專利名稱：一種橋石短芽孢桿菌x23及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物保護領域，尤其涉及一種土居生防菌株，具體地說涉及一種高效防治茄科作物青枯病的橋石短芽孢桿菌X23及其應用。
背景技術：
青枯病由茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起，該菌是一個復合種 (complex species)。該致病菌通過土壤傳播，感染植株后在導管內大量繁殖，導致導管被堵塞，水分運輸受阻，植株因缺水而萎蔫死亡；該致病菌還可分泌胞外多糖、酶和群體感應物質等多種致病因子擾亂寄主正常的代謝活動。青枯病在我國所有茄科作物生產區(qū)普遍發(fā)生，是所有茄科作物生產上共同面臨的毀滅性病害，每年因青枯病導致的損失高達數(shù)十億美元。以馬鈴薯為例，青枯病發(fā)病嚴重時可導致減產80%，甚至絕收。青枯病的防治極為困難，目前對該病尚無有效的防治措施。尋找一種經(jīng)濟、安全和有效的防治方法是當務之急。利用土壤中的有益生物防治病害的研究為茄科作物青枯病的防治提供了新的途徑，許多根際微生物在防治病害的同時還能促進植物的生長、誘導植物產生系統(tǒng)性抗性，從而增強寄主植物的抗病能力和激發(fā)其增產潛力。利用有益生物防治病害的方法完全不同于化學防治，它具有不污染環(huán)境、對人和其他生物安全、防治作用持久， 易于同其他植物保護措施協(xié)調配合并節(jié)約能源等優(yōu)點。從土壤的微生物資源中挖掘能有效防治茄科作物青枯病的生防菌菌株，對茄科作物青枯病的防治具有重要的意義，但目前還沒有可靠的產品可供使用。

發(fā)明內容
下述實例將有助于進一步理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內容。本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的空白，提供一種橋石短芽孢桿菌X23，是一種從土壤中分離篩選得到的對茄科作物青枯病具有拮抗作用的生防細菌菌株，能夠有效地抑制茄科作物青枯病菌的生長，對茄科作物青枯病菌的防治具有重要的意義。因此，本發(fā)明第一個發(fā)明目的是提供一種包含橋石短芽孢桿菌 X23 (Brevibacillus choshinensis X23)的微生態(tài)抑菌劑，所述菌株已于2011年1月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC N0:4534。其中，所述的橋石短芽孢桿菌篩選過程從各地采集土壤樣品，采用不同的培養(yǎng)基進行篩選，篩選到多個菌株，逐一進行青枯病菌抑制實驗，得到抑制青枯病菌的拮抗菌株， 進行菌種鑒定和毒理實驗。生理學特征是1. 14X0. 38 μ m,單個著生，好氧或兼性厭氧，有莢膜，革蘭氏染色陽性。芽孢0. 6 0. 9微米，橢圓到柱狀，中生到近中生，芽孢囊不明顯膨大。菌落粗糙、不透明，反光，擴張，乳白色或微帶黃色。它可液化明膠、胨化牛奶，還原硝酸鹽、水解淀粉，是好氧性細菌。在一個具體實施方案中，所述的微生態(tài)抑菌劑還包括該菌培養(yǎng)基質及該菌代謝產物。
