù)先設(shè)定的位置對應(yīng)規(guī)則排列而成的各種矩陣式毛細(xì)管基因芯片[二維平面排列]、線形毛細(xì)管基因芯片[一維線形排列]、以及在基片式結(jié)構(gòu)中制作出的各種不少于一個微管道式空腔結(jié)構(gòu)的矩陣式并行排列[即微流體電泳芯片等]，本發(fā)明所說的基因芯片上用來檢測的探針或靶可以是，但不限于如下種類之一或不同種類的組合或下面種類的某種成分，提取物(1)核糖核酸[RNA]，各種核糖核酸[″ribonucleic acid″and″RNA″]，包括信使RNA[簡稱mRNA]、轉(zhuǎn)錄RNA[簡稱tRNA]等，(2)脫氧核糖核酸[DNA]如DNA，互補(bǔ)DNA[cDNA]等，(3)寡核苷酸[oligonucleotide]，包括寡聚脫氧核糖核酸[oligodeoxynucleotide，簡稱ODNs]，寡聚核糖核酸[oligoribonucleotide，ORNs]，多聚核苷酸[polynucleotide]，
(4)核酸結(jié)構(gòu)相似物[DNA-DNA，RNA-RNA or RNA-DNA mimic duplexes，triplexes or quadroplexes，等]]如肽核酸[peptide nucleic acids，簡稱PNA]，(5)脫氧核糖核酸、核糖核酸及其結(jié)構(gòu)相似物的互補(bǔ)雙鏈、三[重]鏈、四[重]鏈等形式的雜交分子如DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA、PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA，PNA-DNA-PNA]等。
本發(fā)明在基因芯片處理技術(shù)中采用高荷信號載體(高分子熒光微球或含有大量熒光染料、半導(dǎo)體納米晶量子點(diǎn)、電致發(fā)光分子等的高分子顆粒，通過合成技術(shù)將大量信號分子聚合為一體的各種形式的巨型信號分子，硅氧光學(xué)磁珠[silica beads]，膠體金[或納米金顆粒，colloidal gold nanoparticles]，或通過任何其他手段將熒光染料，非熒光染料，半導(dǎo)體量子點(diǎn)、電致發(fā)光、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光物質(zhì)信號分子等固定于微粒的表面或包埋于其內(nèi)部等多種形式的高荷信號載體)作為標(biāo)記物進(jìn)行分子信號放大。
本發(fā)明所要介紹的基因芯片信號放大標(biāo)記技術(shù)，是以各種形式的高荷信號載體或信號體應(yīng)用于標(biāo)記各種形式的基因芯片探針、靶或探針-靶雜交體。
這里所說的基因芯片包括但不限于如下類型基因芯片[包括各種DNA芯片，如玻璃基因芯片，膜芯片，實(shí)驗(yàn)室芯片，微流體芯片等]、以電化學(xué)原理或生物電子學(xué)原理為基礎(chǔ)的各種生物傳感器等。
本發(fā)明所使用基因芯片的檢測原理可以是，但不限于如下種類之一或不同原理的結(jié)合(1)通過對固相表面定位在不同位置的探針-靶特異性親合反應(yīng)結(jié)合體或雜交體進(jìn)行光學(xué)信號[如熒光分子、化學(xué)發(fā)光等]標(biāo)記，然后經(jīng)激發(fā)產(chǎn)生熒光、化學(xué)或生物發(fā)光并進(jìn)行檢測。以玻璃、硅片、尼龍膜等為材質(zhì)的基因芯片、蛋白芯片、免疫芯片多采取這種模式；(2)通過對標(biāo)記的或未標(biāo)記的探針或靶在施加了電壓的液相中的移動速度或遷移率進(jìn)行檢測，即電泳技術(shù)或由電泳技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合而產(chǎn)生的其他技術(shù)，如毛細(xì)管電泳[capillaryelectrophoresis，CE]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳[capillary zone electrophoresis，CZE]、毛細(xì)管凝膠電泳[CGE]、高效毛細(xì)管電泳[HPCE]、毛細(xì)管等電聚焦[capillary isoelectric focusing(CIEF)]、等速電泳[isotachophoresis(ITP)]、動電色譜[electrokineticchromatography(EKC)]、膠束動電毛細(xì)管色譜[micellar electrokinetic capillarychromatography(MECC OR MEKC)]、毛細(xì)管電色譜法[capillaryelectrochromatography(CEC)]、非水相毛細(xì)管電泳[non-aqueous capillaryelectrophoresis(NACE)]等，(3)通過探針、靶或探針-靶絡(luò)合物以及它們的標(biāo)記物不同的親和力，進(jìn)行色譜技術(shù)分析，如親和層析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gelpermeation chromatography]，MCC[metal chelate chromatography]等，(4)利用具有氧化還原性質(zhì)的分子或分子的部分結(jié)構(gòu)[即化學(xué)基團(tuán)或功能團(tuán)]、金屬絡(luò)合物或(核酸)嵌入劑與被定位并固定在固相表面不同位置或電極上的探針、靶或探針-靶絡(luò)合物結(jié)合并在外加適當(dāng)方式或適當(dāng)大小的電壓(或電勢差)作用(直流電壓或交變電流或脈沖電場或電壓)下，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，致使從還原性分子或基團(tuán)(電子授體，electrondonor)的電子轉(zhuǎn)移到氧化性分子或基團(tuán)(電子受體，electron acceptor)，形成電子流，通過電極傳送到檢測系統(tǒng)進(jìn)行測量，所測得的電流強(qiáng)度大小與雜交并被標(biāo)記的雙鏈核酸的量成正比，(5)利用雙鏈核酸和單鏈核酸的導(dǎo)電性能差異，或利用由序列完全互補(bǔ)配對的核酸雜交所形成的雙鏈核酸分子與有錯配堿基對(Mismatches)存在的雙鏈核酸(nucleic acids duplexes)分子之間在導(dǎo)電性能差異，通過對經(jīng)由核酸分子傳導(dǎo)的電子流大小的測量而對核酸分子由此所反映的其他方面所進(jìn)行的各種鑒別、檢測和考察，如在基因突變、基因多態(tài)性、基因測序、基因表達(dá)譜研究、疾病機(jī)理分析和疾病診斷等方面的應(yīng)用，(6)將發(fā)生在核酸分子上或由具有氧化還原性質(zhì)的物質(zhì)(包括但不限于，具有氧化還原性質(zhì)的金屬絡(luò)合物以及由金屬絡(luò)合物或金屬絡(luò)合物的衍生物為單體聚合而成的聚合物、熒光分子、核酸嵌入劑等)所發(fā)生的電子或電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)或電子流轉(zhuǎn)換成其他可檢測或可考察形式的檢測技術(shù)，如通過電致發(fā)光[Electroluminescence]原理，利用電致發(fā)光分子將電子流轉(zhuǎn)換為光信號所進(jìn)行的檢測，(7)直接或間接以具有氧化還原性物質(zhì)(如二茂鐵基)對探針或靶分子標(biāo)記物，通過標(biāo)記后可以使標(biāo)記物接近電極表面而發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)對發(fā)生在電極表面的生物或化學(xué)反應(yīng)的檢測。如摩托羅拉公司的eSensor Chips。
(8)通過探針、靶或探針-靶絡(luò)合物以及它們的標(biāo)記物不同的親和力，進(jìn)行色譜技術(shù)分析，如親和層析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gelpermeation chromatography]，MCC[metal chelate chromatography]、動電色譜[electrokinetic chromatography(EKC)]、膠束動電毛細(xì)管色譜[micellarelectrokinetic capillary chromatography(MECC OR MEKC)]、毛細(xì)管電色譜法[capillary electrochromatography(CEC)]等。
這里所說基因芯片的高荷信號載體[HSC]包括但不限于如下類型，以各種微小顆粒形式存在的高負(fù)荷光學(xué)、磁性、電子學(xué)或電化學(xué)信號載體，它可以是量子點(diǎn)微球[QD-tagged Microbeads]、高聚物熒光微球或高分子熒光微球[polymer microspheres]或膠體微珠[latex beads]、表面修飾有熒光染料的硅氧磁珠[silica beads]、膠體發(fā)光半導(dǎo)體納米晶量子點(diǎn)[colloidal fluorescent semiconductor nanocrystalquantum dots]、樹枝狀高聚物納米球[dendrimers]、星形樹枝狀高分子或樹形分子[star dendrimers，dendrimeric stars or dendrimers]、蛋白質(zhì)包裹的半導(dǎo)體納米顆粒或微小顆?；蛄孔狱c(diǎn)[如Chaperoninmediated semiconductor nanoparticles.Chaperonin中以Chaperonin GroEL蛋白和T.th cpn蛋白包裹效果最佳]、膠束[micelles]、分子磁體[molecular magnets]、膠囊式微球[encapsulated spheres]、膠體納米金[colloidal gold nanoparticles]、電致發(fā)光分子[electroluminescent molecules]、二茂金屬基共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如二茂鐵基聚合物[polyferrocene block copolymers，PFC，或polyferrocenylsilanes，PFS]微球，多聚二茂鋯[polyzirconoeene，PZC]、多聚二茂金屬基修飾或接枝的樹枝狀高分子[包括但不限于，聚二茂鐵基接枝的樹枝狀高分子(polyferrocenyl-branched dendrimers)]、二茂金屬基或多聚二茂金屬基修飾或接枝的納米金膠體[包括但不限于，胺基二茂鐵基功能化的納米金膠體(Gold colloids functionalized with amidoferrocenyl structures)等]、共聚物微球或納米球、含有富勒烯結(jié)構(gòu)的或以富勒烯為單體之一的高聚物或共聚物、其它含熒光染料或化學(xué)發(fā)光[chemiluminescence]、生物發(fā)光[bioluminescence]材料的載體，藻膽蛋白類[phycobiliproteins]及其各種衍生物或生物或化學(xué)修飾物，以及上述每一種載體中不同參數(shù)[如大小、光學(xué)發(fā)射光波長、電磁學(xué)性質(zhì)、表面生物或化學(xué)功能團(tuán)修飾等物理或化學(xué)性質(zhì)]載體的組合，或各種不同載體之間的相互組合。其表面修飾有可以與下面通式(I)化合物中的探針接頭A-特異性反應(yīng)的功能團(tuán)或作用對A’-。
