專利名稱：實現(xiàn)mRNA-介導的將遺傳信息轉移到植物中的方法及該方法的產(chǎn)物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學和遺傳工程學領域。具體地說，本發(fā)明涉及將外源遺傳物質(mRNA)引入植物的方法。
參考文獻本專利申請引用了多篇學術文章和科學出版物來描述本申請所涉及的現(xiàn)有技術。所有這些出版物均全文引入作為參考。
背景技術：
現(xiàn)有技術中已有改良種多種作物的方法。其中的一些涉及將外源(即非內源)DNA引入植物細胞或組織，再分析所得植物中外源核酸的存在以及外源基因的表達。盡管這些方法在某些情況下可以取得成功，但它們費時、費力并且再現(xiàn)性差。因此，仍然需要進一步開發(fā)有利于農(nóng)作物遺傳轉化的方法，以提高蛋白產(chǎn)量或對其進行改良使之更益于人和/或動物食用。
發(fā)明簡述一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)轉基因植物的方法，該方法通過向植物中引入外源mRNA賦予所得轉基因植物在其子代中合成外源蛋白的能力。本發(fā)明通過mRNA分子(而非DNA分子)傳遞遺傳信息，相對于現(xiàn)有技術中應用的方法具有顯著的進步。應用本發(fā)明的方法可使植物在表達有價值的外源蛋白的同時植物內源蛋白的表達也得到有益增長。
另一方面，本發(fā)明還包括表達有益外源蛋白的轉基因植物，所述植物是通過下述步驟生產(chǎn)的獲得編碼外源蛋白的mRNA的樣品，在可使mRNA進入種子的條件下，用mRNA溫育并接種植物種子，使種子發(fā)芽并從種子長成轉基因植物。所述的mRNA樣品優(yōu)選來自大豆，最優(yōu)選來自大豆的子葉或芽。另外，可通過經(jīng)分離的、編碼所述蛋白的DNA分子轉錄來獲得上述mRNA樣品，所述DNA分子例如編碼在醫(yī)藥方面有用的蛋白(優(yōu)選人蛋白，如γ干擾素，白介素1，白介素2和人生長激素)的DNA分子。更優(yōu)選地，所述植物是玉米，最優(yōu)選玉米品系27-1或85089。
另一方面，本發(fā)明包括表達大豆球蛋白、人白介素1、人白介素2或人γ干擾素的轉基因植物，優(yōu)選玉米。最優(yōu)選地，在本發(fā)明的這一方面所述的玉米是品系27-1；或者是玉米品系85089。
在一個實施本發(fā)明的示例中，從大豆子葉中分離并純化出mRNA用于玉米種子微注射。使經(jīng)處理的種子萌芽，分析所得植物中外源蛋白的表達。微注射并轉化后，通過蛋白檢測技術分析繁殖出的轉基因玉米植株中蛋白的存在與含量。用大豆球蛋白特異的放射性標記DNA探針，通過DNA印跡證實在經(jīng)轉化的玉米中存在大豆DNA。
在本發(fā)明另一個示例性的實施方案中利用的是從大豆的芽中分離出的mRNA。此外，還可以應用其他的玉米品系，如玉米品系85089。可一次、兩次甚至多次將mRNA微注射到受體種子中。利用本發(fā)明的方法成功地生產(chǎn)出表達大豆球蛋白的轉基因玉米植株。
下面通過詳細描述和實施例對本發(fā)明的其他特點和有益之處進行闡述。
優(yōu)選實施方案及已知的本發(fā)明最佳實施方式的詳細描述為了便于理解本發(fā)明，提供下述定義mRNA信使核糖核酸是編碼蛋白的DNA有義鏈的暫時性的互補拷貝。在真核生物中，這一基因表達過程中的重要中間產(chǎn)物是通過RNA聚合酶II從編碼蛋白的基因轉錄而來。通常，先轉錄出較長的前-mRNA，然后在核內對其進行加工。而且，對于大多數(shù)真核mRNA還要通過轉錄后修飾加上5′帽結構和3′poly A尾。
轉基因植物通過重組核酸技術工程化、表達由其他植物或動物編碼的外源蛋白的植物。
