基于液相芯片技術(shù)判斷體液環(huán)境中細(xì)胞狀態(tài)的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種基于液相芯片技術(shù)判斷體液環(huán)境中細(xì)胞狀態(tài)的方法，利用液相芯片技術(shù)對(duì)卵泡液的生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，以此判斷與卵泡液來(lái)自同一卵泡的卵子形成胚胎的質(zhì)量，與形態(tài)學(xué)分析相結(jié)合，從而決定將優(yōu)質(zhì)胚胎選擇。本發(fā)明通過(guò)提供卵子質(zhì)量的客觀指標(biāo)，可以提高IVF的臨床妊娠率和胚胎植入率，改善IVF治療結(jié)局。卵泡液判斷卵子質(zhì)量的多個(gè)因子組合可以制成商品化的液相芯片試劑盒，用于輔助生殖技術(shù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】基于液相芯片技術(shù)判斷體液環(huán)境中細(xì)胞狀態(tài)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬輔助生殖【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種基于液相芯片技術(shù)判斷體液環(huán)境中細(xì)胞狀態(tài)的方法，是基于液相芯片技術(shù)，通過(guò)分析體液中的成分來(lái)判斷卵子質(zhì)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002](I)體外受精技術(shù)
體外受精，是指哺乳動(dòng)物的精子和卵子放在一起體外培養(yǎng)，在嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件下發(fā)育成受精卵(也稱(chēng)胚胎)，因?yàn)榇隧?xiàng)技術(shù)的受精過(guò)程是在體外人工控制的環(huán)境中完成的，所以稱(chēng)為體外受精(in vitro fertilization, IVF)。通過(guò)IVF技術(shù)獲得受精卵后，再將受精卵放入子宮發(fā)育成為胎兒，這一過(guò)程就是胚胎移植技術(shù)(embryo transfer, ET)。體外受精-胚胎移植(IVF-ET)是目前解決不孕問(wèn)題最有效的技術(shù)手段。臨床工作中，IVF-ET包括I)藥物促排卵2)采卵3)精液收集和處理4)體外受精5)胚胎培養(yǎng)6)胚胎選擇7)胚胎移植等過(guò)程。
[0003]IVF-ET的妊娠率與所選擇胚胎的發(fā)育潛能密切相關(guān)，如何在不損害胚胎的前提下評(píng)判胚胎的質(zhì)量，十分重要。目前尚無(wú)準(zhǔn)確方法預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能，主要是根據(jù)不同時(shí)期胚胎的發(fā)育情況及形態(tài)特征來(lái)進(jìn)行判斷。但是胚胎的形態(tài)與實(shí)際的發(fā)育潛能并不完全一致，一些形態(tài)良好的胚胎也有發(fā)育停滯的可能。目前IVF的胚胎著床率在30%左右，即雖然經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)選擇，移植胚胎中仍有70%不能著床。而且，形態(tài)學(xué)觀察具有一定主觀性和個(gè)體差異，不同觀察者之間甚至同一觀察者都可能對(duì)胚胎的質(zhì)量判斷出現(xiàn)偏差。
[0004]為獲得良好的妊娠率，目前臨床上通常移植2至3個(gè)胚胎，但同時(shí)導(dǎo)致多胎妊娠率明顯增加。多胎妊娠大大增加了孕婦胎兒/新生兒圍產(chǎn)期疾病和并發(fā)癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，減少移植胚胎數(shù)甚至行選擇性單胚胎移植逐漸成為IVF的發(fā)展趨勢(shì)。但如果不能準(zhǔn)確判斷胚胎質(zhì)量，減少移植胚胎數(shù)將降低臨床妊娠率。因此，采用無(wú)創(chuàng)手段選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植至關(guān)重要。