這里特別提一下量子點(diǎn)微球[QD-tagged Microbeads，或QD-tagged Polymeric Microspheres，QD-Beads]。這是一種將量子點(diǎn)包埋在高分子微球中的一種HSC。由于QD可以被大量地包埋到高分子微球中，因而也是一種信號極強(qiáng)的HSC。鑒于一方面QD在發(fā)光波長上可以通過半導(dǎo)體納米晶粒徑的調(diào)節(jié)輕易地實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)，另一方面高分子微球在包埋QD方面可以根據(jù)包埋的比例不同改變量子點(diǎn)微球的光信號強(qiáng)度水平，因此，量子點(diǎn)微球[QD-Beads]在熒光發(fā)射的波長與強(qiáng)度方面可以很理想地實(shí)現(xiàn)多元化和層次化。另外，在有利的制備條件下，量子點(diǎn)微球可以達(dá)到高度的均一，在電泳等1 方面有著極為有價(jià)值的應(yīng)用意義。
本發(fā)明所要介紹的信號放大技術(shù)，是一種雙探針基因芯片信號放大標(biāo)記技術(shù)，其特征是，雙探針由捕獲探針[Capture Probe]和標(biāo)記探針[Labeling Probe]組成，捕獲探針固定于基因芯片固相表面，構(gòu)成基因芯片微點(diǎn)陣，而標(biāo)記探針是由高荷信號載體以及一個或更多固定于其表面的、或與高荷信號載體進(jìn)行共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵偶聯(lián)的可以與靶基因上的一個或不止一個位點(diǎn)的序列進(jìn)行互補(bǔ)雜交的特異性核酸序列構(gòu)成，游離存在于標(biāo)記溶液中，二者都分別擁有與待測靶基因的不同位點(diǎn)的特異性序列互補(bǔ)配對的核酸序列。
這種雙探針基因芯片信號放大技術(shù)，其標(biāo)記反應(yīng)模式可以是，但不限于如下通式所描述的幾種情景(1)單一樣本來源的靶基因與標(biāo)記探針優(yōu)先雜交，在雜交雙鏈進(jìn)行或未進(jìn)行鏈間交聯(lián)或鎖定之后，成為標(biāo)記靶基因，再與基因芯片上的捕獲探針特異性雜交，同樣在捕獲探針與靶基因所形成的雜交雙鏈進(jìn)行或未進(jìn)行鏈間交聯(lián)或鎖定之后，形成雙探針雜交標(biāo)記的靶基因，(2)兩種或兩種以上不同樣本來源的靶基因分別與不同特性的標(biāo)記探針優(yōu)先雜交，從而使不同來源的靶基因各自被特異性的標(biāo)記探針?biāo)x，在雜交雙鏈進(jìn)行或未進(jìn)行鏈間交聯(lián)或鎖定之后，成為標(biāo)記靶基因，再與基因芯片上的捕獲探針特異性雜交，同樣在捕獲探針與靶基因所形成的雜交雙鏈進(jìn)行或未進(jìn)行鏈間交聯(lián)或鎖定之后，形成雙探針雜交標(biāo)記的靶基因，(3)單一來源的靶基因與捕獲探針和標(biāo)記探針同時進(jìn)行雜交過程，之后，進(jìn)行或未進(jìn)行雜交雙鏈的鏈間鎖定過程以強(qiáng)化標(biāo)記和雜交雙鏈的連接強(qiáng)度，標(biāo)記探針的結(jié)構(gòu)可以用通式(I)表示，通式(I)F(-L-XNA)n’或F(-XNA)n’
用以核酸雙鏈鏈間交聯(lián)或鎖定的化合物以X表示，可以分別是如下情況之一或不同類型化合物的組合使用，n是從零到無窮大的自然數(shù)0，1，2，3...
其中，X-是與雙鏈核酸通過靜電吸引力、次鍵力[如范德華力、氫鍵等]、與雙螺旋結(jié)構(gòu)中的大溝或小溝的親和力[Groove binders]、嵌入雙鏈堿基對的親和力[intercalators]、與雙螺旋結(jié)構(gòu)形成三螺旋結(jié)構(gòu)或四螺旋結(jié)構(gòu)等方式相結(jié)合的功能團(tuán)，與核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)通過化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵結(jié)合的功能團(tuán)或分子，可以特異性識別核酸雙鏈結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合的生物分子，可與核酸雙鏈絡(luò)合或結(jié)合的各種生物或化學(xué)分子，它可以包括但不限于下列化合物以及以下列化合物為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)或特征的各種衍生物和生物或化學(xué)修飾后所形成的化合物X-的結(jié)構(gòu)特征根據(jù)其與為雜交單鏈核酸或與已經(jīng)互補(bǔ)雜交的核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用性質(zhì)可以分為如下幾種類型；1.靜電吸引力、次鍵力[如范德華力、氫鍵等]，與核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中的大溝或小溝的親和力[Groovebinders]。屬于這種情況的X-可以是，但不限于如下幾種化合物(1)以雙螺旋大溝[major grooves]為作用機(jī)理的嵌入劑放射菌素類，如7-氨基-放射菌素D[7-amino-Actinomycin D]；(2)與雙螺旋小溝[minor grooves]形成絡(luò)合物的咔唑類[如3，6-carbazole，2，7-carbazole]和二苯基呋喃二銨類[diphenylfuran diamindine]，聚胺類[polyamines]DNA嵌入劑，吲醌類嵌入劑[6H-indoloquinolinecore]，烷基氨基烷基鏈[alkylaminoalkyl chain，DNA小溝嵌入劑]，2.可以嵌入雜交核酸雙螺旋堿基對的親和力[intercalators]。屬于這種情況的X-可以是(1)在一定條件下，可以形成鏈間共價(jià)交聯(lián)的一類化合物，如補(bǔ)骨脂素(Psoralen，relatively weak(Kd10-4M))、異補(bǔ)骨脂素以及它們的任何衍生物形式，如4’-羥甲基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(4’-hydroxymethyl-4，5’，8-trioxalen，簡寫HMT)、4’-胺甲基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(4’-aminomethyl-4，5’，8-trioxalen，簡寫AMT)、三甲基補(bǔ)骨脂素(trimethylpsoralen，簡寫TMP)、8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-methoxypsoralen，縮寫為8-MOP)、4，7，4’-和4，7，5’-三甲基異補(bǔ)骨脂素(4，7，4′-and 4，7，5′-trimethylallopsoralen)以及補(bǔ)骨脂素本身。光激發(fā)嵌入劑[Ru(phen)2dppz2+；phen＝1，10-phenanthroline；dppz＝dipyridophenazine]，順氯氨鉑[cisplatin]，兼具DNA光損傷性質(zhì)的嵌入劑吲哚基喹啉正離子鹽類或喹啉衍生物正離子鹽類[indolo[2，3-b]-quinolizinium bromide]；(2)作為雙鏈嵌入劑的EDTA過渡金屬絡(luò)合物類[如methinidiumpropyl EDTA Fe(II)]，2，7-diazapyrene(DAP)，DAPI[4’-6-diamidino-2-phyenylindole]，N-甲基化正離子[N-methylated cations DAP+andDAP2+]，吖啶類化合物{Acridine orange[3，6-bis(dimethylamino)acridine，HCl]}，雙齒狀吖啶類嵌入劑[bis-dentate acridine intercalators]、氨基氮蒽或氨基吖啶[9-aminoacridine(9AA)]，碘基或碘代吖啶類[2-iodine-125-iodoacridine]；(3)可切斷DNA鏈結(jié)構(gòu)的嵌入劑亞德里亞霉素或阿霉素[Adriamycin，或Doxorubicin]，elsamicin，Nogalamycin，Sanguinarine，Cherethyrine，anthracyclinedrug，leinamycin，Echinomycine，正定霉素或道諾霉素類[Daunomycin]，[Rebeccamycin]；(4)兼具核酸堿基嵌入功能和雙螺旋溝槽嵌入功能的偏端霉素類化合物[distamycin]和紡錘菌素類化合物[netropsin]以及Hoechst 33258和Hoechst33342等；(5)以次鍵力為主與雙螺旋結(jié)構(gòu)中的堆積堿基相互作用的亞甲基藍(lán)[methylene blue(MB，MB+)，溴乙非啶或溴化二氨乙苯啡啶[ethidiumbromide]和二溴乙錠正離子[diethdium cathion]，3.與雙螺旋結(jié)構(gòu)形成三螺旋結(jié)構(gòu)或四螺旋結(jié)構(gòu)等方式相結(jié)合的功能團(tuán)，與核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)通過化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵結(jié)合的功能團(tuán)或分子，可以特異性識別核酸雙鏈結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合的生物分子，可與核酸雙鏈絡(luò)合或結(jié)合的各種生物或化學(xué)分子，它可以包括但不限于下列化合物以及以下列化合物為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)或特征的各種衍生物(1)所有可以嵌入核酸雙鏈結(jié)構(gòu)或核酸雙鏈的大溝或小溝中的嵌入物、多聚嵌入物、線性或環(huán)狀嵌入物等，4.