專利名稱：無融合生殖玉米的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過將無融合生殖機制由野生植物種轉(zhuǎn)移到栽培植物中形成不分離雜種而得到的純育植物。更具體而言，本發(fā)明涉及無融合生殖的玉米和無融合生殖的玉米/磨擦禾雜種。本發(fā)明也涉及控制無融合生殖的遺傳因子、含有控制無融合生殖的遺傳因子的載體、用這些遺傳因子產(chǎn)生不分離的植物子代的方法和可用于鑒定與無融合生殖關(guān)聯(lián)的遺傳因子的核酸序列。
植物的生殖通常劃分為有性和無性。無融合生殖通常被認(rèn)為是通過各種無性生殖形式代替有性生殖(Rieger等，1976)。無融合生殖是植物生殖的遺傳控制方法，其中胚胎形成無需卵子和精子核的結(jié)合。有三種基本的無融合生殖類型1)無孢子生成的胚胎由珠心來源的胚囊中染色體未減數(shù)的卵子發(fā)育而來，2)二倍孢子形成的胚胎由未減數(shù)的大孢子母細(xì)胞來源的胚囊中的卵子發(fā)育而來，和3)不定胚生殖的胚胎直接由體細(xì)胞發(fā)育而來。在多數(shù)無融合生殖形式中，極核的假配合或受精產(chǎn)生胚乳對種子活力是必需的。專性無融合生殖體據(jù)信具有完全封閉的重組系統(tǒng)；即，重組僅發(fā)生于小孢子發(fā)生過程中，大孢子發(fā)生過程中不發(fā)生重組。在兼性無融合生殖體中，無性和有性生殖方式共存。
前述無融合生殖類型具有經(jīng)濟潛力，因為它們能使無論怎樣雜合的任何基因型的生物繁殖時不分離。它是一種規(guī)避了雌性減數(shù)分裂和配子配合而產(chǎn)生遺傳上完全等同于母本的胚胎的生殖過程。通過無融合生殖，特殊適應(yīng)的或雜種基因型生物的子代在重復(fù)的生命周期中都會保持其遺傳忠實性。除了保持雜種活力，無融合生殖還使生產(chǎn)雜種所需的有效雄性不育或育性恢復(fù)系統(tǒng)尚為未知或尚未建立的作物的商用雜種生產(chǎn)成為可能。此外，無融合生殖還可增加具有畸形或不利的染色體結(jié)構(gòu)的植物的生殖能力。
無融合生殖無需多步雜交而使得雜種育成更為有效。它也簡化了雜種的生產(chǎn)，增加了具有良好的雄性不育系的植物的遺傳多樣性。它用來尋找控制栽培種中專性或高水平無融合生殖的基因是理想的，并能方便地進行雜交親和的有性×無融合基因型的雜交產(chǎn)生不分離的F1雜種。實際上，多數(shù)理想的控制無融合生殖的基因發(fā)現(xiàn)于野生種，它們與栽培種關(guān)系較遠(yuǎn)。盡管栽培和野生種之間的種間雜交也是可能的，但基因組間染色體配對通常較少或不存在。
無融合生殖的典型情況存在于多倍體草中(Harlan等，1964；Connor，1979；Bashaw等，1990a；Asker等，1992；Koltunow，1993；)，鴨茅狀磨擦禾(Tripsacum dactyloides(L.)L.)也不例外。鴨茅狀磨擦禾是玉米(Zea mays L.)的遠(yuǎn)親，為兼具有性和無性生殖形式的多年生疏叢性禾本科牧草。在二倍體水平上(2n＝2x＝36)，主要見到的是有性生殖，而在三倍體(2n＝3x＝54)和四倍體(2n＝4x＝72)水平上，二倍孢子形成的無融合生殖占優(yōu)勢(Brown等，1958；Burson等，1990；Sherman等，1991)。無融合生殖的鴨茅狀磨擦禾中胚囊發(fā)育機制的特征在于蝶須屬型的二倍孢子假配合(Brown等，1958；Burson等，1990；Leblanc等，1995)。在該系統(tǒng)中，極核和卵子的雙受精不會發(fā)生。極核的受精刺激未減數(shù)卵細(xì)胞的無性發(fā)育。
小麥、水稻、高粱和玉米是提供世界上大多數(shù)食物來源的主要作物種。已有人提出發(fā)展這些禾本科作物的無融合生殖形式對發(fā)展中國家的食物安全會提供主要的貢獻(xiàn)(Wilson等，1992)。農(nóng)業(yè)社會中特別感興趣的是實現(xiàn)雜種玉米的有效水平的無融合生殖。達(dá)到該目標(biāo)可使世代連續(xù)無限，維持F1雜種具有的雜種活力、抗病性和其它遺傳特性的原始水平，從而使世界上的玉米種植區(qū)中該谷類作物的使用和生產(chǎn)大大改變?，F(xiàn)有技術(shù)的說明磨擦禾首先由Mangelsdorf等(1931)實現(xiàn)與玉米雜交。其它研究也證實了產(chǎn)生這兩個種間的可育雜種的可能性(Mangelsdorf等，1939；Galinat，1973)。其他研究人員進行的研究進一步提示將磨擦禾種質(zhì)漸滲至玉米中的可能性(Maguire，1961，1962；Reeves等，1964；deWet等，1972；Simone等，1976；Bergquist，1981；Cohen等，1984)。Petrov及其同事提出了將控制無融合生殖的基因由磨擦禾轉(zhuǎn)移至玉米中以形成不分離雜種的可能性(Petrov，1957；Petrov等，1984a)，并報道了成功的結(jié)果(Petrov等，1984b)；遺憾的是，對這些材料的遺傳學(xué)研究(Yudin等，1989)否定了這些發(fā)現(xiàn)。
在經(jīng)典的玉米/磨擦禾//玉米回交方案中，一旦得到56條染色體(20玉米+36磨擦禾)或38條染色體(20玉米+18磨擦禾)水平，通常會在無融合生殖中發(fā)生部分或全部丟失(deWet等，1974)。在該水平或該水平之上甚至只是部分表達(dá)無融合生殖的材料也可用于進一步研究，并可能作為嘗試使無融合生殖漸滲至玉米中的候選者。
讓有性生殖的個體與無性生殖的個體互交已成功地用于闡明禾本科中幾個種的無融合生殖機制。Harlan等(1964)運用孔穎草屬和雙花草屬的有性×有性、有性×無融合生殖和無融合生殖×有性來源的胚胎學(xué)和雜交研究，提出了一種雙基因座系統(tǒng)來解釋這些種中無融合生殖的遺傳性。無融合生殖體中無融合生殖基因被認(rèn)為是雜合的，無融合生殖對有性生殖來說是顯性的。有性二倍體的基因型懷疑為a1 a1 a2 a2，而四倍體基因型為A1 A1 a1 a1 A2 A2 a2 a2。此外，已發(fā)現(xiàn)兩個基因座之間平衡的基因型關(guān)系。在雀稗屬中，Burton等(1960)通過產(chǎn)生有性四倍體探討了無融合生殖的遺傳控制。在該方案中，有性四倍體與專性的無性四倍體雜交，隨后產(chǎn)生有性的同源四倍體。對該數(shù)據(jù)的分析表明，無融合生殖由一些隱性基因控制。
Hanna等(1973)通過將大黍(Panicum maximum)天然存在的有性四倍體與天然存在的四倍體無融合生殖體互交并評價其子代，提出在該物種當(dāng)中，無融合生殖相對有性生殖是隱性的，生殖方式可能由至少兩個基因座控制。
利用有性和無性的玉米/磨擦禾雜種進行的研究已預(yù)言了雜合的雙基因系統(tǒng)(Petrov等，1978，1979)。一套基因控制卵子的非減數(shù)作用(N)，而另一套控制卵子的無性(單性)發(fā)育(A)。提出的無融合生殖的四倍體磨擦禾的基因組成為N N n n A A a a。基于在無融合生殖的56染色體(20玉米+36磨擦禾)和無融合生殖的38染色體(20玉米+18磨擦禾)玉米-磨擦禾回交雜種中觀察到的分離，推測兩套基因是連鎖的(Petrov等，1978，1979)。未提出有性二倍體的基因組成。近來Kindiger和Dewald(未發(fā)表)對一套鴨茅狀磨擦禾三倍體的有性和無性生殖系統(tǒng)的分離進行的研究，也提示無融合生殖由兩個顯性基因控制。
盡管有將無融合生殖性狀引入正常有性作物的需求，并且已有一些使栽培種與關(guān)系較遠(yuǎn)的野生種雜交的成功的例子，迄今為止，還未實現(xiàn)使無融合生殖漸滲入有性作物。在很多情況下，這種努力由于不能得到相關(guān)的無融合生殖的野生型或無法實現(xiàn)栽培品種和野生型的雜交而遇到障礙。Asker(1992)報道將無融合生殖性狀引入小麥、大麥、高粱、甜菜、玉米和許多其它作物的努力大多以失敗告終。