[0005]卵泡是卵子生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境，卵泡液的成分包括各類(lèi)激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等，通過(guò)測(cè)定卵泡液的雌孕激素、生長(zhǎng)因子等發(fā)現(xiàn)與卵子的成熟和質(zhì)量有著一定聯(lián)系。但至今尚無(wú)公認(rèn)的反映卵子質(zhì)量的指標(biāo)，而且，采用常規(guī)ELISA等方法，一次實(shí)驗(yàn)只能測(cè)定一個(gè)指標(biāo)，對(duì)預(yù)測(cè)卵子質(zhì)量有一定局限性?？紤]到卵子在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都處在多種因子調(diào)節(jié)的生理?xiàng)l件下，我們有理由相信綜合測(cè)定多個(gè)分子將比單獨(dú)測(cè)定某個(gè)分子更準(zhǔn)確地反應(yīng)卵子質(zhì)量。
[0006](2)液相芯片技術(shù)
液相芯片(Iiquichip),又稱(chēng)為懸浮陣列(suspension array)技術(shù)是20世紀(jì)90年代后期開(kāi)發(fā)出來(lái)的既能保證信息質(zhì)量，又能提供相對(duì)高通量的新一代分子診斷技術(shù)平臺(tái)。由于反應(yīng)是在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測(cè)速度極快，其設(shè)計(jì)理念亦同樣體現(xiàn)了計(jì)算機(jī)芯片的并行處理和高密度集成、高通量的精髓，所以稱(chēng)作“液相芯片”。液相芯片體系由許多不同的微球(microsphere )為主要基質(zhì)構(gòu)成,每種微球上固定有不同的探針?lè)肿?，將這些微球懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了一個(gè)液相蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)，利用這個(gè)系統(tǒng)，我們可以對(duì)同一個(gè)樣品中的多個(gè)不同的分子同時(shí)進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。在液相系統(tǒng)中，為了區(qū)分不同的探針，每一種用于標(biāo)記探針的微球基質(zhì)都帶有一個(gè)獨(dú)特的色彩編號(hào)。在微球基質(zhì)的制造過(guò)程當(dāng)中，摻入了兩種不同的紅色分類(lèi)熒光，根據(jù)這兩種紅色分類(lèi)熒光的比例不同，可以把微球基質(zhì)分為100種。利用這100種微球基質(zhì)，可以標(biāo)記上100種不同的探針?lè)肿?，同時(shí)對(duì)一個(gè)樣本中的100種不同的目的分子進(jìn)行檢測(cè)。
[0007]液相芯片的獨(dú)特設(shè)計(jì)使得它擁有常規(guī)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法所不具備的特點(diǎn):通量大一可對(duì)同一樣本中的多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行分析；反應(yīng)時(shí)間短一在35-60分鐘內(nèi)可完成檢測(cè)；液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，也更有利于探針和被檢測(cè)物的反應(yīng)；只需要微量的樣品即可進(jìn)行檢測(cè)。這些特點(diǎn)使其成為測(cè)定生物標(biāo)志物的理想方法。
[0008]目前，已經(jīng)商業(yè)化的液相芯片試劑盒包括炎癥因子組合、腫瘤因子組合、糖尿病組合等，但尚無(wú)卵子/胚胎質(zhì)量相關(guān)因子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供基于液相芯片技術(shù)判斷體液環(huán)境中細(xì)胞狀態(tài)的方法，是一種輔助生殖技術(shù)方法，在目前IVF主要依靠主觀形態(tài)學(xué)分析的基礎(chǔ)上，提供判斷卵子質(zhì)量的客觀指標(biāo)，并將胚胎形態(tài)學(xué)結(jié)果和卵泡液分析結(jié)果相結(jié)合，決定該卵子體外受精后形成胚胎的命運(yùn)。
[0010]本發(fā)明通過(guò)如下的技術(shù)手段來(lái)實(shí)現(xiàn):
1.選取與卵子質(zhì)量相關(guān)的因子:選擇粒細(xì)胞集落刺激因子，白介素15，干細(xì)胞因子和干擾素誘導(dǎo)蛋白組成液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)。選擇與卵子發(fā)育潛能相關(guān)，能預(yù)測(cè)胚胎成功植入的因子:我們通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)卵泡液多個(gè)因子的表達(dá)情況與卵子成熟、受精、胚胎植入存在關(guān)聯(lián)性，可以作為反應(yīng)卵子質(zhì)量/胚胎發(fā)育潛能的指標(biāo)。