可與RNA形成各種絡(luò)合物的核仁素類[如Nucleolin RBD12]，5.可以在雙螺旋結(jié)構(gòu)中的多個位點(diǎn)進(jìn)行嵌入的多重嵌入劑，比如將棘皮霉素類[Echinomycine，DNA雙重嵌入劑]通過共價(jià)鍵偶聯(lián)起來，或串聯(lián)起來，可以形成四重嵌入的四重嵌入劑；6.重氮氨苯脒乙酰甘氨酸鹽[berenil]，細(xì)胞毒素類[如cytotoxin NLCQ-1]，三骨菌素[triostin]，黃連素類[如protoberberine-8]，，口腔M[Gilvocarcin M]，呋喃萘基吡喃酮類[furonaphthopyrone]，卟啉或金屬卟啉類化合物[porphyrins or metalloporphyrins]，咔啉類化合物[如beta-carbolines]，原黃素[proflavin(Acr-NH2)]，3，7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium chloride]，苯基巰基吡喃[benzothiopyranoindazole]，[水溶性]亞丙基碘化物[propidium iodide]，7.以芳香環(huán)結(jié)構(gòu)堆積為特征的線狀多聚DNA嵌入物[the stacked aedamer core，具有兩個或若干個1，4，5，8-四羧酸二酰亞胺(1，4，5，8-tetracarboxylic diimide)等特征結(jié)構(gòu)單元多聚嵌入物]，8.可以產(chǎn)生電化學(xué)信號的嵌入物二茂鐵基萘二酰亞胺類線狀嵌入劑[threading ferrocenyl naphthalinediimide]；9.蒽類[anthryl compands如AMAC[9-氨基-6-氯-2-甲氧基啞啶(9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine)]，anthracycline，APAC，N-Et-AMAC等]，蒽醌類[anthraquinones]，萘二酰亞胺類嵌入劑[naphthalene diimide intercalators]，菲離子類嵌入劑[phenanthridinium intercalators]，10.金屬類嵌入劑，如八面體DNA銠嵌入劑[rhodium intercalator，bis(2-2′bipyridyl)chrysene quinone diimine，D-[Rh[(R，R)-Me 2 trien]phi]3+，Ru(NH2)63+]，有手性絡(luò)合物結(jié)構(gòu)的金屬釕嵌入劑[ruthenium intercalators，[Ru(phen)2dppz]2+(phen＝1，10-phenantroline；dppz＝dipyrido[3，2-a2′，3′-c]phenazine)]，terpyridine platinum compound(TPH)，mitoxantrone，鑭系金屬化合物DNA嵌入劑[lanthanide]，二吡啶基(乙二胺)鉑鹽或三吡啶基鉑鹽類[bipyridyl(ethylenediamine)Pt(II)2+，4-picoline-2，2’6’，2”-terpyridine-platinum]，11.可改變雙螺旋溝槽結(jié)構(gòu)的萘二酰亞胺類化合物[雙嵌入劑，如naphthalene diimides，N，N’-disubstituted naphthalene diimide derivatives，用多肽鏈作為嵌入雙螺旋小溝的連接臂的萘四羧酸二酰亞胺雙嵌入劑(1，4，5，8-Naphthalene Tetracarboxylic Diimide Bis-Intercalator with theLinker(-Ala)3-Lys in the Minor Groove)，用胺基烷基將DNA嵌入功能團(tuán)線性連接起來所形成的雙嵌入劑，三嵌入劑，多聚嵌入劑和有環(huán)雙線狀嵌入劑等]，12.荷苞牡丹堿類[dicentrine]，三環(huán)大那霉素類[tricyclic dynemicin A]，硝基胺類[nitracrine，親電子性DNA嵌入劑]，環(huán)磷酰胺類[cyclophosphamide]，amsacrine，丹參酮類[如Dihydrotanshinone，I]，octahydroxanthene，吲唑類[indazoles，如benzothiopyranoindazole DNA嵌入劑]，咪唑類[imidazole]，N-[4-(9-吖啶基氨基)-3-甲氧基-苯基]甲烷-磺胺類化合物[N-[4-(9-acrydinylamino)-3-methoxy-phenyl]methane-sulphonamide，m-AMSA]，大環(huán)內(nèi)酰胺類[macrocyclic lactam]，喹啉衍生物類嵌入劑{如indolo[2，3-b]quinolines，6H-indoloquinoline core，quinoxalines}，Amsacrine，(夾)氧雜蒽類[Xanthenes，如1，8-二氧代-9-(o-硝基苯基)-1，2，3，4，5，6，7，8八氫氧雜蒽(1，8-dioxo-9-(o-nitrophenyl)-1，2，3，4，5，6，7，8-octahydroxanthene)]，luzopeptin，甘菊環(huán)類[6a，7-diazanaphth[3，2，1-cd]azulene和7H-1，7-diazaindoleno[1，2e]azulene system]，Ditercalinium，4，6-diamidino-2-phenyline[DAPI]，戊烷脒類[pentamidine]，13.Pixantrone，基于吲哚結(jié)構(gòu)的玫瑰樹堿類[indole-based intercalator ellipticine]，奎吖因類[quinacrine]，重氮化合物類[4，9-diazapyrenium]，雌甾二醇類[estradiol]，雙苯基酰亞胺類[bisbenzimide]，噻唑類[如thiazole orange]，14.光活性生物素或光生物素[photoactivable biotin，photobiotin]、光生物素與生物分子或化學(xué)分子的偶聯(lián)體、及光生物素的衍生物，15.所有可以對核酸進(jìn)行染色的染料分子，如熒光染料bisbenzimide H fluorochrome[TriHCl]，色霉素[chromomycin]A3，熒光性嵌入劑[如TOTO，YOYO，SYBR Green]，16.所有可以與基因芯片上的已互補(bǔ)雜交的核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)形成三重(倍)[triplex]螺旋或四重(倍)[quadruplex]螺旋結(jié)構(gòu)的化合物或生物分子或生物分子結(jié)構(gòu)類似物以及此結(jié)構(gòu)與其他分子共價(jià)偶聯(lián)所形成的復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)，如PNA[peptide nucleic acids]，寡聚核苷酸，多肽[如[N-MeCys3，N-MeCys7]TANDEM]等；17.可與核酸雙鏈發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或光化學(xué)反應(yīng)從而形成共價(jià)鍵連接的功能團(tuán)或分子，如疊氮類化合物，結(jié)構(gòu)中含有苯甲酮功能團(tuán)的化合物及其衍生物。可以與核酸探針或靶基因發(fā)生共價(jià)交聯(lián)的各種化學(xué)交聯(lián)劑或化學(xué)反應(yīng)功能團(tuán)如可以通過與靶基因上的羥基發(fā)生縮水反應(yīng)的碳二亞胺，或光化學(xué)反應(yīng)活性的交聯(lián)劑，如芳香基疊氮化合物[aryl azides，如N-((2-pyridyldithio)ethyl)-4-azidosalicylamide[PEAS]等]、氟代芳香基疊氮化合物[fluorinated arylazides]，苯甲酮類光反應(yīng)試劑[benzophenone-based photoreactive reagents，如苯甲酮馬來酰亞胺[benzophenone maleimide]]等；18.可以序列特異性地或非序列特異性地識別核酸雙鏈結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合或以雙鏈核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)為底物的蛋白質(zhì)或酶等生物分子，如HMGB蛋白，可與經(jīng)順氯氨鉑修飾的dsDNA結(jié)合的NHP6A蛋白，參與DNA復(fù)制的酶、凝血酶[thrombin]、RNA轉(zhuǎn)錄的酶絲裂霉素[Mitomycin C]、可以與核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)的雙鏈間形成共價(jià)橋形鍵的博來霉素或爭光霉素類[Bleomycin]、雙鏈核酸抗體、雙鏈核酸的特異性結(jié)合酶，DNA聚合酶或RNA聚合酶，
19.可以與待測靶基因或基因芯片上探針核酸分子的某個或某些特異性序列進(jìn)行特異性互補(bǔ)并結(jié)合形成互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸分子，反義核酸[anti-sense nucleic acid sequences]序列等。該類化合物可以同時適用于雜交前標(biāo)記和雜交后標(biāo)記兩種方案。
20.上述各種嵌入劑或結(jié)合物組合或通過共價(jià)鍵結(jié)合起來的分子結(jié)構(gòu)，或通過化學(xué)修飾從而實(shí)現(xiàn)在與核酸探針、靶或探針-靶雜交雙鏈發(fā)生相互作用并形成共價(jià)鍵連接或交聯(lián)的上述化合物的衍生物，或單獨(dú)與多肽、線性或鏈狀生物或化學(xué)合成高分子偶聯(lián)形成的高級嵌入劑或核酸結(jié)合分子。
21.具有氧化還原[redox]性質(zhì)，可以發(fā)生電子授受反應(yīng)[Electron Donor-Acceptor Reaction]或電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)[Electron-Transfer Reaction]的核酸結(jié)合物以及以這些化合物為單體聚合而成的聚合物和低聚物、寡聚物，如[a]可以嵌入核酸雙鏈中的熒光分子有但不限于，亞甲基藍(lán)[Methylene Blue，MB+]和Hoechst33258等熒光分子等，或[b]金屬絡(luò)合物，如釕金屬絡(luò)合物[Rutheniumtris(2，2’-bipyridine)]等，或[c]通過共價(jià)鍵連接或非共價(jià)鍵結(jié)合與上述任何一種核酸嵌入劑發(fā)生共價(jià)交聯(lián)或非共價(jià)鍵結(jié)合的具有氧化還原性質(zhì)的高荷信號載體[HSC]，包括但不限于，多聚二茂鐵基團(tuán)[polyferrocenyl]、多聚二茂鋯基團(tuán)、多聚二茂釕基團(tuán)等多聚二茂金屬類物質(zhì)。
