專利名稱：一種新型肌苷產(chǎn)生菌及其生產(chǎn)肌苷的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)肌苷的微生物菌株及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的方法。
肌苷(Inosine)，學名次黃嘌呤核苷，是有一定醫(yī)療價值的藥物，可用于治療肝臟、心臟疾病，白血球、血小板減少癥；中心視神經(jīng)膜炎、視神經(jīng)萎縮等疾病及放療造成的血小球減少癥；此外，還可作為合成抗病毒藥和食品呈味劑的原料。
生產(chǎn)肌苷大致有3種方法1.利用化學全合成法；2.酶解法，從酵母菌或其他細胞中提取核糖核酸，在利用酶法降解提取肌苷；3.發(fā)酵法；目前，國內外一般采用枯草桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷。1963年，已有報道從各種菌的嘌呤缺陷型生產(chǎn)各種嘌呤核苷酸衍生物；同年，報道了枯草桿菌的腺嘌呤缺陷型產(chǎn)肌苷達7g/l，基本建立肌苷的工業(yè)生產(chǎn)。(喬賓福工業(yè)微生物84(2))，1970年，日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)公司分離出KY13714(Akira Funya et al，Appl.Microbiol.，1970 20(2)265)，產(chǎn)肌苷10g/l左右。1981年，上海工業(yè)微生物研究所采用枯草芽孢桿菌301菌株，在生產(chǎn)罐中，平均產(chǎn)肌苷12g/l(項目年度編號89203223).1986年，復旦大學采用枯草芽孢桿菌FD8601在240升發(fā)酵罐上平均產(chǎn)肌苷17.59g/l。(成果鑒定編號國家級872129)1994年，吳江報道(南京農(nóng)業(yè)大學學報94.17(2)，66-69)用枯草桿菌變異株在5L全自動發(fā)酵罐上進行多次試驗，肌苷產(chǎn)量為15g/l。1994年，劉長云等報道(中國藥科大學學報94，25(1)，56-60)采用枯草芽孢桿菌的變異株LSBS1255，搖瓶72h，產(chǎn)肌苷為27.43mg/ml。1995年，邱玉棠等報道(核農(nóng)學報，9(3)，129-133)，利用GMI-741搖瓶發(fā)酵，產(chǎn)肌苷25.18g/l。1995年，陳寧等報道(天津輕工業(yè)學院學報)用枯草桿菌TSXB29，在最佳搖瓶發(fā)酵條件下，平均搖瓶產(chǎn)肌苷27.85g/l。上述研究都是采用枯草桿菌利用酵母粉發(fā)酵生產(chǎn)肌苷，該工藝采用藥用酵母粉(難容于水)為主要原材料，價格較高(目前每噸約10000元)，培養(yǎng)基滅菌溫度、時間較難控制，易造成污染，發(fā)酵結束后，發(fā)酵醪液粘度較大，增加后提取——離子交換工序的難度。
本發(fā)明的目的是提供一種新型肌苷產(chǎn)生菌及其利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的方法。以便能用較便宜并易溶于水的材料代替以往肌苷發(fā)酵中采用的價格昂貴的原材料——藥用酵母粉，并解決上述現(xiàn)有發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷所存在的問題。
本發(fā)明所提供的微生物菌株是經(jīng)選育的肌苷高產(chǎn)突變株產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)GMA-1198。該菌種保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NOM201025。保藏時間為2001年7月11日。該菌種以下簡稱為GMA-1198 CCTCCM201025。
