專(zhuān)利名稱(chēng)：TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及TOP2A mRNA表達(dá)檢測(cè)液相芯片及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
DNA拓?fù)涿窱I(Topo II)抑制劑藥物是一類(lèi)重要的化療藥物，主要有依托泊苷(etoposide)、開(kāi)普拓、鬼臼噻吩苷、拓?fù)涮乜系龋渲?，依托泊苷作為?xì)胞周期特異性抗腫瘤Topo II抑制劑藥物，主要用于治療小細(xì)胞肺癌、惡性淋巴瘤、惡性生殖細(xì)胞瘤、白血病，對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、卵巢癌、非小細(xì)胞及小細(xì)胞肺癌、胃癌和食管癌等有一定療效。其抗癌機(jī)制是作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，形成藥物-酶-DNA穩(wěn)定的可逆性復(fù)合物，阻礙DNA修復(fù)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II是一種真核生物生存所必需的泛酶，在幾乎所有DNA代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Topo II有IIα型和IIβ型兩種，其中Topo IIα(又稱(chēng)TOP2A)在細(xì)胞快速增殖期含量最高，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系Topo IIαmRNA檢測(cè)表明，Topo IIα在各種腫瘤組織廣泛表達(dá)，無(wú)明顯組織特異性。Topo II介導(dǎo)DNA解結(jié)或解旋，在DNA代謝的細(xì)胞生命過(guò)程中起重要作用。因?yàn)槠渲匾砉δ?，Topo II已成為抗癌藥物的重要作用靶點(diǎn)。Topo II抑制劑通過(guò)直接作用Topo II或僅與雙鏈DNA中的一條鏈結(jié)合以影響Topo II功能。研究表明Topo IIα酶活性的降低或表達(dá)水平降低都會(huì)造成Topo II抑制劑藥物耐藥。研究報(bào)道高表達(dá)的Topo IIα使用依托泊苷效果較好，低表達(dá)的Topo IIα對(duì)依托泊苷藥物耐藥。檢測(cè)TOP2AmRNA表達(dá)水平可以有效預(yù)測(cè)化療藥物依托泊苷的療效。
作為T(mén)OP2A表達(dá)水平的參照物，持家基因一般在體內(nèi)可穩(wěn)定表達(dá)，但由于這種穩(wěn)定表達(dá)是相對(duì)的，在一定的病理狀態(tài)或用藥情況下，某些常用的持家基因的表達(dá)也會(huì)發(fā)生變化。選擇在我們所研究對(duì)象中穩(wěn)定表達(dá)的基因作持家基因，對(duì)保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。因此，本發(fā)明從一定數(shù)量的常用持家基因中進(jìn)行篩選，確定3個(gè)合適的持家基因，分別是β2-微球蛋白(B2M)、鐵傳遞蛋白受體(TFRC)、TATA框結(jié)合蛋白(TBP)。
基于以上基因的表達(dá)水平與化療藥物療效的相關(guān)性，專(zhuān)家推薦患者在接受化療藥物之前，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行相關(guān)的基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)，幫助臨床醫(yī)生根據(jù)患者的個(gè)體差異制定個(gè)體化用藥方案，以提高藥物療效，減少藥物毒副作用的發(fā)生。
目前，對(duì)基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)主要有逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、RNA原位核酸雜交(RISH)等。其中，RISH主要用于分析組織或細(xì)胞內(nèi)RNA分布以了解特定基因的表達(dá)情況，且其過(guò)程較長(zhǎng)、操作繁瑣，不適合用于臨床應(yīng)用；而逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，首先，這兩種方法均需要進(jìn)行RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄，檢測(cè)的結(jié)果受RNA降解影響大；其次，這兩種方法只通過(guò)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，容易產(chǎn)生非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性高；再次，這兩種方法一般只有一個(gè)持家基因作對(duì)照，其準(zhǔn)確性容易受到病理狀態(tài)的影響；因此，逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法作為臨床應(yīng)用均存在著難以克服的技術(shù)缺陷。
液相芯片技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，在微球的制造過(guò)程中，摻入不同比例的染色劑，從而形成100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價(jià)結(jié)合了針對(duì)不同待檢測(cè)物的探針?lè)肿訌亩鴮?shí)現(xiàn)對(duì)多達(dá)100中待檢物質(zhì)的同步并行檢測(cè)。因此，我們采用液相芯片技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的高通量，大大提高了檢測(cè)效率。
技術(shù)方案 本發(fā)明的目的之一是提供檢測(cè)TOP2A mRNA表達(dá)水平的液相檢測(cè)芯片。
實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下 一種TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，主要包括有 (1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5’端的間隔臂序列和3’端的與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼； (2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3’端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對(duì)TOP2A基因的選自SEQ.NO.5-SEQ.NO.10中的2條或2條以上；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2條或2條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2條或2條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2條或2條以上；所述支持延伸探針的P3序列選自SEQ.NO.26-SEQ.NO.29； (3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3’端序列P5，3’端還修飾有生物素；所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有針對(duì)TOP2A基因的選自SEQ.NO.30-SEQ.NO.39中的5條或5條以上；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.40-SEQ.NO.49中的5條或5條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.50-SEQ.NO.59中的5條或5條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.60-SEQ.NO.69中的5條或5條以上；所述P5為不存在內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列。