DNA雜交實驗由Edward Southern于1975年開發(fā)的一種技術，這項技術指經(jīng)電泳分離的DNA片段變性后從瓊脂糖凝膠上轉移到覆蓋在該凝膠上的硝酸纖維素或尼龍膜上，然后再使其與互補核酸探針雜交。之所以需要上述的轉移步驟是因為與凝膠本身雜交效率很低。這項技術普遍應用于分子遺傳學領域，其多種應用形式通常用于從限制性片段混合物中鑒定出特定的DNA序列，例如確定基因組中某基因的存在、位置和拷貝數(shù)。該項技術也可用于DNA分型。
蛋白印跡一種從復雜的蛋白混合物(如細胞抽提物)中檢測一種或多種特定蛋白的方法，由于該方法類似于鑒定DNA序列的DNA雜交和鑒定RNA的RNA印跡方法而得名。該方法包括通過變性SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白混合物，再由電印跡將上述混合物轉移并固定到硝酸纖維素膜或尼龍固體膜上。然后將加載后的膜與針對感興趣的蛋白的抗體一起溫育。然后利用與某種酶共價連接并針對上述第一抗體的第二抗體檢測在膜上如此形成的抗原-抗體復合物。利用酶反應形成的可溶性反應物指示膜上靶蛋白的位置。
Ouchterlony雙向瓊脂免疫擴散實驗在該實驗中，將抗原和抗體置于瓊脂糖凝膠中的孔內，兩者相向擴散，在以適當比例相接觸的區(qū)域沉淀形成不透明的線。包含幾種抗原則的沉淀物通常產(chǎn)生多條線。在相鄰近的孔中設置沉淀反應可用于評估抗原間的免疫關系。各抗原形成的線可能完全匯合，顯示出免疫同一性。若抗原間部分相關則表現(xiàn)為馬刺狀，若形成十字交叉則表明抗原間不相關。
本發(fā)明的方法可以從所選擇的來源中分離和純化mRNA。分離后，將mRNA單獨注射到植物的種子中(例如，玉米谷粒)，然后將其種植下去并使其生長至成熟。轉化后，分析所得植物子代中的蛋白含量?？赏ㄟ^免疫和生化方法證明經(jīng)處理的植物中是否存在外源蛋白。
下文中詳細列出的實驗數(shù)據(jù)表明，將植物或動物的mRNA微注射到玉米谷粒中可形成轉基因玉米植株代，該植株中可形成由所選擇的mRNA編碼的蛋白。在不試圖通過任何特定的解釋對這一現(xiàn)象進行限定的情況下，這一現(xiàn)象表明上述的mRNA進行了反轉錄并整合到玉米的基因組中。因此，例如大豆mRNA產(chǎn)生的球蛋白在玉米的后續(xù)世代中得以表達。利用32P-標記的互補大豆球蛋白探針通過DNA印跡可以證明大豆球蛋白核酸序列的存在。
本發(fā)明的方法可以生產(chǎn)轉基因玉米，其中的轉基因可在后續(xù)世代中穩(wěn)定遺傳，該方法包括下述步驟1.分離或通過其他的方法獲得所需的mRNA。
2.收獲待遺傳修飾的植物物種的種子。
3.使上述種子吸液膨脹。
4.將mRNA微注射到上述種子中。
5.種植上述種子并使其生長至成熟。
6.篩選長成的植株并從中選出含有由所需mRNA編碼的蛋白的植株。
第一步，通過分離或其他方法獲得所需的mRNA，任何在所需植物中表達的mRNA均可用于本發(fā)明。本申請中以兩大類mRNA為例(1)編碼植物主要結構蛋白的mRNA，例如，大豆球蛋白；(2)編碼具有有用的生物活性的蛋白；例如人生長激素(HGH)和人γ干擾素的mRNA。利用本發(fā)明的方法已引入植物的其他mRNA包括引入玉米品種85079的大豆球蛋白，人生長激素，人白介素1，β，2，人γ-干擾素；引入玉米品種27-1的大豆球蛋白；引入玉米品種340的人白介素2；引入美國甜玉米的大豆球蛋白和人γ-干擾素；引入水稻的大豆球蛋白；引入小麥的大豆球蛋白和(試驗性的)雞肌球蛋白。
其他可用于本發(fā)明的mRNA包括但不限于人白蛋白，人尿激酶型纖溶酶激活物、水蛭素(來自水蛭的抗凝血劑)和人胸腺素-4。總之，本發(fā)明包括使用任何植物和動物的mRNA。
