專利名稱：一種輔助篩選高油大豆品種的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中一種輔助篩選高油大豆品種的方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
大豆的大部分農(nóng)藝性狀是由多基因或QTL控制的數(shù)量性狀，在這樣一個多基因體系中，每個基因?qū)δ繕?biāo)性狀只表現(xiàn)微效作用，沒有明顯的顯性，而且表現(xiàn)型受環(huán)境條件影響很大。因而采用傳統(tǒng)的育種途徑對這些性狀進(jìn)行選擇有很大的難度。分子標(biāo)記輔助選擇為數(shù)量性狀的改良提供了新的研究思路。Paterson等(Paterson A H，Landon E S，Hewitt J D，et al.Resolution of quantitativeinto Mendelian factors by using acomplete RFLP linkage map.Nature，1988，335721-726)認(rèn)為高密度分子遺傳圖譜的建立，使覆蓋全基因組的分子標(biāo)記將控制數(shù)量性狀的微效多基因分解成孟德爾遺傳因子，并定位到分子標(biāo)記所在的染色體上，進(jìn)而按照經(jīng)典遺傳模式進(jìn)行研究。這就使得利用與QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記對這些QTL進(jìn)行轉(zhuǎn)移以達(dá)到對這些數(shù)量性狀的改良成為可能。
微衛(wèi)星是以少數(shù)幾個核苷酸為核心單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，是一種簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats，SSR)，兩側(cè)一般是保守序列。由于它具有多態(tài)性高、共顯性、容易用PCR檢測和結(jié)果穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)，因此是一種十分理想的分子標(biāo)記。
油分是大豆重要的品質(zhì)性狀和數(shù)量性狀，利用分子標(biāo)記技術(shù)尋找與高油基因連鎖的分子標(biāo)記一直是大豆數(shù)量性狀定位研究中的重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助篩選高油大豆品種的方法及其專用引物。
本發(fā)明所提供的用于輔助篩選高油大豆品種的引物，名稱為Satt160，由正向引物和反向引物組成，所述正向引物具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述反向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列。
本發(fā)明所提供的輔助篩選高油大豆品種的方法，是以待測大豆的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測大豆得到450-500bp的DNA片段，則該待測大豆為候選高油大豆品種。
實(shí)驗(yàn)證明，以24個大豆品種品系的總DNA為模板，以用Satt160引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的帶型與高油親本黑農(nóng)45的帶型的符合率為83.33％。說明Satt160引物可用于高油大豆的輔助選擇。本發(fā)明的輔助篩選高油大豆品種的方法將在高油大豆的育種中發(fā)揮重要作用，為選育高油大豆提供了一種快捷的選擇方法。


圖1為部分SSR引物多態(tài)性篩選結(jié)果圖2為satt160引物在120個單株中的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖3為6個連鎖群的分子遺傳圖譜圖4為satt160引物在24個大豆品種品系及親本中的PCR擴(kuò)增結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的大豆品種品系均可從商業(yè)途徑獲得。
實(shí)施例1、與大豆高油基因連鎖的分子標(biāo)記的獲得1、多態(tài)性SSR引物的篩選以高蛋白大豆品系哈交99-5448-4為父本和高油大豆品種黑農(nóng)45作為母本，配制雜交組合。雜種F1代種子溫室種植。F2代種子在實(shí)驗(yàn)田種植，小區(qū)行長3米，株距10厘米，獲得F2:3家系，共120個單株，作為供試分離群體。通過田間鑒定和室內(nèi)鑒定對親本和群體農(nóng)藝性狀進(jìn)行考察。
參照Cregan(Cregan P B，Jarvik T.An integrated genetic linkage map ofthe soybean genome.Crop Sci，1999，35(5)1464-1490)的“大豆公共圖譜”選擇SSR引物，選擇的標(biāo)準(zhǔn)之一是座位分布均勻，二是基因多樣性程度高。選擇基本覆蓋大豆全基因組的239對SSR引物(見表1)SSR引物的序列在大豆數(shù)據(jù)庫SoyBase中獲得，網(wǎng)站地址是http//www.soybase.com/。