-L-可以是但不限于如下各種結(jié)構(gòu)或分子(1)溶劑相容性連接臂，即當(dāng)溶劑為疏水體系時，連接臂亦為疏水連接臂；當(dāng)溶劑為親水體系時，連接臂亦為親水連接臂，可以是PEG、合成多肽等，長度不限，(2)分子導(dǎo)線[molecular wires，如雙鏈DNA分子，親水性連接臂，珠鏈型富勒烯線型聚合物(富勒烯被導(dǎo)入有機(jī)高分子主鏈的珠鏈型高分子)或?qū)⒏焕障巴基球，fullerene]用R基連接起來的巴基球項(xiàng)鏈等]，(3)分子絕緣體[molecular insulators，如疏水性連接臂，長鏈烷烴等]，(4)結(jié)合有分子磁體的連接臂等，(5)在化學(xué)或光學(xué)等因素作用下，分子鏈可以斷鏈的連接臂等，如雙硫鍵[-SS-]等。
F表示以各種微小顆粒形式存在的高負(fù)荷光學(xué)、磁性、電子學(xué)或電化學(xué)信號載體，它可以是高聚物或共聚物熒光微球、表面修飾有熒光染料的硅氧磁珠[silica beads]、半導(dǎo)體等無機(jī)物的量子點(diǎn)[quantum dots]、半導(dǎo)體等無機(jī)物納米晶[nanocrystal particles]、樹枝狀高聚物納米球[dendrimers]、星形樹枝狀高聚物納米球[dendrimeric stars]、膠束[micelles]、分子磁體[molecular magnets]、膠囊式微球[encapsulated spheres]、膠體納米金[colloidal gold nanoparticles]、電致發(fā)光分子[electroluminescentmolecules]、多聚二茂金屬共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如多聚二茂鐵共聚物[polyferroceneblock copolymers，PFC]微球，多聚二茂鋯[polyzirconocene，PZC]共聚物微球或納米球、含有富勒烯結(jié)構(gòu)的或以富勒烯為單體之一的高聚物或共聚物、其它含熒光染料或化學(xué)發(fā)光[chemiluminescence]、生物發(fā)光[bioluminescence]材料的載體，以及上述每一種載體中不同參數(shù)[如大小、光學(xué)發(fā)射光波長、電磁學(xué)性質(zhì)、表面生物或化學(xué)功能團(tuán)修飾等物理或化學(xué)性質(zhì)]載體的組合，或各種不同載體之間的相互組合，其表面修飾有可以與通式(I)化合物中的探針分子接頭A-特異性反應(yīng)的功能團(tuán)或作用對A’-。
本發(fā)明還在基因芯片的雜交或探針-靶特異性結(jié)合過程，標(biāo)記，洗脫等過程中全面引入了程序化交變電磁場作用，用于加快上述過程的效率，縮短過程所需時間。
本發(fā)明所涉及技術(shù)術(shù)語的定義本發(fā)明以下術(shù)語與Chenchik等人的美國專利[US.Pat 6,489,159]相同縮氨酸[peptide]、低聚肽[oligopeptide]、多肽[polypeptide]、核酸[nucleic acid]、核糖核酸[″ribonucleic acid″and″RNA″]、DNA、寡核苷酸[oligonucleotide]、多聚核苷酸[polynucleotide]等。
高荷信號載體[HSC]本發(fā)明如下定義 靶和探針、高聚物熒光微球或高分子熒光微球[polymer microspheres]或膠體微珠[latex beads]、量子點(diǎn)微球[QD-tagged Microbeads]、硅氧磁珠[silica beads]、膠體發(fā)光半導(dǎo)體納米晶量子點(diǎn)[colloidal fluorescent semiconductor nanocrystal quantum dots]等術(shù)語采用被目前普遍認(rèn)可的命名標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)例一 本實(shí)施例用于基因芯片在捕獲探針和靶基因雜交之前進(jìn)行標(biāo)記的實(shí)施例，當(dāng)X-選用補(bǔ)骨脂素[Psoralen]及其衍生物時的技術(shù)解決方案[包括基因芯片雜交室、HCL儀和SPR-CCD信號檢測與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)]，可以參見在先專利申請[國際專利申請基因芯片分子探針及相關(guān)技術(shù)。國際申請?zhí)枺琍CT/CN02/00887]。這些方法對于以玻璃、石英、硅、塑料和膜等薄片式基因芯片是適用的。
由于本發(fā)明中的捕獲探針就是基因芯片基片上點(diǎn)制微點(diǎn)針用的基因探針，目前屬于十分成熟的技術(shù)工藝，因此，此處不再述及捕獲探針的制備。本發(fā)明將著重闡述標(biāo)記探針的制備。
標(biāo)記探針的制備分三部分與靶基因上某位點(diǎn)的堿基序列可以特異性互補(bǔ)核酸探針的設(shè)計(jì)、高荷信號載體的選取以及二者的共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵偶聯(lián)。
(1)熒光微球的選取通式(I)中的F-選擇高分子熒光微球，如聚苯乙烯熒光微球等?？梢圆少徝绹鳰olecular Probes公司，Duke公司或Bang’s Laboratories等公司的產(chǎn)品。關(guān)于熒光微球的激發(fā)光/發(fā)射光波長，表面的化學(xué)特性等方面的因素考慮及其解決方案請參閱本人的中國發(fā)明專利申請，其申請?zhí)柺?1142654.3。作為最佳實(shí)施例，可以選擇與市場上基因芯片掃描儀激發(fā)光/發(fā)射光波長相吻合的，激發(fā)光波長在488納米、633納米的聚苯乙烯熒光微球。
(2)熒光微球與核酸分子的共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵偶聯(lián)[1]選擇Molecular Probes Inc公司的表面羧基修飾的熒光微球，[2]用DNA合成儀合成3’-末端或5’-末端帶氨基的寡聚核苷酸，[3]用水溶性碳二亞胺[EDAC]將前二者通過共價(jià)鍵偶聯(lián)起來，形成與某靶基因可以互補(bǔ)雜交的標(biāo)記探針。
(3)用(1)和(2)所述的方法，制備出與不同靶基因的特異性位點(diǎn)分別互補(bǔ)配對并雜交的標(biāo)記探針。
(4)雜交雜交時將不同標(biāo)記探針與靶基因溶液混合在一起，與基因芯片上的捕獲探針進(jìn)行同時雜交。雜交過程參見Hames，B.D.，和Higgins，S.J等人的《核酸雜交，一種實(shí)用方法》等。
實(shí)例二 本實(shí)例其他部分與實(shí)例一相同，只是通式(I)中的F選擇量子點(diǎn)[QDs]、量子點(diǎn)微球[QD-taggedMicrobeads，或QD-tagged Polymeric Microspheres，QD-Beads(這是一種將量子點(diǎn)包埋在高分子微球中的一種HSC。由于QD可以被大量地包埋到高分子微球中，因而也是一種信號極強(qiáng)的HSC。鑒于一方面QD在發(fā)光波長上可以通過半導(dǎo)體納米晶粒徑的調(diào)節(jié)輕易地實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)，另一方面高分子微球在包埋QD方面可以根據(jù)包埋的比例不同改變量子點(diǎn)微球的光信號強(qiáng)度水平，因此，量子點(diǎn)微球[QD-Beads]在熒光發(fā)射的波長與強(qiáng)度方面可以很理想地實(shí)現(xiàn)多元化和層次化。另外，在有利的制備條件下，量子點(diǎn)微球可以達(dá)到高度的均一，在電泳等方面有著極為有價(jià)值的應(yīng)用意義)]、熒光樹枝狀高分子[dendrimers，簡稱DD]、星形樹枝狀高聚物[dendrimeric stars，或star dendrimers，以下簡稱SD]、分子磁體[molecular magnets]電致發(fā)光分子[electroluminescent molecules]、多聚二茂金屬共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如多聚二茂鐵共聚物[polyferrocene block copolymers，PFC]微球，多聚二茂鋯[polyzirconocene，PZC]共聚物微球或納米球等。
高荷信號載體SD的制備，可以選用Ronald C Hedden等人的方法，先制成聚PAMAM[poly(amidoamine)]SD核。在此SD核中生長出金屬[如金，鉑，鈀等]或半導(dǎo)體[如CdS納米晶，通常控制在2-10納米]。在PAMAMSD核表面有大量的胺基，在加入可以接上PEG[即聚乙二醇，poly(ethylene glycol)，5,000g/mol]臂的同時，按照一定的比例[MAL-PEG-NHS和PEG-NHS的比例為，1∶10]摻入馬來酰亞胺-PEG-N-羥基-琥珀酰亞胺酯[Maleimide PEG NHS ester，簡寫MAL-PEG-NHS，有市售。Apollo Scientific Ltd，http//www.apolloscientific.co.uk/otherProducts_Lifesciences_PEGcross.htm]，從而制成馬來酰亞胺基修飾的SD[SD(PEG-MAL)n]，作為通式(I)中的F。
合成3’-末端或5’-末端為巰基修飾的與某一靶基因的特異性位點(diǎn)序列互補(bǔ)的核酸探針，與SD(PEG-MAL)n在水溶液環(huán)境下進(jìn)行共價(jià)鍵偶聯(lián)。偶聯(lián)過程與雜交過程參見實(shí)例一的相關(guān)部分以及本人的中國發(fā)明專利申請微陣列信號放大方法，申請?zhí)?3129124.4。
實(shí)例三 當(dāng)通式(I)中的X-選用順氯氨鉑[cisplatin，即(cis-diamminedichloroplatinum(II))]及其衍生物[無須光化學(xué)交聯(lián)]，或光激發(fā)嵌入劑釕絡(luò)合物[Ru(phen)2dppz2+；phen＝1，10-phenanthroline；dppz＝dipyridophenazine]，或烷基化物氮芥[即二氯甲基二乙胺[mechlorethamine(ME)]，或稱nitrogenmustard，無須光激發(fā)交聯(lián)]等。以釕絡(luò)合物為X-為例，須合成釕絡(luò)合物琥珀酸酯作為通式(I)X-L-A化合物的體現(xiàn)。為此，可以采用Dimitri Ossipov等人的合成技術(shù))固相合成技術(shù)合成釕絡(luò)合物琥珀酸酯[succinate 3′-[Ru(tpy)(dppz)Cl]+。其中，琥珀酸酯基作為與高荷信號載體表面大量修飾的伯胺基[-NH2，A’-]可以特異性反應(yīng)對中反應(yīng)基團(tuán)[A-]進(jìn)行特異性共價(jià)鍵標(biāo)記反應(yīng)。
