本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
：甲狀腺結(jié)節(jié)在臨床上很常見(jiàn)，其中多數(shù)為良性結(jié)節(jié)，少數(shù)為惡性結(jié)節(jié)，二者早期臨床表現(xiàn)相似，但治療方法及預(yù)后并不相同，因此鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性質(zhì)至關(guān)重要。盡管臨床上可采用高分辨率超聲、掃描、CT、MRI、甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(FNAC)等來(lái)評(píng)估結(jié)節(jié)的良惡性質(zhì)，但依然存在一定的局限性，造成了一些患者進(jìn)行不必要的手術(shù)治療。由于甲狀腺癌細(xì)胞可以分泌、表達(dá)一些甲狀腺特異性抗原，因此，近年國(guó)外一些學(xué)者致力于在組織或外周血中尋找甲狀腺癌的分子標(biāo)志物，關(guān)注熱點(diǎn)包括DNA甲基化物、BRAF基因、甲狀腺球蛋白(Tg)mRNA、促甲狀腺素激素受體(TSHR)mRNA和甲狀腺過(guò)氧化物酶(TPO)mRNA等，國(guó)內(nèi)近年也有外周血TgmRNA表達(dá)的報(bào)道，但離臨床實(shí)際應(yīng)用尚有距離。甲狀腺癌是最常見(jiàn)的頭頸部?jī)?nèi)分泌腫瘤，分為分化型甲狀腺癌(DTC)和未分化甲狀腺癌(ATC)。分化型甲狀腺癌(DTC)是其主要病理學(xué)類(lèi)型，占甲狀腺癌的絕大多數(shù)，主要包括甲狀腺乳頭狀癌(PTC)和甲狀腺濾泡癌(FTC)。其中，PTC占85％，F(xiàn)TC占10％。DTC屬低度惡性腫瘤，侵襲性弱，進(jìn)展較緩慢，預(yù)后良好，10年生存率達(dá)80-95％，但存在一定的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，有報(bào)道稱(chēng)，約20％-40％的DTC患者術(shù)后會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，需要長(zhǎng)期隨訪以監(jiān)測(cè)病情變化。目前，隨訪的手段包括血清甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)檢測(cè)、1311全身顯像(wholebodyscan,WBS)、18F-FDGPET顯像。Tg檢測(cè)法，經(jīng)過(guò)甲狀腺全切及放射性531I治療后，甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulinantibodies,TgAb)為陰性的情況下，血清Tg對(duì)檢測(cè)甲狀腺癌是否復(fù)發(fā)具有較高的敏感性和特異性。然而10％正常人存在TgAb，同時(shí)20％40％的甲狀腺癌患者存在TgAb抗體，TgAb抗體的存在干擾了Tg的測(cè)量，導(dǎo)致Tg檢測(cè)的敏感性及特異性下降。且在抑制性促甲狀腺激素(TSH)的條件下，Tg的敏感性下降到40％左右，存在假陰性。WBS方法也因?yàn)楦鞣N因素常常會(huì)出現(xiàn)假陰性。停用甲狀腺激素，在TSH刺激條件下，可以提髙血清Tg和WBS診斷的敏感性，但是這樣可能會(huì)刺激DTC病灶的生長(zhǎng)。18F-FDGPET顯像在診斷DTC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移灶方面的診斷率由于感染、炎性病變及其他部位的非特異性攝取等因素的影響存在一定的假陽(yáng)性率，且PET/CT檢查費(fèi)用較高，不能作為常規(guī)隨訪手段。鑒于以上鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性質(zhì)的方法以及患者術(shù)后隨訪手段均存在一定的局限性，甲狀腺癌分子標(biāo)志物的探查及研究越來(lái)越廣泛。目前，己檢測(cè)到34種甲狀腺癌分子標(biāo)志物，絕大多數(shù)的分子標(biāo)志物檢測(cè)是基于外科病理組織標(biāo)本，還有一部分是基于細(xì)針穿刺組織學(xué)檢查(FNAB)，材料不易得到且有創(chuàng)。甲狀腺球蛋白(Tg)和促甲狀腺激素受體(TSHR)均與甲狀腺細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰老、變異及功能有密切關(guān)系。雖然，血清Tg測(cè)定是公認(rèn)的監(jiān)測(cè)DTC復(fù)發(fā)的敏感手段之一，但由于TgAb的存在，干擾了對(duì)Tg的測(cè)定結(jié)果，從而影響了對(duì)結(jié)果的正確判斷。人TSHR由于獲取困難和技術(shù)原因目前尚沒(méi)有建立真正的測(cè)定方法。生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和病變通常是由基因在不同階段和部位的差異表達(dá)決定的?；虮磉_(dá)差異最終表現(xiàn)為蛋白質(zhì)合成的差異，并在一定程度上決定了細(xì)胞的激活、增殖、分化、病變和凋亡。定量分析mRNA，是了解機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和病變機(jī)理的—個(gè)重要方面。