用常規(guī)方法分離mRNA，如Sambrook等，分子克隆，冷泉港實驗室(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory)(1989)或Ausubel等(編)現(xiàn)代分子生物學技術(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley & Sons(2001)中所描述的方法。
在一個優(yōu)選實施方案中，所需的mRNA是主要的結構或貯存蛋白(如，大豆球蛋白)的mRNA，適量的mRNA可通過分離表達所述蛋白的組織如，大豆子葉或芽的總mRNA成分而獲得。在另一實施方案中，所需的mRNA不是主要組分，該mRNA可由經(jīng)分離的編碼所述蛋白(如人細胞中的γ-干擾素)的DNA分子通過體外轉錄獲得。體外轉錄系統(tǒng)是可商購的，如可購自Promega Biotech，Madison，Wisconsin或BRL，Rockville，Maryland。
接下來，需獲得待遺傳修飾的植物的種子。其可以是任何植物物種的種子，沒有特別限定。優(yōu)選地，所述的種子是可施用微注射技術的重要農(nóng)作物的種子。在一個優(yōu)選的實施方案中是來自玉米或小麥的種子。在另一個實施方案中是來自水稻的種子。在另外的實施方案中，它們可以來自其他重要的農(nóng)作物，如大豆、大麥、苜蓿、高粱和黑麥，另外，它們也可以是其他果蔬作物的種子，包括但不限于番茄、胡蘿卜、黃瓜、豌豆、花椰菜、菜花、卷心菜、菠菜等。特別優(yōu)選用于本發(fā)明的是玉米，其任何品種均適用。特別適合的是品種27-1和85089。
將種子在水中浸泡適當時間，如對玉米為2-3天以使其充分吸液膨漲以適于微注射。利用可商購的微注射系統(tǒng)通過常規(guī)方法實施微注射。對玉米而言，微注射針應盡可能地靠近種子的中心軸。注射到玉米中的適宜mRNA量為1μg/μl蒸餾水。在將種子種植下去之前可進行多次注射，并且可注射多種特異的mRNA。
注射后種植種子并使其生長，對長成的植株的適當部分進行分析以確定是否存在由所注射的mRNA編碼的蛋白。這種分析是本領域已知的。其包括蛋白分離(例如，實際地純化所述外源蛋白并進行氨基酸組成或序列分析)或檢測技術(例如免疫學技術，如蛋白印跡、免疫沉淀或Ouchterlony擴散)，以及mRNA或DNA檢測(例如應用特異的DNA探針進行的斑點印跡、RNA印跡、DNA印跡)。
下述實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行說明，其不對本發(fā)明進行任何形式的限制。
實施例1編碼大豆球蛋白的mRNA對玉米的穩(wěn)定轉化已在玉米中證實了基于轉移由mRNA而非DNA編碼的信息的遺傳轉化。由大豆的子葉和芽中提取mRNA，并將其分別引入玉米谷粒，然后種植經(jīng)處理的谷粒。
材料和方法mRNA的分離根據(jù)文獻(Niu，M.C.，L.C.Niu，C.Ma，Z.P.Lin and Y.L.Zhang(1980)Scientia Sinica，23119-122.)公開的方法，利用發(fā)芽的大豆的子葉和/或芽(莖和根軸)提取mRNA。大豆中80％的poly A mRNA編碼大豆球蛋白(1 IS和7S)。
玉米種子的微注射分別處理來自玉米品系27-1和85089的種子，并進行下述分析200粒玉米種子(即谷粒)為一批用自來水沖洗兩次。然后在4NC條件下于雙蒸水中浸潤48到72小時。其間換水2或3次。再用可商購的微注射器將大豆mRNA(分離自大豆芽或大豆子葉)微注射到吸漲的種子中，所述的微注射器是帶有一根不銹鋼針、容量為100微升、帶刻度的玻璃管。將針插入盡可能靠近種子中心軸的位置。注射量為每1毫克雙蒸水1微克大豆mRNA。90％以上經(jīng)注射的種子萌芽并長成了玉米植株。