其他部分技術(shù)解決方案可參見在先專利申請[國際專利申請基因芯片分子探針及相關(guān)技術(shù)]。
實(shí)例四 將實(shí)例一中的氨基末端的核酸標(biāo)記探針用生物素末端的核酸標(biāo)記探針來替代。而購買鏈霉親合素[streptavidin]表面包被的聚苯乙烯熒光微球代替表面羧基修飾的聚苯乙烯熒光微球。其他條件相同。
實(shí)例五 本實(shí)施例為雙探針雙色法基因芯片雜交信號放大標(biāo)記。雙色法標(biāo)記的目的主要是為了用一張基因芯片同時檢測來自不同細(xì)胞或組織樣品來源的靶基因，并在同一張基因芯片上通過競爭性雜交進(jìn)行比較，根據(jù)最終所顯示出來的顏色來判斷兩種來源的靶基因豐度或含量或表達(dá)比例等相對值。這種方法尤其在分析基因差異表達(dá)譜中經(jīng)常使用。目前，通常采用分別被Cy3和Cy5標(biāo)記的堿基在對樣品DNA或RNA PCR擴(kuò)增時摻入到PCR產(chǎn)品中，并被混合在一起用來標(biāo)記基因芯片。本發(fā)明中所揭示的HSC信號放大技術(shù)同樣可以用雙探針雙色法標(biāo)記來自不同來源DNA或RNA樣品中靶基因及其表達(dá)比例，或同一來源的基因在不同條件下的不同的表達(dá)比例，并在基因芯片上進(jìn)行檢測。
標(biāo)記探針合成步驟[該步驟的目的是合成標(biāo)記探針雜交標(biāo)記了的來源不同的靶基因。等效于目前基因芯片常用的用來檢測差異表達(dá)基因時用于與基因芯片上的探針微陣列雜交的靶基因。即“標(biāo)記探針+靶基因＝標(biāo)記靶基因”](1)先合成如實(shí)例一所述的與各種靶基因特異性位點(diǎn)互補(bǔ)配對的末端氨基修飾的DNA，混合，用等量的上述DNA溶液分別與不同熒光發(fā)射波長[激發(fā)波長分別在488nm和633nm]的表面羧基修飾的聚苯乙烯微球在在水溶性碳二亞胺作用下進(jìn)行共價(jià)鍵偶聯(lián)，形成標(biāo)記探針。
(2)兩種不同發(fā)射光波長的標(biāo)記探針分別與來自不同樣本的DNA或RNA靶基因進(jìn)行雜交，并用補(bǔ)骨脂素在紫外光激發(fā)下使雜交雙鏈發(fā)生共價(jià)鍵交聯(lián)，分別形成兩種不同的標(biāo)記靶基因。將等量的上述兩個溶液[各30微升]混合并與基因芯片上的捕獲探針進(jìn)行雜交。雜交緩沖液為(5×SSC，6×Denhardt’s溶液，60mM Tris HCl pH7.6，0.12％ sarkosyl，48％ formamide；filter sterilised)。在42-47攝氏度2-4小時。
借助本人的國際專利申請[基因芯片分子探針及相關(guān)技術(shù)。國際申請?zhí)?，PCT/CN02/00887]中的HCL儀，雜交過程如下預(yù)雜交(1)將基因芯片雜交室預(yù)冷到4攝氏度，將50微升的雜交緩沖液加入其中，將微量雜交緩沖液從基因芯片雜交室正面的小孔加入，用小橡皮塞塞住以防止緩沖液揮發(fā)，保持雜交過程的濕度，(2)在47攝氏度溫浴2-4小時，(3)用至少250微升洗脫液在室溫下洗滌基因芯片15-30秒，(4)導(dǎo)入干燥空氣1-2分鐘，將基因芯片雜交室涼干。
雜交(1)混合兩種單鏈cDNA標(biāo)記探針過程如下33μl ss cDNA標(biāo)記靶基因(488nm)，33μl ss cDNA標(biāo)記靶基因(633nm)，4μl polyA DNA，4μl人類Cot1 DNA和7.0μl 3M乙酸鈉pH5.2，218μl，絕對乙醇≈293μl，(2)沉淀ss cDNAs，polyA和Cot1 DNA，-70℃ 20分鐘，(3)加入基因芯片雜交室，在47℃下溫浴12-24小時。室溫下洗脫，涼干，(4)用激光共聚焦或CCD檢測儀，對上述兩個波長的熒光進(jìn)行檢測。
實(shí)例六 其他過程如實(shí)例五所述。本實(shí)施例用不同發(fā)射熒光波長的QD、SD等分別制作標(biāo)記探針并用來與來自不同樣本的DNA或RNA樣本進(jìn)行雜交。本實(shí)施例用半導(dǎo)體量子點(diǎn)納米晶代替聚苯乙烯熒光微球。
實(shí)例七 本實(shí)施例為不同種類不同大小的高荷信號載體[HSC]對基因芯片雜交前或雜交后進(jìn)行的聯(lián)合標(biāo)記。由于本發(fā)明所介紹的信號放大技術(shù)是依靠不同大小和種類的HSC可以攜帶不同量的信號分子進(jìn)行信號放大的，尺寸越大的HSC可以攜帶的信號分子越多，在信號檢測中可以發(fā)出越強(qiáng)的信號，其信號放大能力就越強(qiáng)。但是，隨著HSC尺寸的增大，它們在被標(biāo)記到基因芯片上之后所占據(jù)的空間就會越大。以下是由美國Molecular Probes公司提供的熒光高分子微球的尺寸和所攜帶的信號分子[熒光素當(dāng)量]之間的關(guān)系*。
熒光微球直徑[微米] 每個熒光微球的熒光素當(dāng)量
0.02 1.8×1020.04 3.5×1020.1 7.4×1030.2 1.1×1050.5 2.0×1061.0 1.3×1072.0 3.1×107101.1×1010153.7×1010*注本表摘自《Handbook of Fluorescent Probes and Research Products》第九版，第177頁。by RichardP.Haugland。
根據(jù)這些數(shù)據(jù)可以計(jì)算出每種尺寸的熒光微球可以占據(jù)的基因芯片空間面積，并繼而計(jì)算出通過使用該尺寸的熒光微球在基因芯片上的基因點(diǎn)的直徑為200微米[所占據(jù)基因芯片面積為104π微米2]時可以達(dá)到的理論靈敏度檢測線性范圍[見下表]。表中還附帶了一些關(guān)于膠體半導(dǎo)體[CdSe]納米晶量子點(diǎn)[QDs]的直徑尺寸[一般在2-5納米。此處取值4納米。根據(jù)報(bào)道其信號強(qiáng)度是一般熒光信號分子，如熒光素強(qiáng)度的20倍]。借助于激光共聚焦基因芯片檢測儀[根據(jù)Affymetrix公司的介紹，他們依靠此技術(shù)檢測靈敏度下限為30萬個分子。即只有在待測標(biāo)本中有30萬個DNA分子時，采可以檢測得到]所能達(dá)到的靈敏度下限[可檢測分子數(shù)]。
每個熒光微球熒光微球在基因芯片 每個基因點(diǎn)上可以標(biāo)記的最大熒光激光共聚焦基因芯片掃描的熒光素當(dāng)量上占據(jù)的面積[微米2] 微球數(shù)目[靈敏度線性檢測上限] 儀可以達(dá)到的靈敏度下限1.8×1021×10-4π 1×10816673.5×1024×10-4π 2.5×1078577.4×10325×10-4π4×106401.1×1051×10-2π 1×10632.0×1060.0625π 1.6×1050.151.3×1070.25π 4×104-3.1×107π 1×104-1.1×101025π 4×102-3.7×101056.25π 1.7×102-QD的熒光素 QD在基因芯片上占 每個基因點(diǎn)上可以標(biāo)記的最大QD 激光共聚焦基因芯片掃描當(dāng)量 據(jù)的面積[微米2] 數(shù)目[靈敏度線性檢測上限] 儀可以達(dá)到的靈敏度下限20 1.6×10-5π 6.25×1081.5×104從上表可以看出在靈敏度提高的同時，檢測的線性范圍數(shù)量級大致不變，而線性檢測的上限開始下移。因此，在靈敏度下限和上限之間存在著一定的矛盾。隨著靈敏度提高，靈敏度的檢測范圍的上限會下降。
為了克服這個矛盾，本實(shí)施例采用不同信號放大能力的HSC聯(lián)合使用的技術(shù)。即，采用不同尺寸[即不同信號放大能力]的同一種顏色或不同顏色的高分子熒光微球，或者較大尺寸的熒光高分子微球和QD的組合使用。選材時，盡量力求不同品種、規(guī)格或顏色的HSC的靈敏度上限和下限的銜接，以確保低信號放大能力的HSC的高的線性檢測上限與高信號放大能力HSC的低的線性檢測下線銜接起來，從而優(yōu)勢互補(bǔ)。比如，采用200納米直徑的高分子熒光微球[靈敏度線性檢測范圍為3～106個分子]]與4納米直徑的半導(dǎo)體納米晶QD[靈敏度線性檢測范圍為1.5×104～6.25×108個分子]聯(lián)合使用，可以將實(shí)際測量的線性范圍擴(kuò)大到3～6.25×108個分子。當(dāng)然，也可以選擇和20納米直徑的高分子熒光微球聯(lián)合使用，從而將線性檢測范圍擴(kuò)展到3～1×108個分子。
不同粒徑、不同發(fā)射光顏色[不同的熒光波長]和不同表面化學(xué)功能團(tuán)修飾[用以連接不同的連接臂]的熒光高分子微球可直接購買[Molecular Probes，Merck，Bangs Laboratories公司.，Brookhaven儀器有限公司或Duke科學(xué)公司等]。
QD的表面化學(xué)修飾和共價(jià)偶聯(lián)技術(shù)可以參照Bawendi等人的美國專利US.Pat 6,306,610，2001年10月23日。
HSC諸如不同發(fā)光波長和信號強(qiáng)度的量子點(diǎn)微球、高分子微球、量子點(diǎn)等都是非常好的選材。
權(quán)利要求
