專利名稱：組織特異性和靶rna特異性核酶的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及組織特異性和靶RNA特異性核酶用于治療癌癥和細(xì)菌、寄生蟲和病毒感染的應(yīng)用。更具體的，本發(fā)明涉及在前列腺上皮特異性啟動(dòng)子(probasinpromoter)控制下尋靶RNA聚合酶1(A)的核酶。
背景技術(shù)：
核酶是斷裂RNA特異序列的催化性RNA分子。已經(jīng)指出核酶可作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的有潛力的基因調(diào)節(jié)器和抗病毒試劑，但其仍面臨著技術(shù)可行性的嚴(yán)重問題。例如，還不知道核酶是怎樣被引到靶細(xì)胞上的，或它們是怎樣被指向作為它們的靶RNA的同一亞細(xì)胞區(qū)室的。其它問題是關(guān)于靶RNA二級結(jié)構(gòu)對核酶活性的影響。該領(lǐng)域中還沒有成功地解決這些問題。
而且，由于核酶是反義技術(shù)的一種，反義技術(shù)用于疾病治療時(shí)遇到的問題也在核酶技術(shù)應(yīng)用中遇到。例如，發(fā)現(xiàn)反義RNA在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)始終使靶RNA分子減少，而且當(dāng)靶RNA分子減少時(shí)，它并不與蛋白質(zhì)的減少平行，是不可預(yù)測的。有時(shí)甚至當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水平降低時(shí)，沒有檢測到有生物效應(yīng)(Whitton,J.Lindsay＂(反義治療病毒感染)Antisense Treatment of Viral Infection＂Adv.in VirusRes.Vol.44,1994)。
該領(lǐng)域中的經(jīng)驗(yàn)表明，核酶在游離時(shí)或包埋在不相關(guān)的大RNA分子中時(shí)是是否最有效的，這點(diǎn)是不清楚的(Whitton,1994)。如今，也沒有獲得足夠的體外或細(xì)胞培養(yǎng)中的數(shù)據(jù)來系統(tǒng)地比較游離的核酶和其包埋型的反式活性(transeactivities)。
有些研究側(cè)重于核酶技術(shù)在治療癌癥方面的潛力。在這些研究中，核酶被直接作用于細(xì)胞培養(yǎng)物中的c-fos和c-ras致癌基因，并在移植入小鼠時(shí)表現(xiàn)出抑制惡性的活性。因此，這些核酶可特異性尋靶致癌基因。
沒有任何文獻(xiàn)指出，通過將有組織特異性啟動(dòng)子的核酶輸遞至組織上并且尋靶至細(xì)胞存活所必需的RNA上，可治療組織特異性癌癥或其它組織特異性疾病。本發(fā)明提供了這樣一種可治療組織特異性癌癥和其它組織特異性疾病的核酶。
大多數(shù)前列腺癌癥問題不需要作很多介紹。每年有大約44000個(gè)男子死于前列腺癌癥，約10000000個(gè)男子有前列腺癌癥前期的疾病癥狀。很明顯，新的治療方法是急需的。用動(dòng)物模型來測試醫(yī)療方法剛剛變成可能，并且還需要數(shù)年才能有效化。然而，本發(fā)明提供了解決這一問題的重要的試劑。
用基因治療法來治療前列腺癌癥的一個(gè)難點(diǎn)是靶特異性輸遞的長時(shí)間持久問題。然而，最近研究出的前列腺上皮特異性啟動(dòng)子提供了靶特異性，其可全身輸遞本發(fā)明的編碼核酶的載體(Greenburg等人，Mol.Endocrinol.8:230-239，1994)。本發(fā)明的載體包括串聯(lián)排列的3個(gè)錘頭狀核酶，其5＇和3＇端設(shè)計(jì)成可將其從初級轉(zhuǎn)錄物上自催化斷裂下來。這一新穎的結(jié)構(gòu)消除了延伸殘基側(cè)翼序列帶來的問題，否則側(cè)翼序列的存在將妨礙催化活性和特異性。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)將前列腺特異性的前列腺上皮特異性啟動(dòng)子與可尋靶前列腺細(xì)胞生長關(guān)鍵必需的mRNA的三連體核酶(triple-ribozyme)連接起來。
在組織特異性或其它啟動(dòng)子控制下的核酶的內(nèi)源性輸遞由于“滲漏(leakiness)”(體外組織中發(fā)生低水平的轉(zhuǎn)錄)而復(fù)雜。這將根據(jù)所選的細(xì)胞靶的不同而產(chǎn)生相當(dāng)嚴(yán)重的治療問題。本發(fā)明的核酶通過尋靶有高水平產(chǎn)物的細(xì)胞靶(即RNA聚合酶Ⅰ產(chǎn)生大量的細(xì)胞核糖體RNA)來彌補(bǔ)了該問題。因此，當(dāng)啟動(dòng)子滲漏發(fā)生在不希望的組織中時(shí)細(xì)胞就不會死亡。因此，這種選擇提供了所需程度的安全性，且polⅠ的尋靶適用于許多采用其它啟動(dòng)子的選擇性組織。
基因治療中的一個(gè)常見問題是將核酶輸遞至正確的組織很困難。本發(fā)明通過使核酶尋靶到細(xì)胞(核酶構(gòu)建物可有效輸遞至其上)中非細(xì)胞類RNA來避免了這一困難。Ⅳ脂質(zhì)體輸遞對治療HBV肝炎是有效的。Ⅳ和/或體外治療有效地將構(gòu)建物輸遞至紅細(xì)胞上來治療瘧疾傳染。表面給藥(有或沒有ⅳ)有效地將核酶構(gòu)建物輸遞至發(fā)育不良/癌癥前期/癌癥的HPV 16頸損傷的頸上皮上。后一個(gè)例子對治療發(fā)育不良/癌原位損傷(經(jīng)異常的巴氏污點(diǎn)(Pap smear)診斷得出)特別重要。非細(xì)胞類靶核酶的第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，即使不希望的細(xì)胞中發(fā)生啟動(dòng)子滲漏和/或體外輸遞和/或表達(dá)，核酶也不會斷裂任何細(xì)胞RNA。
發(fā)明概述本發(fā)明提供組織特異性和靶RNA特異性的核酶。這些核酶可用來破壞靶特異性腫瘤和治療病毒感染及其它用途。本發(fā)明的核酶包括5＇端自催化斷裂的核酶序列、含靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)的催化性核酶和3＇端自催化斷裂的核酶。