從玉米谷粒中抽提蛋白以6顆谷粒為一組于4℃下在雙蒸水中浸泡過夜。去掉外皮在丙酮中浸泡脫水、醚浸泡脫脂、再碾成細粉末。用3ml抽提液(10％甘油，5％2-巰基乙醇，2.3％SDS，8M/L尿素，0.02％溴酚藍溶于0.625M/L Tris-HCl中，pH6.8)抽提蛋白。離心(4000rpm 10min)去除沉淀。將上清液煮沸3min，離心(5000rpm5min)。將上清液貯存于-20℃以備分析。
SDS-PAGE用不連續(xù)的SDS-PAGE方法(Laemmli，U.K.(1970)Nature，227681-685)，提取出的蛋白可分離成一系列的帶，用考馬斯亮藍R250染色。
Ouchterlony雙向瓊脂免疫擴散實驗用1.2％的瓊脂制備實驗用平板。兔抗-大豆蛋白血清用于檢測在經(jīng)mRNA-處理的谷粒和未經(jīng)處理的對照樣品中是否存在大豆蛋白。
利用蛋白印跡技術檢測大豆蛋白將在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)實驗中獲得的額外的帶轉移到硝酸纖維素膜上(Vaessen，R.T.M.J.，J.Kreke和G.S.P.Groot(1981)FEBSletter 124193-196)。用下述緩沖液洗膜(0.02M/L Tris緩沖鹽溶液(TBS)，pH 7.4，和0.05％ Tween 20(TTBS))，然后密封在含4％牛血清白蛋白(BSA)TTBS的避光小室中，在30NC下作用2小時。在用TTBS液體清洗后，利用ProtoBlot蛋白印跡AP系統(tǒng)依照Promega技術手冊檢測大豆蛋白。
DNA分子雜交檢測大豆DNA從經(jīng)大豆mRNA處理的和對照玉米樣品中抽提DNA。將DNA在凝膠上電泳后轉移到硝酸纖維素膜上。用可商購的反轉錄酶催化大豆mRNA轉錄成cDNA(Szkukalek，A.，和F.Solymosy(1994)Plant Science 99183-187)。該cDNA切口平移成32P-標記的cDNA。用與大豆mRNA互補的32P-標記的cDNA探針對經(jīng)處理的和對照玉米DNA進行DNA印跡分析。出現(xiàn)的雜交帶表明在經(jīng)處理的玉米中存在大豆球蛋白DNA序列。在對照樣品中沒有出現(xiàn)上述的雜交帶。典型的凝膠包括含下述樣品的泳道大豆DNA對照；從未經(jīng)注射的對照玉米樣品中分離的DNA；從生長在不同田地中經(jīng)大豆mRNA處理的玉米中提取的DNA。
結果抽提蛋白隨后進行生化實驗表明，這些玉米谷粒表達大豆球蛋白。此外，通過蛋白印跡實驗證明了在玉米的后續(xù)世代中存在mRNA-誘導的大豆球蛋白。
用與大豆球蛋白RNA特異的、32P-標記的cDNA探針對從經(jīng)大豆球蛋白mRNA處理的玉米中分離的DNA進行DNA雜交分析。表明在經(jīng)處理的玉米中存在大豆球蛋白核苷酸序列。
這些結果證明通過導入編碼農(nóng)業(yè)上重要蛋白的mRNA構建有價值的轉基因植物是可行的。
重要經(jīng)濟植物物種的遺傳轉化是非常需要的。至今，將基因轉移到植物中的策略通常包括將外源DNA導入原生質體或愈傷組織中，以使其導入核基因組。但是，難于使經(jīng)上述轉化的原生質體再生成特定的植物物種。這一實施例表明大豆球蛋白mRNA在玉米中的轉化能力。這一結果說明通過mRNA分子遞送遺傳信息可用于穩(wěn)定轉化單子葉植物。本發(fā)明的利用mRNA分子的方法代表了一種比利用外源DNA轉移遺傳信息更可靠的向植物中引入新基因的方式。并且，mRNA誘導的遺傳信息改變是穩(wěn)定的，而由DNA誘導的遺傳信息改變不穩(wěn)定。
