一種奧古狐尾藻組織培養(yǎng)與快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及沉水植物奧古狐尾藻的組培和快速 繁殖方法，該方法是利用完全無菌和嚴(yán)格的控溫措施，實(shí)現(xiàn)了沉水植物在實(shí)驗(yàn)室大量生產(chǎn)， 并可以推廣到生態(tài)環(huán)境修復(fù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 奧古狐尾藻屬于被子植物門（Angiospermae)雙子葉植物綱（Dicotyledoneae)小 二仙草科（Haloragidaceae)。目前湖泊生態(tài)修復(fù)工程中作為凈水工具種和植被恢復(fù)先鋒物 種、魚蝦蟹塘養(yǎng)殖過程中作為餌料、避難和產(chǎn)卵場(chǎng)所，以及室內(nèi)觀賞水族養(yǎng)殖過程中作為布 景材料的迫切需要。運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)，獲得并大規(guī)模擴(kuò)繁其優(yōu)質(zhì)工程苗，以克服該物種在 自然環(huán)境中種源有限且污染嚴(yán)重的問題。
[0003] 目前關(guān)于狐尾藻組織培養(yǎng)的報(bào)道比較多，但是除了穗花狐尾藻外都沒有具體落實(shí) 到是何種狐尾藻。而且關(guān)于奧古狐尾藻的生理生化，以及生態(tài)學(xué)方面的報(bào)道都非常稀少。雖 然它有狐尾藻屬的共同特性，但是其自身的特點(diǎn)也導(dǎo)致組培的方式和條件有變化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種奧古狐尾藻組織培養(yǎng)與快速繁殖方法。該方法是在無菌條件 下，采取控溫措施，給予固定光照，培養(yǎng)無菌苗體系，可常年提供大量無菌幼苗。方法易行， 操作方便，產(chǎn)量高。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0006] -種奧古狐尾藻組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其步驟是：
[0007] A、外植體選擇與預(yù)處理：選擇生長(zhǎng)健壯，顏色鮮綠，無病蟲害的莖段作為外植體， 用堿性洗滌劑浸泡30min，再在自來水下沖洗2h，用蒸餾水反復(fù)沖洗4-5次，用無菌水再反 復(fù)清洗4-5次，置于無菌操作臺(tái)。
[0008] B、外植體滅菌：在無菌操作臺(tái)上首先用70% (體積比）乙醇浸泡15s，用無菌水沖 洗4-5次，再用0.1% (質(zhì)量體積比）氯化汞進(jìn)行表面消毒2-5min，無菌水沖洗4-5次，放 入0.15% (質(zhì)量體積比）的無菌檸檬酸溶液中切割，在無菌濾紙上將水吸干，待用。
[0009] C、愈傷組織和芽誘導(dǎo)：將0. 5_2cm的去除葉片的步驟B中的奧古狐尾藻外植體接 入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織和幼芽。
[0010] 所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS固體培養(yǎng)基 +6BA0. 50-2. 00mg/L+NAA0. 25-0. 50mg/L+ 蔗糖3% (質(zhì)量體積比），pH5. 8-6. 0。
[0011] D、增殖培養(yǎng)：可繼續(xù)使用步驟C的培養(yǎng)基，用于增殖培養(yǎng)。也可待幼芽生長(zhǎng)到 I. 5-2cm，更換增殖培養(yǎng)基，進(jìn)一步擴(kuò)大繁殖，形成幼苗。
[0012] 所述的增殖培養(yǎng)基為：1/2MS液體培養(yǎng)基+6BA0? 50-2. 00mg/L+NAA 0.25-0.5011^/1+蔗糖1.5%，？115.8-6.0。
[0013] 每隔20-25d繼代一次，形成的幼苗，切成0. 5-2. 0cm，轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基或增殖培養(yǎng) 基，在與步驟D相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，擴(kuò)繁植株；
[0014] E、生根：愈傷組織不斷生長(zhǎng)，幼苗生長(zhǎng)到4-6cm左右，可以不更換培養(yǎng)基繼續(xù)在步 驟C的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出根，也可以更換為生根培養(yǎng)基，不僅可促進(jìn)其生根，也可加速生長(zhǎng)。
[0015] 所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS液體培養(yǎng)基+NAA0. 10mg/L+蔗糖1. 5%，pH 5. 8-6. 0。F、煉苗和移栽：待不定根長(zhǎng)至2.Ocm以上時(shí)，打開瓶蓋，室溫下煉苗l-2d后，取出 試管苗，洗凈其根部培養(yǎng)基，移栽至室外水體中。
[0016] 以上步驟C，D，E均為無菌環(huán)境，光照40-60yEAm2 ?s)，光照周期為12h/d，室內(nèi) 溫度 25±2°C。
[0017] 優(yōu)選的，步驟B中氯化采的消毒時(shí)間為2分鐘；步驟C和D中，6BA的濃度為 0? 50mg/L，NAA的濃度為 0? 25mg/L。
[0018] MS培養(yǎng)基配方如下：?jiǎn)挝籱g/L
[0019] KNO3 1900
[0020] NH4NO3 1650
[0021] MgSO4 ? 7H20 370
[0022] KH2PO4 170
[0023] CaCl2 ? 2H20 440
[0024] MnSO4 ? 4H20 22. 3
[0025] ZnSO4 ? 7H20 8. 6
[0026] H3BO3 6. 2
[0027] KI 0. 83
[0028] Na2MoO4 ? 7H20 0. 25
[0029] CuSO4 ? 5H20 0. 025
[0030] CoCl2 ? 6H20 0. 025
[0031] Na2-EDTA37. 3
[0032] FeSO4 ? 7H20 27. 8
[0033] 甘氨酸 2. 0
[0034] 鹽酸吡哆醇 0? 5
[0035] 鹽酸硫銨素 0. 1