本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明的核酶的核酸。這些核酸可用來在選擇的位點(diǎn)處表達(dá)本發(fā)明的核酶。本發(fā)明的核酸包括一個(gè)組織特異性啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于編碼5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)的催化性核酶和3＇端自催化斷裂的核酶序列的序列上游。
本發(fā)明提供了一種通過抑制組織中細(xì)胞增生來治療患有特異性組織增生疾病的患者的方法，方法包括為患者給藥權(quán)利要求5的核酸，其中靶特異性啟動(dòng)子結(jié)合序列對疾病組織有特異性，從而使核酸編碼的核酶被表達(dá)，抑制組織中核糖體RNA的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞增生，從而來治療增生疾病。
本發(fā)明提供了一種治療患有前列腺癌癥的患者的方法，方法包括對患者用權(quán)利要求7的核酸給藥，從而使核酸編碼的核酶在前列腺中被表達(dá)并治療前列腺癌癥。
本發(fā)明還提供了一種治療患者中的感染的方法，方法包括對患者用權(quán)利要求l的核酸給藥，其中編碼的靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)對感染因素才有的RNA有特異性，從而使核酸編碼的核酶被表達(dá)并除去感染因素。
附圖簡述


圖1顯示了編碼親代雙連體核酶(double ribozyme)的從NotⅠ位點(diǎn)起始的DNA。有下劃線的序列是NotⅠ位點(diǎn)(GCGGCCGC)和BglⅡ位點(diǎn)(AGATCT)。親代雙連體核酶的序列從NotⅠ位點(diǎn)起始。有下劃線的序列是NotⅠ位點(diǎn)(GCGGCCGC)和BglⅡ位點(diǎn)(AGATCT)圖2顯示了編碼整個(gè)序列的DNA，尋靶的三連體核酶的內(nèi)部polⅠ用粗體表示。有下劃線的序列是NotⅠ位點(diǎn)(GCGGCCGC)和BglⅡ位點(diǎn)(AGATCT)。這是有尋靶三連體核酶的內(nèi)部polⅠ(粗體表示)的整個(gè)序列。有下劃線的序列是NotⅠ位點(diǎn)(GCGGCCGC)和BglⅡ位點(diǎn)(AGATCT)圖3顯示了親代雙連體核酶的二維結(jié)構(gòu)，其中克隆入核心核酶作為其反向互補(bǔ)DNA。
發(fā)明詳述核酶本發(fā)明提供了組織特異性和靶RNA特異性的核酶。這些核酶可用來破壞靶特異性腫瘤和治療病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染及其它用途。本發(fā)明的核酶包括5＇端自催化斷裂的核酶序列、含靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶。本發(fā)明的核酶的一個(gè)例子以其DNA編碼序列顯示在圖2和SEQ IDNO:1中。1-164位的核苷酸編碼了包括5＇端和3＇端自催化核酶序列的核酶。這種典型核酶的5＇端自催化斷裂核酶、催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶分別顯示在SEQ ID NO:1中。
或者，5＇端自催化斷裂核酶可用轉(zhuǎn)錄的RNA的另一段序列來代替。在該RNA中，最初的20-30個(gè)(或更長)核苷酸后的序列是最初20-30個(gè)核苷酸反向補(bǔ)體。這樣，構(gòu)建物估計(jì)可能仍在5＇端與polⅡ轉(zhuǎn)錄物一樣形成帽結(jié)構(gòu)，但是最初核苷酸不會改變尋靶中間核酶的5＇側(cè)上核苷酸的特異性。由于轉(zhuǎn)錄物將形成帽結(jié)構(gòu)，它可有效地輸送至細(xì)胞質(zhì)。對于本發(fā)明有5＇和3＇自催化核酶的三連體核酶來說，希望有一些擴(kuò)散將內(nèi)部尋靶的核酶介導(dǎo)輸送至細(xì)胞質(zhì)，盡管這一替換的5＇端應(yīng)當(dāng)提高細(xì)胞質(zhì)比例。
本發(fā)明提供了有獨(dú)特特征的核酶，其特征是在其催化反應(yīng)中有靶RNA特異性，并被組織特異性表達(dá)。在
圖1和SEQ IN NO:1所示的例子中，可與RNA聚合酶Ⅰ(A)(核糖體RNA聚合酶)單一序列特異性結(jié)合的RNA結(jié)合位點(diǎn)提供了靶RNA特異性。應(yīng)當(dāng)理解任何RNA的單一RNA序列可以作為本發(fā)明的靶RNA特異性核酶的靶。單一序列的測定方法是常規(guī)的，只要有大量的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(GenBank)和計(jì)算機(jī)程序(Genetics Computer Group,PCGENE and BLAST)來檢索查找任何與核酸序列配合的序列即可。位于一個(gè)數(shù)據(jù)庫上的單一DNA序列會有相應(yīng)的單一RNA序列。
本發(fā)明核酶的催化性序列的一個(gè)例子也以其DNA編碼序列顯示在
圖1和SEQ ID NO:1中。其它催化性序列包括那些該領(lǐng)域已知的序列。許多序列變化確定了“主干”區(qū)域中可允許的核苷酸變化(Fedor and Unlenbeck Proc.Nat.Acad.Sci.87:1668-1672,1990)。該領(lǐng)域技術(shù)人員會理解任何催化性序列(甚至那些還未公開的)可用來構(gòu)建本發(fā)明的核酶，當(dāng)其如這里所述的以常規(guī)方式與自催化斷裂核酶和RNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合時(shí)。
圖1和SEQ ID NO:1，以及圖2和3中顯示了和本發(fā)明的催化性核酶一起表達(dá)的5＇端和3＇端自催化斷裂核酶的例子。如下進(jìn)一步所描述的，這些核酶對于催化性核酶的表達(dá)是重要的，因?yàn)樗鼈円坏┍晦D(zhuǎn)錄形成一個(gè)有最小外端5＇或3＇序列的催化性核酶，它們就立即從核酶轉(zhuǎn)錄物上斷裂下來。因此，靶特異性結(jié)合位點(diǎn)和包括催化性核酶的催化性序列是以正確的構(gòu)型與靶RNA結(jié)合并使其斷裂。例舉構(gòu)建物中的外端序列是克隆技術(shù)的結(jié)果。應(yīng)當(dāng)理解通過選擇變化的克隆方案，可除去一些或全部這些外端核苷酸。
編碼核酶的核酸本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明的核酶的核酸。這些核酸可用來在選擇的位點(diǎn)上表達(dá)本發(fā)明的核酶。在治療組織特異性癌癥時(shí)，這些位點(diǎn)可以是組織特異性的，或者在核酶防止感染性試劑來治療感染(如肝炎、皰疹、瘧疾、結(jié)核病等)時(shí)可以是靶特異性的。