到現(xiàn)在為止，有關(guān)無融合生殖的最成功的方案是將控制無融合生殖的基因由狼尾草屬野生種轉(zhuǎn)移到栽培種之中(Dujardin，1983，Dujardin等，1989)。與珍珠稗的種間雜 種通常是高度雄性不育的。然而，無融合生殖的雜種中，產(chǎn)生可育花粉的正常雄性減數(shù)分裂通常是繼續(xù)雜交的前提，因為無融合生殖的固有特性是缺乏減數(shù)分裂過的減數(shù)(即重組)的雌性配子。通過提高誘導(dǎo)的四倍體珍珠稗(2n＝4x＝28)，野生的無融合生殖的種P.squamulatum Fresen(2n＝6x＝54)和象草(P.purpureum Schum)(2n＝4x＝28)之間產(chǎn)生的復(fù)合雜種的雄性不育性，漸滲珍珠稗中的無融合生殖基因已獲得了進展(Dujardin等，1989，本文引作參考)。Maxon等(1989)也報道，以無性可傳遞的雄性不育因子(AMS載體)處理植物使無融合生殖現(xiàn)象轉(zhuǎn)移至有性種(大豆)中也取得了一些進展。
發(fā)明概述我們已成功地證實無融合生殖機制可由野生種轉(zhuǎn)移到主要的栽培種背景中，以提供以無性發(fā)育為特征的純育植物。具體來說，我們已產(chǎn)生了其玉米染色體所占比例較現(xiàn)有技術(shù)迄今報道比例更高的無融合生殖的玉米/磨擦禾雜種。本發(fā)明范圍內(nèi)的雜種的玉米染色體∶磨擦禾染色體的比例為至少30∶9。示出了包括30-70個玉米染色體和9個磨擦禾染色體的核型，其中包括帶有無融合生殖基因的磨擦禾16號染色體長臂易位至玉米6號染色體長臂的核型。具30個玉米(Zea mays)染色體和9個磨擦禾染色體的代表性雜種已于1995年7月27日保藏于ATCC，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland 20852 USA，ATCC登記號為97233。
根據(jù)本發(fā)明的目的，即使無融合生殖漸滲至通常通過有性生殖繁殖自身的植物中，我們已成功地產(chǎn)生了玉米/磨擦禾雜種，它們在基因型上較現(xiàn)有技術(shù)中已知的雜種更像玉米。這些雜種所含的顯性遺傳物質(zhì)使雜種規(guī)避有性生殖過程，而代之以無融合生殖形式，即通常所稱的蝶須屬型二倍孢子形成的無融合生殖。
本發(fā)明的另一目的是提供具有來自磨擦禾的9個染色體和30-70個玉米染色體的一套染色體的玉米，其具有二倍孢子形成的無融合生殖能力。這些植物可用作育種庫，以產(chǎn)生具有更高比例的玉米染色體并減少磨擦禾染色體數(shù)量的無融合生殖的雜種。
本發(fā)明的再一個目的是提供建立專性無融合生殖的玉米的永生化商業(yè)品系的基礎(chǔ)，該玉米具有穩(wěn)定的遺傳特征，而無需通過與選定親本品系的多步或重復(fù)雜交連續(xù)生產(chǎn)雜種種子。
本發(fā)明的又一個目的是提供一系列用于分析玉米/磨擦禾雜種的無融合生殖行為的DNA標(biāo)記。
本發(fā)明的再一個目的是提供決定和控制二倍孢子形成的無融合生殖的基因，以及根據(jù)基因與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)提供基因與特定的分子連鎖群的相應(yīng)關(guān)系，并根據(jù)細(xì)胞遺傳和分子研究提供基因在特定染色體上的定位。
最后，本發(fā)明的目的是提供可以通過經(jīng)典的植物育種方法、細(xì)胞和組織培養(yǎng)方法和/或植物轉(zhuǎn)化和遺傳工程技術(shù)將所需基因引入玉米以及其它植物種的遺傳物質(zhì)，隨后這些植物可以通過克隆選擇、再生和繁育，形成能夠進行二倍孢子形成的無融合生殖的個體。
本發(fā)明其它目的和優(yōu)點由以下敘述顯而易見。
種子的保藏包括含有30個玉米染色體和9個鴨茅狀磨擦禾染色體的雜種的至少2500粒種子的樣品代表本文所稱的V162家族，于1995年7月27日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)則保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，并已給予登記號ATCC97233。
附圖簡述


圖1表示用來發(fā)展與無融合生殖關(guān)聯(lián)的RAPD標(biāo)志的五個家族間的一般譜系/關(guān)系。
圖2表示玉米第6號染色體的相對分子圖，包括玉米和部分同源的磨擦禾連鎖群。
圖3比較了磨擦禾16號染色體，玉米6號染色體和Mz6L-Tr16L易位，并給出了關(guān)聯(lián)的RAPD引物和RFLP標(biāo)記。
術(shù)語無融合生殖以各種無性生殖形式代替有性生殖。專性無融合生殖體據(jù)信具有完全封閉的重組系統(tǒng)，而在兼性無融合生殖體中，無融合生殖和有性生殖方式共存。
BIII雜種由未減數(shù)的卵子(2n)與減數(shù)的精核(n)融合產(chǎn)生的個體。
二倍孢子的假配合極核由精子受精從而刺激未減數(shù)的卵細(xì)胞的無融合生殖發(fā)育。
連鎖群位于任一染色體上的基因或分子標(biāo)記的順序排列。
減數(shù)分裂與有性生殖關(guān)聯(lián)的一種核分裂類型，由一個二倍體細(xì)胞產(chǎn)生四個單倍體細(xì)胞，其過程包括兩輪分裂。減數(shù)分裂用來使染色體數(shù)目減半，從而防止每一代中發(fā)生染色體加倍，并通過獨立的分配和重組在子細(xì)胞中產(chǎn)生遺傳物質(zhì)的混合。
Mz6L-Tr16L-隨體(或Mz6L-Tr16L)染色體磨擦禾16號染色體(Tr16)長臂易位至玉米第6號染色體長臂末端形成的染色體。
多胚性在單個胚珠內(nèi)有幾個胚胎發(fā)育；一個合子形成一個以上胚胎，如同卵雙生。
RAPD隨機擴增多態(tài)DNA。
RFLP隨機片段長度多態(tài)性。
發(fā)明詳述遺傳模型作為理解無融合生殖由鴨茅狀磨擦禾漸滲至玉米中的機制的基礎(chǔ)，我們已建立了一個磨擦禾中無融合生殖因子的遺傳和分離的遺傳模型。若不囿于任何特定理論，此處提出該模型作為理解本發(fā)明以下敘述的上下文。提出的遺傳模型及鴨茅狀磨擦禾中無融合生殖遺傳的基因型組合于以下表I中提供。
表I由有性二倍體×無融合生殖四倍體雜交產(chǎn)生的三倍體鴨茅狀磨擦禾雜種中無融合生殖因子的遺傳和分離模型基因組成a預(yù)計頻率 母本育性 生殖方式N N n A A a1 3高育性三倍體 無融合生殖N n n A A a2中等育性三倍體 無融合生殖n n n A A a1不育 有性生殖N N n A a a2幾乎完全不育，＞99％ 有性生殖N n n A a a4幾乎完全不育，＞99％ 有性生殖n n n A a a2 13 不育 有性生殖N N n a a a1不育 有性生殖N n n a a a2不育 有性生殖n n n a a a1不育 有性生殖a 三倍體由有性二倍體(n n a a)與無融合生殖四倍體(N N n n A A aa)雜交產(chǎn)生。
該模型包括假設(shè)具有以下特性的兩個獨立分離的基因座(I)N為非減數(shù)作用的顯性等位基因；(II)A為控制未減數(shù)的卵子無融合生殖發(fā)育(孤雌發(fā)育)的顯性等位基因；(III)非減數(shù)(N)和無融合生殖(N)基因是上位的和不完全顯性的，因此需要兩倍劑量才能必然發(fā)生卵子的非減數(shù)作用和無融合生殖發(fā)育。一倍劑量N和兩倍劑量A可能會產(chǎn)生“滲漏”表型，其中非減數(shù)作用和可能的無融合生殖發(fā)育是偶然的，而不是經(jīng)常的(極少超過40％育性)；(IV)兩個基因系列(N，n和A，a)的適當(dāng)劑量或平衡對高頻率的無融合生殖發(fā)育是必需的要素；(V)存在兩類“可育的”三倍體，并且每一類保持略微不同的基因組成(N N n A A a＝高度可育的三倍體，N n n A A a＝中度可育的三倍體)；及(VI)所有其它基因型分離產(chǎn)物是有性(非無融合生殖)發(fā)育(經(jīng)歷減數(shù)分裂)，并且由于其為三倍體而被認(rèn)為是高度可育的。然而，這并非意味著表現(xiàn)為雌性可育的極低水平的無性發(fā)育在這一類(即N N n A a a和N n n A a a)的某些個體中極少發(fā)生。
根據(jù)表I的預(yù)測和上列參數(shù)，可以預(yù)計到13不育2中等可育1高度可育的比例。高度可育的個體應(yīng)當(dāng)具有N N n A A a基因型。中等可育的個體基因型為N n n A A a。不育或幾乎完全不育的個體具有所有其它基因型組合。