[0036] 煙酸 0? 5
[0037] 肌酸 100
[0038] MS固體培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加7g/L的瓊脂，pH5. 8-6. 0。
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0040] 本發(fā)明提供的奧古狐尾藻組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，可在短期提供大量的幼苗， 為進(jìn)一步對(duì)奧古狐尾藻的生理生化特征的研宄提供源源不斷的資源。通過愈傷組織的傳代 更易于保存和維持種植資源的質(zhì)量。一個(gè)長(zhǎng)Icm的莖段經(jīng)過一周的培養(yǎng)，能行成一塊面積 為0. 25cm2的愈傷組織，再經(jīng)三周的培養(yǎng)可獲得6-8個(gè)幼苗，每個(gè)幼苗長(zhǎng)5-8cm，增殖倍數(shù)達(dá) 到6-8倍，一年一個(gè)芽可繁殖數(shù)億棵以上幼苗。以一個(gè)芽20d繼代一次，每次的增殖倍數(shù)為 8計(jì)算。
[0041]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種奧古狐尾藻組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其步驟是： A、 外植體選擇與預(yù)處理：選擇生長(zhǎng)健壯，顏色鮮綠，無病蟲害的莖段作為外植體，用堿 性洗滌劑浸泡30min，再在自來水下沖洗2h，用蒸餾水反復(fù)沖洗4-5次，用無菌水再反復(fù)清 洗4-5次，置于無菌操作臺(tái)； B、 外植體滅菌：在無菌操作臺(tái)上首先用70%體積比乙醇浸泡15s，用無菌水沖洗4-5 次，再用0. 1%質(zhì)量體積比氯化汞進(jìn)行表面消毒2-5min，無菌水沖洗4-5次，放入0. 15%質(zhì)量 體積比的無菌檸檬酸溶液中切割，在無菌濾紙上將水吸干，待用； C、 愈傷組織和芽誘導(dǎo)：將0. 5-2cm的去除葉片的步驟B中的奧古狐尾藻外植體接入誘 導(dǎo)培養(yǎng)基中，于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織和幼芽； 所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS固體培養(yǎng)基+6BA 0. 50-2. 00mg/L+NAA 0. 25-0. 50mg/L+蔗糖 3%質(zhì)量體積比，pH 5.8-6. 0 ; D、 增殖培養(yǎng)：可繼續(xù)使用步驟C的培養(yǎng)基，用于增殖培養(yǎng)；也可待幼芽生長(zhǎng)到 I. 5-2cm，更換增殖培養(yǎng)基，進(jìn)一步擴(kuò)大繁殖，形成幼苗； 所述的增殖培養(yǎng)基為：1/2MS液體培養(yǎng)基+ 6BA 0. 50-2. 00mg/L+NAA 0. 25-0. 50mg/L+ 蔗糖 I. 5%，pH 5· 8-6. 0 ; 每隔20-25d繼代一次，形成的幼苗，切成0. 5-2. 0cm，轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基或增殖培養(yǎng)基， 在與步驟D相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，擴(kuò)繁植株； E、 生根：愈傷組織不斷生長(zhǎng)，幼苗生長(zhǎng)到4-6cm左右，可以不更換培養(yǎng)基繼續(xù)在步驟C 的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出根，也可以更換為生根培養(yǎng)基； 所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS液體培養(yǎng)基+NAA 0. 10mg/L +蔗糖1. 5%，pH 5. 8-6. 0 ; F、 煉苗和移栽：待不定根長(zhǎng)至2. Ocm以上時(shí)，打開瓶蓋，室溫下煉苗l-2d后，取出試管 苗，洗凈其根部培養(yǎng)基，移栽至室外水體中； 以上步驟C，D，E均為無菌環(huán)境，光照40-60 μ E/ (m2 · s)，光照周期為12h/d，室內(nèi)溫度 25±2°C。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟B中氯化汞的消毒時(shí)間為2min ;步驟 C和D中，6BA的濃度為0· 50mg/L，NAA的濃度為0· 25mg/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種奧古狐尾藻組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其步驟是：A.外植體選擇：選擇生長(zhǎng)健壯，顏色鮮綠，無病蟲害的植物莖作為外植體。B.外植體滅菌：用酒精和氯化汞處理外植體。C.芽誘導(dǎo)：選擇最佳的激素配比誘導(dǎo)芽生長(zhǎng)。D.增殖培養(yǎng)：調(diào)整激素配比和培養(yǎng)基濃度進(jìn)行增殖培養(yǎng)。E.生根：選擇合適的細(xì)胞生長(zhǎng)素進(jìn)行生根誘導(dǎo)。F.煉苗和移栽：在培養(yǎng)箱中打開瓶口培養(yǎng)兩天，在轉(zhuǎn)入自然水體中培養(yǎng)。該技術(shù)可以不受季節(jié)和環(huán)境限制，培養(yǎng)出大量無菌苗，供水生生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)之用。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號(hào)】CN104604693
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510076490
【發(fā)明人】李濤, 李琪, 任明磊, 母丹丹, 趙進(jìn)東
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院水生生物研究所
【公開日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日