TgmRNA及TSHRmRNA是基于基因水平的檢測(cè)，只需少量外周血即可，取材方便，其檢測(cè)既可消除TgAb的不利干擾，又可繞開(kāi)TSHR的技術(shù)難點(diǎn)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)測(cè)量外周血TgmRNA及TSHRmRNA相對(duì)表達(dá)量的技術(shù)對(duì)模板要求較高，對(duì)引物設(shè)計(jì)要求較高，且TSHRmRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)特異度不高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明旨在提供一種熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒及其使用方法，該試劑盒利用Taqman-qPCR法，對(duì)外周血及腫瘤組織等樣品中是否存在TSHR-mRNA的表達(dá)及表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明提供了一種熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒，包括用于擴(kuò)增促甲狀腺激素受體mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA的引物、用于促甲狀腺激素受體mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA檢測(cè)的探針：1)所述的用于擴(kuò)增促甲狀腺激素受體mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA的引物為下列組合中的一種：組合a)上游引物為T(mén)SHR_F1、下游引物為T(mén)SHR_R1；組合b)上游引物為T(mén)SHR_F2、下游引物為T(mén)SHR_R2；組合c)上游引物為T(mén)SHR_F3、下游引物為T(mén)SHR_R3；組合d)上游引物為T(mén)SHR_F4、下游引物為T(mén)SHR_R4；2)所述的用于促甲狀腺激素受體mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA檢測(cè)的探針序列為T(mén)SHR_P1、TSHR_P2中的一種。進(jìn)一步的，熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒，還包括內(nèi)標(biāo)、內(nèi)標(biāo)引物、檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針。進(jìn)一步的，熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒中的內(nèi)標(biāo)序列為SEQIDNO:1所示的序列。進(jìn)一步的，熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒中的內(nèi)標(biāo)引物，上游引物為GAPDH_F1、GAPDH_F2和GAPDH_F3中的一種，下游引物為GAPDH_R1、GAPDH_R2和GAPDH_R3中的一種；所述的檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針為GAPDH_P1、GAPDH_P2中的一種。進(jìn)一步的，熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒中的內(nèi)標(biāo)引物，上游引物為GAPDH_F4，下游引物為GAPDH_R4；所述的檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針為GAPDH_P3。進(jìn)一步的，熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照品，所述的陽(yáng)性對(duì)照品的序列為SEQIDNO:2。進(jìn)一步的，熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒還包括特異性反轉(zhuǎn)錄引物，所述特異性反轉(zhuǎn)錄引物序列為RT1-RT8。進(jìn)一步的，熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒中所述的用于促甲狀腺激素受體mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA檢測(cè)的探針具有熒光標(biāo)記，其熒光標(biāo)記5’端為FAM、HEX、ROX和JOE中的一種，3’端為T(mén)AMRA、BHQ和Elipse中的一種。