本肌苷高產(chǎn)突變株產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCCM201025的微生物特性為具有腺嘌呤、生物素雙重營養(yǎng)缺陷型及對8-氮雜鳥嘌呤、6-巰基嘌呤、黃胺呱有抗性，在保藏斜面或肉湯平皿上28～34℃培養(yǎng)12～18小時，斜面培養(yǎng)物呈淡黃色，平皿上菌落顏色呈淡黃色，直徑約1～10mm，其生產(chǎn)適宜條件為1.培養(yǎng)物(肉湯平皿或保藏斜面培養(yǎng)基同)蛋白胨3～6g/l，牛肉膏10～18g/l，酵母膏5～1 0g/l，瓊脂15～25g/l。2.培養(yǎng)溫度25℃～35℃。培養(yǎng)物pH值6.5～7.5。在液體活化培養(yǎng)基中，28℃～34℃，培養(yǎng)12～18小時，每毫升菌數(shù)在2.0×1010以上，在培養(yǎng)物中散發(fā)出濃烈的氨味，pH值上升到8.0以上。其適宜生長條件為1.培養(yǎng)物葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米漿4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15，腺嘌呤0.010～0.040。2.培養(yǎng)溫度25～35℃。3.培養(yǎng)pH值6.0～9.0。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)肌苷的方法，其特點是用肌苷高產(chǎn)突變株產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCC M201025做發(fā)酵菌株，利用糖質原料和生長素進行搖瓶發(fā)酵。
所說的糖質原料可為葡萄糖或(和)用糖化酶和α-淀粉酶水解的淀粉雙酶水解糖(用糖化酶和α-淀粉酶水解)或(和)糖蜜等；所說的生長素為谷氨酸鈉加次黃嘌呤，其組分為(重量百分比)谷氨酸鈉80～90％，次黃嘌呤10～20％。
所說的生長素還可采用味精母液或谷氨酸發(fā)酵液經(jīng)硫酸或鹽酸冷凍、等電點提取后的高峰液再添加次黃嘌呤，生長素(100％)＝80～90％谷氨酸鈉+10～20％次黃嘌呤[均折實際含量(重量)]。
利用本肌苷高產(chǎn)突變株產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCCM201025，搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的工藝過程如下(1)化凍干保藏種(GMA-1198 CCTCC M201025)打開凍干管，用常規(guī)方法挑選產(chǎn)肌苷最高的單菌落，用接種針接種于保藏斜面上培養(yǎng)。
(2)斜面菌種活化將培養(yǎng)好的保藏斜面種(GMA-1198 CCTCC M201025)劃線于新配制的活化斜面上進行活化。
(3)菌種的液體活化將培養(yǎng)好的活化斜面種接一環(huán)于液體活化培養(yǎng)基中進行液體活化，使液體種的菌數(shù)達到2.0×1010個/ml以上。
(4)搖瓶發(fā)酵按5～10％(V/V)接種量，接入含糖質原料和生長素發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，待殘?zhí)窍陆抵?g/l以下時，停止發(fā)酵。適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基成份如下(按每升培養(yǎng)基所含克重g/l計算)總還原糖100～140，玉米漿10～50，硫酸銨5～15，生長素2～10，磷酸二氫鉀1～5，碳酸鈣10～40，尿素2～8，硫酸鎂0.5～2，pH6.5～7.5。
(5)發(fā)酵完畢的搖瓶發(fā)酵醪液經(jīng)提取工藝(可采用一般傳統(tǒng)的提取工藝)即得含肌苷的制品。
在步驟(1)中，凍干用的牛奶必須新鮮牛奶，凍干管保藏的菌種保藏的時間較長，保藏時間可長達10年以上。從凍干種中轉出來種必須進行分純，挑選出產(chǎn)肌苷最高的單菌落，再接一批于保藏斜面上培養(yǎng)，備用。
在步驟(2)中，培養(yǎng)好的保藏斜面種保藏時間最長不要超過半年，如時間太長，必須從凍干種中轉出種來。
在步驟(5)中，發(fā)酵完畢后的搖瓶發(fā)酵醪液可先分析測定肌苷含量后再提取肌苷。采用的分析方法以紙層析為準，發(fā)酵液下?lián)u瓶后，用4000r/m轉速的離心機離心10分鐘，用50ul微量進樣器點3號層析紙，硫酸銨作展開劑，展層5～10小時，烘干，用紫外分析儀照出肌苷斑點，剪下斑點，用0.001mmol/l的HCl浸泡1-4小時。用752紫外分光光度計于260nm波長處測定紫外光吸收值，計算發(fā)酵醪液含肌苷量。