1.一種雙探針基因芯片信號放大標(biāo)記技術(shù)，其特征是，雙探針由捕獲探針[Capture Probe]和標(biāo)記探針[Labeling Probe]組成，捕獲探針固定于基因芯片固相表面，構(gòu)成基因芯片微點(diǎn)陣，而標(biāo)記探針是由高荷信號載體以及一個或更多固定于其表面的、可以與靶基因上的一個或不止一個位點(diǎn)的序列進(jìn)行互補(bǔ)雜交的特異性核酸序列構(gòu)成，游離存在于標(biāo)記溶液中，二者都分別擁有與待測靶基因的不同位點(diǎn)的特異性序列互補(bǔ)配對的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，是由基底及其表面的鍍層或涂層和固定在基底[縮寫為S]或鍍層[縮寫為C]表面的不少于兩個陣列式排列的捕獲探針組成，用于檢測樣品中的基因靶基因，基底和/或鍍層或涂層的材料可以由但不限于如下材料中任意一種或一種以上不同材料組合制成(1)無機(jī)物片狀材料類如玻璃、石英、云母，透明導(dǎo)電材料如透明導(dǎo)電氧化物類[TCO]，如氧化銦錫[indium tin oxide，ITO，或?qū)憺镮n2O3:Sn]、SnO2:F、砷化鎵[GaAs]、氧化鎂等鍍層，氧化錫[tin oxide，SnO]，ZnO，CdO，CdIn2O4，Cd2SnO4，Zn2SnO4和In2O3-ZnO等，以及碳/陶復(fù)合導(dǎo)電陶瓷，各種半導(dǎo)體材料等，(2)單質(zhì)類鉑、金、銀、鋁、鉻[Au，Ag，Pt，Cu，Rh，Pd，Al，Cr]等金屬以及硅非金屬等，(3)有機(jī)物類各種有機(jī)分子及其由此制成的自組裝單分子膜或自組裝多分子膜，(4)高分子類尼龍膜、醋酸纖維素膜、各種塑料、橡膠、樹脂，基底的結(jié)構(gòu)可以是但不限于如下種類(1)薄片式如玻璃片、硅片、尼龍膜、塑料片、微孔板，微滴板式等，(2)電極式在薄片式基因芯片上以一定規(guī)律排列而成的各種電極陣列，如在半導(dǎo)體、絕緣體等基底上制成的鉑電極、金電極等，(3)微管式由毛細(xì)管或有毛細(xì)管管狀內(nèi)腔結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的其它材料，按預(yù)先設(shè)定的位置對應(yīng)規(guī)則排列而成的各種矩陣式毛細(xì)管基因芯片[二維平面排列]、線形毛細(xì)管基因芯片[一維線形排列]、以及在基片式結(jié)構(gòu)中制作出的各種不少于一個微管道式空腔結(jié)構(gòu)的矩陣式并行排列[即微流體電泳芯片等]，(4)微粒式以微小顆粒為固相載體，生物分子或化學(xué)分子被固定在其表面，通過微小顆粒的大小、[發(fā)光]顏色、表面電勢、表面電荷密度等性質(zhì)元素進(jìn)行分類組合從而產(chǎn)生出大量不同組合的微粒，分別用某一特定組參數(shù)的組合[某一尺寸和某發(fā)光波長等的特殊組合---編碼]的微小顆粒作為某生物或化學(xué)分子的載體，從而可以用大量不同且特殊編碼微小顆粒制成基因芯片，
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的捕獲探針、標(biāo)記探針或靶基因可以是，但不限于如下種類之一或不同種類的組合(1)核糖核酸[RNA]，各種核糖核酸[″ribonucleic acid″and″RNA″]，包括信使RNA[簡稱mRNA]、轉(zhuǎn)錄RNA[簡稱tRNA]等，(2)脫氧核糖核酸[DNA]如DNA，互補(bǔ)DNA[cDNA]等，(3)寡核苷酸[oligonucleotide]，包括寡聚脫氧核糖核酸[oligodeoxynucleotide，簡稱ODNs]，寡聚核糖核酸[oligoribonucleotide，ORNs]，多聚核苷酸[polynucleotide]，(4)核酸結(jié)構(gòu)相似物[DNA-DNA，RNA-RNA or RNA-DNA mimic duplexes，triplexes or quadroplexes，等]]如肽核酸[peptide nucleic acids，簡稱PNA]，(5)脫氧核糖核酸、核糖核酸及其結(jié)構(gòu)相似物的互補(bǔ)雙鏈、三[重]鏈、四[重]鏈等形式的雜交分子如DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA、PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA，PNA-DNA-PNA]等，基因芯片的檢測原理可以是，但不限于如下種類之一或不同原理的結(jié)合(1)通過對固相表面定位在不同位置的探針-靶特異性雜交反應(yīng)進(jìn)行光學(xué)信號[如熒光分子、化學(xué)發(fā)光等]標(biāo)記，然后經(jīng)激發(fā)產(chǎn)生熒光、化學(xué)或生物發(fā)光并進(jìn)行檢測，(2)通過對標(biāo)記的或未標(biāo)記的探針或靶在施加了電壓的液相中的移動速度或遷移率進(jìn)行檢測，即電泳技術(shù)或由電泳技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合而產(chǎn)生的其他技術(shù)，如毛細(xì)管電泳[capillary electrophoresis，CE]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳[capillary zone electrophoresis，CZE]、毛細(xì)管凝膠電泳[CGE]、高效毛細(xì)管電泳[HPCE]、毛細(xì)管等電聚焦[capillary isoelectric focusing(CIEF)]、等速電泳[isotachophoresis(ITP)]、動電色譜[electrokinetic chromatography(EKC)]、膠束動電毛細(xì)管色譜[micellar electrokinetic capillary chromatography(MECC OR MEKC)]、毛細(xì)管電色譜法[capillary electrochromatography(CEC)]、非水相毛細(xì)管電泳[non-aqueous capillary electrophoresis(NACE)]等，(3)通過探針、靶或探針-靶絡(luò)合物以及它們的標(biāo)記物不同的親和力，進(jìn)行色譜技術(shù)分析，如親和層析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gel permeationchromatography]，MCC[metal chelate chromatography]等，(4)利用具有氧化還原性質(zhì)的分子或分子的部分結(jié)構(gòu)[即化學(xué)基團(tuán)或功能團(tuán)]、金屬絡(luò)合物或(核酸)嵌入劑與被定位并固定在固相表面不同位置或電極上的探針、靶或探針-靶絡(luò)合物結(jié)合并在外加適當(dāng)方式或適當(dāng)大小的電壓(或電勢差)作用(直流電壓或交變電流或脈沖電場或電壓)下，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，致使從還原性分子或基團(tuán)(電子授體，electron donor)的電子轉(zhuǎn)移到氧化性分子或基團(tuán)(電子受體，electron acceptor)，形成電子流，通過電極傳送到檢測系統(tǒng)進(jìn)行測量，所測得的電流強(qiáng)度大小與雜交并被標(biāo)記的雙鏈核酸的量成正比，(5)利用雙鏈核酸和單鏈核酸的導(dǎo)電性能差異，或利用由序列完全互補(bǔ)配對的核酸雜交所形成的雙鏈核酸分子與有錯配堿基對(Mismatches)存在的雙鏈核酸(nucleic acids duplexes)分子之間在導(dǎo)電性能差異，通過對經(jīng)由核酸分子傳導(dǎo)的電子流大小的測量而對核酸分子由此所反映的其他方面所進(jìn)行的各種鑒別、檢測和考察，如在基因突變、基因多態(tài)性、基因測序、基因表達(dá)譜研究、疾病機(jī)理分析和疾病診斷等方面的應(yīng)用，(6)將發(fā)生在核酸分子上或由具有氧化還原性質(zhì)的物質(zhì)(包括但不限于，具有氧化還原性質(zhì)的金屬絡(luò)合物以及由金屬絡(luò)合物或金屬絡(luò)合物的衍生物為單體聚合而成的聚合物、熒光分子、核酸嵌入劑等)所發(fā)生的電子或電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)或電子流轉(zhuǎn)換成其他可檢測或可考察形式的檢測技術(shù)，如通過電致發(fā)光[Electroluminescence]原理，利用電致發(fā)光分子將電子流轉(zhuǎn)換為光信號所進(jìn)行的檢測，(7)直接或間接以具有氧化還原性物質(zhì)(如二茂鐵基)對探針或靶分子標(biāo)記物，通過標(biāo)記后可以使標(biāo)記物接近電極表面而發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)對發(fā)生在電極表面的生物或化學(xué)反應(yīng)的檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙探針基因芯片信號放大技術(shù)，其標(biāo)記反應(yīng)模式可以是，但不限于如下通式所描述的幾種情景(1)單一樣本來源的靶基因與標(biāo)記探針優(yōu)先雜交，在雜交雙鏈進(jìn)行或未進(jìn)行鏈間交聯(lián)或鎖定之后，再與基因芯片上的捕獲探針特異性雜交，同樣在捕獲探針與靶基因所形成的雜交雙鏈進(jìn)行或未進(jìn)行鏈間交聯(lián)或鎖定之后，形成雙探針雜交標(biāo)記的靶基因，(2)兩種或兩種以上不同樣本來源的靶基因分別與不同特性的標(biāo)記探針優(yōu)先雜交，從而使不同來源的靶基因各自被特異性的標(biāo)記探針?biāo)x，在雜交雙鏈進(jìn)行或未進(jìn)行鏈間交聯(lián)或鎖定之后，再與基因芯片上的捕獲探針特異性雜交，同樣在捕獲探針與靶基因所形成的雜交雙鏈進(jìn)行或未進(jìn)行鏈間交聯(lián)或鎖定之后，形成雙探針雜交標(biāo)記的靶基因，(3)單一來源的靶基因與捕獲探針和標(biāo)記探針同時進(jìn)行雜交過程，之后，進(jìn)行或未進(jìn)行雜交雙鏈的鏈間鎖定過程以強(qiáng)化標(biāo)記和雜交雙鏈的連接強(qiáng)度，標(biāo)記探針的結(jié)構(gòu)可以用通式(I)表示，通式(I)F(-L2-XNA)n，或F(-XNA)n，用以核酸雙鏈鏈間交聯(lián)或鎖定的化合物以X表示，可以分別是如下情況之一或不同類型化合物的組合使用，X-是與雙鏈核酸通過靜電吸引力、次鍵力[如范德華力、氫鍵等]、與雙螺旋結(jié)構(gòu)中的大溝或小溝的親和力[Groove binders]、嵌入雙鏈堿基對的親和力[intercalators]、與雙螺旋結(jié)構(gòu)形成三螺旋結(jié)構(gòu)或四螺旋結(jié)構(gòu)等方式相結(jié)合的功能團(tuán)，與核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)通過化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵結(jié)合的功能團(tuán)或分子，可以特異性識別核酸雙鏈結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合的生物分子，可與核酸雙鏈絡(luò)合或結(jié)合的各種生物或化學(xué)分子，它可以包括但不限于下列化合物以及以下列化合物為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)或特征的各種衍生物和生物或化學(xué)修飾后所形成的化合物X-的結(jié)構(gòu)特征根據(jù)其與為雜交單鏈核酸或與已經(jīng)互補(bǔ)雜交的核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用性質(zhì)可以分為如下幾種類型(1)靜電吸引力、次鍵力[如范德華力、氫鍵等]，與核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中的大溝或小溝的親和力[Groove binders]。