本發(fā)明的另一目的在于提出一種熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒的使用方法：為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒的使用方法：1)提取腫瘤組織或者血液RNA后，對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中加入特異性反轉(zhuǎn)錄引物RT1-RT8；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42℃孵育30-50分鐘，85℃孵育5分鐘；熒光定量檢測(cè)反應(yīng)條件為：95℃5分鐘、95℃20秒、60℃40秒，40循環(huán)收集熒光信號(hào)；2)逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，以獲得的cDNA為模板進(jìn)行促甲狀腺激素受體基因mRNA的表達(dá)：a)利用擴(kuò)增促甲狀腺激素受體mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA的引物和促甲狀腺激素受體mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA檢測(cè)的探針檢測(cè)受檢樣本中促甲狀腺激素受體基因mRNA的表達(dá)，利用陽(yáng)性對(duì)照品作為對(duì)照以排除假陰性結(jié)果；b)以內(nèi)標(biāo)GAPDH引物和內(nèi)標(biāo)探針檢測(cè)相同受檢樣品中GAPDH的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)為對(duì)照以排除假陰性結(jié)果。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)：本發(fā)明所述的試劑盒利用Taqman-qPCR法，對(duì)外周血、腫瘤組織等樣品中是否存在TSHR-mRNA的表達(dá)及表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性高、檢出率高和特異性的優(yōu)點(diǎn)，還配有內(nèi)標(biāo)和陽(yáng)性對(duì)照品，可以有效消除假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，抗干擾能力強(qiáng)，檢測(cè)快速經(jīng)濟(jì)，對(duì)患者創(chuàng)傷小，產(chǎn)品穩(wěn)定性高的特點(diǎn)。附圖說(shuō)明構(gòu)成本發(fā)明的一部分的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：圖1為引物特異性分析；圖2為探針篩選TSHR表達(dá)檢測(cè)結(jié)果；圖3為引物及探針特異性TSHR表達(dá)檢測(cè)結(jié)果；圖4為內(nèi)標(biāo)、內(nèi)標(biāo)引物、檢測(cè)內(nèi)標(biāo)探針TSHR樣本檢測(cè)結(jié)果；圖5為陽(yáng)性對(duì)照品TSHR檢測(cè)結(jié)果；圖6為特異性反轉(zhuǎn)錄引物TSHR檢測(cè)結(jié)果；圖7為樣本檢測(cè)結(jié)果；具體實(shí)施方式需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本發(fā)明中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1本實(shí)施例為擴(kuò)增促甲狀腺激素受體mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA的引物及探針的設(shè)計(jì)篩選。根據(jù)TSHR基因mRNA的表達(dá)、剪切以及轉(zhuǎn)錄組水平其他相似序列，控制引物長(zhǎng)度和序列，以增加引物特異性，據(jù)此以TSHR基因CCDS(GenBank序列號(hào)CCDS9872.1)全長(zhǎng)序列為模板，設(shè)計(jì)六對(duì)引物。六對(duì)引物分別與總mRNA序列進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證了六對(duì)引物的擴(kuò)增特異性。然后通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證引物的擴(kuò)增效率以及特異性：以甲狀腺癌組織提取的總mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得的DNA樣本為模板，分別利用六對(duì)引物進(jìn)行SYBRGreen-qPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃10分鐘；(95℃15秒，60℃1分鐘)50循環(huán)；通過(guò)擴(kuò)增曲線驗(yàn)證各對(duì)引物擴(kuò)增效率，通過(guò)熔解曲線驗(yàn)證各對(duì)引物的擴(kuò)增特異性。最終篩選出具有良好擴(kuò)增特異性的引物對(duì)組合，結(jié)果如附圖1引物特異性分析圖所示：分別為a)上游引物為T(mén)SHR_F1、下游引物為T(mén)SHR_R1；組合b)上游引物為T(mén)SHR_F2、下游引物為T(mén)SHR_R2；組合c)上游引物為T(mén)SHR_F3、下游引物為T(mén)SHR_R3；組合d)上游引物為T(mén)SHR_F4、下游引物為T(mén)SHR_R4。以篩選出的四對(duì)擴(kuò)增引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)三條TaqMan探針。以不同濃度的陽(yáng)性對(duì)照品為模板，用引物組合a)-d)進(jìn)行qPCR擴(kuò)增驗(yàn)證三條探針檢測(cè)效率，擴(kuò)增條件為：95℃5分鐘(95℃20秒，60℃40秒)，50循環(huán)檢測(cè)信號(hào)。