將兩個高產(chǎn)玉米品系85089和27-1用于上述轉化實驗利用冷苯酚抽提法從粉末化的大豆(子葉或芽)中分離總RNA，再經(jīng)寡DT層析純化。將分離出的mRNA調節(jié)為1微克每微升；將1微升所得溶液分別注射到吸漲的玉米谷粒中。經(jīng)注射的兩個不同品系的谷粒在10×12米的菜園中分別成排播種，排間用通道間隔。品系85089在四月末播種，品系27-1在五月末播種。種植期不同是為了避免交叉雜交。在田地中數(shù)米以外的地方播種未經(jīng)注射的玉米谷粒(對照)。90％以上未經(jīng)注射和經(jīng)大豆mRNA-注射的種子均萌芽并長成植株。所有的植株均在10月份收獲。
本發(fā)明的方法利用玉米品系27-1和85089實施。用于微注射的mRNA要從大豆的至少兩個部位(如，子葉和芽)獲得。
播種經(jīng)微注射的玉米種子，并收獲第一代玉米谷粒。分離自第一代的玉米蛋白SDS-PAGE結果表明額外的帶約為67KD。利用兔抗-大豆蛋白血清進行的Ouchterlony雙向瓊脂免疫擴散實驗表明上述的額外帶來自大豆，并且是由于存在大豆球蛋白。接下來種植上述第一代的谷粒以觀察所述大豆蛋白是否可以傳遞到下一代。
按下述方法對玉米第一代谷粒的抽提物進行分析以檢測大豆球蛋白SDS-PAGE一穗玉米谷粒組成一個樣品?？偣卜治隽?34個mRNA-處理組的樣品和10個對照樣品。在mRNA-處理組的134個樣品中有29個表現(xiàn)出額外的帶，其他的沒有。在經(jīng)處理的玉米的抽提物中額外帶為67KD。來自未經(jīng)處理的玉米的對照抽提物中沒有發(fā)現(xiàn)新的帶。
134個經(jīng)mRNA-處理的玉米樣品的SDS-PAGE分析數(shù)據(jù)總結于表1。當大豆子葉mRNA微注射到玉米品系85089和27-1一次后，有18.75％的85089植株表現(xiàn)出額外的帶，而有23.68％的27-1玉米植株表現(xiàn)出額外的帶。因此，對品系27-1的轉化比對品系85089的轉化更為有效。用大豆子葉分離的mRNA對每一27-1和85089植株進行兩次微注射后所得的數(shù)據(jù)可進一步支持上述結果。在這些實驗中，有26.47％的27-1玉米植株表現(xiàn)出額外的帶，而只有20％的85089玉米植株表現(xiàn)出額外的帶，結果參見表1。
將大豆芽mRNA一次或兩次微注射到玉米品系85089中。由表1所示結果表明，第二次將大豆芽mRNA注射到玉米品系85089中并沒有增加含額外帶的植株的數(shù)量。
如下述表1所示，比較用來自大豆子葉或芽的mRNA微注射玉米品系85089后所得的結果表明，分離自大豆子葉的mRNA比分離自大豆芽的mRNA對產(chǎn)生轉基因玉米植株更為有效
Ouchterlony雙向瓊脂擴散實驗在SD S-PAGE實驗結果的基礎上，來自對照谷粒、帶有或不帶有額外帶的玉米蛋白抽提物與兔抗大豆蛋白血清一起進行雙向瓊脂免疫擴散實驗。所有帶有額外帶的玉米蛋白均與抗血清反應產(chǎn)生沉淀線，但強度有所不同。參見表2。
對照及由不表達額外帶的樣品獲得的玉米蛋白沒有出現(xiàn)沉淀帶。
對來自第二代玉米谷粒的抽提物進行如下分析蛋白印跡技術種植第一代谷粒收獲第二代谷粒。利用蛋白印跡技術對第二代谷粒抽提物進行分析。結果出現(xiàn)了兩條60-70KD間的帶。而對照未觀察到帶。大豆蛋白出現(xiàn)在第二代玉米谷粒中的現(xiàn)象說明大豆mRNA將遺傳信息轉移到了玉米基因組中，因此使大豆球蛋白在下一代得以表達。
DNA印跡在第二代及后續(xù)世代的玉米中發(fā)現(xiàn)大豆蛋白說明mRNA編碼的大豆遺傳信息已反轉錄并整合到玉米基因組中。這大概是由于在玉米種子中存在反轉錄酶。DNA印跡的結果表明在經(jīng)轉化的玉米中存在編碼大豆球蛋白的DNA。雜交帶的存在為經(jīng)注射的大豆mRNA的反轉錄提供了證據(jù)。在由未經(jīng)處理的玉米的DNA中未檢測出來自大豆的核酸序列。