本發(fā)明的核酸包括一個(gè)組織特異性啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，位點(diǎn)在編碼5＇端自催化斷裂核酶序列、包括靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列的序列上游。
產(chǎn)生核酶的構(gòu)建物中的組織特異性啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)使得核酶在組織中組織特異性表達(dá)，從選擇的啟動(dòng)子開始活性轉(zhuǎn)錄RNA。因此，組織中只有利用啟動(dòng)子的靶RNA會被核酶斷裂。
圖1和SEQ ID NO:1中顯示的典型的核酶采用了Probasin啟動(dòng)子(一種前列腺上皮特異性啟動(dòng)子)(Greenburg等人，1994)的結(jié)合位點(diǎn)。該組織特異性啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)的序列顯示在(Greenburg等人，1994)中。
如所預(yù)料的，本發(fā)明的核酸構(gòu)建物中可采用其它組織特異性啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子的例子包括前列腺特異性抗原(前列腺)、白蛋白(肝)、脂肪酸結(jié)合蛋白(骼骨)、乳清酸性蛋白(乳房)、平滑肌運(yùn)動(dòng)(平滑肌)等的結(jié)合位點(diǎn)。還未被鑒定出的靶特異性啟動(dòng)子可用來使本發(fā)明的核酶表達(dá)定向到選擇的組織上。一旦鑒定出靶特異性啟動(dòng)子，其結(jié)合序列可用常規(guī)方法如序列分析方法來測得。啟動(dòng)子通過缺失分析、誘變、足跡法、凝膠移位和轉(zhuǎn)染分析來確定(Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,2nd Ed.Cold Spring HarborLabortory,Cold Spring Harbor,New York,1989)。
在本發(fā)明的編碼核酶的核酸中，編碼5＇端自催化斷裂核酶的核酸有SEQ IDNO:1中顯示的核苷酸1-54的序列。在本發(fā)明的編碼核酶的核酸中，編碼3＇端自催化斷裂核酶的核酸有SEQ ID NO:1中顯示的核苷酸111-164的序列。
應(yīng)當(dāng)理解，可以獲得本發(fā)明核酸編碼的其它5＇端和3＇端自催化斷裂核酶。這些核酶可根據(jù)Taira等人的方法來獲得(Nuc.Acids Res.19(19):5125-5130,1991)。
本發(fā)明的核酸編碼的催化性核酶含有兩個(gè)功能區(qū)一個(gè)高度保守的斷裂靶RNA的催化性序列(也稱為“催化核心”)，以及包括靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)域。通過核酸互補(bǔ)性，結(jié)合位點(diǎn)使核酶定向斷裂靶RNA分子上的特異性位點(diǎn)。側(cè)翼序列的長度不僅意味著特異性，也意味著單個(gè)核酶分子的斷裂效率。在本發(fā)明的催化性核酶中，側(cè)翼序列對靶RNA有高的特異性，但一旦發(fā)生斷裂很容易從靶RNA上解離下來。這就使得核酶可以循環(huán)(估計(jì)的Kcat約為1斷裂/分鐘)并減少了達(dá)到效果所需的核酶量。結(jié)合/解離值的范圍在16-21Kcal內(nèi)應(yīng)當(dāng)是有效的。
人RNA的復(fù)雜度比人DNA要低約100倍，且特異性只通過12-15堿基對就可實(shí)現(xiàn)。RNA-DNA雙鏈體受幾個(gè)因素的影響，如GC含量、溫度、pH、離子濃度和結(jié)構(gòu)。最近鄰規(guī)則可提供對雙鏈體穩(wěn)定性的有用評價(jià)(Castanotto等人，作為醫(yī)療試劑的反義催化RNA“Antisense Catalatic RNAs as Therapeutic Agents”Advances in Pharmacol.25:289-317,1994)。
如上所述，編碼的RNA結(jié)合位點(diǎn)是單一的，因此核酸編碼序列將是相應(yīng)的單一DNA序列。RNA結(jié)合位點(diǎn)可包含與核糖體RNA聚合酶Ⅰ(A)亞單位的單一RNA序列結(jié)合的序列。編碼核糖體RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的DNA的序列如圖3所示。該序列來自RNA聚合酶Ⅰ(A)亞單位。
本發(fā)明的催化性核酶也包括催化性序列，它在靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的位點(diǎn)中間的附近處將靶RNA斷裂。在錘頭狀核酶中，催化性序列通常是高度保守的。保守的催化核心殘基是5＇CUGANGA3＇和5＇GAAA3＇，兩者通過進(jìn)化上保守的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)來連接。
靶RNA上最保守的、且可能最有效的斷裂序列是5＇GUC3＇。然而，XUN(N=A、U或C)也可有效斷裂。該斷裂位點(diǎn)普遍存在于大多數(shù)RNA中，使得基本上所有的RNA能被尋靶(Whitton,J.Lindsay，病毒感染的反義治療“AntisenseTreatment of Viral Infection”Adv.in Virus Res.Vol.44,1994)。
關(guān)于靶RNA上合適位點(diǎn)的選擇，已知靶位點(diǎn)的二級結(jié)構(gòu)對體外斷裂有影響(Whitton,1994)。因此，可用程序RNAFOLD(來自PCGENE組程序或國際網(wǎng)Internet上獲得)對選擇的靶分子序列來常規(guī)篩選潛在的二級結(jié)構(gòu)。因此，可對靶可及性進(jìn)行合理地預(yù)測。計(jì)算機(jī)輔助RNA折疊(Castanotto等人，1994)和RNA三維模型計(jì)算機(jī)分析(Major等人，Science 253:1255-1260,1991和Castanotto等人，1994)在指導(dǎo)斷裂位點(diǎn)的選擇上是相當(dāng)有效的。