本發(fā)明第二個發(fā)明目的是抑菌劑在茄子等作物生產中用于抑制青枯病等病菌的用途。其中所述的用途包括用微生態(tài)抑菌劑(液體制劑)拌種(茄子等作物種子)育苗工藝；用微生態(tài)抑菌劑噴施作物花期的田間管理工藝。在一個具 體實施方案中，使用上述的微生態(tài)抑菌劑(液體制劑)適量清水稀釋拌種(現(xiàn)拌現(xiàn)播茄子等作物種子)育苗工藝，可抑制病菌在苗期侵害作物幼苗，提高出芽率， 減少病苗。其中，用微生態(tài)抑菌劑拌種(茄子等作物)育苗工藝采用微生態(tài)抑菌制劑(固體粉劑)，每克含抑制青枯病等病菌生長繁殖的微生物數(shù)量ι χ IO10Cfu以上，先用清水將作物種子拌濕，撒上固體菌粉拌勻，現(xiàn)拌現(xiàn)播。采用微生態(tài)抑菌制劑(液體制劑)，每毫升含抑制青枯病等病菌生長繁殖的微生物數(shù)量IXlO7Cfu以上，用菌劑將作物種子拌濕，攪拌拌勻， 現(xiàn)拌現(xiàn)播。用量是每畝的種子用抑菌劑0. 5kg 1. Okgo另外，使用微生態(tài)抑菌制劑，每畝可降低10%以上的用種量和10%用肥量。該育苗工藝作用和特征是抑制病菌在苗期侵害作物幼苗，減少病苗，同時提高出芽率10% 15%。在另一個具體實施方案中，其中用微生態(tài)抑菌劑噴施作物生長期的田間管理工藝；該生長期田間管理工藝作用和特征是抑制青枯病等病菌在茄科作物的生長期大量繁殖，防止或減少病菌的侵入。其中，用微生態(tài)抑菌劑噴施作物生長期的田間管理工藝幼苗期，每1公斤抑菌劑用500 800倍清水混勻，噴施幼苗葉面。生長中期每1公斤抑菌劑用300 500倍清水混勻噴施葉面，一周噴施1次微生態(tài)抑菌劑。該生長期田間管理工藝作用和特征是抑制病菌在生長期侵害和生長繁殖，防止或減少病菌侵入葉面提高作物產量。本發(fā)明第二個發(fā)明目的是抑菌劑在作物生產中用于抑制青枯病菌等多種病菌的用途。本發(fā)明的另一個目的是提供了所述高效防治茄科作物青枯病的橋石短芽孢桿菌 X23的制備方法。本發(fā)明還有一個目的是提供了所述高效防治茄科作物青枯病的橋石短芽孢桿菌 X23在防治其他常見的作物病害方面的多種應用。本發(fā)明同時還提供了所述高效防治茄科作物青枯病的橋石短芽孢桿菌X23的制備方法，經(jīng)平板對峙篩選獲得。本發(fā)明還提供了所述的高效防治茄科作物青枯病的橋石短芽孢桿菌X23的應用， 其一是針對茄科作物青枯病3號生理小種的平板拮抗作用。其二是對煙草黑脛病菌、水稻稻瘟病菌、煙草赤星病菌和馬鈴薯晚疫病病菌的拮抗作用。本發(fā)明的有益效果是(1)橋石短芽孢桿菌X23為植物有益細菌，對茄科作物青枯病菌的抑制能力強。除此之外，還對多種病原真菌和病原細菌具有拮抗作用。本發(fā)明通過大量的實驗證明橋石短芽孢桿菌X23菌株能夠有效地抑制茄科作物青枯病菌的生長；此外，對煙草黑脛病菌、水稻稻瘟病菌、煙草赤星病菌和馬鈴薯晚疫病菌也具有明顯的拮抗作用。橋石短芽孢桿菌X23菌株的環(huán)境安全性好，具有良好的開發(fā)前景和應用潛力，尤其是對茄科作物青枯病菌的防治具有重要的意義。(2)本發(fā)明所述菌株培養(yǎng)條件簡單，容易保存，易于工業(yè)化生產，具有良好的開發(fā)應用前景。


圖1橋石短芽孢桿菌X23菌株對青枯病菌P041的平板抑制作用圖2橋石短芽孢桿菌X23的無菌培養(yǎng)液處理青枯病菌后的掃描電子顯微鏡觀察圖3橋石短芽孢桿菌X23菌株對煙草黑脛病菌的抑制作用圖4橋石短芽孢桿菌X23菌株對水稻稻瘟病菌的抑制作用圖5橋石短芽孢桿菌X23菌株對煙草赤星病菌的抑制作用圖6橋石短芽孢桿菌X23菌株對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用
具體實施例方式下面結合具體實驗例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述。實施例1 橋石短芽孢桿菌的篩選從各地采集土壤樣品，采用不同的培養(yǎng)基進行篩選，篩選到多個菌株，逐一進行青枯病菌等病菌的抑制實驗，得到抑制青枯病菌菌株，進行菌種鑒定和毒理實驗。實施例2 枯草芽孢桿菌的生理生活特征及其保藏將篩選的菌株于2011年01月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo. 4534。