通過(guò)擴(kuò)增曲線最終篩選出探針TSHR_P1、TSHR_P2具有較好的檢測(cè)效率。結(jié)果如附圖2引物及探針篩選TSHR表達(dá)檢測(cè)結(jié)果所示：本發(fā)明探針序列的設(shè)計(jì)考慮到探針與轉(zhuǎn)錄組其他序列可能產(chǎn)生的錯(cuò)配以及和現(xiàn)有TSHR檢測(cè)引物、內(nèi)標(biāo)引物可能產(chǎn)生的錯(cuò)配等因素，通過(guò)設(shè)計(jì)以增加其有效性和特異性。實(shí)施例2本實(shí)施例為用于擴(kuò)增促甲狀腺激素受體mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA的引物及探針的特異性測(cè)試，在本實(shí)施例中的試劑盒僅包括用于擴(kuò)增促甲狀腺激素受體mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA的引物及探針，以必要的試劑。1、操作過(guò)程1)樣本制備將抽取的5毫升EDTA抗凝的新鮮外周血經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理去除紅細(xì)胞后，進(jìn)行總RNA提取。2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取一定量的總RNA于等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得DNA樣本。3)TSHR基因表達(dá)量的檢測(cè)以逆轉(zhuǎn)錄獲得的DNA樣本為模板，利用TSHR檢測(cè)的引物和探針，通過(guò)qPCR法檢測(cè)TSHR的表達(dá)量。2、檢測(cè)結(jié)果以qPCR檢測(cè)的TSHR的擴(kuò)增曲線為最終的檢測(cè)結(jié)果。不同檢測(cè)樣本濃度(檢測(cè)樣本)，PBMC和NTC。共檢測(cè)不同濃度樣本4例，PBMC和陰性對(duì)照NTC。PBMC信號(hào)較弱，Ct值為36.9，而陰性對(duì)照NTC未檢出信號(hào)。如表1引物及探針特異性TSHR樣本檢測(cè)，附圖3引物及探針特異性TSHR表達(dá)檢測(cè)結(jié)果所示，檢測(cè)樣本1-4的Ct值從23.4-29.2。表1引物及探針特異性TSHR樣本檢測(cè)3、結(jié)果分析1)TSHR檢測(cè)引物和探針能夠有效檢測(cè)不同濃度TSHR的樣本。2)以正常人血液提取的PBMC為模板以及未加擴(kuò)增模板時(shí)，未檢測(cè)到明顯熒光信號(hào)，說(shuō)明檢測(cè)引物和探針具有較好的特異性。實(shí)施例3本實(shí)施例為內(nèi)標(biāo)、內(nèi)標(biāo)引物、檢測(cè)內(nèi)標(biāo)探針的設(shè)計(jì)篩選。檢測(cè)試劑盒最終判定TSHR表達(dá)量相對(duì)高低，通過(guò)與內(nèi)標(biāo)(GAPDH)擴(kuò)增為參比，并以Ct來(lái)判定，Ct＝Ct(GAPDH)—Ct(TSHR)。GAPDH為反應(yīng)模板起始量的常用內(nèi)參，及時(shí)檢測(cè)樣本含有相近含量的TSHR，但經(jīng)過(guò)GAPDH換算后，單位樣本量中TSHR表達(dá)是不同的，如表2內(nèi)標(biāo)、內(nèi)標(biāo)引物、檢測(cè)內(nèi)標(biāo)探針TSHR樣本檢測(cè)及附圖4內(nèi)標(biāo)、內(nèi)標(biāo)引物、檢測(cè)內(nèi)標(biāo)探針TSHR樣本檢測(cè)結(jié)果所示。因此，內(nèi)標(biāo)可以有效量化兩份來(lái)源不同的檢測(cè)樣本，使的不同來(lái)源的受檢樣本中TSHR表達(dá)量具有可比性。以內(nèi)標(biāo)GAPDH引物和探針檢測(cè)相同受檢樣品中GAPDH的表達(dá)，對(duì)受檢樣本起到量化的作用；與此同時(shí)檢測(cè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品，作為對(duì)照以排除操作失誤和儀器故障，排除假陰性結(jié)果。表2內(nèi)標(biāo)、內(nèi)標(biāo)引物、檢測(cè)內(nèi)標(biāo)探針TSHR樣本檢測(cè)實(shí)施例4本實(shí)施為陽(yáng)性對(duì)照品技術(shù)效果描述。當(dāng)檢測(cè)試劑盒中某一成分失效，或操作失誤忘記加入某一檢測(cè)成分(如反轉(zhuǎn)錄引物、檢測(cè)引物、反應(yīng)液等)，或檢測(cè)條件設(shè)定錯(cuò)誤，或檢測(cè)儀器溫控故障等。若無(wú)陽(yáng)性對(duì)照品，則樣本的樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性；而在對(duì)檢測(cè)樣本以及陽(yáng)性對(duì)照品的平行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照品的陰性檢測(cè)結(jié)果可以說(shuō)明樣本的假陰性檢測(cè)結(jié)果。如表3不同樣本中TSHR基因表達(dá)檢測(cè)、附圖5陽(yáng)性對(duì)照品TSHR檢測(cè)結(jié)果所示，樣品9-16均未檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)，因此僅以熒光信號(hào)無(wú)法判定可能原因，但加入陽(yáng)性對(duì)照品后則能夠排除配樣或者儀器故障等原因引起的陰性結(jié)果。