專利名稱：快速檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對蝦養(yǎng)殖中傳染性皮下及造血組織壞死病毒的檢測裝置。
對蝦養(yǎng)殖業(yè)是我國海水養(yǎng)殖的支柱性產(chǎn)業(yè)，也是亞洲和美洲許多發(fā)展中國家的支柱性海洋產(chǎn)業(yè)。近幾年來，我國加強了對蝦病害防治和養(yǎng)殖高新技術(shù)的研究與應(yīng)用，同時也積極引進原產(chǎn)于南美洲的凡納對蝦(Litopenaeus vannamei，俗稱南美白對蝦)和細(xì)角對蝦(Litopenaeus stylirostris，俗稱藍(lán)對蝦)等新的蝦種進行養(yǎng)殖，特別是我國華南地區(qū)采用高位池和過濾海水防病養(yǎng)蝦系統(tǒng)等高新技術(shù)進行凡納對蝦和斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖取得了顯著的成功，促進了我國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量的迅速回升。但由于在凡納對蝦和細(xì)角對蝦親蝦和幼體的引進過程中，危害嚴(yán)重的各種對蝦病毒也隨之帶入我國對蝦養(yǎng)殖地區(qū)。傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus，簡寫IHHNV)，又稱畸形綜合癥病毒(Runt-deformity syndrome virus)，可造成對蝦幼體和仔蝦高達(dá)80％的累積死亡率，存活的個體頭部畸形，體小，對對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量造成很大影響。由于該病毒粒子微小(直徑17-26nm)，即使用透射電鏡也很難發(fā)現(xiàn)。因此，找出傳染性皮下及造血組織壞死病毒的快速檢測方法能有效控制該病毒的流行。
目前，世界上主要有三種方法檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒1.電鏡法，該法檢測儀器昂貴，樣品預(yù)處理復(fù)雜，靈敏度低，不適合現(xiàn)場測定；2.基因探針法，價格高，操作復(fù)雜；3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法，國外產(chǎn)品價格很高，不適合我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)戶。
本發(fā)明的目的是提供一種對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒檢測試劑盒，以便可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地判斷各種對蝦苗種、幼蝦、成蝦及親蝦是否攜帶傳染性皮下及造血組織壞死病毒。
本發(fā)明的試劑盒主要由以下幾種試劑配方組成試劑A組織裂解液；試劑BDNA提取液；試劑CPCR反應(yīng)液，其中含有特定引物IHHNV-5’和IHHNV-3’，其序列分別為5’-TCATCCCGACGACGAAGAA和5’-GGTTGTCTCCTCCGCTTGTC。
試劑C中所含的特定引物IHHNV-5’和IHHNV-3’，應(yīng)有足夠的含量，一般每種的含量應(yīng)不少于8pm。
本發(fā)明所提供的對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒檢測試劑盒的使用方法如下一、傳染性皮下及造血組織壞死病毒DNA的提取1.取待檢樣品組織25-30mg，于1.5ml離心管中，加200ul TE緩沖液，搗爛。
2.200ul樣品中加入400ul溶液A，混勻后，加入3ul蛋白酶K，置于55℃水浴5-10分鐘，裂解過程中上下混勻幾次。降解完全的樣品應(yīng)為半透明粘稠液體，否則應(yīng)繼續(xù)保溫處理。
3.加入600ul氯仿，輕輕混勻，以保證DNA的完整性。
4.用臺式離心機10000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取500ul上清液，置于1.5ml離心管中。
5.加入500ul溶液B，混勻，室溫放置2分鐘。10000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。
6.吸去上清液，加入100ul 1.2M NaCl，輕輕搖動混勻直至DNA樣品完全溶解。加入3ul核糖核酸A，混勻，置于55℃水浴5-10分鐘。
7.加入300ul冷乙醇，-20℃放置10分鐘。10000轉(zhuǎn)/分離心3-4分鐘。倒掉乙醇，用70％乙醇洗一次。倒置于干凈的濾紙上，室溫干燥。
8.待檢樣品DNA用50ul水溶解。
二、PCR反應(yīng)在取1-2ul待檢樣品DNA加入反應(yīng)管C中，混勻后在PCR儀中進行以下反應(yīng)94℃ 2分鐘 72℃ 5分鐘15℃ 停止反應(yīng)結(jié)束后取5-10ul加4ul溴酚藍(lán)混勻后進行2％瓊脂糖凝膠電泳，確定擴增產(chǎn)物。如出現(xiàn)約540bp的反應(yīng)產(chǎn)物，說明待檢樣品攜帶傳染性皮下及造血組織壞死病毒。
使用本發(fā)明的試劑盒，經(jīng)實際試驗，證明可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地判斷各種對蝦苗種、幼蝦、成蝦及親蝦是否攜帶傳染性皮下及造血組織壞死病毒。
實施例凡納對蝦和細(xì)角對蝦幼苗用對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒檢測試劑盒檢測。試劑盒組成為試劑A組織裂解液。其組成為0.5％SDS，0.25M EDTA；試劑BDNA提取液。其組成為氯仿∶1.2M氯酸鈉＝6∶1；試劑CPCR反應(yīng)液，每管組成為2mM MgCl2，2.5ul 10X PCR緩沖液，17.2ul ddH2O，4ul 10mMdNTP，1u Taq，10pm IHHNV-5’，10pm IHHNV-3’。
按本發(fā)明所提供的對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒檢測試劑盒的使用方法，提取傳染性皮下及造血組織壞死病毒DNA，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取5-10ul加4ul溴酚藍(lán)混勻后進行2％瓊脂糖凝膠電泳，即可發(fā)現(xiàn)幼苗是否攜帶有傳染性皮下及造血組織壞死病毒。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒試劑盒，其特征在于該試劑盒由以下試劑組成試劑A組織裂解液；試劑BDNA提取液；試劑CPCR反應(yīng)液，其中含有特定引物IHHNV-5’和IHHNV-3’，其序列分別為5’-TCATCCCGACGACGAAGAA和5’-GGTTGTCTCCTCCGCTTGTC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所說的試劑CPCR反應(yīng)液，每管組成為2mM MgCl2，2.5ul 10X PCR緩沖液，17.2ul ddH2O，4ul 10mMdNTP，1u Taq，1 0pm IHHNV-5’，10pm IHHNV-3’。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒檢測試劑盒，該試劑盒主要由以下幾種試劑配方組成試劑A組織裂解液；試劑BDNA提取液；試劑CPCR反應(yīng)液，其中含有特定引物IHHNV－5’5’－TCATCCCGACGACGAAGAA和IHHNV－3’5’－GGTTGTCTCCTCCGCTTGTC。使用本發(fā)明的試劑盒，經(jīng)實際試驗，證明可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地判斷各種對蝦苗種、幼蝦、成蝦及親蝦是否攜帶傳染性皮下及造血組織壞死病毒。
文檔編號C12Q1/70GK1410549SQ0112787
公開日2003年4月16日 申請日期2001年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月21日
發(fā)明者胡超群, 沈琪, 任春華, 張呂平 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所