表1 本實(shí)驗(yàn)所使用的239對SSR引物


分別從供試分離群體中的120株供試單株、兩個親本植株哈交99-5448-4和黑農(nóng)45上取大小約為2cm2的嫩綠葉片，置于1.5ml離心管中，向離心管中加入少量液氮，用玻璃棒或不銹鋼錐子將凍干的葉片迅速搗碎(無液氮時可直接用玻璃棒將葉片搗碎)，備用。DNA提取采用SDS法(關(guān)榮霞，常汝鎮(zhèn)，邱麗娟.用于SSR分析的大豆DNA的快速提取.大豆科學(xué)，2003，21(1)73-74)。在上述裝有備用材料的1.5ml離心管中加入400μl預(yù)熱的SDS提取液(含100mmol/L Tris-HCl pH8.5，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，2％SDS)，65℃水浴30min，冷卻后加入等體積酚/氯仿(1∶1)，充分混勻，靜置10min，1000rpm離心5min，取上清液于另一新離心管中，加入2倍體積無水乙醇6000rpm離心2min，棄上清，用70％乙醇洗DNA沉淀一次，風(fēng)干，加300μl超純水溶解。
PCR反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀ABI-9700上進(jìn)行。20ul反應(yīng)體系中含有50-100ng基因組DNA模板，1×PCR緩沖液、1.25mM MgCl2、0.2mM dNTP、0.2μM SSR引物和1U Tag DNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)橄?5℃4min預(yù)變性；再95℃ 30s，47℃ 30s，72℃ 30s，35個循環(huán)。72℃ 10min后，于4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用測序膠(6％聚丙烯酰胺，8mol/L尿素)分離，銀染技術(shù)檢測。檢測結(jié)果表明所有251對SSR引物均擴(kuò)增出穩(wěn)定的產(chǎn)物，其中48對SSR引物具有多態(tài)性，多態(tài)性引物頻率為25.1％(圖1)，該48對SSR引物為(見表2)。
表2 48對在親本間產(chǎn)生多態(tài)性的SSR引物

2、多態(tài)性SSR標(biāo)記的分離分析將這48對多態(tài)性引物逐一在F2分離群體(120個單株)中進(jìn)行展開，所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后進(jìn)行銀染檢測，統(tǒng)計銀染的帶型并記錄數(shù)據(jù)。經(jīng)x2檢驗(yàn)，其中有41個SSR標(biāo)記在群體中呈1∶2∶1的分離比例，占85.42％，符合共顯性標(biāo)記的遺傳特征，該41個SSR標(biāo)記中的satt160引物在120個單株中的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示；有7個SSR標(biāo)記呈現(xiàn)偏分離，5個SSR標(biāo)記偏向黑農(nóng)45，2個SSR標(biāo)記偏向哈交00-5448-4，偏分離引物的比例為14.58％，與Keim等(Keim，P.，B.W.Diers，T.C.Olson，and R.C.Shoemaker.1990.RFLP mapping in soybeanAssociationbetween marker loci and variation in quantitative traits.Genetics126735-742.)報道的13.3％相近，但低于張德水等(張德水，董偉，惠東威，陳受宜，莊炳昌.用栽培大豆與野生大豆間的雜種F2群體構(gòu)建基因組分子標(biāo)記連鎖圖譜框架圖.科學(xué)通報，1997，42(2)1326-1330)報道的25.0％和吳曉雷等(吳曉雷，王永軍，賀超英，陳受宜，蓋鈞鎰，王學(xué)臣.大豆重要農(nóng)藝性狀的QTL分析.遺傳學(xué)報，2001a，28(10)947-955)報道的21.7％。各標(biāo)記的雜合率在39.58％～59.90％之間，平均49.74％，基本符合F2群體的遺傳特征。分離群體中標(biāo)記的偏分離現(xiàn)象普遍存在，與已有的報道相比，本研究群體的偏分離標(biāo)記比例較小，這與吳曉雷等(吳曉雷，王永軍，賀超英，陳受宜，蓋鈞鎰，王學(xué)臣.大豆重要農(nóng)藝性狀的QTL分析.遺傳學(xué)報，2001a，28(10)947-955)的結(jié)果相似，他們也認(rèn)為從不同類型的分子標(biāo)記位點(diǎn)的偏分離情況來看，SSR位點(diǎn)偏分離比例最低。