[0011]所述胚胎是通過(guò)用精子使卵子在體外受精而獲得的。胚胎的質(zhì)量是指植入子宮的能力以及后續(xù)的發(fā)育能力，以胚胎移植后臨床妊娠率，胚胎植入率以及活產(chǎn)率為判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0012]2.選擇相關(guān)因子的合適抗體,采用Bio-Plex氨基稱(chēng)聯(lián)試劑盒將抗體稱(chēng)聯(lián)到突光染色的微球上，組成液相芯片測(cè)試系統(tǒng)；
(O蛋白質(zhì)準(zhǔn)備:如果樣品不含有疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他含自由氨基的添加物，可直接用于耦聯(lián)；否則需要使用Bio-spin微型柱更換緩沖液。
[0013](2)耦聯(lián)反應(yīng):
a.微球活化:選擇微球，漩渦混合，離心后去上清，加入EDC (50 mg/ml)和S-NHS (50mg/ml)，漩渦混合，離心后去上清，加入PBS重懸。
[0014]b.蛋白I禹聯(lián):加入5_12ug的蛋白質(zhì)到活化的微球中，室溫旋轉(zhuǎn)混合2小時(shí)，14000g離心4分鐘，PBS清洗微球后，用封閉緩沖液重懸微球。室溫旋轉(zhuǎn)混合0.5小時(shí)，14000g離心4分鐘，去上清，加入儲(chǔ)存緩沖液洗滌后，加入150ul儲(chǔ)存緩沖液保存微球。
[0015](3)耦聯(lián)效率驗(yàn)證:標(biāo)記兩個(gè)小離心管，測(cè)試管和陰性對(duì)照管。耦聯(lián)的微球漩渦混合，稀釋生物素標(biāo)記的抗體至2ug/ml，加50ul到測(cè)試管中，陰性對(duì)照管加50ul稀釋緩沖液，14000g離心4分鐘,去上清,加入50ul的2ug/ml的Streptavidin-PE,蓋上招箔,室溫孵育10分鐘，用125ul的儲(chǔ)存緩沖液重懸微球，漩渦混合15秒，取125ul樣品到平底96孔板，開(kāi)始用Bio-Plex儀器檢測(cè)。陰性對(duì)照的熒光值不得超過(guò)100MFI，耦聯(lián)微球的熒光值超過(guò)2000MFI認(rèn)為耦聯(lián)成功。
[0016]3.組成液相蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng):這些固定了生物標(biāo)志物探針的微球懸浮于一個(gè)液相體系中，通過(guò)對(duì)同一反應(yīng)體系內(nèi)N種捕獲分子與N種分析物的最適結(jié)合反應(yīng)條件的優(yōu)化，就構(gòu)成了一個(gè)液相蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)，利用這個(gè)系統(tǒng)，我們可以對(duì)同一個(gè)卵泡液中的多個(gè)不同的分子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。
[0017]4.液相芯片技術(shù)輔助選擇移植胚胎:接受IVF-ET的人群在采卵時(shí)，通過(guò)穿刺卵泡同時(shí)獲得卵子和卵泡液，將卵泡液采用液相芯片技術(shù)同時(shí)進(jìn)行多個(gè)標(biāo)志物檢測(cè)，而卵子則進(jìn)行體外受精-胚胎培養(yǎng)。胚胎在體外培養(yǎng)48-72小時(shí)，依據(jù)液相芯片檢測(cè)結(jié)果和胚胎形態(tài)，選擇1-3個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎移植回病人子宮。
[0018]5.繼續(xù)調(diào)整細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素的組合:繼續(xù)選擇可能反映胚胎質(zhì)量的細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，激素，重復(fù)2，3步驟，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析卵泡液的液相芯片測(cè)定結(jié)果與胚胎的植入成功之間的相關(guān)性，相關(guān)性不強(qiáng)的因子予以剔除，將相關(guān)性強(qiáng)的因子入選液相芯片測(cè)試系統(tǒng)。
[0019]所說(shuō)的卵子、胚胎、子宮是人類(lèi)的卵子、胚胎、子宮。
[0020]所說(shuō)的分析檢驗(yàn)是指采用液相芯片技術(shù)同時(shí)測(cè)定多個(gè)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素或它們的組合。
