用于合浦珠母貝微衛(wèi)星家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記引物及鑒定方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于貝類遺傳育種的分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于合浦珠母貝微 衛(wèi)星家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記引物及鑒定方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 合浦珠母貝（Pinctada fucata)亦稱"馬氏珠母貝"，雙殼綱，珍珠貝科，附著生活 在水質(zhì)澄清有珊瑚礁或多沙堿的淺海底，分布于南海，日本亦產(chǎn)，除產(chǎn)珍珠外，肉可食，殼可 制紐扣，是中國及世界上海水珍珠培育的主要種類之一，我國華南沿海合浦珠母貝所產(chǎn)珍 珠即為舉世聞名的"南珠"。
[0003] 由于在長期的養(yǎng)殖過程中不注重選育種，并且養(yǎng)殖模式陳舊，養(yǎng)殖場地老化，育珠 技術(shù)落后，致使養(yǎng)殖合浦珠母貝生長緩慢，珍珠質(zhì)分泌能力下降，育珠能力降低，導(dǎo)致人工 養(yǎng)殖珍珠質(zhì)量和產(chǎn)量都明顯下降，珠粒小，珠層薄，色澤差，珍珠養(yǎng)殖效益低下，許多養(yǎng)殖戶 放棄養(yǎng)殖珍珠而改養(yǎng)其它品種，嚴(yán)重限制了 "南珠"養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，盡快開展合浦珠 母貝良種選育工作是促進其養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)定、健康發(fā)展的必要手段。
[0004] 在貝類遺傳育種研究中，清晰的系譜信息對于家系的選育和親本的管理至關(guān)重 要，同時也是明確個體間親緣關(guān)系，建立正確系譜的重要手段。通過親緣關(guān)系鑒定，開展家 系分析研究可W闡明繁殖成功率，增殖放流幼體擴散等許多有關(guān)遺傳學(xué)方面和繁殖生態(tài)學(xué) 的科學(xué)問題。在合浦珠母貝育種過程中，親本的數(shù)量都不會很多，加之逐代人工繁殖，導(dǎo)致 了很多苗種出現(xiàn)了衰退現(xiàn)象。
[0005] 因此有效的系譜鑒定可W 了解育種親本的育種價值，同時對提高育種效率和生產(chǎn) 實踐都有重要意義。W微衛(wèi)星分型為基礎(chǔ)的親子鑒定技術(shù)是目前水產(chǎn)動物系譜確認中應(yīng)用 最廣泛最可靠的手段之一。已應(yīng)用到扇貝、太平洋牡頗、耳鮑、凡納濱對郵、中國對郵、牙解 等水產(chǎn)經(jīng)濟動物育種中。
[0006] 目前，關(guān)于將微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于合浦珠母貝家系鑒定研究的報道甚少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種用于合浦珠母貝微衛(wèi)星家系鑒定 的微衛(wèi)星標(biāo)記引物。
[000引本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種利用上述微衛(wèi)星標(biāo)記引物進行合 浦珠母貝微衛(wèi)星家系的鑒定方法，該方法易于同時分型檢測，可W用于合浦珠母貝的群體 遺傳結(jié)構(gòu)，遺傳育種學(xué)評估及親子鑒定等，同時可大幅度節(jié)約實驗成本。
[0009] 本發(fā)明所要解決的最后一個技術(shù)問題是提供一種利用上述用于合浦珠母貝微衛(wèi) 星家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記引物在合浦珠母貝家系鑒定中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種用于合浦 珠母貝微衛(wèi)星家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記引物，所述微衛(wèi)星標(biāo)記引物共有9個引物對，分別為 PF-3、PF-4、PF-II、PF-13、PF-16、PF-27、PF-30、PF-44 和 PF-48，其中：
[0011] 引物對PF-3的核巧酸序列如沈Q ID NO: I和沈Q ID N0:2中所示；
[001^ 弓|物對PF-4的核巧酸序列如沈Q ID N0:3和沈Q ID N0:4中所示；
[OOU]引物對PF-Il的核巧酸序列如沈Q ID N0:5和沈Q ID N0:6中所示；
[0014] 引物對PF-13的核巧酸序列如沈Q ID N0:7和沈Q ID N0:8中所示；
[001引引物對PF-16的核巧酸序列如沈Q ID N0:9和沈Q ID NO: 10中所示；
[0016] 引物對PF-27的核巧酸序列如沈Q ID NO: 11和沈Q ID NO: 12中所示；
[0017] 引物對PF-30的核巧酸序列如沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14中所示；
[001引引物對PF-44的核巧酸序列如沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16中所示；
[0019] 引物對PF-48的核巧酸序列如沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18中所示。
[0020] 本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：上述合浦珠母 貝微衛(wèi)星家系的鑒定方法，包括W下步驟：
[0021] (1)合浦珠母貝親本及子代DNA提取:選取合浦珠母貝作為親本進行全同胞家系繁 殖，繁殖后選取親本及子代肌肉組織，采用Magen動物DNA提取試劑盒提取，獲得合浦珠母貝 親本及子代的DNA作為模板待用；