在一項由有性二倍體(2n＝36)個體與無性四倍體(2n＝4x＝72)花粉親本雜交產(chǎn)生的387個三倍體(2n＝3x＝54)雜種的研究中，該模型得以證實。同樣，由有性二倍體與“合成”或BIII-來源的無性四倍體雜交產(chǎn)生的90個三倍體子代也以預(yù)期的13∶2∶1的比例分離。
另外，偶爾也會產(chǎn)生由不育的三倍體(2n+n交配)產(chǎn)生的BIII-來源的四倍體雜種。該模型預(yù)測這種4×BIII雜種是不育和非無融合生殖的。四個高度可育的3×雜種雜交產(chǎn)生4個BIII來源的四倍體，證實了上述預(yù)測。每一BIII-來源的四倍體都是高度不育的(超過99％)。
最后，有性和無性的玉米-磨擦禾雜種的細(xì)胞遺傳和分子評價以及無融合生殖的玉米6L-Tr16L易位原種表明只有一個染色體臂帶有賦予無融合生殖的基因。這表明等位基因N和A位于Tr16L上。
39染色體無融合生殖的玉米/磨擦禾雜種的產(chǎn)生在本發(fā)明工作之前，Petrov等(1984b)在俄羅斯育成了一種玉米/鴨茅狀磨擦禾雜種，此后稱之為H278。該雜種核型為20玉米和36磨擦禾染色體，并被用來通過與玉米回交而產(chǎn)生一些與H278遺傳上等同的56染色體(20玉米+36磨擦禾染色體)無融合生殖的雜種。隨后，利用本地的開放傳粉二倍體玉米栽培種與H278回交(Petrov等，1984b)產(chǎn)生了具有38個染色體(20玉米+18磨擦禾)的5個個體。其中，3個個體可見產(chǎn)生減數(shù)分裂或有性生殖方式來源的子代。第4個個體完全不育，而第5個個體產(chǎn)生染色體計數(shù)為38的子代(H781)。與二倍體(2n＝2x＝20)和四倍體(2n＝4x＝40)測交玉米連續(xù)回交15代之后，由該單一個體(H781)最終產(chǎn)生了大量具有10-30個玉米染色體和18-36個磨擦禾染色體的個體和家族。最近對來源于H781的材料的研究已證實它們能夠通過無融合生殖進行繁殖(Kindiger等，1995a)。
本發(fā)明的無融合生殖材料來源于前述的38染色體無融合生殖(20mz+18Tr)雜種，通過與二倍體和四倍體測交玉米進一步回交，并篩選58染色體的回交雜種(40Mz+18Tr)獲得。該58染色體的個體是基因組聚集過程的結(jié)果，基因組聚集過程中未減數(shù)的卵子不進行無融合生殖發(fā)育，而可由精核受精，形成BIII雜種(即2n+n交配)。鑒定的58染色體雜種與二倍體測交玉米回交。由雜交產(chǎn)生的種子形成具有30玉米+9磨擦禾染色體的個體，如
圖1譜系樹最左支所示。39染色體的子代為完全有性過程的結(jié)果，而具有20Mz+9Tr染色體的未減數(shù)卵細(xì)胞由單倍體(n＝10)精核受精。這樣產(chǎn)生了30Mz+9Tr染色體的個體。
在本文所述雜種中，有部分雄性育性的證據(jù)，這是使極核能夠受精和隨后產(chǎn)生有活力的種子的有用性狀。然而，在商業(yè)育種程序中，胚乳和種子發(fā)育必需的花粉可由任何玉米花粉來源或培育的栽培種提供，花粉源種植于無融合生殖的雜種附近使得傳粉能夠進行。由于栽培種的未減數(shù)卵子通過孤雌生殖發(fā)育，花粉源當(dāng)然不會影響無融合生殖的栽培種的遺傳學(xué)。
通過前述方法已產(chǎn)生了幾個無融合生殖的玉米/磨擦禾雜種家族。在各例中，均存在同樣的9個磨擦禾染色體，即，磨擦禾染色體7、10、11、12、13、14、16、17和18。這套染色體被命名為9B系列。細(xì)胞學(xué)觀察表明這9個染色體通常是正常存在于磨擦禾的18個染色體中較小的染色體。它們可通過細(xì)胞學(xué)觀察或使用特定引物(如十聚體引物)進行RAPD分析獲得陽性鑒定，下文實施例2中將詳述所述鑒定。
根據(jù)對具有18個或9個磨擦禾染色體的植物衍生的有性和無融合生殖的個體進行RAPD研究的結(jié)果，我們已確定有性回交雜種代表了9個連鎖群中的8個。這使得只有一個連鎖群可能攜帶無融合生殖的基因。因此，結(jié)論是基因A和N位于同一個染色體上，并且在空間上距離足夠遠(yuǎn)，使得它們在花粉/小孢子發(fā)育中重組后能夠獨立分離。因此，這些基因的特征在于非連鎖。
通過研究特定的玉米/磨擦禾雜種使得無融合生殖的基因與Tr16的長臂(Tr16L)相對應(yīng)。在對具有來自9B系列的40個玉米和8個磨擦禾染色體的非無融合生殖的(有性)玉米/磨擦禾雜種(V142-3)進行核型分析中，可見磨擦禾染色體組中缺Tr16，表明其必定與無融合生殖關(guān)聯(lián)。其次，在具有Mz6L-Tr16L-隨體染色體(易位的Tr16L，見下文討論)的無融合生殖個體(V9)的根尖壓片中，可見該植物缺少Tr16短臂，但具有易位至Mz6L遠(yuǎn)末端的Tr16L片段(見實施例4)。因此，可以得出結(jié)論無融合生殖基因必定位于Tr16的長臂(隨體末端)。
一個稱為V9的39-染色體無融合生殖的玉米/磨擦禾雜種來源于最初的F1雜種H278，如
圖1所示。它類似于V162的衍生，但其為減數(shù)分裂的結(jié)果，產(chǎn)生具有10Mz+18Tr染色體的個體。V9個體的獨特在于它們以Mz6L-Tr16L易位為特征，該易位由允許Mz6和Tr16的部分同源區(qū)域之間配對的部分減數(shù)分裂過程產(chǎn)生。該易位區(qū)別于，但也類似于Maguire(1961，1962)和Kindiger等(1990)所述玉米9號染色體的易位。帶有核仁組織區(qū)(NOR)和隨體的每一染色體有助于參與Mz6L-Tr16L易位的玉米和磨擦禾染色體的鑒定。經(jīng)典的玉米核型表明玉米隨體位于6S，而磨擦禾核型顯示隨體位于16L。Mz6L-Tr16L易位在有小的Tr16L區(qū)段加入的6號染色體的兩個末端具有隨體。參見圖3和下文實施例2和3的進一步討論。
無融合生殖體的特征本發(fā)明的雜種在無融合生殖方面具有以下特征無融合生殖的子代無融合生殖的子代可通過多種技術(shù)鑒定。大多數(shù)子代染色體數(shù)與其無融合生殖的親本相同，只有BIII雜種例外。因此，例如39染色體個體的子代也具有39個染色體，或在BIII-雜種時為49或59個染色體。本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞學(xué)方法可用于確定個體中的染色體數(shù)。在子代之間以及子代和親本之間，遺傳均一性是可以預(yù)見的。這種均一性可以通過例如子代檢測、同工酶和分子方法確證。但是，由于BIII雜種的出現(xiàn)，相關(guān)的無融合生殖體的分子帶型偶爾可見到差異，下文詳細(xì)討論。BIII雜種BIII雜種被定義為由未減數(shù)的卵子(2n)與減數(shù)的精核(n)融合產(chǎn)生的個體。在蒺藜草屬(Bashaw等，1990b)、雀稗屬(Burson，1992)、狼尾草屬(Bashaw等，1992)及最近在磨擦禾屬(Kindiger等，1994a)中，這種2n+n交配已在文獻(xiàn)中有充分的敘述。作為鴨茅狀磨擦禾中無性發(fā)育的獨特生殖特征，預(yù)計如果無融合生殖的磨擦禾基因在玉米背景中具有全部功能，這種方式會在玉米-磨擦禾雜種中表現(xiàn)出來。BIII雜種的產(chǎn)生通常為相對低頻出現(xiàn)的事件。如下文實施例2中所示，39染色體的無融合生殖體出現(xiàn)2n+n交配的百分比通常低于10％。在二倍體形式的磨擦禾中未見產(chǎn)生BIII雜種，并且預(yù)期也不會產(chǎn)生，因為這些植物的生殖形式為有性。多胚性鴨茅狀磨擦禾中出現(xiàn)多胚性已由Farquharson(1955)觀察到和報道。多胚性未見于有性二倍體形式，而只是磨擦禾無融合生殖形式的獨特特征。盡管未進行充分的研究，推測磨擦禾中出現(xiàn)多個胚胎是在極核受精和未減數(shù)卵細(xì)胞的無融合生殖刺激之后(Farquharson，1955)。未減數(shù)的卵子的無融合生殖發(fā)育之后，刺激了鄰近的助細(xì)胞自動發(fā)育成有活力的胚。