[0021]所說(shuō)的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素是指粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-colonystimulating factor,CSF),白介素 15(interleukin 15, IL-15),干細(xì)胞因子(stem cellfactor, SCF)和干擾素誘導(dǎo)蛋白 10 (interferon induced protein 10，IP-10)的組合。
[0022]本發(fā)明的有益效果在于，(I)通過(guò)分析檢驗(yàn)卵泡液，判斷與卵泡液來(lái)自同一卵泡的卵子形成胚胎的質(zhì)量，與胚胎形態(tài)學(xué)指標(biāo)相結(jié)合，將能更準(zhǔn)確地選擇質(zhì)量好的胚胎植入子宮，從而提高IVF的臨床妊娠率和胚胎植入率，改善IVF治療結(jié)局。(2)我們采用液相芯片技術(shù)可以同時(shí)分析卵泡液的多個(gè)因子，克服了一般檢測(cè)手段一次僅能分析一個(gè)指標(biāo)的局限，考慮到卵子在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都處在多種因子調(diào)節(jié)的生理?xiàng)l件下，綜合測(cè)定多個(gè)分子將比采用其他技術(shù)手段單獨(dú)測(cè)定某個(gè)分子更準(zhǔn)確地反應(yīng)卵子質(zhì)量。(3)卵泡液判斷卵子質(zhì)量的多個(gè)因子組合可以制成商品化的液相芯片試劑盒，用于輔助生殖技術(shù)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1是檢測(cè)體系設(shè)計(jì)流程圖。
[0024]圖2是微球活化流程。
[0025]圖3是抗體耦聯(lián)流程圖。
[0026]圖4是耦聯(lián)效率驗(yàn)證流程圖。
[0027]圖5是G-CSF有助于準(zhǔn)確選擇優(yōu)質(zhì)胚胎。
【具體實(shí)施方式】
[0028]本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0029]實(shí)施例1
1.根據(jù)文獻(xiàn)選擇與卵子發(fā)育潛能相關(guān)，能預(yù)測(cè)胚胎成功植入的因子，比如粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor, CSF),白介素 15 (interleukin 15,IL-15),干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF)和干擾素誘導(dǎo)蛋白10。
[0030]2.為選擇的因子選擇購(gòu)買(mǎi)適合液相芯片技術(shù)的抗體
3.蛋白質(zhì)準(zhǔn)備:如果抗體不含有疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他含自由氨基的添加物，可直接用于耦聯(lián)；否則需要使用Bio-spin微型柱更換緩沖液。
[0031]4.耦聯(lián)反應(yīng):
a.微球活化:選擇微球，漩渦混合，離心后去上清，加入EDC (50 mg/ml)和S-NHS (50mg/ml)，漩渦混合，離心后去上清，加入PBS重懸。
[0032]b.蛋白耦聯(lián):加入5_12ug的蛋白質(zhì)到活化的微球中，室溫旋轉(zhuǎn)混合2小時(shí)，14000g離心4分鐘，去上清，加入PBS清洗微球，14000g離心4分鐘，去上清，用封閉緩沖液重懸微球。室溫旋轉(zhuǎn)混合0.5小時(shí)，14000g離心4分鐘，去上清，加入儲(chǔ)存緩沖液，16000g離心6分鐘，去上清，加入150ul儲(chǔ)存緩沖液保存微球。
[0033]5.耦聯(lián)效率驗(yàn)證:標(biāo)記兩個(gè)小離心管，測(cè)試管和陰性對(duì)照管。耦聯(lián)的微球漩渦混合，稀釋生物素標(biāo)記的抗體至2ug/ml，加50ul到測(cè)試管中，陰性對(duì)照管加50ul稀釋緩沖液，14000g離心4分鐘,去上清,加入50ul的2ug/ml的Streptavidin-PE,蓋上招箔,室溫孵育10分鐘，用125ul的儲(chǔ)存緩沖液重懸微球，漩渦混合15秒，取125ul樣品到平底96孔板，開(kāi)始用Bio-Plex儀器檢測(cè)。陰性對(duì)照的熒光值不得超過(guò)100MFI，耦聯(lián)微球的熒光值超過(guò)2000MFI認(rèn)為耦聯(lián)成功。
[0034]6.組成液相蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)