[0022] (2)微衛(wèi)星標(biāo)記引物巧光修飾:選取權(quán)利要求1中的9個引物對，分成3組，其中PF- 4、PF-11 和 PF-30 為一組，PF-13、PF-27 和 PF-44 為一組，PF-3、PF-16 和 PF-48 為一組，在每組 引物的正向引物5'端分別用FAM、肥X和ROXS種不同的巧光基團進行修飾，用于PCR分析；
[0023] (3)巧光PCR:采用巧光PCR反應(yīng)利用步驟(2)中巧光基團修飾過的9個引物對分別 對步驟(1)中的親本及子代的DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物按照步驟(2)中分組的方法進行混 合，混合物作為上機待測樣品；
[0024] (4)合浦珠母貝微衛(wèi)星家系鑒定:將上機待測樣品采用基因分析儀進行分析，讀取 每個樣品的基因型，對親本基因型和子代基因型進行分析，判定子代個體的父母本，獲得合 浦珠母貝的微衛(wèi)星家系。
[0025] 在上述合浦珠母貝微衛(wèi)星家系的鑒定方法中：
[00%] 步驟(3)中巧光PCR反應(yīng)時，2化L反應(yīng)體系優(yōu)選包括15.2化雙蒸水，2化10 X PCR緩 沖液，濃度為10皿/L的正、反引物各0.化L，濃度為lOmm/L的dNTP 0.化L，濃度為抓/化的化q 酶0.化L，化L DNA模板。
[0027] 步驟(3)中巧光PCR反應(yīng)時，優(yōu)選95 °C預(yù)變性5min，95 °C變性30s，56 °C退火30s，72 。(:延伸30s，反應(yīng)進行30個循環(huán)，最后72°C再延伸lOmin。
[0028] 步驟(4)中優(yōu)選采用軟件(ERVUS3.0軟件對親本基因型和子代基因型進行分析，判 定子代個體的父母本。
[0029] 采用軟件CERVUS3.0可計算親本和子代在各微衛(wèi)星座位上等位基因頻率、雜合度、 期望雜合度、多態(tài)信息含量、平均排除概率、化rdy-Weinberg平衡及無效等位基因頻率等信 息，從而判定子代個體的父母本。
[0030] 進一步的，本發(fā)明提供的一種合浦珠母貝微衛(wèi)星家系的鑒定方法，包括W下步驟：
[0031] (1)合浦珠母貝DNA提取
[0032] 選取健康發(fā)育良好的合浦珠母貝作為親本進行全同胞家系繁殖，剪取親本及子代 閉殼肌組織樣品放于無水乙醇中，采用Magen軟體動物DNA提取試劑盒來操作，檢測質(zhì)量和 濃度后，稀釋至IO化g AiL，存放于-20°c保存?zhèn)溆茫?br>[0033] (2)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記引物的篩選和引物合成
[0034] 選取9對微衛(wèi)星引物，按照片段大小分成3組，其中，引物PF-4,PF-11，PF-30，為一 組，引物PF-13，PF-27，PF-44，為一組，引物PF-3，PF-16，PF-48，為一組;在正向引物5 '端分 另Ij用FAM，肥X，ROX^種不同的巧光基團進行修飾，用于PCR分析；
[0035] (3)巧光 PCR
[0036] 采用巧光PCR反應(yīng)對親本和子代DNA樣品進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物按照步驟(2)中所 選微衛(wèi)星引物分組的方法進行混合，作為上機檢測的樣品；
[0037] (3)微衛(wèi)星位點基因分型W及斑節(jié)合浦珠母貝微衛(wèi)星家系鑒定
[0038] 樣品在ABI3730)(L基因分析儀上進行分型，用GS-500作為內(nèi)參，用GeneMa郵er V 3.2軟件讀取每個樣品的基因型，采用CERVUS 3.0軟件對親本基因型和子代基因型進行分 析，判定子代個體的父母本。
[0039] 本發(fā)明所要解決的第=個技術(shù)問題是通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：上述用于合浦 珠母貝微衛(wèi)星家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記引物在合浦珠母貝家系鑒定中的應(yīng)用。
[0040] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0041] (1)采用本發(fā)明中的引物，首次在合浦珠母貝上利用巧光標(biāo)記的多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記 建立了親子鑒定平臺，其鑒定準(zhǔn)確率達到了90.24%;
[0042] (2)本發(fā)明方法能快速、有效地鑒別合浦珠母貝不同家系及來源，為合浦珠母貝的 選育，繁殖配組和增殖放流評估提供了依據(jù)；
[0043] (3)本發(fā)明按照微衛(wèi)星引物擴增片段大小和巧光標(biāo)記的顏色不同進行組合，將3個 微衛(wèi)星引物分另化CR擴增之后的DNA產(chǎn)物混合在一起上樣檢測，比普通PCR檢測方法提高了 3 倍效率，同時節(jié)約了成本和時間；
[0044] (4)本發(fā)明選擇的微衛(wèi)星位點等位基因數(shù)目較多，多態(tài)性高，可W用于合浦珠母貝 的群體遺傳結(jié)構(gòu)，遺傳育種學(xué)評估及親子鑒定等，同時可大幅度節(jié)約實驗成本。
【具體實施方式】
[0045] W下結(jié)合具體實施方法對本發(fā)明進行詳細說明。
[0046] 實施例1用于合浦珠母貝微衛(wèi)星家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記引物的篩選與合成
[0047] 通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選到含有合浦珠母貝微衛(wèi)星重復(fù)序列的unigene，然后從合浦 珠母貝轉(zhuǎn)錄組文庫將其中檢測到含有微衛(wèi)星位點的序列設(shè)計微衛(wèi)星特異性引物，檢測其多 態(tài)性，經(jīng)過篩選之后最終選擇了9對條帶清晰，多態(tài)性高的引物作為家系鑒定的引物，引物 在上海生工生物工程股份有限公司合成。
[004引本發(fā)明中選擇的