或一種TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，主要包括有 (1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5’端的間隔臂序列和3’端的與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼； (2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3’端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對(duì)TOP2A基因的選自SEQ.NO.5-SEQ.NO.10中的2條或2條以上；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2條或2條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2條或2條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2條或2條以上；所述支持延伸探針的P3序列選自SEQ.NO.26-SEQ.NO.29； (3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3’端序列P5；所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有針對(duì)TOP2A基因的選自SEQ.NO.30-SEQ.NO.39中的5條或5條以上；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.40-SEQ.NO.49中的5條或5條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.50-SEQ.NO.59中的5條或5條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.60-SEQ.NO.69中的5條或5條以上；所述P5為不存在內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；和 (4)標(biāo)記探針，所述標(biāo)記探針具有與擴(kuò)增延伸探針P5互補(bǔ)配對(duì)的、序列(優(yōu)選為SEQ.NO.84，且具有生物素修飾。
優(yōu)選地，還包括有填充序列，針對(duì)TOP2A基因的選自SEQ.NO.70-SEQ.NO.71中的一條或多條；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.72-SEQ.NO.79中的一條或多條；和/或針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.80-SEQ.NO.83中的一條或多條。
優(yōu)選地，所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。更優(yōu)選地，所述支持探針的間隔臂序列為8個(gè)T；所述支持延伸探針的間隔臂序列為5個(gè)T；所述擴(kuò)增延伸探針的間隔臂序列為5個(gè)T。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)TOP2A基因mRNA表達(dá)水平的方法。
實(shí)現(xiàn)上述目的技術(shù)方案如下 一種使用上述液相芯片對(duì)TOP2A基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)的方法，主要包括以下步驟 (一)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液； (二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針密封于雜交板中，54℃±1℃，600rpm震蕩孵育過(guò)夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的P1結(jié)合互補(bǔ)結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合，從而將目標(biāo)mRNA結(jié)合到微球上；擴(kuò)增延伸探針帶有生物素標(biāo)記，擴(kuò)增延伸探針的P4與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大； (三)步驟(二)的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)； (四)通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。
或者包括以下步驟 (一)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液； (二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針密封于雜交板中，54℃±1℃，600rpm震蕩孵育過(guò)夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的P1結(jié)合互補(bǔ)結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合，從而將目標(biāo)mRNA結(jié)合到微球上；擴(kuò)增延伸探針的P4與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合； (三)再加入標(biāo)記探針，標(biāo)記探針帶有生物素標(biāo)記，50℃±1℃，600rpm震蕩孵育1小時(shí)，標(biāo)記探針與擴(kuò)增延伸探針的序列P5互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大； (四)步驟(三)的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)； (五)通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于 (1)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的各種探針，能夠在均一的反應(yīng)條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，且各種探針之間基本不存在非特異性結(jié)合；所設(shè)計(jì)的探針在檢測(cè)中特異性好、信噪比高。同時(shí)，多種探針的組合使用使液相芯片和檢測(cè)方法形成一個(gè)檢測(cè)效果完好的系統(tǒng)。運(yùn)用本發(fā)明所述的液相芯片和檢測(cè)方法，對(duì)TOP2A基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)的，無(wú)需RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR等步驟，檢測(cè)結(jié)果受樣本中RNA的質(zhì)量影響較小，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；另一方面，以多個(gè)持家基因作對(duì)照(N≥3)，檢測(cè)結(jié)果不易受病理狀態(tài)的影響，準(zhǔn)確性高使檢測(cè)結(jié)果更為可靠。