這些固定了生物標(biāo)志物探針的微球懸浮于一個(gè)液相體系中，通過(guò)對(duì)同一反應(yīng)體系內(nèi)N種捕獲分子與N種分析物的最適結(jié)合反應(yīng)條件的優(yōu)化，就構(gòu)成了一個(gè)液相蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)，利用這個(gè)系統(tǒng)，我們可以對(duì)同一個(gè)卵泡液中的多個(gè)不同的分子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。
[0035]實(shí)施例2
1.患者經(jīng)超促排卵，卵泡發(fā)育成熟后在B超引導(dǎo)下采卵，一個(gè)卵泡的內(nèi)容物收集至一個(gè)無(wú)菌試管，并將其倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，在體視顯微鏡下尋找卵子，找到卵子后轉(zhuǎn)入G-1VF(Vitrolife)培養(yǎng)液，在37度，6% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相應(yīng)的培養(yǎng)液經(jīng)采用液相芯片技術(shù)進(jìn)行生物標(biāo)志物分析。
[0036]2.卵泡液生物標(biāo)志物測(cè)定過(guò)程如下:
(1)準(zhǔn)備好標(biāo)本，IOOOg離心15分鐘
(2)準(zhǔn)備耦聯(lián)好的微球:在15ml試管中加入適量緩沖液，耦聯(lián)好的微球漩渦混合30秒，加入適量的微球至15ml試管，避光，室溫平衡20分鐘。
[0037](3)將耦聯(lián)好的微球，樣品等加入96孔板:每孔加入50ul耦聯(lián)好的微球，洗板兩次，每孔加入50ul對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，室溫孵育I小時(shí)。
[0038](4)加入檢測(cè)抗體:孵育結(jié)束后,洗板3次，每孔加入25ul檢測(cè)抗體，室溫震蕩孵育30分鐘。
[0039](5)加入 Streptavidin-PE:洗板 3 次,每孔加入 50ul Streptavidin-ΡΕ,震蕩孵育10分鐘。洗板三次，每孔加入125ul緩沖液，室溫震蕩30秒，然后用Luminex液相芯片儀對(duì)96孔板進(jìn)行檢測(cè)。
[0040]3.體外受精-胚胎培養(yǎng)過(guò)程如下:卵子經(jīng)GMOPS (Vitrolife)漂洗后，轉(zhuǎn)入G-1VF (Vitrolife)培養(yǎng)液培養(yǎng)2_4小時(shí)后，加入經(jīng)洗滌的病人丈夫的精液，最終密度約為1-5XlOVmlο在授精后16-18小時(shí)，在顯微鏡下觀察卵子的原核、極體和胞漿，評(píng)估受精狀態(tài)。然后轉(zhuǎn)入G-1 (Vitrolife)培養(yǎng)液培養(yǎng)。48小時(shí)后進(jìn)行卵裂期胚胎觀察，同時(shí)結(jié)合生物標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果，以此判斷與卵泡液來(lái)自同一卵泡的卵子形成胚胎的質(zhì)量，將此結(jié)果和胚胎形態(tài)學(xué)分析相結(jié)合，從而選取最佳胚胎移植回子宮，并決定將其余胚胎凍存或放棄。
[0041]4.繼續(xù)調(diào)整細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素的組合:通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析卵泡液的液相芯片測(cè)定結(jié)果與胚胎的植入成功之間的相關(guān)性，相關(guān)性不強(qiáng)的因子予以剔除，增加相關(guān)性強(qiáng)的因子。
[0042]實(shí)施例3
2011.10-2012.3期間，我們選擇了部分體外受精-胚胎移植病人，進(jìn)行卵泡液液相芯片生物標(biāo)志物檢測(cè)，初步結(jié)果顯示:增加液相芯片生物學(xué)客觀指標(biāo)，有助于增加胚胎植入率。比如選擇G-CSF，胚胎植入預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)80.6%，而一般情況下胚胎植入率在30%-40%左右。結(jié)果參見(jiàn)圖5。
【權(quán)利要求】