在磨擦禾和玉米-磨擦禾雜種中，雙生體具有相同的染色體數(shù)(均為無融合生殖體)或不同的染色體數(shù)(一個為無融合生殖體，另一個為BIII來源的雜種或兩者均為BIII雜種，由2n+n雜交產(chǎn)生)。雙生和三生多胚已在磨擦禾和30Mz+9Tr無融合生殖的雜種材料中觀察到。
但是，在玉米中出現(xiàn)多胚性不是沒有先例。Kermicle(1969)在具有ig(不確定的配子體)等位基因的玉米原種中觀察到多胚性，該等位基因允許玉米中形成雄核發(fā)育的單倍體。Lin(個人通訊)和Kindiger等(1993)進一步證實在額外的ig原種發(fā)育期間多胚性可以選擇性降低或提高。在兩種情況下，均未觀察或預(yù)計到這些材料的無融合生殖。在ig的情況下，多胚性與玉米的非無融合生殖品系關(guān)聯(lián)。但是，預(yù)計在無融合生殖的玉米-磨擦禾回交雜種中觀察到的多胚性，真實地反映了無融合生殖基因成功地由磨擦禾轉(zhuǎn)移至這些雜種中的結(jié)果，因為ig未引入玉米-磨擦禾雜種材料中。不完全減數(shù)分裂多倍體磨擦禾被認(rèn)為是兼性或近于專性的無融合生殖體。因此，它具有一定水平的有性發(fā)育(即減數(shù)分裂后有精子和卵子的受精)。已有人提出，在某些表現(xiàn)出有絲分裂的二倍孢子形成的植物中，偶爾會發(fā)生進入減數(shù)分裂的情況，但在很早的階段就終止了?？赡苁沁@種不完全減數(shù)分裂過程允許不改變?nèi)旧w數(shù)而發(fā)生遺傳改變。這種行為通常稱為第一次分裂恢復(fù)，并已在無融合生殖的磨擦禾中見到(Kindiger等，1995b)。它允許產(chǎn)生新的重組類型，而不減少染色體數(shù)或由外部花粉源引入新的等位基因。不完全減數(shù)分裂過程的偶爾發(fā)生也見于無融合生殖的玉米-磨擦禾雜種。這種行為為無融合生殖因子由磨擦禾中成功地轉(zhuǎn)移到玉米中并在玉米背景中表達(dá)該性狀提供了進一步的證據(jù)。倍性相關(guān)的無融合生殖表達(dá)在磨擦禾中，已觀察到由2n+n交配產(chǎn)生的BIII來源的五倍體(2n＝5x＝90)和六倍體(2n＝6x＝108)雜種表現(xiàn)出完全或近乎完全的雌性育性。因為2n+n交配中不會丟失母本基因組和無融合生殖基因，花粉親本額外基因組的作用肯定是打破了控制無融合生殖的基因的平衡。這種行為在無融合生殖種中明顯是不尋常的(Asker和Jerling，1992)。
對產(chǎn)生無融合生殖的38、48、58和68染色體的BIII-來源雜種的2n+n交配產(chǎn)生的玉米-磨擦禾BIII來源雜種的結(jié)實能力進行觀察，也表明了失去結(jié)實能力的趨勢。結(jié)實率從具有38染色體(20Mz+18Tr)的個體的約30％到具有58染色體(40Mz+18Tr)的個體的約5％。58染色體以上，育性基本上為零。核苷酸標(biāo)記也許正如預(yù)計的那樣，存在著與無融合生殖關(guān)聯(lián)的獨特的核苷酸序列或標(biāo)記。其中，包括可通過多種試驗中的任一種鑒定的控制無融合生殖的等位基因A和N的獨特的標(biāo)記。下文實施例2敘述了使用RAPD分析區(qū)分無融合生殖和非無融合生殖的個體。
無融合生殖進一步漸滲至玉米背景中設(shè)計了多種技術(shù)使用本文所述的30Mz+9Tr雜種作為起始材料使無融合生殖進一步漸滲至玉米背景中。當(dāng)然，據(jù)信減少磨擦禾染色體套數(shù)的原材料優(yōu)選具有Mz6L-Tr16L易位的材料(如來自V9家族的個體)。經(jīng)典育種該方法取決于前述由原始F1雜種H278獲得含有39染色體(30Mz+9Tr)的材料的策略。30Mz+9Tr材料同樣可以成功地與玉米回交。2n+n交配之后，選擇無融合生殖并且玉米染色體套數(shù)增加(即基因組聚集)的BIII-來源的雜種。采用該策略，可以衍生出具有49(40Mz+9Tr)、59(50Mz+9Tr)、69(60Mz+9Tr)和79(70Mz+9Tr)染色體的個體。由于玉米基因組的增加，進一步減少磨擦禾遺傳物質(zhì)比例是可能的。一般情況下，40-70個玉米染色體的存在或積累導(dǎo)致出現(xiàn)不頻繁的有性過程，這引起磨擦禾9B系列染色體的進一步隨機丟失。以這種方式可以產(chǎn)生具有整套玉米染色體和減少了的一套磨擦禾染色體的植物。
由于N和A基因不連鎖，設(shè)想獲得無融合生殖的玉米F1雜種是可能的。每一基因獨立轉(zhuǎn)移至玉米的兩個互補近交系中會使雜種無融合生殖。該系統(tǒng)類似于玉米和高粱雜種種子的商業(yè)生產(chǎn)中所用的胞質(zhì)雄性不育系/恢復(fù)系系統(tǒng)。小孢子培養(yǎng)在無融合生殖的磨擦禾和無融合生殖的玉米 磨擦禾雜種中，蝶須屬型二倍孢子形成的無融合生殖體表現(xiàn)出的經(jīng)典行為表明大孢子發(fā)生(卵子的發(fā)育)過程中忽略了減數(shù)分裂。但是，在小孢子發(fā)生(花粉發(fā)育)過程中減數(shù)分裂正常進行。孤雄發(fā)育是胚胎的基因組成僅來源于雄性配子體的胚胎形成。通過孤雄發(fā)育產(chǎn)生單倍體植物已在一種稱為花藥培養(yǎng)的方法中進行了探討(Collins，1977；Morrison等，1988)。成熟的玉米小孢子法已由二倍體(2n＝2x＝20)玉米個體產(chǎn)生的減數(shù)小孢子獲得了單倍體(1n＝1x＝10)個體(Ting等，1985；Pescitelli等，1988)。對玉米-磨擦禾雜種(Kindiger等，1993)進行的觀察已證實減數(shù)分裂是正常的，并且在減數(shù)分裂形成之后破壞了花粉發(fā)育。
通常，經(jīng)典的小孢子技術(shù)使用兩種培養(yǎng)基系統(tǒng)。第一種是用于愈傷組織發(fā)育的Murashige和Skoog MS起始培養(yǎng)基(Green等，1975；和Conger等，1987，二者均被本文引作參考)。愈傷組織形成之后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基中刺激根和莖的發(fā)生。發(fā)育的小植株轉(zhuǎn)移至無菌土壤混合物中維持和繼續(xù)發(fā)育。小孢子培養(yǎng)法一般在減數(shù)分裂之后(有絲分裂之前)的單核階段或在此之前分離有活力的小孢子。培養(yǎng)由30Mz+9Tr和40Mz+9Tr個體獲得的小孢子極有可能成功地產(chǎn)生具有Tr染色體數(shù)減少的有活力的“單倍體”小孢子。在39染色體植物的情況下，具有少于5個的不同數(shù)目Tr染色體的二倍體玉米(2n＝2x＝20)是結(jié)果之一。另外，還會產(chǎn)生具有不同玉米染色體和磨擦禾染色體數(shù)的幾種非整倍體個體。一個實例是具有18Mz和0-5Tr染色體的個體。也許更具價值的是由具有40Mz+9Tr染色體的個體培養(yǎng)的小孢子。小孢子發(fā)生過程中正常的減數(shù)分離將會提供具有20個玉米染色體和隨機數(shù)目的0-5Tr染色體的“二倍體”小孢子。由兩種核型中的任一種起始，目標(biāo)都是通過小孢子法使玉米和磨擦禾染色體數(shù)減少，并篩選具有無融合生殖方式的減數(shù)產(chǎn)物。很有可能在每種情況下都會產(chǎn)生核型為20Mz染色體和Tr16染色體的無融合生殖個體。小孢子培養(yǎng)法的產(chǎn)物必需具有Tr16染色體或在如前述的Mz6L-Tr16L染色體的易位形式中的染色體的一部分。本文所述的標(biāo)準(zhǔn)方法可用來鑒定這些材料中是否存在完整的Tr16或Mz6L-Tr16L染色體。
鑒定無融合生殖基因通過染色體步查分離和克隆基因現(xiàn)在，已有幾種方法可由植物基因組中鑒別、鑒定和分離基因。每一種方法都依賴于分子標(biāo)記及其與目的基因的關(guān)聯(lián)和連鎖的利用。接近所述基因的標(biāo)記被認(rèn)為與該基因緊密連鎖并且是最有價值的。與該基因關(guān)聯(lián)但不一定與其緊密連鎖的其它標(biāo)記也有價值但直接的價值較小。實施例2(第V部分)所述的7個RAPD標(biāo)記大小為200-1200bp，并與無融合生殖發(fā)育(無融合生殖基因)關(guān)聯(lián)。這些標(biāo)記證實了Tr16具有無融合生殖基因的細(xì)胞學(xué)測定，并提供了該基因位于Tr16長臂的必要證據(jù)。這些標(biāo)記也提供了追查無融合生殖性狀和基因在Tr16臂或Mz6L-Tr16L易位上的位置。