(2)本發(fā)明使用的是探針的多位點(diǎn)特異配對(duì)、級(jí)聯(lián)放大的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，而不是PCR擴(kuò)增的方法，提高了檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的特異性，避免了逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的假陽(yáng)性。
(3)本發(fā)明所述的液相芯片和檢測(cè)方法適用于新鮮組織、石蠟包埋固定組織、組織切片、穿刺組織等樣本類(lèi)型，對(duì)比起其他的mRNA檢測(cè)方法，有著操作簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確性高、特異性高的特點(diǎn)。

具體實(shí)施例方式 本領(lǐng)域的人員所知，所述間隔臂序列為用于將支持探針與微球表面間隔開(kāi)來(lái)，在支持延伸探針與擴(kuò)增延伸探針內(nèi)部也存在間隔臂序列，通過(guò)在探針序列與胺基之間、探針內(nèi)部設(shè)置適當(dāng)長(zhǎng)度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。常見(jiàn)的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂(間隔臂長(zhǎng)度優(yōu)選2-4)。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5-10個(gè)T，在中國(guó)，T的合成技術(shù)比較成熟，成本相對(duì)較低。
實(shí)施例1TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片試劑盒，主要包括有 一、偶聯(lián)有支持探針(SP)的微球 支持探針由三部分組成，5’端是與微球結(jié)合的胺基端，3’端是與支持延伸探針結(jié)合的特異性序列P1，長(zhǎng)度為16nt，中間是8個(gè)寡聚核苷酸T的間隔臂序列，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，并選用一條支持探針，每種微球具有不同的熒光編碼。每個(gè)目標(biāo)基因的支持探針如表1所示 表1不同的目標(biāo)基因及其選用微球的編號(hào)、支持探針(SP) 所有探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成的支持探針用滅菌ddH2O配成100nmol/ml的貯存液。微球包被的過(guò)程如下 分別取5×106個(gè)上述編號(hào)的羧基化的微球(購(gòu)自L(fǎng)uminex公司)懸浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的捕獲探針(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(購(gòu)自Pierce Chemical公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液，恒溫孵育30分鐘，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒溫孵育30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用0.02％的Tween-20洗滌一次，再用0.1％的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有支持探針的微球重懸于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/LEDTA]中，2-8℃避光保存。
二、與目標(biāo)基因mRNA特異結(jié)合的支持延伸探針(SE)、擴(kuò)增延伸探針(AE) 1)支持延伸探針(SE)是連接支持探針(SP)與目標(biāo)基因mRNA之間的序列，SE由三部分組成，5’端是能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2，長(zhǎng)度介于17nt至28nt，3’端是能與支持探針5’端P1序列通過(guò)堿基互補(bǔ)結(jié)合的特異性序列P3，中間是5個(gè)寡聚核苷酸T的間隔臂序列。每個(gè)目標(biāo)基因分別設(shè)計(jì)5至7條支持延伸探針，以提高檢測(cè)的特異性。使用時(shí)，針對(duì)每種目標(biāo)基因，選擇2條或2條以上支持延伸探針即可完成檢測(cè)，特異性和穩(wěn)定性都很好(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)省略)，優(yōu)選于使用5至7條支持延伸探針，以使特異性達(dá)到最好。合成后的每條探針?lè)謩e用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的貯存液。目標(biāo)基因的支持延伸探針(SE)見(jiàn)表2、表3。
表2目標(biāo)基因的支持延伸探針P2序列

表3目標(biāo)基因的支持延伸探針的P3序列
2)擴(kuò)增延伸探針(AE)是連接目標(biāo)基因mRNA與信號(hào)檢測(cè)組分之間的序列，AE由三部分組成，5’端是能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4，3’端是能與標(biāo)記探針互補(bǔ)配對(duì)的序列P5，(如不運(yùn)用標(biāo)記探針檢測(cè)時(shí)，則3’端還修飾有生物素)，中間是5個(gè)寡聚核苷酸T的間隔臂序列。每個(gè)目標(biāo)基因分別設(shè)計(jì)10至15條擴(kuò)增延伸探針，從而將檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行級(jí)聯(lián)放大。合成后的每條探針?lè)謩e用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的貯存液。目標(biāo)基因的擴(kuò)增延伸探針(AE)見(jiàn)表3。所述P5的設(shè)計(jì)按照本領(lǐng)域的探針設(shè)計(jì)的公知常識(shí)，其為不存在內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間都不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合，GC含量為50％-65％的序列，本發(fā)明優(yōu)選為堿基組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。使用時(shí)，針對(duì)每種目標(biāo)基因，選擇5條或5條以上擴(kuò)增延伸探針即可完成檢測(cè)，特異性和穩(wěn)定性都很好(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)省略)，優(yōu)選于使用10條擴(kuò)增延伸探針，以使特異性達(dá)到最好。