1.基于液相芯片技術(shù)判斷體液環(huán)境中細(xì)胞狀態(tài)的方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)選擇粒細(xì)胞集落刺激因子，白介素15，干細(xì)胞因子和干擾素誘導(dǎo)蛋白組成液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)； (2)采用Bio-Plex氨基耦聯(lián)試劑盒將抗體耦聯(lián)到熒光染色的微球上，組成液相芯片測(cè)試系統(tǒng): (a)蛋白質(zhì)準(zhǔn)備:如果樣品不含有疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他含自由氨基的添加物，可直接用于耦聯(lián)；否則需要使用Bio-spin微型柱更換緩沖液； (d)耦聯(lián)反應(yīng):微球活化:選擇微球，漩渦混合，離心后去上清，加入50 mg/ml EDC和50mg/ml S-NHS，漩渦混合，離心后去上清，加入PBS重懸；蛋白耦聯(lián):加入5_12ug的蛋白質(zhì)到活化的微球中，室溫旋轉(zhuǎn)混合2小時(shí)，14000g離心4分鐘，PBS清洗微球后，用封閉緩沖液重懸微球，室溫旋轉(zhuǎn)混合0.5小時(shí)，14000g離心4分鐘，去上清，加入儲(chǔ)存緩沖液洗滌后，力口入150ul儲(chǔ)存緩沖液保存微球； (c)耦聯(lián)效率驗(yàn)證:標(biāo)記兩個(gè)小離心管，測(cè)試管和陰性對(duì)照管，耦聯(lián)的微球漩渦混合，稀釋生物素標(biāo)記的抗體至2ug/ml，加50ul到測(cè)試管中，陰性對(duì)照管加50ul稀釋緩沖液，14000g離心4分鐘,去上清,加入50ul的2ug/ml的Streptavidin-PE,蓋上招箔,室溫孵育10分鐘，用125ul的儲(chǔ)存緩沖液重懸微球，漩渦混合15秒，取125ul樣品到平底96孔板，開(kāi)始用Bio-Plex儀器檢測(cè)，陰性對(duì)照的熒光值不得超過(guò)100MFI，耦聯(lián)微球的熒光值超過(guò)2000MFI認(rèn)為耦聯(lián)成功； (3)組成液相蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng):將生物標(biāo)志物探針的微球懸浮于一個(gè)液相體系中，通過(guò)對(duì)同一反應(yīng)體系內(nèi)N種捕獲分子與N種分析物的最適結(jié)合反應(yīng)條件的優(yōu)化，構(gòu)成一個(gè)液相蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)； (4)液相芯片技術(shù)輔助選擇移植胚胎:將卵泡液采用液相芯片技術(shù)同時(shí)進(jìn)行多個(gè)標(biāo)志物檢測(cè)，而卵子則進(jìn)行體外受精-胚胎培養(yǎng)，胚胎在體外培養(yǎng)48-72小時(shí)，依據(jù)液相芯片檢測(cè)結(jié)果和胚胎形態(tài)，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移； (5)繼續(xù)調(diào)整細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素的組合:繼續(xù)選擇可能反映胚胎質(zhì)量的細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，激素，重復(fù)2，3步驟，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析卵泡液的液相芯片測(cè)定結(jié)果與胚胎的植入成功之間的相關(guān)性，相關(guān)性不強(qiáng)的因子予以剔除，將相關(guān)性強(qiáng)的因子入選液相芯片測(cè)試系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相芯片技術(shù)判斷體液環(huán)境中細(xì)胞狀態(tài)的方法，其特征在于，所說(shuō)的分析檢驗(yàn)是指采用液相芯片技術(shù)同時(shí)測(cè)定多個(gè)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素或它們的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于液相芯片技術(shù)判斷體液環(huán)境中細(xì)胞狀態(tài)的方法，其特征在于，所說(shuō)的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素是指粒細(xì)胞集落刺激因子，白介素15，干細(xì)胞因子和干擾素誘導(dǎo)蛋白10的組合。
【文檔編號(hào)】G01N33/74GK103713120SQ201310710571
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】葉英輝, 黃荷鳳, 周承亮, 曲凡 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)