表3不同樣本中TSHR基因表達(dá)檢測(cè)實(shí)施例5本實(shí)施例為特異性反轉(zhuǎn)錄引物技術(shù)效果描述。特異性反轉(zhuǎn)錄引物RT1-RT8能夠更加有針對(duì)的反轉(zhuǎn)錄TSHR的mRNA，因此能夠提高本試劑盒的檢測(cè)靈敏度。對(duì)七份1×106個(gè)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中混入10個(gè)甲狀腺腫瘤細(xì)胞的樣本進(jìn)行mRNA的提取，命名為模板1-7。其中，模板1-6除了正常進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄體系外，加入特異性反轉(zhuǎn)錄引物RT1-RT8；模板7進(jìn)行常規(guī)總mRNA的反轉(zhuǎn)錄獲取DNA樣本，未加入特異性反轉(zhuǎn)錄引物；模板8為正常人血液PBMC樣本，作為陰性對(duì)照，反轉(zhuǎn)錄是同時(shí)加入特異性逆轉(zhuǎn)錄引物；NTC為滅菌超純水。通過(guò)TSHR檢測(cè)擴(kuò)增引物對(duì)TSHR_F1/TSHR_R1、檢測(cè)探針TSHR_P1，分別對(duì)兩份DNA樣本進(jìn)行qPCR擴(kuò)增檢測(cè)。表4反轉(zhuǎn)錄cDNA如表4反轉(zhuǎn)錄cDNA、附圖6特異性反轉(zhuǎn)錄引物TSHR檢測(cè)結(jié)果所示，qPCR擴(kuò)增曲線顯示，加入特異性反轉(zhuǎn)錄引物RT1-RT8的樣本能夠檢測(cè)出TSHR基因產(chǎn)物(模板1-6)，未加入特異性反轉(zhuǎn)錄引物RT1-RT8的樣本檢測(cè)TSHR信號(hào)較弱(模板7)。而PBMC(模板8)即使加入特異性引物也未能檢測(cè)出有效Ct信號(hào)。由此可見(jiàn)，特異性反轉(zhuǎn)錄引物RT1-RT8能夠增加TSHR基因的檢測(cè)靈敏度。實(shí)施例6本實(shí)施例為試劑盒的使用方法。1、標(biāo)本的制備50毫升離心管中加入30毫升紅細(xì)胞裂解液，將EDTA抗凝的5毫升新鮮外周血倒入紅細(xì)胞裂解液中，室溫放置5至10分鐘，待液體變?yōu)榧t色透明狀態(tài)后于400G轉(zhuǎn)速下離心10分鐘。棄去上清液，留下白細(xì)胞沉淀物，向離心管中加入5毫升PBS重懸沉淀，400G轉(zhuǎn)速離心5分鐘。棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入1毫升BufferRLT(康為世紀(jì)，目錄號(hào)CW0538S)重懸細(xì)胞沉淀。2、總RNA提取血液RNA提取選用康為世紀(jì)血液RNA提取試劑盒(目錄號(hào)CW0538S)。1)將上述BufferRLT重懸的液體轉(zhuǎn)移至已裝入收集管的過(guò)濾柱(SpinColumnsFL)中，12000rpm(～13400g)離心2分鐘，收集濾液，棄掉過(guò)濾柱。若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入，多次收集濾液；2)向?yàn)V液中加入1倍體積的70％乙醇(無(wú)RNase水配制)，混勻；3)將上述溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱(SpinColumnsRM)中，12000rpm離心15秒，倒掉收集管中廢液，將吸附柱重新放回收集管中；若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入；4)向吸附柱中加入350μlBufferRW1，12000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中；5)配制DNaseI混合液：取52μlRNase-FreeWater，向其中加入8μl10×ReactionBuffer和20μlDNaseI(1U/μl)，混勻，配制成終體積為80μl的反應(yīng)液；6)向吸附柱中直接加入80μlDNaseI混合液，20-30℃孵育15分鐘；7)向吸附柱中加入350μlBufferRW1，12,000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中；8)向吸附柱中加入500μlBufferRW2(使用前檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12,000rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；9)重復(fù)步驟8；10)12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液；將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干；11)將吸附柱置于一個(gè)新的RNase-Free的1.5ml離心管(自備)中，向吸附柱的中間部位加入30-50μlRNase-FreeWater，室溫放置1分鐘，12,000rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。3、RT-PCR1)取1μl上述步驟獲取的RNA為模板，冰上配制以下反應(yīng)體系，總體積為20μl。