內(nèi)部核酶可尋靶至寄生蟲、病毒生命周期等所必需的非細(xì)胞類RNA上，且表達(dá)可由組織特異性或病毒特異性啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)。申請中特別指出的三個(gè)重要的例子是A)肝炎B型病毒靶(選擇用相同核酶靶部位來斷裂病毒RNA前基因組、S蛋白和聚合酶/反向轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄物)的白蛋白啟動(dòng)子的應(yīng)用；B)在紅細(xì)胞中有活性的普通啟動(dòng)子的應(yīng)用，用尋靶EMP-1蛋白家族(來自P.falciparum，其是瘧疾中細(xì)胞粘連和抗原變化所必需的)高度保守區(qū)的核酶；和C)HPV啟動(dòng)子的應(yīng)用，核酶尋靶E6蛋白翻譯起始位點(diǎn)附近的特異性位點(diǎn)，翻譯起始位點(diǎn)是E6和E7蛋白質(zhì)(它們密切參與頸致癌)表達(dá)的關(guān)鍵位點(diǎn)。
本發(fā)明的一個(gè)核酸例子有序列表SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列。該典型的核酸包括前列腺上皮特異性啟動(dòng)子，其在編碼5＇端自催化斷裂核酶(有SEQ IDNO:1中所示序列)，編碼核糖體RNA結(jié)合位點(diǎn)的DNA(有序列表SEQ ID NO:1所示序列)，和3＇端自催化斷裂核酶(有SEQ ID NO:1所示序列)的序列上游。
或者，啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)和核酶編碼序列中可進(jìn)行沉默堿基取代，以在相同的組織內(nèi)表達(dá)相同的核酶。因此，本發(fā)明提供了基本上有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸，其可編碼SEQ ID NO:1所示的核酶。核酸可根據(jù)所選的啟動(dòng)子的特征/定義而不同，且與SEQ ID NO:1有80％-99％的序列相同性，更佳的，其與SEQ ID NO:1有90％-99％的序列相同性，其它改進(jìn)包括例如，為克隆目的而插入的核苷酸(圖2，其包括-1至-8，+69至+76)的變化(或缺失)，在圖3中，框包括作為克隆選擇的外部核苷酸，因此，它可作改進(jìn)。未配對的堿基可以是任何堿基，其只由所選的克隆方案來確定。如果一對堿基中的一個(gè)改變，則另一個(gè)必需以互補(bǔ)方式改變。而且，編碼核酶的序列可以以改變核酶序列但不影響核酶的靶RNA特異性或使斷裂活性失去的方式來變化。例如，在5＇、3＇端和內(nèi)部核酶(圖2)的莖環(huán)區(qū)內(nèi)的變化可以結(jié)合入其它構(gòu)建物而維持催化活性(Fedor and Uhlenbeck，1990)。
核酶生成構(gòu)建物的合成典型地，RNA結(jié)合序列和核心序列合成反向互補(bǔ)寡核苷酸，并克隆人載體，從而生成含有核酶的有關(guān)RNA。本發(fā)明的核酶通過寡核苷酸(5＇GGA AGA TCTTTC AAA GAC TGA TGA CTC CGT GAG GAC GAA ACG AGG ATC AGA TCTTCC 3＇)和其反向互補(bǔ)體的合成來制得?？寺≈兴玫腂glⅡ位點(diǎn)用下劃線表示。在合適的限制酶消化后，在這一具體的BglⅡ例子中，雙鏈DNA寡核苷酸被克隆入親代載體的多克隆位點(diǎn)(
圖1)。
功能測試一旦測序后，測定這些核酶的功能。測試可包括用兩種可能的細(xì)菌啟動(dòng)子中的一種來轉(zhuǎn)錄核酶，在這一例中是SP-6或T-7(在痕量放射性存在下)，然后通過電泳來評價(jià)核酶的自催化斷裂。實(shí)施例中提供了來自這些測試的數(shù)據(jù)。
其它測試步驟包括體外轉(zhuǎn)錄的核酶與體外合成的靶RNA轉(zhuǎn)錄物或細(xì)胞質(zhì)RNA制備物的培育。在培育后，RNA用標(biāo)準(zhǔn)的Northern印跡分析來檢驗(yàn)靶RNA轉(zhuǎn)錄物的特異性分解。
構(gòu)建的三連體核酶還可通過將其亞克隆到一個(gè)組織特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)子之后來進(jìn)行進(jìn)一步測試，其中組織特異性啟動(dòng)子可以組織特異性方式驅(qū)動(dòng)靶上的載體表達(dá)。實(shí)施例中提供了來自這些測試的數(shù)據(jù)。
最后，三連體核酶實(shí)驗(yàn)方法通過在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步有效化。兩組這樣的研究如實(shí)施例描述的那樣進(jìn)行。第一個(gè)例子用了比polⅠ核酶更容易監(jiān)測的對照載體，其中對照載體包括驅(qū)動(dòng)藻類綠色熒光蛋白質(zhì)(pBGFT)表達(dá)的前列腺上皮特異性啟動(dòng)子。該測試質(zhì)粒用來確認(rèn)我們的體內(nèi)輸遞系統(tǒng)的有效性。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)也在有polⅠ核酶加入的小鼠中進(jìn)行。在兩個(gè)例子中，無論是加入三連體核酶還是綠色熒光蛋白，動(dòng)物均在操作后不同時(shí)間處殺死、解剖，并用免疫組織化學(xué)法測定各個(gè)組織的載體活性。
輸遞本發(fā)明的核酸可以是用來將核酸輸遞至表達(dá)核酶的部位處的載體。載體可以是一種商業(yè)上可獲得的制品，如pGM質(zhì)粒(Promega)，載體輸遞可以通過脂質(zhì)體，用商業(yè)上可獲得的脂質(zhì)體制品或新研究出的有本發(fā)明脂質(zhì)體特點(diǎn)的脂質(zhì)體。也可采用其它常規(guī)輸遞方法在這里的方法中測試。用脂質(zhì)體輸遞的方法例子在實(shí)施例中有進(jìn)一步描述。
脂質(zhì)體的給藥方式可根據(jù)治療疾病以及尋靶組織的不同而不同。對于脂質(zhì)體在其中會下沉的肺(如結(jié)核病和癌癥)和肝(如肝炎和癌癥)來說，靜脈給藥是合理的。對于許多其它局限性病理疾病，如癌癥、感染(如肝炎、膀胱炎、直腸炎、子宮頸炎等)以及癌癥前期疾病來說，在器官上游動(dòng)脈插入導(dǎo)管是較佳的輸遞方式，因?yàn)槠浔苊饬朔魏透未罅康厍宄|(zhì)體。對于其它許多部位的損傷(如皮膚癌、人乳頭瘤病毒感染、皰疹(嘴或生殖器)和癌癥前期頸發(fā)育不良)，表面輸遞是有效的且較佳的，因?yàn)樗芊奖恪?br> 白血病和其它疾病如瘧疾，也很容易通過核酶來自體內(nèi)給藥來治療。