總的說來，鑒定玉米中的大豆蛋白分三步進行。第一步利用SDS-PAGE。觀察到由經(jīng)mRNA-處理的玉米谷粒長成的玉米抽提物的額外帶。從未經(jīng)處理的玉米分離的抽提物沒有上述額外帶。第二步由Ouchterlony雙向瓊脂免疫擴散實驗，利用兔抗大豆蛋白血清對表現(xiàn)出額外帶的玉米谷粒抽提物進行分析?？寡搴驮赟DS-PAGE中表現(xiàn)出額外帶的谷粒抽提物之間出現(xiàn)了沉淀線(表2)。在抗血清和對照抽提物間沒有出現(xiàn)沉淀線。第三步，為驗證大豆球蛋白是否在玉米的下一代中表達，再次種植第一代的谷粒。收獲由這些谷粒長成的玉米通過蛋白印跡分析其蛋白抽提物。這一實驗的結果表明所出現(xiàn)的兩條帶應當代表兩種大豆球蛋白，7S和11S(1)。最后，利用32P-標記的大豆特異性探針通過DNA雜交實驗表明經(jīng)mRNA處理的玉米中存在編碼大豆球蛋白的核酸。
實施例2在轉基因玉米谷粒中鑒定人生長激素和人γ干擾素本實施例中所用的在轉基因玉米中鑒定外源蛋白的方法是Yu和Niu在“RNA在發(fā)育和繁殖中的作用”(The Role of RNA in Developmentand Reproduction)一書pp.893-903，1981(引入作為參考)(編者Niu和Chuang，China Press and distributed by Nostrand andReinhard Co.，New York，Cincinnati，Toronto，London andMelbourne)中發(fā)表的方法。
獲取編碼人生長激素(HGH)和γ干擾素蛋白的mRNA，依照如實施例1中所述的方法將其注射到玉米谷粒中。種植經(jīng)注射的玉米谷粒并使其生長(此處指“第一代”)。種植第一代的谷粒使其長成成熟的植株(“第二代”)。
對于第一代，以6顆谷粒為一組，依照實施例1中描述的與從經(jīng)大豆mRNA處理的玉米中抽提大豆球蛋白相同的方法進行抽提。對于第二世、代，以6顆谷粒為一組，每組的6顆谷粒分別來自6個穗軸(每一穗軸來自6株玉米植株的每一株)。離心抽提物。將水層用于SDS-PAGE分析。
SDS-PAGE表明與未經(jīng)處理的植株相比，來自經(jīng)HGH mRNA處理的玉米的谷粒表現(xiàn)出一條額外的帶，推測為HGH。
SDS-PAGE分析進一步表明，經(jīng)γ干擾素處理的植物植株的谷粒表現(xiàn)出一條與在上述經(jīng)HGH-處理的植株中觀察到的帶幾乎等分子量的額外的帶。據(jù)認為兩蛋白帶定位近似是由于HGH和γ干擾素分子量相近的原因。
將每一凝膠板上的額外的帶切除出來并從凝膠中洗脫。向分別來自γ干擾素凝膠平板和HGH凝膠平板的洗脫物中加入抗γ干擾素的兔血清或抗HGH的兔血清。得到兩種沉淀一種來自γ干擾素凝膠平板，另一種來自HGH凝膠平板。
作為對照，純化的γ干擾素和純化的HGH同樣分別與相同的相應兔抗血清進行免疫沉淀反應。各種免疫沉淀反應如下來自經(jīng)γ干擾素mRNA處理的谷粒的額外的帶 g-AB+g-蛋白與純化的γ干擾素的免疫沉淀 g-AB+g-AG來自經(jīng)HGH mRNA處理的谷粒的額外的帶 HGH-AB+HGH蛋白與純化的HGH的免疫沉淀HGH-AB+HGH-AG將g-AB+g-AG及g-AB+g-蛋白(其由額外的帶洗脫得來)形成的沉淀進行SDS-PAGE。可以看到兩種沉淀均分離成兩條帶。這些水平排列在接近17kDa分子量標記處的帶有著近似的分子量(約15-17kDa)。將這些帶洗脫出來。一個洗脫物是經(jīng)純化的蛋白，另一個是來自玉米谷粒的γ干擾素。
Yu和Niu在1981年利用離子交換層析分析了經(jīng)胰蛋白酶消化的蛋白組分。他們發(fā)現(xiàn)兩種蛋白(實驗蛋白和對照蛋白)的肽圖譜在化學組成上相似。但此處我分析了兩種蛋白的氨基酸組成(純化抗原和從谷粒中抽提的γ干擾素)，發(fā)現(xiàn)其各自的氨基酸組成幾乎是相同的。
