一種柳葉劍蕨愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種柳葉劍蕨愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌外植體的獲得、愈傷組織的誘導、懸浮細胞培養(yǎng)、稀土調(diào)控懸浮細胞生長等步驟，本發(fā)明方法所制備的柳葉劍蕨懸浮細胞生長速度快，利用稀土對柳葉劍蕨懸浮細胞進行有目的調(diào)控，可以在短期內(nèi)獲得大量的制藥原料，并能有效降低生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種柳葉劍蕨愈傷組織和懸淳細胞的快速繁殖方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及組培條件下柳葉劍蕨懸浮細胞的培養(yǎng)，屬于植物【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 柳葉劍蕨ZcLTOgra遞?e sa/ici/b/ia,劍蕨科植物，產(chǎn)浙江、安徽、河南、湖北、湖南、 江西、福建、臺灣、廣東、廣西、貴州、四川、甘肅，附生樹干或巖石上，海拔200-1200米。韓 國、日本也有。用于潤肺止咳，主治癆傷咳嗽。目前，柳葉劍蕨的天然資源貧乏，栽培過程中 產(chǎn)量和品質(zhì)有所下降，因此采用基因技術的方法，開發(fā)生產(chǎn)柳葉劍蕨的藥用成分，進行柳葉 劍蕨植物資源開發(fā)，亦是減少占地的一種新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供柳葉劍蕨細胞懸浮培養(yǎng)的快速繁殖方法，并通 過稀土對懸浮細胞調(diào)控獲得生長良好，生長速度快的懸浮細胞，可以規(guī)?；臑樗帍S提供 制藥原料。
[0004] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用下列技術方案： 取柳葉劍蕨的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污漬，流水沖洗30min，超 凈工作臺上氯化萊處理12min，無菌水沖洗5遍，滅菌處理過的柳葉劍蕨葉片接入培養(yǎng)基配 方為MS+NAAO. 5mg/L+IBA4mg/l+4mg/L檸檬酸誘導培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，附加 蔗糖30g/L，瓊脂6. 5g/L，PH5. 8,暗室培養(yǎng)，誘導30天后將誘導出來的愈傷組織放入液體培 養(yǎng)基MS+2,4-DO. 2mg/L+6-BA0. 2mg/L進行懸浮細胞培養(yǎng)，每個三角瓶接種50mLMS液體培 養(yǎng)基，接種后置于旋轉式搖床振蕩培養(yǎng)，搖床轉速為80 r/min，溫度25°C，附加蔗糖30g/L， PH5. 8,光照20001x，繼代2-3次，培養(yǎng)基中加入2mg/L的硝酸鋪，30天后，取出稱重。
[0005] 采用本發(fā)明制備的柳葉劍蕨懸浮細胞，生長速度快，利于大生產(chǎn)操作，能耗小，污 染小，柳葉劍蕨懸浮細胞增長率為85%。
[0006] 下面將結合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明要求保護的范圍并不 局限于下列實施方式。

【具體實施方式】 [0007] 實施例1 取柳葉劍蕨的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污漬，流水沖洗30min，超 凈工作臺上氯化萊處理12min，無菌水沖洗5遍，滅菌處理過的柳葉劍蕨葉片接入培養(yǎng)基配 方為MS+NAAO. 5mg/L+IBA4mg/l+4mg/L檸檬酸誘導培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，附加 蔗糖30g/L，瓊脂6. 5g/L，PH5. 8,暗室培養(yǎng)，誘導30天后將誘導出來的愈傷組織放入液體培 養(yǎng)基MS+2,4-DO. lmg/L+6-BA0. lmg/L進行懸浮細胞培養(yǎng)，每個三角瓶接種50mLMS液體培 養(yǎng)基，接種后置于旋轉式搖床振蕩培養(yǎng)，搖床轉速為80 r/min，溫度25°C，附加蔗糖30g/L， PH5. 8,光照20001x，繼代2-3次，培養(yǎng)基中加入lmg/L的硝酸鋪，30天后，取出稱重，柳葉劍 蕨懸浮細胞增長率為80%。
[0008] 實施例2 取柳葉劍蕨的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污漬，流水沖洗30min，超 凈工作臺上氯化萊處理12min，無菌水沖洗5遍，滅菌處理過的柳葉劍蕨葉片接入培養(yǎng)基配 方為MS+NAAO. 5mg/L+IBA4mg/l+4mg/L檸檬酸誘導培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，附加 蔗糖30g/L，瓊脂6. 5g/L，PH5. 8,暗室培養(yǎng)，誘導30天后將誘導出來的愈傷組織放入液體培 養(yǎng)基MS+2,4-DO. 2mg/L+6-BA0. 3mg/L進行懸浮細胞培養(yǎng)，每個三角瓶接種50mLMS液體培 養(yǎng)基，接種后置于旋轉式搖床振蕩培養(yǎng)，搖床轉速為80 r/min，溫度25°C，附加蔗糖30g/L， PH5. 8,光照20001x，繼代2-3次，培養(yǎng)基中加入3mg/L的硝酸鋪，30天后，取出稱重，柳葉劍 蕨懸浮細胞增長率為82%。