本發(fā)明中用生長素代替以往肌苷發(fā)酵采用藥用酵母粉和氯化鉀作為原料，與用枯草桿菌采用藥用酵母粉等作為原料的現(xiàn)有工藝相比，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌溫度、時間較易控制，降低污染可能性，放罐發(fā)酵液粘度小，避免因消毒不徹底而增加的染菌機會(酵母粉消毒較難徹底)；且發(fā)酵液離心后，非常澄清，發(fā)酵醪液沉淀物也比用現(xiàn)有工藝進行發(fā)酵時少，這樣就有利后提取工序——離子交換工序，提高提取率產(chǎn)氨短桿菌發(fā)酵速度、長菌速度比肌苷產(chǎn)生菌枯草桿菌快，產(chǎn)苷期大為提前，在同樣實驗條件下本發(fā)明的發(fā)酵周期只要60小時左右，而現(xiàn)有工藝發(fā)酵周期要70h；本發(fā)明在最佳搖瓶發(fā)酵工藝條件下，產(chǎn)肌苷最高可達28g/l，達到現(xiàn)有工藝的最高水平；同時，因發(fā)酵原材料不用酵母粉，使發(fā)酵成本降低，其主要原材料成本比現(xiàn)有工藝下降20％左右。
實施例一利用肌苷高產(chǎn)突變株產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCCM201025做發(fā)酵菌株，以葡萄糖為原料搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)肌苷。
打開凍干管，在管內加少許無菌水，用接種針將保藏的菌種轉入活化斜面中，32℃培養(yǎng)24小時，再將活化好的斜面種轉入液體活化培養(yǎng)基中，24℃培養(yǎng)15小時，后用無菌水按一定稀釋度進行進行稀釋，涂肉湯平皿，肉湯平皿18-34℃培養(yǎng)18-30小時，挑選產(chǎn)肌苷最高的單菌落，用接種針接種于保藏斜面上培養(yǎng)。保藏斜面培養(yǎng)基的組成(g/l)蛋白胨4，牛肉膏14，酵母膏7，瓊脂20，pH7.0。)，轉接到新配置的活化斜面培養(yǎng)基上，活化斜面培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米漿6，蛋白胨1 0，酵母膏10，腺嘌呤0.025，瓊脂20，pH7.0。經(jīng)32℃恒溫培養(yǎng)20小時后，接一環(huán)于液體活化培養(yǎng)基中，液體活化培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米漿6，蛋白胨1 0，酵母膏10，腺嘌呤0.025，pH7.0。液體活化培養(yǎng)基于32℃水浴搖床(沖程70mm、轉速96r/m)振蕩培養(yǎng)15小時，這時，菌液濃度一般OD(菌液稀釋20倍，用721分光光度計650nm波長、1cm比色皿，蒸溜水作參比，測定光吸收值)達0.8以上。取1ml菌液(5％接種量)，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖120，玉米漿30，(NH4)2SO410，KH2PO43，生長素6，尿素5(分開滅菌)，CaCO320(先稱入空三角瓶中)MgSO4·7H2O1，pH7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基裝于500ml三角瓶中，裝量20ml，于76mm沖程、轉速120r/m往復式搖床振蕩培養(yǎng)，溫度控制方式如下0～12小時，32℃；12～24小時，33℃；24～36小時，34℃；36～48小時，35℃；48～61小時，36℃。待殘?zhí)窍陆抵?g/l以下時，停止發(fā)酵，這時的發(fā)酵液澄清，鏡檢菌體完整。發(fā)酵液經(jīng)離心后，取上清液，用紙層析法測定肌苷含量，其肌苷含量為25.4g/l，與國內目前采用的發(fā)酵工藝(采用藥用酵母粉)相比，發(fā)酵主要原材料成本下降20％左右。
實施例二利用肌苷高產(chǎn)突變株產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCCM201025做發(fā)酵菌株，以淀粉雙酶糖為原料搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)肌苷。