脂質(zhì)體可以表面給藥、非腸道給藥(如靜脈給藥)、肌肉間注射、腹膜內(nèi)注射、經(jīng)皮膚給藥、外體(excorporeally)給藥等，但是Ⅳ或表皮給藥是特別佳的。所需脂質(zhì)體的確切量根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況，待治療疾病的嚴(yán)重程度，所用的特殊的化合物，其給藥方式等而不同。因此，不可能確定確切的量。然而，合適的量可由該領(lǐng)域普通技術(shù)人通過這里提及的常規(guī)實(shí)驗(yàn)法來測得。通常，劑量與實(shí)施例中給出的典型例子相近。
非腸道給藥，如果用的話，通常是指注射。注射制品可制成常規(guī)形式，如液體溶液或懸浮液、適用于在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形態(tài)或乳劑。一種最近改進(jìn)的非腸道給藥方法是用緩慢釋放或持續(xù)釋放的系統(tǒng)，使得維持恒定水平的劑量。見如美國專利No.3,710,795，其結(jié)合人本文作參考。
表面給藥可以通過乳膏、凝膠、栓劑等。來自體內(nèi)(外體)輸遞可以典型地用于其它上下文中。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物，其胚芽或體細(xì)胞中含有核酸，核酸包括一個(gè)靶特異性啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)，位點(diǎn)在編碼5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列的序列上游，其中動(dòng)物表達(dá)的核酸含有5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列。
核酸可以是
圖1和SEQ ID NO:1中所示的核酸?；蛘?，可在啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)和核酶編碼序列中進(jìn)行沉默堿基取代，以在相同組織中表達(dá)相同的核酶。例如這些取代可如上所述那樣。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物是有用的，因?yàn)閯?dòng)物不表達(dá)與靶RNA相關(guān)的表型(如與其編碼的蛋白質(zhì)相關(guān))。這里所用的術(shù)語“表型”包括受失效影響的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)曲線(如RNA或表達(dá)的蛋白質(zhì)的變化量等)和其它參數(shù)。例如，健康細(xì)胞的死亡可以是由于核酶表達(dá)而改變表型的衡量標(biāo)準(zhǔn)。
轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞本發(fā)明的核酶可在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中表達(dá)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可用來使核酶表達(dá)特異性和對靶RNA斷裂活性的特異性有效。有如此篩選功能的例子在實(shí)施例中有所描述。
篩選方法本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可用于篩選可使動(dòng)物或宿主細(xì)胞表達(dá)與靶RNA有關(guān)的表型的化合物的方法。方法需要對動(dòng)物/細(xì)胞用化合物給藥，并評價(jià)化合物引起表型表達(dá)的能力。如果表型恢復(fù)，則認(rèn)為化合物是有效的。例如可制備L-多巴功能失效(L-dopa functional knockout)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物并用來篩選使L-多巴相關(guān)表型恢復(fù)的藥物。
治療增生型疾病本發(fā)明提供了一種治療患有特異組織增生疾病的患者的方法。治療通過抑制特異組織中的細(xì)胞增生來進(jìn)行治療，且這是通過對患者用核酸給藥來實(shí)現(xiàn)的，核酸可編碼尋靶細(xì)胞存活或復(fù)制所必需的RNA的核酶，并含有對病患組織有特異性的靶特異性啟動(dòng)子結(jié)合序列。核酸編碼的核酶在病患組織中表達(dá)，組織中必需RNA的生成被抑制，組織中的細(xì)胞增生被抑制，隨即引起細(xì)胞死亡而治療了增生疾病。
用本發(fā)明的方法來治療的增生疾病包括靶特異性啟動(dòng)子來治療的幾乎所有的癌癥，如前列腺、乳房、結(jié)腸、胰、肺和肝中的癌癥。
例如，本發(fā)明提供了一種治療患有前列腺癌癥的患者的方法，方法包括對患者用SEQ ID NO:1中所示的核酸來給藥，從而使核酸編碼的核酶在前列腺中表達(dá)來治療前列腺癌癥。
治療病毒感染本發(fā)明提供了一種治療患者病毒感染的方法，方法包括用本發(fā)明核酸對患者給藥，其中編碼的靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)對感染因素(infectious agent)單一RNA有特異性，從而使核酸編碼的核酶表達(dá)并殺死感染因素。轉(zhuǎn)錄可用病毒特異性啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)，啟動(dòng)子可在感染病毒的組織中選擇性地定向表達(dá)核酶，即用肝特異性自蛋白啟動(dòng)子來定向表達(dá)抗肝炎B型病毒的核酶。
在測定抗病毒效應(yīng)中，表達(dá)核酶的細(xì)胞系可與可支持病毒感染/復(fù)制/生成的負(fù)對照核酶比較。以上述相同方法可獲得表達(dá)核酶的細(xì)胞系并對其測定；而且在所有情況下可測得核酶防止感染的能力。
本發(fā)明將在下列非限制性的實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)地描述。
實(shí)施例核酶基因治療前列腺癌癥的測定本實(shí)施例指出了用于采用錘頭狀核酶的前列腺定向表達(dá)來殺死普通的和腫瘤型前列腺上皮的載體和新的方案。核酶是非常新穎的三連體核酶，其可通過攻擊必需RNA來定向破壞細(xì)胞。核酶的5＇和3＇端被設(shè)計(jì)成在轉(zhuǎn)錄時(shí)可自催化斷裂，使內(nèi)部核酶(高水平地)游離存在于細(xì)胞中。
