專利名稱：改良大豆品種的外源dna直接導(dǎo)入大豆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物品種改良的生物技術(shù)。
現(xiàn)有植物品種改良一般有兩種方法，一是有性雜交法，這種方法存在以下不足(1)只能在品種間進(jìn)行，因而易造成遺傳基礎(chǔ)越來(lái)越狹窄。而遠(yuǎn)緣、超遠(yuǎn)緣，甚至不同科屬間的有性雜交就很難成功。(2)雜交是整套染色體的重排，因而引起變異分離的幅度較大，大豆野生種和栽培種雜交雖可以成功，但其雜種后代分離較大，野生性難以改造，應(yīng)用效率極低。二是基因工程技術(shù)，基因工程技術(shù)也稱DNA體外重組技術(shù)。該方法目的性很強(qiáng)，但也存在如下缺點(diǎn)和不足(1)要求的技術(shù)難度大。(2)轉(zhuǎn)移條件必須是細(xì)胞或組織，因而還要經(jīng)歷再生這一關(guān)。(3)在達(dá)到獲得種子這一步前要經(jīng)歷許多步驟，因此達(dá)到最終轉(zhuǎn)化難度較大，特別是穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化后代更要難些。(4)目的基因獲得也受到一定的限制。轉(zhuǎn)移后還存在安全性問(wèn)題。(5)投入較多，一般實(shí)驗(yàn)室難以達(dá)到。
本發(fā)明的目的是研制一種改良大豆品種的外源DNA直接導(dǎo)入大豆的方法，該方法易能打破物種界限和某些基因連鎖，擴(kuò)大基因源，豐富遺傳基礎(chǔ)。該方法還可越過(guò)細(xì)胞或組織器官等的植株再生障礙和復(fù)雜過(guò)程，當(dāng)年就應(yīng)獲得改良后大豆的種子。該方法獲得的大豆后代應(yīng)具有穩(wěn)定、育種周期短、成本低的特點(diǎn)。
本發(fā)明的方法由以下步驟實(shí)現(xiàn)第一步采用大豆DNA快速提取方法(即氯仿——異戊醇——核糖核酸酶法)，但由于大豆不同于禾本科作物，其蛋白質(zhì)等物質(zhì)含量較高，本發(fā)明的DNA粗提離心次數(shù)二次，DNA純化為3～4次，DNA沉淀時(shí)加入乙醇的體積是DNA的三倍。乙醇濃度采用無(wú)水乙醇。使大豆DNA提取的純度達(dá)到A260/230≥2,A260/280≥1.8；片段大小為50kb的標(biāo)準(zhǔn)。第二步在常溫、常濕度下，在上午7時(shí)～8時(shí)觀察大豆植株，當(dāng)大豆花冠高于最高花萼0.5～1mm時(shí)，于當(dāng)日下午2時(shí)至次日下午5時(shí)內(nèi)進(jìn)行操作。采用切柱頭滴提取后的DNA于切口處，導(dǎo)入濃度為500Mg/ml。三天后和結(jié)莢期內(nèi)進(jìn)行成活率調(diào)查和多次檢查。
本發(fā)明導(dǎo)入的是總DNA的部分片段，可以打破物種界限和某些基因連鎖，擴(kuò)大基因源，豐富遺傳基礎(chǔ)。導(dǎo)入是在完成受精的整株水平上進(jìn)行的，轉(zhuǎn)化的是不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞，因而當(dāng)年即可獲得種子，還可越過(guò)細(xì)胞或組織器官等的植株再生障礙和復(fù)雜過(guò)程。導(dǎo)入整合的是極少部分DNA片段，因此后代穩(wěn)定快，比有性雜交可節(jié)約一半的時(shí)間，使育種周期大大縮短，也降低了育種成本。并且不存在基因工程的安全性問(wèn)題。操作簡(jiǎn)便、所需儀器藥品投入少，比基因工程更易于被育種者所接受。利用該方法對(duì)實(shí)現(xiàn)大豆品種的熟期、蛋白質(zhì)含量、大粒型等特性轉(zhuǎn)化效果十分明顯。如用該生物技術(shù)轉(zhuǎn)化改良成功的大豆品種“黑生101”，受體蛋白質(zhì)含量平均為43.68％，供體蛋白質(zhì)含量為51.01％，后代黑生101蛋白質(zhì)含量平均為45.44％(脂肪17.87％)，最高年份可達(dá)47.58％，平均比受體提高2個(gè)百分點(diǎn)，比標(biāo)準(zhǔn)品種高5個(gè)百分點(diǎn)，蛋白質(zhì)和脂肪含量的總和也比受體高近2個(gè)百分點(diǎn)(受體為61.95％)。與大豆品質(zhì)相關(guān)的球蛋白總量比受體高近10個(gè)百分點(diǎn)，其中與大豆加工品質(zhì)和產(chǎn)率相關(guān)的IIS球蛋白所占比例高達(dá)72.9％，是大豆屬中罕見(jiàn)的，也是受體所不及的。用本方法獲得的大豆品種還具有高產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，異地鑒定產(chǎn)量平均為2595公斤/公頃，比標(biāo)準(zhǔn)品種(豐收22)增產(chǎn)11.3％，比受體增產(chǎn)46.8％。