HGH-AB+HGH-AG和HGH-AB+HGH蛋白所形成的沉淀接受與上述相同的處理。發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白(抗原和經(jīng)抽提的HGH)的氨基酸組成幾乎相同。
上述為本發(fā)明的優(yōu)選實施方案和示例性的說明，但本發(fā)明并非局限于上述的實施方案。在不脫離本發(fā)明的范圍、不違背本發(fā)明的精神的情況下可對本發(fā)明進行修飾，如下述權利要求以及等同內容所示。
權利要求
1.一種生產(chǎn)表達外源蛋白的轉基因植物的方法，該方法包括a)獲得編碼所述外源蛋白的mRNA樣品；b)在可使所述mRNA進入所述種子的條件下，將所述植物的種子和mRNA一起溫育；c)使所述的種子萌芽；和d)由所述種子長成所述轉基因植物。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述的外源蛋白是大豆球蛋白。
3.如權利要求1所述的方法，其中，所述的外源蛋白選自人生長激素，人γ干擾素，人白介素1，人白介素β和人白介素2。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述的種子是玉米種子。
5.如權利要求1所述的方法，其中，所述外源蛋白利用選自下組的方法檢測蛋白印跡，雙向瓊脂免疫擴散，和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。
6.如權利要求1所述的方法，其中，通過微注射將所述mRNA引入所述種子中。
7.如權利要求2所述的方法，其中，所述的mRNA是從大豆子葉或芽分離的。
8.如權利要求3所述的方法，其中，mRNA是由經(jīng)分離的DNA分子轉錄產(chǎn)生的。
9.一種由下述方法生產(chǎn)的表達外源蛋白的轉基因植物，該方法包括a)獲得編碼所述外源蛋白的mRNA樣品；b)在可使所述mRNA進入所述種子的條件下，將所述植物的種子和mRNA一起溫育；c)使所述的種子萌芽；和d)由所述種子長成所述轉基因植物。
10.如權利要求9所述的轉基因植物，其中，所述的外源蛋白是大豆球蛋白。
11.如權利要求9所述的轉基因植物，其中，所述的外源蛋白選自人生長激素，人γ干擾素，人白介素1，人白介素β和人白介素2。
12.如權利要求9所述的轉基因植物，其中所述的種子是玉米種子。
13.由權利要求9所述的轉基因植物獲得的種子。
14.如權利要求13所述的種子，其是玉米谷粒。
15.一種生產(chǎn)表達大豆球蛋白的轉基因玉米植株的方法，該方法包括a)獲得編碼大豆球蛋白的mRNA；b)在可使所述mRNA進入所述玉米種子的條件下，將玉米種子和所述mRNA一起溫育；c)使經(jīng)步驟b)處理的玉米種子萌芽；d)由所述萌芽的種子長成植株；和e)在所得的轉基因玉米植株中檢測所述大豆球蛋白。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述的玉米是品種27-1或品種85089.
17.由權利要求14所述方法產(chǎn)生的轉基因玉米。
18.表達大豆球蛋白的轉基因玉米植物。
19.如權利要求18所述的植物，其中，所述的植物是玉米品種27-1或85089。
20.表達大豆球蛋白的轉基因玉米谷粒。
全文摘要
本發(fā)明所公開的是用于有益的植物遺傳轉化的方法，該方法通過mRNA而非DNA介導遺傳信息轉移。此外還公開了表達由上述mRNA編碼的蛋白的植物。
文檔編號C12N15/82GK1555218SQ01823177
公開日2004年12月15日 申請日期2001年2月27日 優(yōu)先權日2001年2月27日
發(fā)明者牛滿江 申請人:多種基因工程公司