表4目標(biāo)基因的擴(kuò)增延伸探針(AE)


3)填充序列(FS)，將目標(biāo)基因mRNA中沒(méi)有與SE、AE特異結(jié)合的區(qū)域封閉，以減少后續(xù)反應(yīng)中生物素或標(biāo)記探針的非特異性結(jié)合，從而減少檢測(cè)背景。填充序列的Tm值應(yīng)與SE、AE接近，如表5所示。
表5目標(biāo)基因的填充序列(FS)
三、標(biāo)記探針(LP) 標(biāo)記探針(LP)由兩部分組成，其序列是能與擴(kuò)增延伸探針3’端的序列P5互補(bǔ)結(jié)合的序列，5’端帶有生物素標(biāo)記，通過(guò)與擴(kuò)增延伸探針結(jié)合實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大。
表6標(biāo)記探針(LP)
實(shí)施例2運(yùn)用實(shí)施例1所述的TOP2A mRNA表達(dá)檢測(cè)液相芯片對(duì)臨床樣本的檢測(cè)所述各種溶液的配方如下
一、裂解樣本釋放總RNA 1.將FFPE腫瘤組織切片從載玻片上刮下，放入1.5ml離心管中，加入300ul勻漿緩沖液和3ul蛋白酶K(50ug/ul)，混合均勻，65℃消化2h。
2.消化2h后的樣品，室溫下13,000rpm離心5分鐘，吸取中間澄清的溶液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中備用。(如溶液仍不澄清，則重復(fù)本步驟1～2次。) 二、目標(biāo)mRNA通過(guò)與探針特異性結(jié)合固定在微球上。
1.取出探針工作液于室溫融解，然后在95℃變性5分鐘，馬上置于冰上。
2.按下表配制工作液，混合均勻

3.將上述配制好的工作液分裝至雜交板上，60ul/孔。然后將上述處理好的樣品以40ul/孔分別加入雜交板中；空白對(duì)照加入勻漿緩沖液40ul/孔。密封雜交板，54℃±1℃，600rpm震蕩孵育過(guò)夜(16-22h)。
4.用洗滌緩沖液潤(rùn)濕濾板1分鐘，除去洗滌緩沖液。
5.將雜交板取出，500×g離心1分鐘，將反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移至濾板中。
6.除去溶液，用200ul洗滌緩沖液洗滌3次。
三、通過(guò)雜交反應(yīng)將目標(biāo)RNA信號(hào)放大 1.加入標(biāo)記探針工作液100ul/孔。50℃±1℃，600rpm震蕩孵育1小時(shí)。
2.除去溶液，用200ul洗滌液洗滌2次。
四、與SA-PE結(jié)合，并在液相芯片閱讀儀上檢測(cè) 1.加入SA-PE工作液100ul/孔，600rpm震蕩室溫孵育30min。
2.抽濾除去溶液，用200ul SA-PE洗滌液洗滌2次，用吸水紙吸干濾板底部。
3.加入SA-PE洗滌液130ul/孔。室溫，600rpm震蕩孵育2至5分鐘。
4.在液相芯片儀上讀取數(shù)據(jù)。
五、數(shù)據(jù)分析 在4個(gè)目標(biāo)基因中，其中目標(biāo)基因1個(gè)TOP2A； 持家基因3個(gè)，分別是B2M、TFRC、TBP； 將讀取的熒光值按照以下方法進(jìn)行均一化處理 步驟1獲得原始數(shù)據(jù)(MFI值) 步驟2樣品的MFI減去空白孔N的MFI＝net MFI 步驟3每個(gè)樣品的三個(gè)持家基因的net MFI值分別取幾何平均值，得到相應(yīng)的G1、G2、G3......Gn 步驟4每個(gè)樣品目標(biāo)基因mRNA的net MFI除以對(duì)應(yīng)的Gn得到相應(yīng)的Nn。Nn即為已排除上樣量差異，可在樣品間進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量比較的數(shù)值。
本實(shí)施例中對(duì)10例樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下所示 表7空白孔N與10例樣品原始數(shù)據(jù)(MFI值)與TOP2A的相對(duì)表達(dá)量
實(shí)施例3不同間隔臂的液相芯片對(duì)TOP2A表達(dá)水平的檢測(cè) 一、液相芯片制備的設(shè)計(jì)(間隔臂的選擇) 以所述液相芯片對(duì)TOP2A檢測(cè)的支持探針為例，分別選用不同的間隔臂，具體設(shè)計(jì)如表8所示。探針SP、SE與AE的合成、SP序列包被微球、檢測(cè)方法等如實(shí)施例1和實(shí)施例2所述。
表8間隔臂及其長(zhǎng)度 二、樣品檢測(cè) 采用上述設(shè)計(jì)制備的液相芯片，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過(guò)程和方法對(duì)樣品11-15進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為檢測(cè)熒光值) 表9樣品檢測(cè)結(jié)果(檢測(cè)熒光值<MFI值>) 將4組設(shè)計(jì)的檢測(cè)熒光值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證明4組設(shè)計(jì)的檢測(cè)效果沒(méi)有差異。因此，這4種間隔臂的設(shè)計(jì)是等效的。
其它針對(duì)支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針內(nèi)部不同的間隔序列的液相芯片，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。
實(shí)施例4標(biāo)記探針的運(yùn)用 液相芯片制備的設(shè)計(jì)(信號(hào)檢測(cè)組分) 所述信號(hào)檢測(cè)組分有兩種選擇，1)擴(kuò)增延伸探針3’端序列P5的3’端帶有生物素標(biāo)記；2)擴(kuò)增延伸探針3’端序列P5與標(biāo)記探針(LP)通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，同時(shí)標(biāo)記探針的5’端帶有生物素標(biāo)記。這兩種信號(hào)檢測(cè)組分均能實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，檢測(cè)到正常信號(hào)。其中，使用標(biāo)記探針的生物素活性更加穩(wěn)定，效果較優(yōu)。
以所述液相芯片的檢測(cè)TOP2A基因的兩種信號(hào)檢測(cè)組分為例，具體設(shè)計(jì)如表10所示。即所述液相芯片的組成為 實(shí)驗(yàn)組1支持探針偶聯(lián)的微球、支持延伸探針、填充序列同實(shí)施例1，擴(kuò)增延伸探針具有生物素標(biāo)記；沒(méi)有標(biāo)記探針； 實(shí)驗(yàn)組2支持探針偶聯(lián)的微球、支持延伸探針、填充序列、標(biāo)記探針同實(shí)施例1，擴(kuò)增延伸探針不具有生物素標(biāo)記。
表10信號(hào)檢測(cè)組分
二、樣品檢測(cè) 采用上述設(shè)計(jì)制備的液相芯片，檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)組2同實(shí)施例2所述檢測(cè)過(guò)程和方法對(duì)樣品16-20進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組1所述檢測(cè)方法，省略(三、通過(guò)雜交反應(yīng)將目標(biāo)RNA信號(hào)放大)該步驟，其余同實(shí)施例2。