RAPD分析產(chǎn)生的帶可由瓊脂糖凝膠上分離并克隆至大腸桿菌型質(zhì)粒(載體)中。這些克隆可用作鑒定任何磨擦禾種或玉米-磨擦禾雜種中是否存在無融合生殖的RFLP標(biāo)記。
另外，這7個RAPD標(biāo)記與Tr16染色體上的特定DNA區(qū)域關(guān)聯(lián)。這些標(biāo)記在Tr16染色體上的空間分布可用來對控制無融合生殖的A和N基因進行定位。標(biāo)記與基因之間的順序、位置和空間關(guān)系因而可通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法作圖。一旦確定了基因的位置，就可使用標(biāo)準(zhǔn)的基因分離技術(shù)。例如，染色體可通過脈沖凝膠電泳或標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖電泳，使用這些標(biāo)記作為提取基礎(chǔ)或基點進行分離。一旦分離到所需片段，就可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進行測序。通過轉(zhuǎn)座子標(biāo)記分離和克隆基因另一個對A和N基因進行定位和分離的方法是使用轉(zhuǎn)座因子系統(tǒng)。通常稱為“跳躍基因”的這些自主因子由一個染色體跳躍至另一個染色體，改變基因組的遺傳結(jié)構(gòu)并且產(chǎn)生突變。一個稱為增變因子“Mu”的轉(zhuǎn)座因子特別活躍，并被成功地用來確定基因的位置，以及提供分離基因的標(biāo)記(Chomet，1994；Walbot等，1986)。Mu進入染色體的特定位點或基因修飾了該基因的序列，因此改變了其表達(dá)。作為玉米中的一個實例，Mu因子插入Wx(非蠟質(zhì))基因座改變了該基因，從而產(chǎn)生Wx(蠟質(zhì))表型，該表型通過修飾種子中淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出來。發(fā)生這種情況時，Mu在該基因座留下了特定的遺傳指紋；因而可以通過成熟的方法分離相應(yīng)片段和基因(Chandler等，1994；Martienssen等，1989；和O′Reilly等，1985)。
我們已通過簡單回交成功地將Mu因子轉(zhuǎn)移到了30Mz+9Tr染色體品系中并且通過2n+n交配產(chǎn)生了40Mz+9Tr BIII雜種個體。增加這些材料會產(chǎn)生大量帶有Mu因子的49染色體植株，預(yù)期Mu因子最終會插入一個控制無融合生殖的基因，從而賦予相應(yīng)個體一些嵌合特征。迄今，已在玉米-磨擦禾雜種中觀察到高度雄性不育伴隨著無融合生殖發(fā)育。在植物個體中尋找高度雄性不育部分將會發(fā)現(xiàn)一個Mu因子插入A或N基因座。另外，該嵌合部分產(chǎn)生的種子都會是有性來源的。由未受Mu插入影響的部分產(chǎn)生的種子會是無融合來源的。若發(fā)生這樣的情況，可以通過遺傳學(xué)家用來鑒定Mu插入的220bp末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)“標(biāo)記”分離和克隆該基因。發(fā)現(xiàn)目的無融合生殖基因突變后，對該基因進行定位的第一步是用可以公開獲得的Mul探針檢測含突變原種DNA的Southern印跡。突變基因座的遠(yuǎn)交和分離及其與Mul探針的關(guān)聯(lián)肯定地證實了探針，Mu插入，與目的基因的連鎖。
其它可用來定位和分離A和N基因的轉(zhuǎn)座因子系統(tǒng)包括Ac/Ds系統(tǒng)(Shure等，1983；Federoff等，1983；和Dellaporta等，1994)和Spm系統(tǒng)(Cone，1994)。
用無融合生殖基因轉(zhuǎn)化植物一旦分離到與無融合生殖關(guān)聯(lián)的基因，即可通過已知方法將它們插入質(zhì)粒中進行增強、維持和擴增。目前已知有幾種將基因插入植物和動物材料的方法。包括花粉轉(zhuǎn)化法(Ohta，Y.1986；Smith等，1994；deWet等，1985，三者均為本文引入作為參考)、電穿孔法(Rhodes等，1988；Krzyzk等，1995；二者均為本文引入作為參考)和微?；蜣D(zhuǎn)移法。一些方法利用聚乙二醇介導(dǎo)系統(tǒng)吸收所提供的基因進入細(xì)胞系中?；旧?，每一種方法均設(shè)計為將選定基因植入植物細(xì)胞(或原生質(zhì)體)中并將這些基因整合進選定種的基因組中(Kamo等，1987)。因為無融合生殖可能處于尚待鑒定的表達(dá)或抑制蛋白的控制之下，可能需要引入合適的調(diào)控序列以適當(dāng)控制宿主植物中的表達(dá)。
微粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法可能被認(rèn)為是今日產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用的最可靠和有效的方法。基本上，待插入的多個拷貝基因置于多種微粒介質(zhì)(碳化硅纖維、鎢粒子、金粒子等)的任一種之中，并插入所謂的基因槍中。一般通過注入空氣或壓力系統(tǒng)，可將這些顆粒射入植物愈傷組織中。鑒定基因整合進入愈傷組織的特定系統(tǒng)(也稱為報告基因)為大腸桿菌vidA“GUS”基因和花色素苷調(diào)節(jié)基因C1和B。一旦鑒定到轉(zhuǎn)化細(xì)胞，將它們由愈傷組織移出并轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中。最后通過愈傷組織由生長培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方法再生出完整植株。大田研究和子代檢測證實了無融合生殖的穩(wěn)定表達(dá)，因而也證明合適的等位基因已整合至基因組中。Lowe等(1995)報道用這種方法成功地轉(zhuǎn)化了玉米，該文獻(xiàn)本文引作參考。
當(dāng)然，其它轉(zhuǎn)化方法也可使用，如以玉米條斑病毒(MSV)或載有包括無融合生殖基因的重組裝核蛋白復(fù)合體的油壺屬(Olpidium)游動孢子轉(zhuǎn)染(Langenberg等，1995)。
可用來接受無融合生殖基因的非限制性的植物類別為農(nóng)學(xué)和園藝學(xué)上重要的植物，如谷類作物、飼料作物、種子繁殖的水果、種子繁殖的觀賞植物和經(jīng)濟作物。這些植物的非限制性實例為玉米、小麥、大麥、高粱、黑麥、燕麥、水稻、菜豆、豌豆、花生、小扁豆、西紅柿、胡椒、西瓜、蘋果、橙子、葡萄柚、檸檬、萊母酸橙、珍珠稗、苜蓿、洋蔥、胡椒、甜菜、糖甜菜、蕪菁、花莖甘藍(lán)、圓白菜、土豆、大豆、向日葵、亞麻、芥菜、紅花、油菜、棉花、煙草等。
無融合生殖基因產(chǎn)物的表達(dá)如上所述，無融合生殖可處于表達(dá)或抑制蛋白的控制之下。為檢測和鑒定這些蛋白，可將未轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的蛋白圖譜與類似的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的蛋白圖譜進行比較。例如，如果無融合生殖基因被引入玉米近交系Mo17中，可將其蛋白圖譜通過本領(lǐng)域熟知的方法與標(biāo)準(zhǔn)Mo17玉米近交系的蛋白圖譜進行比較，從而揭示蛋白在無融合生殖中起作用。分離、洗脫和生化分析可按常規(guī)方法進行。
無融合生殖體的用途本發(fā)明用于產(chǎn)生不分離的雜種特別有用，從而簡化商用F1雜種的生產(chǎn)。商用的栽培作物中出現(xiàn)無融合生殖將會減少常規(guī)雜種生產(chǎn)的很多缺點，包括1)抑制自花傳粉；2)增加和維持大量的雄性不育、保持系和恢復(fù)系；和3)當(dāng)雜種種子僅由雌性親本收獲時種植大面積的雜種的雄性和雌性親本以產(chǎn)生商用雜種。