錘頭狀核酶的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并定向?qū)ぐ屑?xì)胞的必需RNA(如RNA聚合酶Ⅰ(A))致使細(xì)胞死亡。如果核酶是以限制性方式尋靶特異性組織，則只有該組織中的細(xì)胞受核酶表達(dá)的作用。選擇性地尋靶前列腺可通過鼠前列腺上皮特異性啟動(dòng)子(pb)(或前列腺特異性抗原啟動(dòng)子)來實(shí)現(xiàn)。由于用前列腺上皮特異性啟動(dòng)子可尋靶組織特異性前列腺，因此載體全身輸遞或直接將載體引到前列腺上可使前列腺癌靶死亡，而在剩余的正常前列腺上皮上也觀察到有一些伴隨損傷。由于前列腺上皮特異性啟動(dòng)子的單一特異性，預(yù)計(jì)在體內(nèi)其它部位不會有伴隨性損傷。這預(yù)計(jì)也適于前列腺特異性抗原。
靶的例子包括RNA聚合酶Ⅰ和Ⅱ的Ⅰ(A)亞單位。其它內(nèi)部尋靶的核酶可用所述方法來進(jìn)行體外和體內(nèi)活性測試。
合成構(gòu)建
圖1所示的初級雙連體核酶載體。兩個(gè)側(cè)翼核酶(堿基1至54和66至120)可以自身斷裂。將第三個(gè)尋靶polⅠmRNA的核酶(圖2)(堿基64-105)克隆入側(cè)翼核酶之間。內(nèi)部核酶有兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的19個(gè)堿基(TTCAAAGA-催化核心-ACGAGGATCAG)，它們與polⅠ信息反義并通過最小二級結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)堿基配對相互作用來實(shí)現(xiàn)斷裂。
內(nèi)部polⅠ核酶通過寡核苷酸的合成來制得，寡核苷酸為5＇GGA AGA TCTTTC AAA GAC TGA TGA CTC CGT GAG GAC GAA ACG AGG ATC AGA TCTTCC3＇(只有核酶的有義鏈顯示在其反向補(bǔ)體中)。下劃線是克隆所用的BglⅡ位點(diǎn)。在用BglⅡ進(jìn)行合適地限制性消化后，將雙鏈寡核苷酸克隆人本發(fā)明載體的BglⅡ位點(diǎn)中(
圖1)。
輸遞當(dāng)前列腺特異性啟動(dòng)子與三連體核酶構(gòu)建物偶聯(lián)時(shí)，它將通過脂質(zhì)體全身輸遞至前列腺。各種引入血管系統(tǒng)的途徑(一些通過肺和肝)如所述的進(jìn)行評價(jià)。也可用常位途徑(orthotopic route)。預(yù)計(jì)脂質(zhì)體賦形劑是有效的，由于高度血管化，其足以將分子輸遞至前列腺癌細(xì)胞上。因此，通過這種基因治療方法來治愈或至少減少腫瘤負(fù)擔(dān)的結(jié)果是合理的。
在這些研究中用了下列脂質(zhì)體制劑(a)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)是由正電荷液體DOSPA和中性液體DOPE以3∶1摩爾比組成的聚陽離子液體；(b)陽離子液體DDAB與DOPE以2∶1或0.6∶1.0的比例組合(Brunette等人，Mol.Cell.Biol.14∶2411-2418,1994)；和(c)DMRIE與DOPE以1∶1摩爾比組合(Felgner等人，Methods(Orlando)5∶67-75,1995)(從VICAL Corp.(SanDiego,CA)獲得)。脂質(zhì)體試劑在轉(zhuǎn)染前保藏在4℃下。
測試一旦測序后就測試這些核酶的功能。測試機(jī)理包括用兩種可能的細(xì)菌啟動(dòng)子中的一種來轉(zhuǎn)錄核酶，在這一例中是pCRⅡ載體中的SP-6或T-7(Invitrogen,SanDiego,Ca)(在痕量放射性存在下)，然后通過電泳來評價(jià)核酶的自催化斷裂。這是用polⅠ核酶來進(jìn)行的，并發(fā)現(xiàn)有斷裂，即首先產(chǎn)生包括內(nèi)部尋靶核酶和3＇端核酶的113bp片段，然后出現(xiàn)含有內(nèi)部polⅠ核酶的74bp的片段。
隨后核酶通過將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人C3H10T 1/2小鼠成纖維細(xì)胞來測試。其證實(shí)了當(dāng)誘導(dǎo)三連體核酶表達(dá)時(shí)polⅠRNA被分解。因此測得并證實(shí)了分子的兩階段活性的產(chǎn)生。順式核酶的自催化斷裂和反式polⅠmRNA的功能性降解如預(yù)計(jì)地那樣發(fā)生。
隨后是將三連體核酶在組織特異性啟動(dòng)子(如前列腺上皮特異性或前列腺特異性抗原的啟動(dòng)子，其以組織特異性的方式使表達(dá)定向)控制下引入載體。這是通過用含有整個(gè)3＇、5＇端和內(nèi)部核酶的Not1片段(圖2)并將其插入含有前列腺上皮特異性啟動(dòng)子區(qū)的載體(-426至+28(Greenburg等人，1994))來實(shí)現(xiàn)的。該啟動(dòng)子被證明可使基因表達(dá)定向到前列腺上。
在表達(dá)三連體核酶抗polⅠ構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)測試載體。轉(zhuǎn)基因小鼠用Hogan描述的標(biāo)準(zhǔn)前核注射方法(鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)手冊“Manipulating themouse embryo:a laboratory manual”,Cold Spring Harbor,NY 1986)來獲得。在注射前，用限制性酶(HindⅢ和SacⅡ)消化質(zhì)粒，然后用蔗糖梯度分級來將構(gòu)建物從載體DNA上分離下來。在注射前，分離獲得的構(gòu)建物用10mm Tris pH 8.0,0.1mm EDTA來透析。在這些小鼠中，一旦前列腺上皮特異性啟動(dòng)子表達(dá)變得明顯，則在產(chǎn)生后的3-5周階段就會發(fā)生前列腺上皮的破壞。在26只輸遞的小鼠中，發(fā)生轉(zhuǎn)基因的小鼠的比例為10-15％，即有2-3只轉(zhuǎn)基因小鼠。另一種確定本發(fā)明的核酶功能的方法是將載體引入組織培養(yǎng)物如人PC3前列腺癌細(xì)胞中，并觀察響應(yīng)核酶激活后的細(xì)胞死亡情況。已經(jīng)確認(rèn)C3H10T 1/2小鼠成核細(xì)胞對polⅠ三連體核酶敏感。