檢測(cè)結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為檢測(cè)熒光值) 表11樣品檢測(cè)結(jié)果(檢測(cè)熒光值<MFI值>) 將兩組設(shè)計(jì)的檢測(cè)熒光值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證明兩組設(shè)計(jì)的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有差異，因此，這兩種信號(hào)檢測(cè)組分對(duì)信號(hào)的檢測(cè)是等效的。其中，使用標(biāo)記探針的信號(hào)檢測(cè)組分，由于其生物素的活性更為穩(wěn)定，效果較優(yōu)。
以上是針對(duì)本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說(shuō)明，但該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專(zhuān)利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專(zhuān)利范圍中。
序列表
<110>廣州益善生物技術(shù)有限公司
<120>TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片和檢測(cè)方法
<160>84
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
catattacat tcacat16
<210>2
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ctttctttaa tctcaa16
<210>3
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<212>DNA
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<400>3
cattcaaatc tcaact16
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<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
caattacttc aaatct16
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gaaagtagaa aaggaggaag agtgaca27
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gcctctgatg atttgagaag atgaa 25
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
agccagaggg gacaggtcaa g 21
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
cttggatcaa atgttgtccc cga23
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
tgtagacagg tcttaacaaa gtttacaa 28
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
gaaagtagaa aaggaggaag agtgaca27
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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aaggccacgg agcgagacat20
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ccattctctg ctggatgacg tg22
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
gctgaaagac aagtctgaat gctc 24
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
ttaactatct tgggctgtga caaag 25
<210>15
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggagacagca ctcaaagtag aatta 25
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
acaatagccc aagtagccaa tcat 24
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
tcggttcctg ccagtctctc ac22
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tctccgacaa ctttctcttc aggt 24
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
ccagcctcac gagggacata t 21
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
acgccagact ttgctgagtt taa 23
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
cgaagtgcaa tggtctttag gtca 24
<210>22
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
cgtggttcgt ggctctctta tcc 23
<210>23
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
tattttcttg ctgccagtct gg 22
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
catcacagct ccccaccata ttct 24
<210>25
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
caattctggg tttgatcatt ctgtag 26
<210>26
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
atgtgaatgt aatatg 16
<210>27
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
ttgagattaa agaaag 16
<210>28
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
agttgagatt tgaatg 16
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<211>16
<212>DNA
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agatttgaag taattg 16
<210>30
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
ttttaaatca aactgctcta gtttta 26
<210>31
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
gaaccataaa gttctatctg atggtaa27
<210>32