屬于這種情況的X-可以是，但不限于如下幾類物質(zhì)(1)以雙螺旋大溝[majorgrooves]為作用機(jī)理的嵌入劑放射菌素類，如7-氨基-放射菌素D[7-amino-Actinomycin D]；與雙螺旋小溝[minor grooves]形成絡(luò)合物的咔唑類[如3，6-carbazole，2，7-carbazole]和二苯基呋喃二銨類[diphenylfurandiamindine]，聚胺類[polyamines]DNA嵌入劑，吲醌類嵌入劑[6H-indoloquinoline core]，烷基氨基烷基鏈[alkylaminoalkyl chain，DNA小溝嵌入劑]，(2)可以嵌入雜交核酸雙螺旋堿基對的親和力[intercalators]，屬于這種情況的X-可以是(a)在一定條件下，可以形成鏈間共價(jià)交聯(lián)的一類化合物，如補(bǔ)骨脂素(Psoralen)、異補(bǔ)骨脂素以及它們的任何衍生物形式，如4’-羥甲基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(4’-hydroxymethyl-4，5’，8-trioxalen，簡寫HMT)等，光激發(fā)嵌入劑[Ru(phen)2dppz2+；phen＝1，10-phenanthroline；dppz＝dipyridophenazine]，順氯氨鉑[cisplatin]，兼具DNA光損傷性質(zhì)的嵌入劑吲哚基喹啉正離子鹽類或喹啉衍生物正離子鹽類[indolo[2，3-b]-quinolizinium bromide]；(b)作為雙鏈嵌入劑的EDTA過渡金屬絡(luò)合物類[如methinidiumpropyl EDTA Fe(II)]，2，7-diazapyrene(DAP)，DAPI[4’-6-diamidino-2-phyenylindole]，N-甲基化正離子[N-methylated cations DAP+and DAP2+]，吖啶類化合物{Acridine orange[3，6-bis(dimethylamino)acridine，HCl]}，雙齒狀吖啶類嵌入劑[bis-dentate acridineintercalators]、氨基氮蒽或氨基吖啶[9-aminoacridine(9AA)]，碘基或碘代吖啶類[2-iodine-125-iodoacridine]；(c)可切斷DNA鏈結(jié)構(gòu)的嵌入劑亞德里亞霉素或阿霉素[Adriamycin，或Doxorubicin]，elsamicin，Nogalamycin，Sanguinarine，Cherethyrine，anthracycline drug，leinamycin，Echinomycine，正定霉素或道諾霉素類[Daunomycin]，[Rebeccamycin]；(d)兼具核酸堿基嵌入功能和雙螺旋溝槽嵌入功能的偏端霉素類化合物[distamycin]和紡錘菌素類化合物[netropsin]以及Hoechst 33258和Hoechst 3342等；(e)以次鍵力為主與雙螺旋結(jié)構(gòu)中的堆積堿基相互作用的亞甲基藍(lán)[methylene blue(MB，MB+)，溴乙非啶或溴化二氨乙苯啡啶[ethidium bromide]和二溴乙錠正離子[diethdium cathion]，(3)與雙螺旋結(jié)構(gòu)形成三螺旋結(jié)構(gòu)或四螺旋結(jié)構(gòu)等方式相結(jié)合的功能團(tuán)，與核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)通過化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵結(jié)合的功能團(tuán)或分子，可以特異性識別核酸雙鏈結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合的生物分子，可與核酸雙鏈絡(luò)合或結(jié)合的各種生物或化學(xué)分子，它可以包括但不限于下列化合物以及以下列化合物為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)或特征的各種衍生物所有可以嵌入核酸雙鏈結(jié)構(gòu)或核酸雙鏈的大溝或小溝中的嵌入物、多聚嵌入物、線性或環(huán)狀嵌入物等，(4)可與RNA形成各種絡(luò)合物的核仁素類[如Nucleolin RBD12]，(5)可以在雙螺旋結(jié)構(gòu)中的多個位點(diǎn)進(jìn)行嵌入的多重嵌入劑，比如將棘皮霉素類[Echinomycine，DNA雙重嵌入劑]通過共價(jià)鍵偶聯(lián)起來，或串聯(lián)起來，可以形成四重嵌入的四重嵌入劑；(6)重氮氨苯脒乙酰甘氨酸鹽[berenil]，細(xì)胞毒素類[如cytotoxin NLCQ-1]，三骨菌素[triostin]，黃連素類[如protoberberine-8]，，口腔M[Gilvocarcin M]，呋喃萘基吡喃酮類[furonaphthopyrone]，卟啉或金屬卟啉類化合物[porphyrins or metalloporphyrins]，咔啉類化合物[如beta-carbolines]，原黃素[proflavin(Acr-NH2)]，3，7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium chloride]，苯基巰基吡喃[benzothiopyranoindazole]，[水溶性]亞丙基碘化物[propidium iodide]，(7)以芳香環(huán)結(jié)構(gòu)堆積為特征的線狀多聚DNA嵌入物[thestacked aedamer core，具有兩個或若干個1，4，5，8-四羧酸二酰亞胺(1，4，5，8-tetracarboxylic diimide)等特征結(jié)構(gòu)單元多聚嵌入物]，(8)可以產(chǎn)生電化學(xué)信號的嵌入物二茂鐵基萘二酰亞胺類線狀嵌入劑[threading ferrocenyl naphthaline diimide](9)蒽類[anthryl compands如AMAC[9-氨基-6-氯-2-甲氧基啞啶(9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine)]，anthracycline，APAC，N-Et-AMAC等]，蒽醌類[anthraquinones]，萘二酰亞胺類嵌入劑[naphthalene diimide intercalators]，菲離子類嵌入劑[phenanthridinium intercalators]，(10)金屬類嵌入劑，如八面體DNA銠嵌入劑[rhodium intercalator，bis(2-2′bipyridyl)chrysene quinonediimine，D-[Rh[(R，R)-Me 2 trien]phi] 3+，Ru(NH2)63+]，有手性絡(luò)合物結(jié)構(gòu)的金屬釕嵌入劑[rutheniumintercalators，[Ru(phen)2 dppz]2+(phen＝1，10-phenantroline；dppz＝dipyrido[3，2-a2′，3′-c]phenazine)]，terpyridine platinum compound(TPH)，mitoxantrone，鑭系金屬化合物DNA嵌入劑[lanthanide]，二吡啶基(乙二胺)鉑鹽或三吡啶基鉑鹽類[bipyridyl(ethylenediamine)Pt(II)2+，4-picoline-2，2’6’，2”-terpyridine-platinum]，(11)可改變雙螺旋溝槽結(jié)構(gòu)的萘二酰亞胺類化合物[雙嵌入劑，如naphthalene diimides，N，N’-disubstitutednaphthalene diimide derivatives，用多肽鏈作為嵌入雙螺旋小溝的連接臂的萘四羧酸二酰亞胺雙嵌入劑(1，4，5，8-Naphthalene Tetracarboxylic Diimide Bis-Intercalator with the Linker(-Ala)3-Lys in the MinorGroove)，用胺基烷基將DNA嵌入功能團(tuán)線性連接起來所形成的雙嵌入劑，三嵌入劑，多聚嵌入劑和有環(huán)雙線狀嵌入劑等]，(12)荷苞牡丹堿類[dicentrine]，三環(huán)大那霉素類[tricyclic dynemicin A]，硝基胺類[nitracrine，親電子性DNA嵌入劑]，環(huán)磷酰胺類[cyclophosphamide]，amsacrine，丹參酮類[如Dihydrotanshinone，I]，octahydroxanthene，吲唑類[indazoles，如benzothiopyranoindazole DNA嵌入劑]，咪唑類[imidazole]，N-[4-(9-吖啶基氨基)-3-甲氧基-苯基]甲烷-磺胺類化合物[N-[4-(9-acrydinylamino)-3-methoxy-phenyl]methane-sulphonamide，m-AMSA]，大環(huán)內(nèi)酰胺類[macrocycliclactam]，喹啉衍生物類嵌入劑{如indolo[2，3-b]quinolines，6H-indoloquinoline core，quinoxalines}，Amsacrine，(夾)氧雜蒽類[Xanthenes，如1，8-二氧代-9-(o-硝基苯基)-1，2，3，4，5，6，7，8八氫氧雜蒽(1，8-dioxo-9-(o-nitrophenyl)1，2，3，4，5，6，7，8-octahydroxanthene)]，luzopeptin，甘菊環(huán)類[6a，7-diazanaphth[3，2，1-cd]azulene和7H-1，7-diazaindoleno[1，2e]azulene system]，Ditercalinium，4，6-diamidino-2-phenyline[DAPI]，戊烷脒類[pentamidine]，(13)Pixantrone，基于吲哚結(jié)構(gòu)的玫瑰樹堿類[indole-based intercalator ellipticine]，奎吖因類[quinacrine]，重氮化合物類[4，9-diazapyrenium]，雌甾二醇類[estradiol]，雙苯基酰亞胺類[bisbenzimide]，噻唑類[如thiazole orange]，(14)光活性生物素或光生物素[photoactivable biotin，photobiotin]、光生物素與生物分子或化學(xué)分子的偶聯(lián)體、及光生物素的衍生物，可斷鏈的光生物素[如photoactivable cleavablebiotin]，(15)所有可以對核酸進(jìn)行染色的染料分子，如熒光染料bisbenzimide H fluorochrome [TriHCl]，色霉素[chromomycin]A3，熒光性嵌入劑[如TOTO，YOYO，SYBR Green]，(16)所有可以與基因芯片上的已互補(bǔ)雜交的核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)形成三重(倍)[triplex]螺旋或四重(倍)[quadruplex]螺旋結(jié)構(gòu)的化合物或生物分子或生物分子結(jié)構(gòu)類似物以及此結(jié)構(gòu)與其他分子共價(jià)偶聯(lián)所形成的復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)，如PNA[peptidenucleic acids]，寡聚核苷酸，多肽[如[N-MeCys3，N-MeCys7]TANDEM]等；(17)可與核酸雙鏈發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或光化學(xué)反應(yīng)從而形成共價(jià)鍵連接的功能團(tuán)或分子，如疊氮類化合物，結(jié)構(gòu)中含有苯甲酮功能團(tuán)的化合物及其衍生物?？