無融合生殖增加產(chǎn)生最優(yōu)基因組合的機會。無論遺傳雜合程度，專性無融合生殖基因型植物的染色體數(shù)或染色體組成(即種間雜交)在繁育時均不分離。無融合生殖拓寬了基因庫并降低了商用雜種的遺傳可變性，因為它無須使用具有雄性不育誘導(dǎo)系統(tǒng)的母本來生產(chǎn)商用雜種。
本文考慮的無融合生殖作物可用作飼料或谷物栽培種，或作為有性種質(zhì)的雄性傳粉者以產(chǎn)生新的無融合生殖的飼料和谷物雜種。無融合生殖植物也可如上所述作為控制無融合生殖的基因來源。這些植物的種子當(dāng)然可作為食物、飼料和繁殖材料。種子也可作為淀粉、蛋白、油脂和其它可通過本領(lǐng)域熟知的方法分離或加工的成分的來源。
應(yīng)當(dāng)理解，本文所指的無融合生殖植物，無論是廣義的還是狹義的，都意在包括這些植物的所有營養(yǎng)和繁殖形式，包括生長中的或已收獲的植物、種子、花粉、根、莖、葉和其它各種植物部分和種子成分，特別是可用來產(chǎn)生植物子代的那些，而不論是通過常規(guī)技術(shù)還是組織培養(yǎng)技術(shù)獲得。
實施例1本發(fā)明的無融合生殖材料來自F1雜種個體，以下稱為H278(20Mz+36Tr)。H278是被稱為V182(2n＝2x＝40)的四倍體玉米測交種和四倍體鴨茅狀磨擦禾(2n＝4x＝72)雜交的結(jié)果，后者最初獲自墨西哥中部并在Tashkent Botanical Gardens，Tashkent，Uzbikitan(Petrov等，1984b)保持。V182四倍體玉米測交種的特征在于種子白色、果皮無色、果穗白色。雄花穗花藥黃色。這些性狀的遺傳標(biāo)記為y(白色)，而Y為黃色種子；P-WW為果皮無色、果穗白色。無色或黃色花藥稱為pl。具有花色素苷色素的二倍體玉米測交種(2n＝2x＝20)V174被用于下述的后續(xù)雜交中。V174植株為紫色(花色素苷色素)，種子有色，果穗有色，雄花穗具紫色花藥。這些性狀的遺傳標(biāo)記為A、C、Bz1、Bz2、R(有色種子)、B(植株紫色)、P1(紫色花藥，與無色或黃色相對)和P-WR(果穗紅色，但果皮無色)。鴨茅狀磨擦禾親本(Tp209)、玉米測交種和來自H278的無融合生殖種子和種質(zhì)于Southern Plains Range Research Station，Woodward，Oklahoma維持。
由最初的F1雜種(H278)通過無融合生殖育成了幾種遺傳上等同的56染色體(20玉米染色體+36磨擦禾染色體)F1雜種。隨后這些雜種之一的進一步回交使用本地的開放傳粉二倍體玉米品種(Petrov等，1984b)，獲得了5株38個染色體(20玉米+18磨擦禾)的個體。其中，3個個體可見產(chǎn)生通過減數(shù)分裂或有性生殖方式獲得的子代。第4個個體完全不育，而第5個個體(H781)產(chǎn)生染色體數(shù)為38的子代。隨后與二倍體(2n＝2x＝20)和四倍體(2n＝4x＝40)玉米測交種連續(xù)回交15代以上，最后由該單一個體(H781)產(chǎn)生了帶有18個磨擦禾染色體和10-40個玉米染色體的大量個體和家族。對由H278和H781獲得的這些材料所做的其它研究已證實了它們通過無融合生殖繁殖的能力(Kindiger等，1995a；Kindiger，1995b)。
38染色體材料與二倍體和四倍體玉米測交種的進一步回交之后，產(chǎn)生了另一系列具有30個玉米染色體和9個磨擦禾染色體的潛在無融合生殖材料。這些材料通過無融合生殖的38染色體個體與四倍體玉米測交種回交并篩選58染色體的BIII來源的雜種而得到。該個體是基因組聚集過程的結(jié)果，基因組聚集過程中未受精的卵子不會無融合生殖發(fā)育，而可接受精子核的受精，形成BIII雜種(2n+n交配)。鑒定的58染色體雜種與二倍體玉米測交種再次回交。這樣產(chǎn)生了具有30個玉米染色體+9個磨擦禾染色體的個體(見
圖1譜系樹的最左支)。七個這樣的個體于下述表II中報道。磨擦禾染色體由18個減少至9個是有性過程的結(jié)果(減數(shù)分裂I和II)，而聚集的玉米染色體導(dǎo)致無融合生殖表達(dá)的失敗。因此58染色體的雜種(40Mz+18Tr)形成具有20Mz+9Tr的減數(shù)的卵子。該單倍體卵子隨后由來自二倍體花粉親本的單倍體精核(n＝10)受精，產(chǎn)生具有30Mz+9Tr染色體的個體。
V162家族代表通過前述方法得到的30Mz+9Tr雜種。V162家族的50個個體植株的測量平均值獲得了下列的形態(tài)特征穗節(jié)葉(ear node leaf)長度76.22cm植株高度(至雄花穗尖端)173.96cm穗高(至頂穗基部)94.68cm分蘗數(shù)目8.5穗節(jié)葉寬度5.81cm頂穗節(jié)間長度14.12cm頂穗以上葉數(shù)2.12雄花穗分支數(shù)9.36雄花穗長度29.58cm穗長10.65cm每穗種子行數(shù)4兩組成對行“雄性不育”包括來自V162家族個體的至少2500粒種子的樣品保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，并給予登記號ATCC 97233，已如上述。
表II來自幾個無融合生殖的39染色體(30Mz+9Tr)玉米-磨擦禾雜種的子代的染色體數(shù)1ID 39染色體無2n+n總數(shù)BIII來源的雜(家族個體) 融合生殖體 交配產(chǎn)物 種的百分率V141-1 12 0 12 0V144-6 15 0 15 0V162-2 18 2 20 10V162-6 11 0 11 0V162-7 10 0 10 0V162-8 35 2 37 5.4V164-3 17 1 18 5.51Mz和Tr分別指玉米和磨擦禾染色體。
實施例2如實施例1所述產(chǎn)生具有30、40或50個玉米染色體和9個磨擦禾染色體的40個以上雜種家族，并采用多種技術(shù)對前述的一些無融合生殖方式和特征進行評價。用于評價冬季苗圃的材料從二月到四月生長于溫室中。溫度保持25C(+/-5C)，并由1000W金屬鹵化物燈提供9小時白晝長度。I.無融合生殖子代的出現(xiàn)染色體計數(shù)按Kindiger的方法(1993，本文引作參考)進行。每一家族的染色體計數(shù)證實所有個體的染色體計數(shù)均為39個染色體。根據(jù)已知的玉米和磨擦禾核型對這些個體進行了細(xì)致的核型分析，結(jié)果表明這些個體均具有30個玉米染色體和9個最小的磨擦禾染色體(即9B系列)。與玉米核型相比，最大的磨擦禾染色體(屬9B系列)較玉米染色體6、7和8為小。另外，由于大小、臂比和結(jié)構(gòu)造的差別，9個磨擦禾染色體無一類似于玉米一套染色體中的任一染色體，可能只有玉米染色體10例外。9個磨擦禾染色體均具有非常小的短臂，磨擦禾第16號染色體被示出，該染色體帶有磨擦禾一套基因組中的核仁組織區(qū)(隨體區(qū))。
利用已建立的Adh、Acp、Mdh、Phi、Pgd和Pgm的同工酶系統(tǒng)分析每一家族的個體的潛在“非正常型”。如Stuber等(1988)所述，針對每一同工酶系統(tǒng)的電泳技術(shù)用于該分析。該分析表明在研究的材料之內(nèi)和之中沒有同工酶變異性。II.BIII來源的雜種的出現(xiàn)如前面討論的那樣，如果無融合生殖的磨擦禾基因在玉米背景中完全正常地發(fā)揮功能，預(yù)期玉米-磨擦禾雜種中會表現(xiàn)出BIII雜種的出現(xiàn)。
根據(jù)染色體計數(shù)，來自幾個玉米-磨擦禾回交雜種的觀察到的BIII來源雜種的頻率可由以上表II中得到。V162家族中2n+n交配頻率為4/78或5.1％。V164家族中該頻率為1/18或5.6％。由以下表III可清楚地看出，由2n+n交配產(chǎn)生的類似個體可見于鴨茅狀磨擦禾的無融合生殖家族中，但出現(xiàn)頻率更高。由2n+n交配產(chǎn)生的BIII雜種的比較還表明磨擦禾的無融合生殖基因在39染色體雜種中存在并發(fā)揮功能。BIII雜種的產(chǎn)生在磨擦禾的有性、二倍體形式中未觀察到，并且其產(chǎn)生也未有預(yù)期。