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
ggcacataag aggctgagtg tagtag 26
<210>33
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
ctgtgtcaag ttatagacac agccaa 26
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
ctttgggaga ttcagactca gagg24
<210>35
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
cttctgcaat ccagtcctct tagaa 25
<210>36
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
gctcattgct gagcatggtt atc 23
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
tggagatttc ccaaaatgaa tcta24
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<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
cgttgataac attactcaag tcacacac28
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<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
gctgaaataa tcacataact actctaatt 29
<210>40
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
ttcaggaatg cccgcca17
<210>41
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
ccaggccaga aagagagagt agc 23
<210>42
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
cctgaatctt tggagtacgc tgg23
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
ggatgaaacc cagacacata gcaa 24
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
agtgggggtg aattcagtgt agta 24
<210>45
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
tcacacggca ggcatactca tct23
<210>46
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
gctgcttaca tgtctcgatc cc 22
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
tgcggcatct tcaaacctcc20
<210>48
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
gcaacctgct cagatacatc aaaca 25
<210>49
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
cctctaagtt gccagccctc cta23
<210>50
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
atagtcccat agcagatact tccac 25
<210>51
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
caatcaagaa aaagacgatc acagc25
<210>52
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
ctcagttttt ggttctaccc ctt 23
<210>53
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
ctcctggctc ctccctcact g21
<210>54
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
cgacgtgctg cagggaagt 19
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
gctggtgaag tctgtgctgt cc22
<210>56
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
ttttcattca gcagcttgat gg22
<210>57
<211>22
<212>DNA
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<400>57
cgagttttga gcgctgtctt tg22
<210>58
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
caggattctc caccaggtaa acaa 24
<210>59
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
gttgcagcct tactatacgc cac 23
<210>60
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>60
gcagctgcgg tacaatccc19
<210>61
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>61
tacaaccaag attcactgtg gatac 25
<210>62
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>62
gattatattc ggcgtttcgg gc22
<210>63
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>63
atgattaccg cagcaaaccg c 21
<210>64
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>64
gcacaccatt ttcccagaac tg22
<210>65
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>65
ctgttcttca ctcttggctc ctg 23
<210>66
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>66
acccaacttc tgtacaactc tagc 24
<210>67
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>67
tcttgaagtc caagaactta gctgg 25
<210>68
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>68
gggtgagcac aaggccttct aa22
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<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>69
