專利名稱：馬鼻肺炎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于動物病毒檢測技術領域，具體涉及一種馬鼻肺炎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法。
背景技術：
馬鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis, ER)是馬屬動物幾種高度接觸傳染性疾病的總稱，其病原體為親緣關系密切的兩種皰疹病毒馬皰疹病毒1型(EHV-I)和馬皰疹病毒 4型(EHV-4)。馬鼻肺炎是馬的一種急性發(fā)熱性傳染病。在敏感馬群中可100%感染，1993 年6月在新疆野馬繁殖中心野馬群中爆發(fā)的馬鼻肺炎流行過程中，馬群100%感染，成年馬臨床癥狀較輕而幼駒癥狀嚴重，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、上呼吸道粘膜的卡他性炎癥以及白細胞減少。病程1周左右，幼駒可達IOd以上，妊娠毋馬感染本病時易發(fā)生流產(chǎn)和產(chǎn)下弱駒，弱駒產(chǎn)下后多在48h內(nèi)死亡，流產(chǎn)和弱駒死亡率可達80%以上。本病廣泛發(fā)生于世界各地，美國、英國、日本、澳大利亞、新西蘭、意大利、波蘭、瑞典、比利時、愛爾蘭、挪威、瑞士、葡萄牙、西班牙、法國、德國、匈牙利、加拿大、南非、巴西、 阿根廷、印度、馬來西亞以及我國的臺灣省和香港特別行政區(qū)等50多個國家和地區(qū)均有報導，給世界養(yǎng)馬業(yè)帶來很大危害、多數(shù)國家已將本病例為養(yǎng)馬業(yè)重點防制疫病之一。世界動物衛(wèi)生組織將馬鼻肺炎列為須通報動物疫病。在大量飼養(yǎng)馬匹進行傳統(tǒng)耕作或以之作為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟一部分的國家中，EHV-I和 EHV-4這兩種病毒感染呈地方性流行。從馬以外的其它馬屬動物，如斑馬、亞洲野驢和驢，已經(jīng)分離到與EHV1/4親緣關系極為密切的皰疹病毒.也可見到EHV-I感染非馬屬動物的個別病例，如感染牛引起流產(chǎn)，美洲駝引起視神經(jīng)疾病和失明等。目前，尚無證據(jù)證明這兩種皰疹病毒對人有感染性。馬鼻肺炎的呼吸道疾病雖說可造成很大的經(jīng)濟損失，但最大的威脅卻是給種馬、賽馬或娛樂馬帶來的潛在的流產(chǎn)和神經(jīng)疾患后遺癥。國內(nèi)于1980年從流產(chǎn)的馬胎兒中分離到了病毒(但未區(qū)分是EHV-I還是EHV-2)，并對部分省區(qū)的馬匹進行了普查，總陽性率為49. 9 %，證明了本病在我國的存在。人類基因組測序已經(jīng)完成，豐富的信息加深了我們對基因差異及其與疾病和疾病治療關系的理解。越來越多的致病基因突變需要鑒定，分子生物學實驗室要檢測的DNA大幅度增加，迫切需要快速，精確，經(jīng)濟的高通量核酸檢測方法。本專利采用PCR檢測方法與液相芯片檢測技術結合，建立了馬鼻肺炎(EHV-I)的液相芯片快速檢測方法，為馬鼻肺炎的檢測提供了又一種方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供馬鼻肺炎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法，即一種操作簡單、結果準確的馬鼻肺炎病毒液相芯片檢測方法，及其所用到的引物，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的，采用液相芯片技術。該技術是在核酸水平上的一種檢測技術，具有準確性好、靈敏度高的特點。其原理是將編碼微球單個逐一通過檢測通道時受到雙色激光(如紅色和綠色)同時照射，第一束激光激發(fā)微球的分類熒光，根據(jù)熒光編碼確定微球的類別，即微球內(nèi)部的兩種熒光物質受激發(fā)后可發(fā)射兩種不同波長的熒光，不同類別微球內(nèi)這兩種熒光物質比例不同，則熒光強度比例也不同，從而將不同的特異性反應區(qū)分開來；第二束激光激發(fā)報告分子上的熒光素，根據(jù)熒光強度確定微球上結合的報告分子的數(shù)量從而確定目標分子的數(shù)量(定量)。系統(tǒng)只記錄與紅色熒光同時出現(xiàn)的綠色熒光信號， 不記錄未結合的報告分子熒光信號，因此檢測前無需洗脫未結合的報告分子。此外，利用流式細胞術中90°C角散射光可有效地消除微球聚集對結果造成的影響。各種熒光信號經(jīng)分析軟件進行數(shù)字化處理，可獲得檢測物的種類和數(shù)量。本發(fā)明中所涉及到的引物和探針序列如下正向引物dirct primer :5-AAGCCCAGGCATTCGCAAGACC-3~ SEQ ID NO :1反向引物reverse primer :5:CAAACCGACGCTGATGCCCACA_3~ SEQ ID NO :2探針Probe 5~ _TTAAGTGGCCCAGCATCAAACA_3~ SEQ ID NO :3。