梢耘c核酸探針或靶基因發(fā)生共價(jià)交聯(lián)的各種化學(xué)交聯(lián)劑或化學(xué)反應(yīng)功能團(tuán)如可以通過與靶基因上的羥基發(fā)生縮水反應(yīng)的碳二亞胺，或光化學(xué)反應(yīng)活性的交聯(lián)劑，如芳香基疊氮化合物[aryl azides，如N-((2-pyridyldithio)ethyl)-4-azidosalicylamide[PEAS]等]、氟代芳香基疊氮化合物[fluorinated aryl azides]，苯甲酮類光反應(yīng)試劑[benzophenone-based photoreactive reagents，如苯甲酮馬來酰亞胺[benzophenonemaleimide]]等；(18)可以序列特異性地或非序列特異性地識別核酸雙鏈結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合或以雙鏈核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)為底物的蛋白質(zhì)或酶等生物分子，如HMGB蛋白，可與經(jīng)順氯氨鉑修飾的dsDNA結(jié)合的NHP6A蛋白，參與DNA復(fù)制的酶、凝血酶[thrombin]、RNA轉(zhuǎn)錄的酶絲裂霉素[Mitomycin C]、可以與核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)的雙鏈間形成共價(jià)橋形鍵的博來霉素或爭光霉素類[Bleomycin]、雙鏈核酸抗體、雙鏈核酸的特異性結(jié)合酶，DNA聚合酶或RNA聚合酶，(19)可以與待測靶基因或基因芯片上探針核酸分子的某個或某些特異性序列進(jìn)行特異性互補(bǔ)并結(jié)合形成互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸分子，反義核酸[anti-sense nucleic acidsequences]序列等，該類化合物可以同時適用于雜交前標(biāo)記和雜交后標(biāo)記兩種方案，(20)具有氧化還原[redox]性質(zhì)，可以發(fā)生電子授受反應(yīng)[Electron Donor-Acceptor Reaction]或電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)[Electron-TransferReaction]的核酸結(jié)合物以及以這些化合物為單體聚合而成的聚合物和低聚物、寡聚物，如[a]可以嵌入核酸雙鏈中的熒光分子有但不限于，亞甲基藍(lán)[Methylene Blue，MB+]和Hoechst33258等熒光分子等，或[b]金屬絡(luò)合物，如釕金屬絡(luò)合物[Ruthenium tris(2，2’-bipyridine)]等，或[c]通過共價(jià)鍵連接或非共價(jià)鍵結(jié)合與上述任何一種核酸嵌入劑發(fā)生共價(jià)交聯(lián)或非共價(jià)鍵結(jié)合的具有氧化還原性質(zhì)的高荷信號載體[HSC]，包括但不限于，多聚二茂鐵基團(tuán)[polyferrocenyl]、多聚二茂鋯基團(tuán)、多聚二茂釕基團(tuán)等多聚二茂金屬類物質(zhì)，(21)核酸結(jié)構(gòu)類似物[nucleic acid mimics]，如PNA[peptide nucleic acids]，可以與核酸形成穩(wěn)定結(jié)合物，-L-可以是但不限于如下各種結(jié)構(gòu)或分子(1)溶劑相容性連接臂，即當(dāng)溶劑為疏水體系時，連接臂亦為疏水連接臂；當(dāng)溶劑為親水體系時，連接臂亦為親水連接臂，可以是PEG、合成多肽等，長度不限，(2)分子導(dǎo)線[molecular wires，如雙鏈DNA分子，親水性連接臂，珠鏈型富勒烯線型聚合物(富勒烯被導(dǎo)入有機(jī)高分子主鏈的珠鏈型高分子)或?qū)⒏焕障巴基球，fullerene]用R基連接起來的巴基球項(xiàng)鏈等]，(3)分子絕緣體[molecular insulators，如疏水性連接臂，長鏈烷烴等]，(4)結(jié)合有分子磁體的連接臂，(5)在化學(xué)或光學(xué)等因素作用下，分子鏈可以斷鏈的連接臂等，如雙硫鍵[-SS-]等，F(xiàn)表示以各種微小顆粒形式存在的高載荷光學(xué)、磁性、電子學(xué)或電化學(xué)信號載體，它可以是高聚物或共聚物熒光微球、表面修飾有熒光染料的硅氧磁珠[silica beads]、半導(dǎo)體納米晶量子點(diǎn)[quantumdots，QDs]、高分子微球與量子點(diǎn)相結(jié)合的產(chǎn)物量子點(diǎn)微球[QD-tagged nanobeads or microspheres]、蛋白質(zhì)包裹的半導(dǎo)體納米顆?；蛭㈩w?；蛄孔狱c(diǎn)[如Chaperonin mediated semiconductor nanoparticles]、樹枝狀高分子或樹形分子[dendrimers]、星形樹枝狀高分子[dendrimeric stars]、膠束[micelles]、分子磁體[molecular magnets]、膠囊式微球[encapsulated spheres]、膠體納米金[colloidal gold nanoparticles]、電致發(fā)光分子[electroluminescent molecules]、二茂金屬基共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如二茂鐵基聚合物[polyferrocene block copolymers，PFC，或polyferrocenylsilanes，PFS]微球，多聚二茂鋯[polyzirconocene，PZC]、多聚二茂金屬基修飾或接枝的樹枝狀高分子[包括但不限于，聚二茂鐵基接枝的樹枝狀高分子(polyferrocenyl-branched dendrimers)]、二茂金屬基或多聚二茂金屬基修飾或接枝的納米金膠體[包括但不限于，胺基二茂鐵基功能化的納米金膠體(Gold colloids functionalized withamidoferrocenyl structures)等]、共聚物微球或納米球、含有富勒烯結(jié)構(gòu)的或以富勒烯為單體之一的高聚物或共聚物、其它含熒光染料或化學(xué)發(fā)光[chemiluminescence]、生物發(fā)光[bioluminescence]材料的載體，藻膽蛋白類[phycobiliproteins]及其各種衍生物或生物或化學(xué)修飾物，以及上述每一種載體中不同參數(shù)[如大小、光學(xué)發(fā)射光波長、電磁學(xué)性質(zhì)、表面生物或化學(xué)功能團(tuán)修飾等物理或化學(xué)性質(zhì)]載體的組合，或各種不同載體之間的相互組合，n是從零到無窮大的自然數(shù)0，1，2，3...，XNA表示核酸及其結(jié)構(gòu)類似物，如單鏈或互補(bǔ)雜交的雙鏈核酸[含寡核苷酸]及其相似物[DNA，RNA，PNA，DNA-DNA，RNA-RNA，RNA-DNA or RNA-DNA mimic duplexes，triplexes or quadroplexes，PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA，PNA-DNA-PNA等]，
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1制作的基因芯片雙探針信號標(biāo)記和放大試劑盒，即BAT試劑盒，包含了基因芯片處理各過程所需要的全部生化試劑，含有但不限于如下通式所表示的核心組分通式(I)化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一套雙探針基因芯片信號放大方法。其原理是設(shè)計(jì)兩個或多個與靶基因特異性位點(diǎn)的堿基序列互補(bǔ)的兩個或多個探針，即捕獲探針和標(biāo)記探針。其中以固定于基因芯片上微點(diǎn)陣中核酸探針為捕獲探針，另外至少一個與待測靶基因特異性位點(diǎn)堿基序列互補(bǔ)配對的核酸上通過化學(xué)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵連接高荷信號載體，成為標(biāo)記探針。后者實(shí)際上是一種有強(qiáng)大信號放大能力的標(biāo)記靶基因。通過將各種不同形式的高荷信號載體[HSC]應(yīng)用于基因芯片的信號放大標(biāo)記和檢測過程，從而大大地提高了基因芯片信號檢測靈敏度和信噪比。通過制備大量標(biāo)記靶基因或標(biāo)記探針，可以實(shí)現(xiàn)對不同核酸分子的高通量分析。在一些實(shí)施例中，各種HSC如高分子熒光微球、量子點(diǎn)[QD]、樹形分子[Dendrimers]、多聚二茂鐵、量子點(diǎn)微球[QD－tagged Beads]等被應(yīng)用于基因芯片、微流體電泳芯片等生物芯片的檢測中。利用該技術(shù)標(biāo)記之后的微陣列，在激光共聚焦掃描儀、CCD、熒光顯微鏡和等離子體共振激發(fā)技術(shù)等條件下，可以檢測到在微陣列上發(fā)生的單個標(biāo)記事件，因而是一種微陣列超靈敏檢測技術(shù)。該技術(shù)尤其適合于臨床診斷等領(lǐng)域的基因芯片檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1570140SQ0314184
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者宋克 申請人:宋克