caggaaataa ctctggctca taacta26
<210>70
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>70
aacagataat tatgctctat ctc 23
<210>71
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>71
agcaatttct cattgcttaa aga 23
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cggcccgaat gctgtca 17
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<212>DNA
<213>人工序列
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cagtaagtca acttcaatgt cg 22
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<211>23
<212>DNA
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ctttttcaat tctctctcca ttc 23
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<212>DNA
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agagatagaa agaccagtcc 20
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<212>DNA
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agaatttgga attcatccaa tcc 23
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<212>DNA
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catatcaata ttaaaaagca agc23
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<211>23
<212>DNA
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ctacattttg tgcataaagt gta23
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<212>DNA
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gaagatcatg tccatgttaa cat23
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>80
cgcaagattt tcatcttttt gag23
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>81
cacgaaattg attttcaaca tac23
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>82
ctgaatctta acaaaatgtt ga 22
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>83
ctaccgttct tatcaactat gat23
<210>84
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>84
tagacacggg aggcatagg 19
權(quán)利要求
1.一種TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，主要包括有
(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5’端的間隔臂序列和3’端的與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；
(2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3’端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對(duì)TOP2A基因的選自SEQ.NO.5-SEQ.NO.10中的2條或2條以上；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2條或2條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2條或2條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2條或2條以上；所述支持延伸探針的P3序列選自SEQ.NO.26-SEQ.NO.29；
(3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括有5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3’端序列P5，3’端還修飾有生物素；所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有針對(duì)TOP2A基因的選自SEQ.NO.30-SEQ.NO.39中的5條或5條以上；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.40-SEQ.NO.49中的5條或5條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.50-SEQ.NO.59中的5條或5條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.60-SEQ.NO.69中的5條或5條以上；所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)、探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，還包括有填充序列，針對(duì)TOP2A基因的選自SEQ.NO.70-SEQ.NO.71中的一條或多條；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.72-SEQ.NO.79中的一條或多條；和/或針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.80-SEQ.NO.83中的一條或多條。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，
所述P5的組成為CCTATTGCCTCCCCGTTGTCTA。
5.一種TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，主要包括有
(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5’端的間隔臂序列和3’端的與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；