(等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液：康為世紀(jì)目錄號(hào)：uperRTcDNASynthesisKit貨號(hào)CW0741M)反應(yīng)體系：試劑加入體積RNA模板1ng-5μg等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液10μlTSHR特異反轉(zhuǎn)錄引物RT1-RT80.5μlOligod(T)1μl無(wú)RNase超純水補(bǔ)齊至20μl2)渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液手機(jī)到管底。3)42℃孵育30-50分鐘，85℃孵育5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。4)上述獲取的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qPCR檢測(cè)TSHR表達(dá)，冰上配制以下反應(yīng)體系，總體積為20μl。檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液康為試劑UltraSYBRMixture(LowROX)CW2601MTSHR檢測(cè)反應(yīng)體系：試劑加入體積反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物模板10ngTSHR檢測(cè)上游引物1μlTSHR檢測(cè)下游引物1μlTSHR檢測(cè)探針0.5μl檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液10μl超純水補(bǔ)齊至20μlGAPDH檢測(cè)反應(yīng)體系：TSHR檢測(cè)探針：5’-FAM-TCTGCTGGCTCTCCTGGGCA-TAMRA-3’GAPDH檢測(cè)探針：5’-FAM-ACCTTGCCCACAGCCTTGGC-TAMRA-3’反應(yīng)條件：955分鐘；(9520秒，6040秒)40循環(huán)檢測(cè)信號(hào)5)內(nèi)標(biāo)檢測(cè)試劑加入體積內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品5ngGAPDH檢測(cè)上游引物1μlGAPDH檢測(cè)下游引物1μlGAPDH檢測(cè)探針0.5μl檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液10μl超純水補(bǔ)齊至20μlGAPDH檢測(cè)探針：5’-FAM-ACCTTGCCCACAGCCTTGGC-TAMRA-3’反應(yīng)條件：955分鐘；(9520秒，6040秒)40循環(huán)檢測(cè)信號(hào)6)陽(yáng)性對(duì)照品檢測(cè)試劑加入體積陽(yáng)性質(zhì)控品5ngTSHR或GAPDH檢測(cè)上游引物1μlTSHR或GAPDH檢測(cè)下游引物1μlTSHR或GAPDH檢測(cè)探針0.5μl檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液10μl超純水補(bǔ)齊至20μlTSHR檢測(cè)探針：5’-FAM-TCTGCTGGCTCTCCTGGGCA-TAMRA-3’反應(yīng)條件：955分鐘；(9520秒，6040秒)40循環(huán)檢測(cè)信號(hào)4、結(jié)果分析1)RNA提取、質(zhì)檢與獲得cDNA表5RNA和cDNA濃度測(cè)定經(jīng)過(guò)Nanodrop2000測(cè)定不同腫瘤樣本中提取的RNA以及反轉(zhuǎn)錄濃度如表5所示，濃度和OD260/280比值符合條件能夠進(jìn)行下游檢測(cè)。2)臨床樣本檢測(cè)表6不同樣本檢測(cè)TSHR表達(dá)TSHR表達(dá)以Ct來(lái)判定，Ct＝Ct(GAPDH)—Ct(TSHR)。如表6、附圖7樣本檢測(cè)結(jié)果所示對(duì)于TSHR陽(yáng)性質(zhì)控品檢測(cè)，THSR引物和探針能夠檢測(cè)Ct值約為15；對(duì)于GAPDH陽(yáng)性質(zhì)控品的檢測(cè)，GAPDH引物和探針能夠檢測(cè)，Ct值約為15。通過(guò)甲狀腺癌患者腫瘤組織和血液樣本(腫瘤組織1，腫瘤組織2，血液樣本1和血液樣本2)的檢測(cè)，待檢樣本Ct均顯著高于陰性對(duì)照PBMC1和PBMC2。實(shí)施例7本實(shí)施例為一系列試劑盒產(chǎn)品對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)的效果數(shù)據(jù)。其中內(nèi)標(biāo)均為SEQIDNO:2所示序列，陽(yáng)性對(duì)照均為SEQIDNO:1所示序列，特異性反轉(zhuǎn)錄引物為RT1-RT8。制備腫瘤組織、血液樣本以及陰性對(duì)照品(PBMC)各20份標(biāo)準(zhǔn)品，利用不同組合構(gòu)成的試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，從檢測(cè)準(zhǔn)確率，特異性和穩(wěn)定性方面進(jìn)行驗(yàn)證，如表7所示。