[0009] 實施例3 取柳葉劍蕨的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污漬，流水沖洗30min，超 凈工作臺上氯化萊處理12min，無菌水沖洗5遍，滅菌處理過的柳葉劍蕨葉片接入培養(yǎng)基配 方為MS+NAAO. 5mg/L+IBA4mg/l+4mg/L檸檬酸誘導培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，附加 蔗糖30g/L，瓊脂6. 5g/L，PH5. 8,暗室培養(yǎng)，誘導30天后將誘導出來的愈傷組織放入液體培 養(yǎng)基MS+2,4-DO. lmg/L+6-BA0. 3mg/L進行懸浮細胞培養(yǎng)，每個三角瓶接種50mLMS液體培 養(yǎng)基，接種后置于旋轉式搖床振蕩培養(yǎng)，搖床轉速為80 r/min，溫度25°C，附加蔗糖30g/L， PH5. 8,光照20001x，繼代2-3次，培養(yǎng)基中加入2mg/L的硝酸鋪，30天后，取出稱重，柳葉劍 蕨懸浮細胞增長率為81%。
[0010] 實施例4 取柳葉劍蕨的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污漬，流水沖洗30min，超 凈工作臺上氯化萊處理12min，無菌水沖洗5遍，滅菌處理過的柳葉劍蕨葉片接入培養(yǎng)基配 方為MS+NAAO. 5mg/L+IBA4mg/l+4mg/L檸檬酸誘導培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，附加 蔗糖30g/L，瓊脂6. 5g/L，PH5. 8,暗室培養(yǎng)，誘導30天后將誘導出來的愈傷組織放入液體培 養(yǎng)基MS+2,4-DO. 15mg/L+6-BA0. 2mg/L進行懸浮細胞培養(yǎng)，每個三角瓶接種50mLMS液體培 養(yǎng)基，接種后置于旋轉式搖床振蕩培養(yǎng)，搖床轉速為80 r/min，溫度25°C，附加蔗糖30g/L， PH5. 8,光照20001x，繼代2-3次，培養(yǎng)基中加入3mg/L的硝酸鋪，30天后，取出稱重，柳葉劍 蕨懸浮細胞增長率為83%。
【權利要求】
1. 一種柳葉劍蕨愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌外植體的獲得、愈傷 組織的誘導、懸浮細胞培養(yǎng)、稀土調(diào)控懸浮細胞生長等，主要步驟如下： (1) 取柳葉劍蕨的幼嫩葉片，按照常規(guī)的消毒方法對其進行滅菌處理； (2) 將步驟（1)滅菌處理過的柳葉劍蕨葉片接入培養(yǎng)基配方為MS+NAAO. 5mg/ L+IBA4mg/l+4mg/L檸檬酸誘導培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂 6.5g/L，PH5.8,暗室培養(yǎng)； (3) 取步驟⑵誘導出來的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+2,4-D0. 1-0. 2mg/ L+6-BA0. 1-0. 3mg/L進行懸浮細胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5. 8,光照20001x ; (4) 取步驟（3)懸浮培養(yǎng)出來的細胞放入加入稀土的上述培養(yǎng)基中調(diào)控懸浮細胞生 長。
2. 按照權利要求1所述的一種柳葉劍蕨愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征 在于：步驟（1)中所述柳葉劍蕨無菌葉片的獲得為，取柳葉劍蕨的葉片，先在漂白粉中浸泡 3min，毛刷去除表面污漬，流水沖洗30min，超凈工作臺上氯化萊處理12min，無菌水沖洗5 遍。
3. 按照權利要求1所述的一種柳葉劍蕨愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征 在于：步驟（2)中所述愈傷組織的誘導采用的是暗室培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中附加檸檬酸，可以 有效防止愈傷組織褐化現(xiàn)象。
4. 按照權利要求1所述的一種柳葉劍蕨愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征 在于：步驟（3)所述的劍蕨懸浮細胞按照下述方法得到：取誘導出來的嫩綠松散的愈傷組 織，接種到盛有50mLMS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，接種后置于旋轉式搖床振蕩培養(yǎng)，搖床轉 速為 80 r/min，溫度 25°C。
5. 按照權利要求1所述的一種柳葉劍蕨愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征 在于：步驟（4)中選用的稀土是硝酸鈰，調(diào)控濃度為2-4mg/L。
【文檔編號】A01H4/00GK104206271SQ201410445602
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月4日 優(yōu)先權日:2014年9月4日
【發(fā)明者】張金芳, 楊存 申請人:南京標科生物科技有限公司