表III在選擇的無融合生殖體鴨茅狀磨擦禾Accessionsa中BIII產(chǎn)生的雜種的頻率ID 最初親本評價的BIII來源的倍性 子代數(shù)目 雜種數(shù)目b百分率WW10082n＝4x＝72 107 7 6.5％WW21902n＝4x＝72 49 22 44.9％WW17662n＝3x＝54 113 28 24.8％WW22962n＝3x＝54 111 31 27.9％a根據(jù)來自4x x 4x，4x x 2x，3x x 2x和3x x 4x交配的染色體計數(shù)的數(shù)據(jù)。b包括所有2n+n交配，該交配產(chǎn)生新的四倍體(2n＝4x＝72)、五倍體(2n＝5x＝90)或六倍體(2n＝6x＝108)子代。III.多胚性的出現(xiàn)對30Mz+9Tr無融合生殖的玉米-磨擦禾雜種的評價包括由3個無融合生殖家族(106個個體)獲得的數(shù)據(jù)。其中25個(24％)是多胚的。評價的結(jié)果于以下表IV中報道。
表IV比較無融合生殖磨擦禾Accessions與無融合生殖30Mz+9Tr雜種的多胚性頻率家族/倍性子代數(shù)目多胚現(xiàn)象數(shù)目 多胚現(xiàn)象百分率(無融合生殖的磨擦禾)WW1008(4x) 209 39 18.7WW2167(4x) 315 47 14.9WW2031(4x) 474 8.5WW2296(3x) 237 49 20.7WWFT1-12(3x) 2355 611 25.9(無融合生殖的39染色體玉米-磨擦禾雜種)V162-8 3710 27.0V162-2 20 5 25.0V141-1 12 2 16.6V137 37 8 21.6IV.倍性對無融合生殖表達(dá)的影響分別對具有48、58、68、78和88個染色體(40、50、60、70米染色體+18磨擦禾染色體)的玉米/磨擦禾雜種個體的結(jié)實率進行了分析，結(jié)果表明58染色體以上結(jié)實能力顯著降低(表V)。對由無融合生殖的四倍體產(chǎn)生的五倍體(5x＝5n＝90)和六倍體(6x＝6n＝108)的結(jié)實率進行觀察，也表明通過相同的基因組聚集機制(即2n+n交配)增加倍性之后引起結(jié)實率(0-1％育性)的大幅降低。
表V各種無融合生殖的玉米-磨擦未雜種中的母本育性染色體組成1評價的家族數(shù)育性百分比220Mz+18Tr 630.030Mz+18Tr 615.040Mz+18Tr 4 5.050Mz+18Tr 2 060Mz+18Tr 1 070Mz+18Tr 2 01Mz和Tr分別指玉米和磨擦禾染色體的數(shù)目。2為根據(jù)具有相同染色體組成的家族的總值。該值為花序上潛在種子數(shù)的平均估計值。V.RAPD分析對新鮮的凍干葉材料中提取的DNA進行RAPD分析，以確定19個評價個體中遺傳同一性或鑒定其變異。按照Saghai Maroof等(1984)的方法提取DNA。按照Williams等(1990)建立的方法采用RAPD技術(shù)對個體進行分析。反應(yīng)是用大約5ng植物DNA進行的。Taq聚合酶和10×反應(yīng)緩沖液購自Perkin Elmer(Branchburg，NJ)。RAPD研究中所用的40個引物為十聚體寡核苷酸，以試劑盒A到K形式提供，購自O(shè)peron Technologies(Alameda，CA)。PCR擴增在帶有“熱蓋”附件的M.J.Research，PTC-100熱循環(huán)儀上進行。PCR擴增反應(yīng)程序為94EC 1.5分鐘1個循環(huán)，隨后是94EC 1分鐘；45EC 2分鐘及72EC 5分鐘34個循環(huán)，最后是45EC 2分鐘及72EC 5分鐘1個循環(huán)。擴增后，RAPD產(chǎn)物保持于4EC，然后于1.5％瓊脂糖凝膠上1×TBE中100V下分離4小時。EB染色1小時后于紫外光下顯色。由于偶爾形成或存在假象RAPD帶，不考慮微弱的或不合理的帶。評價時只考慮清楚的帶。另外，對表現(xiàn)出可疑或變化的帶型的個體或家族重復(fù)電泳以證實其真實性/可重復(fù)性。
一組8個玉米對照最初用于俄國玉米-磨擦禾程序，也用于本試驗中以幫助鑒別玉米背景中引物給出的有關(guān)信息。之前對這些十聚體引物給出的有關(guān)信息的評價表明它們能夠在無融合生殖和非無融合生殖的后代中間檢測遺傳可變性。RAPD評價均未鑒別出評價的家族或個體間的差異，這與偶爾出現(xiàn)的BIII來源的雜種中情況不同。
經(jīng)鑒定與無融合生殖有關(guān)的RAPD標(biāo)記(即Tr16的長臂)于以下表VI中報道。將帶有無融合生殖基因的磨擦禾染色體與這七個標(biāo)記進行比較，對所有品系的世代100％有效。即無論被分析的個體是否來源于具有18或9個磨擦禾染色體的親本，或來源于不同的后代品系，所述標(biāo)記與無融合生殖的關(guān)聯(lián)是100％準(zhǔn)確的。
Blakey(1993)(本文引作參考)披露了兩個RFLP標(biāo)記UMC62和UMC134與磨擦禾連鎖群L關(guān)聯(lián)。由于Mz6L-Tr16L易位的產(chǎn)生，我們現(xiàn)在知道連鎖群L表示磨擦禾染色體16的長臂。因此，通過參照，引物UMC62和UMC134肯定與無融合生殖關(guān)聯(lián)。另外，Leblanc等(1995)已報道了三個也定位于Mz6L遠(yuǎn)末端的玉米RFLP標(biāo)記(UMC62、UMC28和CSU68)。這些標(biāo)記在繁殖程序中也可用來觀察無融合生殖。
表VI引物和與無融合生殖關(guān)聯(lián)的相應(yīng)RAPD標(biāo)記引物 標(biāo)記的大致分子量 序列號引物序列OPA-01 3911 CAGGCCCTTCOPA-06 2512 GGTCCCTGACOPA-12 1523 TCGGCGATAGOPG-06 5524 GTGCCTAACCOPI-11 4195 ACATGCCGTCOPJ-14 12006 CACCCGGATCOPK-06 4897 CACCTTTCCC用來建立與無融合生殖關(guān)聯(lián)的RAPD標(biāo)記的5個家族的一般關(guān)系于
圖1中示出。有五個獨特的后代品系。五個家族中的四個來源于由染色體數(shù)目標(biāo)記的完全不同的途徑。V58A與所有其它家族的區(qū)別在于其表型上較其它家族更接近玉米，每穗行數(shù)更多，分蘗少或無。圖的最末行表示有性生殖來源的個體，它們已失去了無融合生殖的潛力，只有帶有Mz6L-Tr16L易位的V9例外(
圖1右下)。與無融合生殖關(guān)聯(lián)的RAPD標(biāo)記在這些個體中不存在，而存在于它們所有的無融合生殖親本中。
實施例3一個鑒定為V9的30Mz+9Tr染色體的玉米/磨擦禾雜種按實施例1所述相同的方法產(chǎn)生，所不同的是在無融合生殖發(fā)育階段，在Mz6和Tr16的同源區(qū)之間發(fā)生了減數(shù)分裂過程(聯(lián)會和重組)，從而產(chǎn)生了Mz6L-Tr16L易位。圖2為Mz6的相對分子圖。相對圖單位示于垂直線的左邊，具體基因示于右邊。磨擦禾連鎖群G和M同源，并分別與圖中位置84的上下區(qū)域共線。圖的右下，Tr16長臂易位表示為連鎖群L(B1akey，1993)。Mz6L-Tr16L易位原種(V9)似乎保留了大多數(shù)(如果不是全部的話)Mz6L，而失去了Tr16S臂。根據(jù)對磨擦禾材料、帶有36、18和9個磨擦禾染色體的無融合生殖的玉米-磨擦禾雜種、有性來源的玉米/磨擦禾雜種(即V142-3，其遺傳組中缺失Tr16)和四倍體玉米測交種的篩選，最初與無融合生殖關(guān)聯(lián)的18個RAPD標(biāo)記中，只有上述表VI中所述七個標(biāo)記存在于Mz16L-Tr16L原種中，這由相應(yīng)的RAPD帶指示。因此，所有18個RAPD標(biāo)記均存在于Tr16上。其中，7個位于Tr16L上。因而，Mz6L-Tr16L的連鎖群L清楚地顯示出帶有無融合生殖的基因。