表7系列試劑盒檢測(cè)效果以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>河北德路通生物科技有限公司<120>熒光定量RT-PCR檢測(cè)促甲狀腺激素受體基因mRNA表達(dá)的試劑盒及其使用方法<160>31<170>PatentInversion3.3<210>1<211>203<212>DNA<213>內(nèi)標(biāo)序列<400>1actgtggatggcccctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatc60atccctgcctctactggcgctgccaaggctgtgggcaaggtcatccctgagctgaacggg120aagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacgtgtcagtggtggacctgacc180tgccgtctagaaaaacctgccaa203<210>2<211>240<212>DNA<213>陽(yáng)性對(duì)照品<400>2gttcctgagaattgtggtgtggttcgttagtctgctggctctcctgggcaatgtctttgt60cctgcttattctcctcaccagccactacagcatggggatgtacctgctcctcatcgcctc120tgtagacctctacactcactctgagtactacaaccatgccatcgactggcagacaggccc180tgggtgcaacacggctggtttcttcactgtctttgcaagcgagttatcggtgtatacgct240<210>3<211>20<212>DNA<213>TSHR_F1<400>3gctcctcatcgcctctgtag20<210>4<211>21<212>DNA<213>TSHR_F2<400>4tcctcatcgcctctgtagacc21<210>5<211>20<212>DNA<213>TSHR_F3<400>5gggatgtacctgctcctcat20<210>6<211>20<212>DNA<213>TSHR_F4<400>6gagaattgtggtgtggttcg20<210>7<211>20<212>DNA<213>TSHR_R1<400>7tacaccgataactcgcttgc20<210>8<211>20<212>DNA<213>TSHR_R2<400>8ggctggtgaggagaataagc20<210>9<211>21<212>DNA<213>TSHR_R3<400>9cagtgaagaaaccagccgtgt21<210>10<211>20<212>DNA<213>TSHR_R4<400>10agtgaagaaaccagccgtgt20<210>11<211>20<212>DNA<213>TSHR_P1<400>11tctgctggctctcctgggca20<210>12<211>20<212>DNA<213>TSHR_P2<400>12tgttgcacccagggcctgtc20<210>13<211>20<212>DNA<213>GAPDH_F1<400>13atcatccctgcctctactgg20<210>14<211>18<212>DNA<213>GAPDH_F2<400>14tccctgcctctactggcg18<210>15<211>20<212>DNA<213>GAPDH_F3<400>15tggtatcgtggaaggactca20<210>16<211>20<212>DNA<213>GAPDH_F4<400>16tcaagaaggtggtgaagcag20<210>17<211>20<212>DNA<213>GAPDH_R1<400>17gtcaggtccaccactgacac20<210>18<211>18<212>DNA<213>GAPDH_R2<400>18gcagtggggacacggaag18<210>19<211>20<212>DNA<213>GAPDH_R3<400>19ccagtagaggcagggatgat20<210>20<211>20<212>DNA<213>GAPDH_R4<400>20cgctgttgaagtcagaggag20<210>21<211>20<212>DNA<213>GAPDH_P1<400>21accttgcccacagccttggc20<210>22<211>20<212>DNA<213>GAPDH_P2<400>22acgccacagtttcccggagg20<210>23<211>20<212>DNA<213>GAPDH_P3<400>23cctcaagggcatcctgggct20<210>24<211>18<212>DNA<213>RT1<400>24ccaggcgcatggcgaagg18<210>25<211>19<212>DNA<213>RT2<400>25gctacttattcccaccaaa19<210>26<211>15<212>DNA<213>RT3<400>26gaagcagggcgagaa15<210>27<211>25<212>DNA<213>RT4<400>27gctcctcatcgcctctgtagacctc25<210>28<211>18<212>DNA<213>RT5<400>28cgatgacgaaggcaacta18<210>29<211>21<212>DNA<213>RT6<400>29cagcagcagacgatgacgaag21<210>30<211>16<212>DNA<213>RT7<400>30accctgcctcatctcg16<210>31<211>16<212>DNA<213>RT8<400>31tggattggcacaggag16當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3