正向引物和反向引物5’端進行生物素標記；探針的5’端進行氨基化修飾。本發(fā)明的引物和探針用于檢測馬鼻肺炎病毒，其檢測方法包括有1)檢測樣品 RNA的提取、2) RT-PCR擴增目的片段、3)寡核苷酸探針與微球共價偶聯(lián)、4)探針與RT-PCR 擴增片段雜交和幻液相芯片儀分析步驟。其中步驟2~) RT-PCR反應的循環(huán)條件為第一階段，反轉錄50°C :30min ；第二階段，預變性94°C :3min ；第三階段，擴增94°C :30s, 59°C :30s, 72°C :30s，30 個循環(huán)；第四階段，延伸72°C :5min。本發(fā)明的檢測方法能夠對樣品進行快速檢測，從樣品處理到出結果僅需4小時左右；由于采用了接近生物反應體系的液相芯片系統(tǒng)和特異性的探針，使該方法可與熒光定量PCR相媲美。本發(fā)明設計的引物與常見馬屬動物其他病毒不發(fā)生交叉反應，由于采用了液相反應體系，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)檢測方法，大大杜絕了非特異性擴增造成的假陰性結果。本發(fā)明的方法提供了優(yōu)化的操作程序，操作簡單，具有良好重復性。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明的方法進行詳細描述。本發(fā)明所用到的儀器耗材信息如下表面羧基化的熒光編碼微球、鞘液購置于BD 公司，TMAC temtrameihyl-ammdni μπι chloride, Tris, SDS (10% sol μ tion)購置于美國 Sigma 公司，SPAE Str印tavidin-R-phycoerythrin 購于美國 Prozyme 公司，RNA 提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購于大連寶生物公司。主要設備包括BD FACSArray液相芯片儀、梯度 PCR擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)、Sigma高速冷凍離心機等。通過hternet登陸美國國立生物信息技術中心(NCBI)，查詢檢索已公布的馬鼻肺炎病毒基因序列。利用I^rimer Premierf.O軟件設計引物和探針，并最終篩選出一對具有高特異性的引物和探針，參見表1。表1設計的引物和預期目的片段大小
權利要求
1.一種馬鼻肺炎病毒的液相芯片檢測的引物和探針，其特征在于，引物和探針的核酸序列如下正向引物=SEQ ID NO 1 反向引物Γ SEQ ID NO 2 探針 Γ SEQ ID NO :3ο
2.如權利要求1所述的引物和探針，其特征在于所述的正向引物和反向引物5'端進行生物素標記；探針的5'端進行氨基化修飾。
3.一種液相芯片檢測馬鼻肺炎病毒的方法，其特征在于，是用權利要求2所述的引物和探針進行檢測。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于包括有1)檢測樣品RNA的提取、2)RT-PCR擴增目的片段、幻寡核苷酸探針與微球共價偶聯(lián)、4)探針與RT-PCR擴增片段雜交和幻液相芯片儀分析步驟。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述的步驟2)RT-PCR反應的循環(huán)條件為 第一階段，反轉錄50°C :30min ；第二階段，預變性94°C :3min ；第三階段，擴增 94°C :30s, 59°C :30s，72°C :30s，30 個循環(huán)； 第四階段，延伸720C :5min0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種馬鼻肺炎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法，本發(fā)明的檢測方法能夠對樣品進行快速檢測，從樣品處理到出結果僅需4小時左右；由于采用了接近生物反應體系的液相芯片系統(tǒng)和特異性的探針，使該方法可與熒光定量PCR相媲美。本發(fā)明設計的引物與常見馬屬動物其他病毒不發(fā)生交叉反應，由于采用了液相反應體系，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)檢測方法，大大杜絕了非特異性擴增造成的假陰性結果。本發(fā)明的方法提供了優(yōu)化的操作程序，操作簡單，具有良好重復性。
文檔編號G01N21/64GK102433394SQ20111042642
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月19日 優(yōu)先權日2011年12月19日
發(fā)明者孫濤, 岳志芹, 徐彪, 朱來華, 梁成珠, 王群, 肖西志, 趙玉然, 鄧明俊, 鄭小龍 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心