3、SSR遺傳圖譜的構(gòu)建利用篩選的48個多態(tài)性SSR標(biāo)記，在分離群體中，對個體進(jìn)行SSR座位進(jìn)行等位變異統(tǒng)計，與父本帶型相同的等位變異記錄為“A”，與母本帶型相同的等位變異記錄為“B”，雜合帶型記錄為“H”，數(shù)據(jù)缺失記錄為“-”。應(yīng)用軟件MAPMAKER/EXPV3.0(Lander等，1987)進(jìn)行圖譜的構(gòu)建。利用“Group”命令進(jìn)行標(biāo)記間的連鎖分析和分組(LOD＝3.0)，連鎖標(biāo)記數(shù)小于8個的使用“Compare”命令進(jìn)行排序，標(biāo)記數(shù)大于等于8個的要重復(fù)使用Ripple命令進(jìn)行排序。利用QTL Cartographer1.1軟件進(jìn)行復(fù)合區(qū)間作圖，LR值11.5(LOD值2.5)為閾值對QTL進(jìn)行定位和效應(yīng)估算。結(jié)果得到一張包括6個連鎖群的分子遺傳圖譜(圖3)，圖譜上的SSR標(biāo)記數(shù)為18個，沒有連鎖的SSR標(biāo)記為30個，整個圖譜覆蓋的基因組長度為306cM，平均長度為17cM，符合QTL定位的要求。而且與公共圖譜(Cregan P B，Jarvik T.An integrated genetic linkage map of the soybean genome.CropSci，1999，35(5)1464-1490)進(jìn)行比較，結(jié)果表明6個連鎖群完全可以與公共圖譜中的連鎖群對應(yīng)上。圖3中，連鎖群(LG)中的數(shù)字表示相鄰的兩個SSR標(biāo)記或QTL和相鄰的SSR標(biāo)記之間的遺傳距離。
利用Mapmaker QTL1.1進(jìn)行QTL定位，在連鎖群F上定位了一個控制大豆油分含量的QTL，此QTL位于satt160-satt193這個區(qū)間內(nèi)，與satt160的遺傳距離是26.0cM，其遺傳貢獻(xiàn)率為23.2％。
其中，Satt160的引物序列為正向引物TCC CAC ACA GTT TTC ATA TAA TATA，反向引物CAT CAA AAG TTT ATA ACG TGT AGA T。
實(shí)施例2、利用satt160引物輔助篩選高油大豆品種實(shí)驗(yàn)材料包括父本高蛋白大豆品系哈交99-5448-4、母本高油大豆品種黑農(nóng)45和表1中的24個材料。
表3 用于分子標(biāo)記輔助選擇的大豆品種品系


上述大豆材料的種子取單粒磨成豆粉，分別置于1.5ml離心管中，4℃保存，按照實(shí)施例1的方法提取基因組DNA。
用父本高蛋白大豆品系哈交99-5448-4、母本高油大豆品種黑農(nóng)45和表3中的24個材料的分子標(biāo)記輔助選擇，具體方法如下利用引物satt160，按照實(shí)施例1的方法對這26個品種品系的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測，結(jié)果如圖4所示，表明有12個材料(黑農(nóng)44、黑農(nóng)45(與P2同)、Hobbit、合豐25、合豐43、墾農(nóng)4、墾農(nóng)18、遼豆14、M14、嫩豐17、中32、5186)具有高油親本黑農(nóng)45所擴(kuò)增出來的DNA片段，檢測符合率達(dá)到了50％，其中所檢測到的高油品種中只有二個材料(合豐25、5186)不是高油品種品系，在檢測到的高油品種中的符合率達(dá)到了83.33％，說明與satt160這個標(biāo)記連鎖的高油基因同時在這10份材料中能夠找到，從而達(dá)到了利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇的目的。圖4中，P1為哈交99-5448-4，P2為黑農(nóng)45，1至24對應(yīng)表3中的品種。
序列表<160>2<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tcccacacag ttttcatata atata 25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2catcaaaagt ttataacgtg tagat 2權(quán)利要求
1.用于輔助篩選高油大豆品種引物，由正向引物和反向引物組成，所述正向引物具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述反向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列。
2.一種輔助篩選高油大豆品種的方法，以待測大豆的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測大豆得到450-500bp的DNA片段，則該待測大豆為候選高油大豆品種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助篩選高油大豆品種的方法及其專用引物。該輔助篩選高油大豆品種的方法，以待測大豆的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如待測大豆得到450－500bp的DNA片段，則該待測大豆為候選高油大豆品種。
文檔編號C12Q1/68GK1876842SQ200610076250
公開日2006年12月13日 申請日期2006年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者劉麗君, 楊喆, 吳俊江, 高明杰, 蒲國鋒, 張雷 申請人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所