全省區(qū)域試驗(yàn)平均為2224.3公斤/公頃，比標(biāo)準(zhǔn)品種增產(chǎn)9.2％。全省生產(chǎn)試驗(yàn)為2198.9公斤/公頃，比標(biāo)準(zhǔn)品種增產(chǎn)9.8％?？鼓嫘詮?qiáng)，耐旱，耐輕堿，抗病性能好，田間鑒定抗灰斑病。該大豆品和主要農(nóng)藝性狀為亞有限結(jié)莢習(xí)性，生育日數(shù)118天，需有效活動(dòng)積溫2362.5℃。株高80cm左右，桿強(qiáng)不倒，主莖型有分枝，平均1個(gè)。單株莢數(shù)多，平均33.3個(gè)，四粒莢多。株型收斂葉片較小而尖，為長(zhǎng)葉型，葉色濃綠，葉肉較厚。通風(fēng)透光性好，白花，灰色茸毛。籽粒圓形，種皮黃色光澤，臍無(wú)色或極淡。粒大小中等，百粒重18～20克。該轉(zhuǎn)化的大豆品種“黑生101”經(jīng)RAPD分子驗(yàn)證，在DNA分子水平上已找到轉(zhuǎn)化證據(jù)。
實(shí)施例第一步進(jìn)行總DNA的提取。一、進(jìn)行提取液的配制。二、進(jìn)行粗制品DNA的制備，粗制品DNA的制備過(guò)程如下1、將大豆芽進(jìn)行研磨、離心處理。2、滅治DNA酶。3、加提取液、再離心處理。4、進(jìn)行兩次乙醇沉淀、離心，DNA沉淀時(shí)加入乙醇的體積是DNA的三倍。三、純化DNA的制備1、去除RNA，2、加提取液、離心，3、進(jìn)行二～三次乙醇沉淀、離心。沉淀時(shí)加入乙醇的體積是DNA溶液的三倍。四、DNA的檢測(cè)1、采用瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)其純度和片段大小，2、采用紫外線檢測(cè)其純度和濃度。當(dāng)純度達(dá)到A260/230≥2,A260/280≥1.8；片斷大小為50kb；濃度為500Mg/ml方為合格。第二步進(jìn)行導(dǎo)入。1、在上午7時(shí)～8時(shí)觀察大豆植株，當(dāng)大豆花冠高于最高花萼0.5～1mm寸，于當(dāng)日下午2時(shí)～5時(shí)進(jìn)行導(dǎo)入操作。此時(shí)田間平均氣溫要大于18℃以上，濕度在78％左右為宜。導(dǎo)入方法是切柱頭，將提取后的DNA滴于切口處，可重復(fù)滴注一次。作好標(biāo)記，三天后作成活率調(diào)查。
權(quán)利要求
1.改良大豆品種的外源DNA直接導(dǎo)入大豆的方法，第一步采用大豆DNA快速提取法，其特征在于第二步，在常溫、常濕度下，在上午7時(shí)～8時(shí)觀察大豆植株，當(dāng)大豆花冠高于最高花萼0.5-1mm時(shí)，于當(dāng)日下午2時(shí)至次日下午5時(shí)內(nèi)進(jìn)行操作，采用切柱頭滴提取后的DNA于切口處，滴注的DNA的純度為A260/230≥2,A260/280≥1.8；片段大小為50kb；導(dǎo)入濃度為500Mg/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良大豆品種的外源DNA直接導(dǎo)入大豆的方法，其特征在于大豆DNA粗提取方法采用二次離心，3～4次純化，DNA沉定時(shí)加入乙醇的體積是DNA的三倍，采用的乙醇濃度為無(wú)水乙醇。
全文摘要
改良大豆品種的外源DNA直接導(dǎo)入大豆的方法,第一步采用大豆DNA快速提取法,第二步在常溫、常濕度下,在上午7時(shí)～8時(shí)觀察,當(dāng)大豆花冠高于最高花萼0.5～1mm時(shí),在當(dāng)日下午2時(shí)至次日下午5時(shí)內(nèi)采用切柱頭滴提取后的DNA于切口處,滴注的DNA的純度為A260/230≥2,A260/280≥1.8;片段大小為50kb;導(dǎo)入濃度為500μg/ml。該方法當(dāng)年就能獲得改良后的大豆種子。不存在基因工程的安全性問(wèn)題。獲得的大豆后代具有穩(wěn)定、育種周期短、成本低、高產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)RAPD分子驗(yàn)證證明是遺傳轉(zhuǎn)化的品種。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1214855SQ9812150
公開(kāi)日1999年4月28日 申請(qǐng)日期1998年10月6日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月6日
發(fā)明者雷勃鈞 申請(qǐng)人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心