通過體內(nèi)研究可進(jìn)一步證實(shí)該基因治療方法的有效性。下面進(jìn)行兩組研究。在第一個(gè)例子中，采用比polⅠ核酶更容易監(jiān)測的對照載體，其中對照載體包括驅(qū)動(dòng)藻類綠色熒光蛋白質(zhì)表達(dá)的前列腺上皮特異性啟動(dòng)子，以確認(rèn)脂質(zhì)體的體內(nèi)輸遞系統(tǒng)的有效性。步驟包括使小鼠麻醉并用外科手術(shù)使降主動(dòng)脈暴露。將30導(dǎo)管徑計(jì)置于降主動(dòng)脈中，然后引入300μg載體/千克體重(載體∶脂質(zhì)體之比為10μg/40μl)。結(jié)果表明，綠色熒光蛋白質(zhì)在背外側(cè)前列腺上皮中有表達(dá)而在肺(脂質(zhì)體正常的靶)中沒有。進(jìn)一步的研究要確定在肺和其它組織如腎、腎上腺和腦中是否發(fā)現(xiàn)有表達(dá)，第二個(gè)實(shí)驗(yàn)也在用上述方法在體內(nèi)有polⅠ核酶加入的小鼠中進(jìn)行。在兩個(gè)例子中，無論是加入三連體核酶還是綠色熒光蛋白，動(dòng)物均在操作后不同時(shí)間處殺死、解剖，并用免疫組織化學(xué)法測定組織的載體活性。數(shù)據(jù)表明，在給藥7天后前列腺上皮中有程序性細(xì)胞死亡(apoptotic cell death)。
在產(chǎn)生前列腺腫瘤的轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行體內(nèi)研究。腫瘤通過前列腺上皮特異性啟動(dòng)子控制的基因如EcoRl(一種限制性酶)、cfos(一種原癌基因)或lamin(一種核基質(zhì)分子)改進(jìn)型的表達(dá)來誘導(dǎo)產(chǎn)生。核酶如上所述進(jìn)行給藥。
靶選擇各種分子被選擇用來尋靶。第一種是RNA聚合酶Ⅰ(A)。它是很好的靶，因?yàn)槠涫且环N高豐度RNA。如果在前列腺細(xì)胞除外的細(xì)胞內(nèi)有前列腺上皮特異性啟動(dòng)子滲漏(低水平轉(zhuǎn)錄)，預(yù)計(jì)它們可使限制水平的polⅠ核酶存活。測定其它潛在的靶，它們包括果糖磷酸激酶(根據(jù)包括的組織，核酶靶部位為核苷酸178、121或162)、RNA polⅡ亞單位14.4kd(核酶靶部位為核苷酸83或884)、mRNApolⅡ140kd亞單位(核酶靶部位為核苷酸204)和RNA polⅡ23kd亞單位(核酶靶部位為核苷酸143)。
其它潛在的感興趣靶是復(fù)制蛋白A的70kD亞單位。它是DNA復(fù)制中點(diǎn)/焦點(diǎn)(centers/foci)形成所需的，因此它應(yīng)破壞DNA的復(fù)制而沒有引入錯(cuò)誤的危險(xiǎn)。序列參考Kim等人的分子細(xì)胞生物學(xué)Mol.Cell.Biol.12:3050-3059,1992。
寄生蟲感染的核酶基因治療法上述方法適用于本文，除非另有特指。例如，對于寄生蟲感染，其給藥方式與前列腺癌癥不同，并與組織部位有關(guān)。
對于瘧疾(惡性瘧原蟲)，對EMP-1蛋白進(jìn)行尋靶，它是細(xì)胞粘連所必需的并且?guī)硌杆俑淖兛乖膯栴}。特別地，對外顯子Ⅱ中的高度保守的GTC進(jìn)行定向。相關(guān)的EMBL登記號為L42246、L42244、L42245、L42247、L40600-L40609、L42636。見Smith等人，Cell 82:101-110,1995，和Su,X等人，細(xì)胞學(xué)Cell 82:89-100,1995?？捎迷诩t細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子，治療也可在體外進(jìn)行。
細(xì)菌感染的核酶基因治療法上述方法適用于本文，除非另有特指。例如，對于細(xì)菌感染，其給藥方式與前列腺癌癥不同，并與組織部位有關(guān)。
對于結(jié)核分支桿菌，對細(xì)胞進(jìn)入所必需的轉(zhuǎn)錄片段進(jìn)行尋靶。EMBL登記號為X70901。見Arruda,S.等人，科學(xué)Science 26l:1454-1457,1993。靶在1535bp片段的靠近編碼52kD蛋白質(zhì)的開放讀框N端處。
病毒感染的核酶基因治療法上述方法適用于本文，除非另有特指。例如，對于病毒感染，其給藥方式與前列腺癌癥不同。
人乳頭瘤病毒型16E6和E7蛋白質(zhì)從雙順反子mRNA翻譯獲得。E6的翻譯起始位點(diǎn)的反義寡核苷酸抑制了E6和E7的合成。靶可以是GTT，其在核苷酸108處斷裂(Tan等人，基因病毒雜志J.Gen.Virol.75:2663-2670,1994)。原始數(shù)目來自Seedort等人，病毒學(xué)Virology 145:181-185,1985。Ⅳ和表面給藥應(yīng)有效組合。表面給藥應(yīng)對發(fā)育不良/癌癥前期損傷。
肝炎B型病毒是部分為單鏈DNA的病毒，現(xiàn)在認(rèn)為病毒基因組的整合不是關(guān)鍵。而病毒基因組形成延伸的RNA中間體，然后中間體反向轉(zhuǎn)錄成DNA。選擇有多個(gè)有利點(diǎn)的靶。它將在第一位置處切開病毒RNA前基因組，其位于S(包膜)和聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)。切口在HBV亞型ayw的核苷酸438后GTC處。EMBL登記號是X02496，其原始序列參考Galibert等人，Nature 281,646-650,1979。表達(dá)通過白蛋白啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)，Ⅳ給藥是非常有效的。
盡管前述的發(fā)明為了清楚和便于理解，在一些細(xì)節(jié)上進(jìn)行了描述，但是該領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本公開，在不脫離發(fā)明和權(quán)利要求的范圍內(nèi)可作出各種形式和細(xì)節(jié)上的變動(dòng)。
在本申請中，各種公開均參照括號的文獻(xiàn)。為了更詳細(xì)地描述本發(fā)明所述領(lǐng)域的技術(shù)狀況，這些完全公開的出版物結(jié)合入本申請中作為參考。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人南卡羅來納州醫(yī)學(xué)院171 Ashley AvenueCharleston,South Carolina 29464(ⅱ)發(fā)明名稱組織特異性和靶RNA特異性核酶(ⅲ)序列數(shù)目1(ⅳ)通信地址(A)收信人NEEDLE & ROSENBERG,P.G.