打開凍干管(方法同實施例一)，轉入保藏斜面中，保藏斜面培養(yǎng)基的組成(g/l)蛋白胨4，牛肉膏14，酵母膏7，瓊脂20，pH7.0。)，轉接到新配置的活化斜面培養(yǎng)基上，活化斜面培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米漿6，蛋白胨10，酵母膏10，腺嘌呤0.025，瓊脂200，pH7.0。經(jīng)32℃恒溫培養(yǎng)20小時后，接一環(huán)于液體活化培養(yǎng)基中，液體活化培養(yǎng)基的組成(g/l)如下淀粉雙酶糖(新酶解，折實際含糖計算)20，尿素4.0，玉米漿6，蛋白胨10，酵母膏10，腺嘌呤0.025，pH7.0。液體活化培養(yǎng)基于32℃水浴搖床(沖程70mm、轉速96r/m)振蕩培養(yǎng)15小時，這時，菌液濃度一般OD(菌液稀釋20倍，用721分光光度計650nm波長、1cm比色皿，蒸溜水作參比，測定光吸收值)達0.8以上。取1ml菌液(5％接種量)，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)如下淀粉雙酶糖(折實際含葡萄糖計算)120，玉米漿25，(NH4)2SO410，KH2PO43，生長素6，尿素5(分開滅菌)，CaCO320(先稱入空三角瓶中)MgSO4·7H2O1，pH7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基裝于500ml三角瓶中，裝量20ml，于76mm沖程、轉速120r/m往復式搖床振蕩培養(yǎng)，溫度控制方式如下0～12小時，32℃；12～24小時，33℃；24～36小時，34℃；36～48小時，35℃；48～56小時，36℃，待殘?zhí)窍陆抵?.5g/l以下時，停止發(fā)酵。下?lián)u瓶時，放瓶發(fā)酵液澄清，鏡檢菌體完整，發(fā)酵液經(jīng)離心后，取上清液，用紙層析法測定其肌苷含量，產(chǎn)肌苷27.6g/l，與國內目前采用的發(fā)酵工藝(采用藥用酵母粉)相比，發(fā)酵主要原材料成本下降24％左右。
實施例三利用肌苷高產(chǎn)突變株產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCCM201025做發(fā)酵菌株，以甘蔗糖蜜為原料搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)肌苷。
打開凍干管(方法同實施例一)，轉入保藏斜面中，保藏斜面培養(yǎng)基的組成(g/l)蛋白胨4，牛肉膏14，酵母膏7，瓊脂20，pH7.0。)，轉接到新配置的活化斜面培養(yǎng)基上，活化斜面培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米漿6，蛋白胨10，酵母膏10，腺嘌呤0.025，瓊脂20，pH7.0。經(jīng)32℃恒溫培養(yǎng)20小時后，接一環(huán)于液體活化培養(yǎng)基中，液體活化培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米漿6，蛋白胨10，酵母膏10，腺嘌呤0.025，pH7.0。液體活化培養(yǎng)基于32℃水浴搖床(沖程70mm、轉速96r/m)振蕩培養(yǎng)15小時，這時，菌液濃度一般OD(菌液稀釋20倍，用721分光光度計650nm波長、1cm比色皿，蒸溜水作參比，測定光吸收值)達0.8以上。取1ml菌液(5％接種量)，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)如下甘蔗糖蜜(折實際含糖計算)120，玉米漿20，(NH4)2SO410，KH2PO43，生長素4，尿素5(分開滅菌)，CaCO320(先稱入空三角瓶中)MgSO4·7H2O1，pH7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基裝于500ml三角瓶中，裝量20ml，于76mm沖程、轉速120r/m往復式搖床振蕩培養(yǎng)，溫度控制方式如下0～12小時，32℃；12～24小時，33℃；24～36小時，34℃；36～48小時，35℃；48～72小時，36℃，待殘?zhí)窍陆抵?g/l以下時，停止發(fā)酵。下?lián)u瓶時，放瓶發(fā)酵液較澄清，鏡檢菌體完整，發(fā)酵液經(jīng)離心后，取上清液，用紙層析法測定其肌苷含量，產(chǎn)肌苷18.7g/l，與國內目前采用的發(fā)酵工藝(采用藥用酵母粉)相比，發(fā)酵主要原材料成本下降17％左右。