圖3示出染色體圖(左邊，由上到下)，表示染色體Tr16、Mz6和Mz6L-Tr16L易位。所有與一個染色體臂相應(yīng)并與無融合生殖關(guān)聯(lián)的RAPD標(biāo)記采用操縱子技術(shù)(Operon Technologies)，Alameda，CA，USA表示為OP(操縱子)名稱后加具體的盒(A-K)和與每一十聚體引物相應(yīng)的具體引物編號(1-20)(即OPA-01)。所有與Tr16L和Mz6L相應(yīng)的RFLP標(biāo)記通過顯色劑表示為UMC或CSU名稱后加與探針相應(yīng)的特定數(shù)字(即UMC134)。提供了染色體Tr16、Mz6和Mz6L-Tr16L易位的線圖(具備隨體)，以使觀察者能看出每一染色體上RAPD和RFLP標(biāo)記的相對位置。隨體表示為大的實心圓。著絲粒表示為小的空心圓。規(guī)定了線圖中每一染色體的長(L)或短(S)臂，詞頭Tr和Mz表示磨擦禾和玉米染色體(即Tr16L或Tr16S)。Mz6L-Tr16L易位表示為“V9Mz6L-Tr16L”，并在最下面的線圖中示出。
實施例4Mu基因已通過2n+n繁殖過程插入無融合生殖材料。具有30Mz+9Tr染色體的植株(V162)與帶有幾個拷貝活性Mu因子的2n＝2x＝20玉米植株雜交(獲自D.Robertson，Iowa State Univ)。二倍體玉米種子無性種帶有基因ACRP1，該基因使玉米種子產(chǎn)生便于鑒定的顏色。來自雜交的具有40Mz+9Tr染色體的個體為2n+n交配的產(chǎn)物，將帶有Mu因子。
應(yīng)當(dāng)理解，前面的詳細(xì)描述僅為進行說明，在不背離本發(fā)明精神與范圍的前提下可對其進行改良和加以變化。本發(fā)明的范圍不限于所保藏的種子，至于該保藏的意圖，僅將其作為本發(fā)明的一個實施方案和本領(lǐng)域技術(shù)人員進行進一步改進的起點。
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序列表(1)一般信息(i)申請人Kindinger，Bryan K.
Sokolov，Victor(ii)發(fā)明名稱無融合生殖的玉米(iii)序列數(shù)目7(iv)通訊地址(A)聯(lián)系人Curtis P.Ribando(B)街道1815 North University Street(C)城市Peoria(D)州IL(E)國家USA(F)郵政編碼61604(v)計算機可讀形式(A)載體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)當(dāng)前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Ribando，Curtis P(B)登記號27976(ix)電訊信息(A)電話309-681-6513(B)傳真309-681-6688(2)序列1信息(i)序列特征(A)長度10堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列表述序列1CAGGCCCTTC 10(2)序列2信息(i)序列特征(A)長度10堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列表述序列2GGTCCCTGAC10(2)序列3信息(i)序列特征(A)長度10堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列表述序列3TCGGCGATAG10(2)序列4信息(i)序列特征(A)長度10堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列表述序列4GTGCCTAACC 10(2)序列5信息(i)序列特征(A)長度10堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列表述序列5ACATGCCGTC 10(2)序列6信息(i)序列特征(A)長度10堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列表述序列6CACCCGGATC 10(2)序列7信息(i)序列特征(A)長度10堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列表述序列7CACCTTTCCC 10
權(quán)利要求
1.無融合生殖玉米。
2.權(quán)利要求1的無融合生殖玉米，具有至少一個顯性基因N控制卵子的非減數(shù)作用，至少一個顯性基因A控制卵子的無融合生殖發(fā)育。
3.權(quán)利要求2的無融合生殖玉米，其中其基因組具有正好一個顯性基因A和正好一個顯性基因N。
4.權(quán)利要求1的無融合生殖玉米，其核型包括帶有無融合生殖等位基因的鴨茅狀磨擦禾16號染色體的長臂。
5.權(quán)利要求1的無融合生殖玉米，特征在于Mz6-Tr16易位。
6.一種無融合生殖玉米/磨擦禾雜種，其核型為玉米染色體∶磨擦禾染色體的比例為至少30∶9。
7.權(quán)利要求6的雜種，其中其核型包括30-70個玉米染色體和9個磨擦禾染色體。
8.權(quán)利要求1的玉米，在通過一種引物由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增的其基因組DNA中具有至少一個標(biāo)記，其中所說的引物選自序列1，序列2，序列3，序列4，序列5，序列6和序列7。
9.權(quán)利要求1的玉米的種子。
10.權(quán)利要求2的玉米的種子。
11.權(quán)利要求3的玉米的種子。
12.權(quán)利要求4的玉米的種子。
13.權(quán)利要求5的玉米的種子。
14.權(quán)利要求6的雜種的種子。
15.權(quán)利要求7的雜種的種子。
16.一種增加玉米/磨擦禾雜種中玉米染色體數(shù)的方法，包括將雜種與有性生殖的玉米品系回交并篩選BIII-來源的雜種。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所說的玉米/磨擦禾雜種包括30個玉米染色體和9個鴨茅狀磨擦禾染色體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所說的玉米/磨擦禾雜種ATCC登記號為97233。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所說的玉米/磨擦禾雜種包括Mz6-Tr16易位。
20.一種增加玉米/磨擦禾雜種中玉米染色體數(shù)的方法，包括將雜種與有性生殖的玉米品系回交，選擇具有Mz6-Tr16易位的個體，將該個體與有性生殖的玉米品系回交，篩選BIII-來源的雜種。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所說的玉米/磨擦禾雜種包括30個玉米染色體和9個鴨茅狀磨擦禾染色體。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所說的玉米/磨擦禾雜種ATCC登記號為97233。
23.一種將無融合生殖漸滲至有性生殖的玉米的方法，包括以包含顯性等位基因N和顯性等位基因A的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化玉米，等位基因N控制非減數(shù)作用，等位基因A控制非減數(shù)卵子的無融合生殖發(fā)育。
24.鴨茅狀磨擦禾16號染色體長壁的一個分離的片段，包括控制非減數(shù)作用的顯性等位基因N和控制非減數(shù)卵子的無融合生殖發(fā)育的顯性等位基因A。
25.分離的控制鴨茅狀磨擦禾的非減數(shù)作用的顯性等位基因N。
26.分離的控制鴨茅狀磨擦禾中非減數(shù)卵子的無融合生殖/單性發(fā)育的顯性等位基因A。
全文摘要
已育成了玉米染色體:摩擦禾染色體比例為至少30∶9的無融合生殖的玉米/摩擦禾雜種。這些雜種通過與選定親本品系反復(fù)雜交可用于使二倍孢子形成的無融合生殖漸滲至玉米背景中,最終建立具有穩(wěn)定遺傳特征的無融合生殖玉米的永生化商用品系,而無需連續(xù)產(chǎn)生雜種種子。提供了用于分析玉米/摩擦禾雜種的無融合生殖行為的DNA引物。
文檔編號A01H5/10GK1202199SQ96198378
公開日1998年12月16日 申請日期1996年9月23日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月22日
發(fā)明者B·K·金迪格爾, V·索科羅夫 申請人:美國政府農(nóng)業(yè)部