(2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3’端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對(duì)TOP2A基因的選自SEQ.NO.5-SEQ.NO.10中的2條或2條以上；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2條或2條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2條或2條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2條或2條以上；所述支持延伸探針的P3序列選自SEQ.NO.26-SEQ.NO.29；
(3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括有5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3’端序列P5；所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有針對(duì)TOP2A基因的選自SEQ.NO.30-SEQ.NO.39中的5條或5條以上；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.40-SEQ.NO.49中的5條或5條以上，針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.50-SEQ.NO.59中的5條或5條以上，和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.60-SEQ.NO.69中的5條或5條以上；所述P5為不存在內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)、探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；和
(4)標(biāo)記探針，所述標(biāo)記探針具有與擴(kuò)增延伸探針P5互補(bǔ)配對(duì)的序列，且末端具有生物素修飾。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，還包括有填充序列，包括有，針對(duì)TOP2A基因的選自SEQ.NO.70-SEQ.NO.71中的一條或多條；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.72-SEQ.NO.79中的一條或多條；和/或針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.80-SEQ.NO.83中的一條或多條。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，
所述P5的組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。
9.一種檢測(cè)TOP2A基因mRNA表達(dá)水平的方法，其特征是，使用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述液相芯片，主要包括以下步驟
(一)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；
(二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針密封于雜交板中，54℃±1℃，600rpm震蕩孵育過(guò)夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的P1互補(bǔ)結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合，從而將目標(biāo)mRNA結(jié)合到微球上；擴(kuò)增延伸探針帶有生物素標(biāo)記，擴(kuò)增延伸探針的P4與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大；
(三)步驟(二)的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；
(四)通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。
10.一種檢測(cè)TOP2A基因mRNA表達(dá)水平的方法，其特征是，使用權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述液相芯片，主要包括以下步驟
(一)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；
(二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針密封于雜交板中，54℃±1℃，600rpm震蕩孵育過(guò)夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的P1結(jié)合互補(bǔ)結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合，從而將目標(biāo)mRNA結(jié)合到微球上；擴(kuò)增延伸探針的P4與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合；
(三)再加入標(biāo)記探針，標(biāo)記探針帶有生物素標(biāo)記，50℃±1℃，600rpm震蕩孵育1小時(shí)，標(biāo)記探針與擴(kuò)增延伸探針的序列P5互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大；
(四)步驟(三)的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；
(五)通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，所述檢測(cè)液相芯片，主要包括有與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球；連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列、間隔臂序列、3’端的能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列互補(bǔ)配對(duì)的序列；連接目標(biāo)基因mRNA與信號(hào)檢測(cè)組分間的擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列、間隔臂序列、3’端能與標(biāo)記探針互補(bǔ)配對(duì)的序列。本發(fā)明還公開(kāi)了運(yùn)用該液相芯片對(duì)TOP2A mRNA表達(dá)水平檢測(cè)的方法。本發(fā)明檢測(cè)過(guò)程無(wú)需RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR等步驟，檢測(cè)結(jié)果受樣本中RNA的質(zhì)量影響較小，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；另一方面，由于液相芯片技術(shù)使多指標(biāo)并行檢測(cè)成為了現(xiàn)實(shí)，在一次檢測(cè)中可設(shè)置多個(gè)內(nèi)參基因，使檢測(cè)結(jié)果更為可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101698884SQ200910193798
公開(kāi)日2010年4月28日 申請(qǐng)日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者許嘉森, 郭元杰, 羅彩英, 吳詩(shī)揚(yáng), 楊惠夷 申請(qǐng)人:廣州益善生物技術(shù)有限公司