權利要求
1.一種新型肌苷產(chǎn)生菌，其特征在于該菌株是經(jīng)選育的肌苷高產(chǎn)突變株產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCC M201025。
2.一種肌苷生產(chǎn)方法，其特征在于用肌苷高產(chǎn)突變株產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)GMA-1198 CCTCC M201025做發(fā)酵菌株，利用糖質原料和生長素進行搖瓶發(fā)酵。
3.根據(jù)權利要求2所述的肌苷生產(chǎn)方法，其特征在于所說的糖質原料為為葡萄糖或(和)用糖化酶和α-淀粉酶水解的淀粉雙酶水解糖或(和)糖蜜。
4.根據(jù)權利要求2所述的肌苷生產(chǎn)方法，其特征在于所說的生長素為谷氨酸鈉加次黃嘌呤，其組分為(重量百分比)谷氨酸鈉80～90％，次黃嘌呤10～20％。
5.根據(jù)權利要求2所述的肌苷生產(chǎn)方法，其特征在于所說的生長素為味精母液或谷氨酸發(fā)酵液經(jīng)硫酸或鹽酸冷凍、等電點提取后的高峰液再添加次黃嘌呤，生長素(100％)＝80～90％谷氨酸鈉+10～20％次黃嘌呤[(均折實際含量(重量)]。
6.根據(jù)權利要求2所述的肌苷生產(chǎn)方法，其特征在于所說的搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的工藝過程為(1)化凍干保藏種(GMA-1198 CCTCC M201025)打開凍干管，用常規(guī)方法挑選產(chǎn)肌苷最高的單菌落，用接種針接種于保藏斜面上培養(yǎng)；(2)斜面菌種活化將培養(yǎng)好的保藏斜面種(GMA-1198 CCTCC M201025)劃線于新配制的活化斜面上進行活化；(3)菌種的液體活化將培養(yǎng)好的活化斜面種接一環(huán)于液體活化培養(yǎng)基中進行液體活化，使液體種的菌數(shù)達到2.0×1010個/ml以上；(4)搖瓶發(fā)酵按5～10％(V/V)接種量，接入含糖質原料和生長素的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，待殘?zhí)窍陆抵?g/l以下時，停止發(fā)酵；(5)發(fā)酵完畢的搖瓶發(fā)酵醪液經(jīng)提取工藝(可采用一般傳統(tǒng)的提取工藝)即得含肌苷的制品。
7.根據(jù)權利要求6所述的肌苷生產(chǎn)方法，其特征是在在步驟(4)中，適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基成份如下(按每升培養(yǎng)基所含克重g/l計算)總還原糖100～140，玉米漿10～50，硫酸銨5～15，生長素2～10，磷酸二氫鉀1～5，碳酸鈣10～40，尿素2～8，硫酸鎂0.5～2，pH6.5～7.5，其中碳酸鈣單獨稱入三角瓶中，尿素分開滅菌。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型肌苷產(chǎn)生菌及其生產(chǎn)肌苷的方法，該新型肌苷產(chǎn)生菌為經(jīng)選育的肌苷高產(chǎn)突變株產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA－1198 CCTCCM201025。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)肌苷的方法，其特點是用GMA－1198 CCTCC M201025做發(fā)酵菌株，利用糖質原料和生長素進行搖瓶發(fā)酵。本發(fā)明發(fā)酵成本低、肌苷提取率高，產(chǎn)肌苷最高可達28g/l，達到現(xiàn)有工藝的最高水平。
文檔編號C12P19/40GK1410527SQ0112788
公開日2003年4月16日 申請日期2001年9月25日 優(yōu)先權日2001年9月25日
發(fā)明者施慶珊, 邱玉棠, 李良秋, 林小平 申請人:廣東省微生物研究所