(B)街道127 Peachtree Street,Suite 1200(C)城市Atlanta(D)州Georgia(E)國家USA(F)郵編30303(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,#1.30版(ⅵ)本申請資料(A)申請?zhí)柮绹暾執(zhí)朜o.08/554,369(B)申請日1995年11月8日(C)分類(ⅷ)律師/代理人信息
(A)姓名Spratt,Gwendolyn D.
(B)登記號36,016(C)參考/案卷號19070.0030/P(ⅸ)通訊信息(A)電話404/688-0770(B)傳真404/688-9880(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度184堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GCGGCCGCTCGAGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGTACCCGGTACCGTCAGCTC60GAGCTCAGATCTTTCAAAGACTGATGACTCGCTGAGGACGAAACGAGGATCAGATCTGGA120TCCGTCGACGGATCTAGATCCGTCCTGATGAGTCGTGAGGACGAAACGGATCTGCAGCGG180CCGC18權(quán)利要求
1．一種核酸，它包括一個(gè)靶特異性啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，位點(diǎn)在編碼5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列的序列上游。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中靶特異性啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)是前列腺上皮特異性啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中編碼5＇端自催化斷裂核酶的核酸有序列表中SEQ ID NO:1指出的核苷酸9-62的序列。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中編碼3＇端自催化斷裂核酶的核酸有序列表中SEQ ID NO:1指出的核苷酸119-172的序列。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中編碼催化性核酶的核酸包括靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)合位點(diǎn)與核糖體RNA，即聚合酶Ⅰ(A)的單一RNA序列結(jié)合。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸，其中核酸有序列表中SEQ ID NO:1指出的核苷酸72-113的序列。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其基本上由序列表中SEQ ID NO:1所指序列的核苷酸組成。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其有序列表中SEQ ID NO:1所指的序列。
9．載體中的權(quán)利要求1所述的核酸。
10．載體中的權(quán)利要求2所述的核酸。
11．載體中的權(quán)利要求3所述的核酸。
12．載體中的權(quán)利要求4所述的核酸。
13．載體中的權(quán)利要求5所述的核酸。
14．載體中的權(quán)利要求6所述的核酸。
15．載體中的權(quán)利要求7所述的核酸。
16．載體中的權(quán)利要求8所述的核酸。
17．一種轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物，其生殖細(xì)胞或體細(xì)胞中含有權(quán)利要求1所述的核酸，其中動(dòng)物表達(dá)的核酶包括5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列。
18．一種轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物，其生殖細(xì)胞或體細(xì)胞中含有權(quán)利要求7所述的核酸，其中動(dòng)物表達(dá)的核酶包括5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列。
19．一種轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物，其生殖細(xì)胞或體細(xì)胞中含有權(quán)利要求8所述的核酸，其中動(dòng)物表達(dá)的核酶包括5＇端自催化斷裂核酶序列、含靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)的催化性核酶和3＇端自催化斷裂核酶序列。
20．根據(jù)權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物，其中動(dòng)物不表達(dá)與靶RNA相關(guān)的表型。
21．一種篩選化合物活性的方法，化合物可終止權(quán)利要求20所述的動(dòng)物表達(dá)與靶RNA相關(guān)的表型，方法包括對動(dòng)物用化合物給藥并評價(jià)其使表型表達(dá)終止的能力。
22．一種通過抑制組織中細(xì)胞增生來治療患有特異性組織增生疾病的患者的方法，方法包括為患者用權(quán)利要求5所述的核酸給藥，其中靶特異性啟動(dòng)子結(jié)合序列對疾病組織有特異性，從而使核酸編碼的核酶表達(dá)，組織中核糖體RNA的產(chǎn)生被抑制，細(xì)胞增生被抑制，從而來治療增生疾病。
23．一種治療患有前列腺癌癥的患者的方法，方法包括對患者用權(quán)利要求7所述的核酸給藥，從而使核酸編碼的核酶在前列腺中表達(dá)來治療前列腺癌癥。
24．一種治療患者的感染型疾病的方法，方法包括對患者用權(quán)利要求1所述的核酸給藥，其中編碼的靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)對感染因素單一RNA有特異性，從而使核酸編碼的核酶被表達(dá)并除去感染因素。
全文摘要
本發(fā)明提供了組織特異性和靶RNA特異性核酶。這些核酶可用來破壞靶特異性腫瘤并治療病毒感染等。本發(fā)明的核酶包括5′端自催化斷裂的核酶序列、包括靶RNA特異性結(jié)合位點(diǎn)的催化性核酶和3′端自催化斷裂的核酶。本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明的核酶的核酸。這些核酸可用來在選擇部位表達(dá)本發(fā)明的核酶。本發(fā)明還提供了通過用核酶給藥來治療疾病的方法。
文檔編號A01K67/027GK1207769SQ96198727
公開日1999年2月10日 申請日期1996年11月8日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月8日
發(fā)明者J·S·諾里斯, G·A·克勞森 申請人:南卡羅來納州醫(yī)學(xué)院, 賓夕法尼亞州研究基金會