該菌株的生理學特征細胞形態(tài)學革蘭氏陽性桿菌(1. 14X0. 38 μ m)，產生內生孢子。培養(yǎng)和生理學特征嗜溫性，在觀1-301下生長。耐熱性好，60°C加熱30分鐘后仍然存活。好氧或兼性厭氧菌，過氧化氫酶陽性，氧化酶陰性。雖然也可以進行發(fā)酵代謝，但主要是呼吸代謝。從下列碳水化合物代謝產酸纖維二糖，果糖，半乳糖，D-葡萄糖，甘油，甘露糖，麥芽糖，D-核糖，蔗糖，海藻糖，和D-木糖，不能從下列碳水化合物代謝產酸阿拉伯糖，肌醇，乳糖，蜜二糖，D-棉子糖，鼠李糖，可溶性淀粉，D-山梨醇，L-山梨糖，或L-木糖。對明膠有微弱的水解液化作用，但不水解殼多糖，淀粉，酪蛋白，尿素，或纖維素。復合性營養(yǎng)，能在蛋白胨基本培養(yǎng)基中生長。生長還可能需要B-復合維生素和氨基酸。在蛋白胨基本培養(yǎng)基上，菌落直徑l-3mm，乳白色，隆起，并具有光滑的邊緣。菌落表面有反光，呈粘液狀。不產生擴散性色
ο實施例3橋石短芽孢桿菌X23菌株對茄科作物青枯病菌3號P041的平板抑制作用實驗橋石短芽孢桿菌X23菌株經(jīng)平板拮抗篩選獲得，所述篩選方法為本領域常規(guī)方法。將培養(yǎng)青枯病菌的固體LB培養(yǎng)基加熱熔化，待冷卻至45°C時加入發(fā)酵培養(yǎng)的青枯菌液至終濃度為1 X 107cfu/mL。隨后倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿，待固體LB培養(yǎng)基完全凝固后用打孔器在培養(yǎng)基上打4個對稱的孔。其中兩個對稱的孔內每孔注入橋石短芽孢桿菌X23的培養(yǎng)液20 μ L，另兩個對稱的孔內注入未經(jīng)使用的培養(yǎng)橋石短芽孢桿菌Χ23的培養(yǎng)基作為對照。實驗設三次重復，29°C培養(yǎng)24小時后測定抑菌圈直徑，由附圖1可見橋石短芽孢桿菌X23顯著抑制茄科作物青枯病菌菌株P041的生長。實施例4橋石短芽孢桿菌X23的無菌培養(yǎng)液處理青枯病菌后的掃描電子顯微鏡觀察將橋石短芽孢桿菌X23接種于NB液體培養(yǎng)基，30°C，200rpm發(fā)酵培養(yǎng)48h ；培養(yǎng)液 7，OOOrpm離心后收集上清液，再經(jīng)孔徑為0. 22 μ m的過濾器過濾 ，所得液體即為橋石短芽孢桿菌X23的無菌培養(yǎng)液。將青枯病菌劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，280C，200rpm過夜培養(yǎng)。 吸取ImL青枯菌的培養(yǎng)液接種于IOOmL新鮮的LB液體培養(yǎng)基，按上述條件培養(yǎng)。至0DA_ =0. 6時，將培養(yǎng)液7，OOOrpm離心收集菌體。加入ImL橋石短芽孢桿菌X23的無菌培養(yǎng)液， 懸浮青枯病菌，分別在10min、20min和30min取樣，對照為新鮮培養(yǎng)的青枯菌。上述樣品分別經(jīng)電子掃描顯微鏡觀察，結果表明，橋石短芽孢桿菌X23的無菌培養(yǎng)液可以在IOmin內即導致青枯菌細胞膜表面出現(xiàn)大量的囊泡狀突起，20-30min時突起的囊泡破裂，細胞內容物外滲，進而導致青枯菌細胞死亡。由附圖2可見X23的無菌培養(yǎng)液處理青枯病菌30min后導致青枯病菌細胞破裂、病菌死亡。實施例5 微生態(tài)抑菌劑的制備(1)菌株的培養(yǎng)配制細菌斜面培養(yǎng)基，接種，放入30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，保存?zhèn)溆谩?2)制備抑菌劑，其中根據(jù)不同的應用方面和不同劑型(液體制劑和固體粉劑)液體制劑參照細菌搖瓶培養(yǎng)基的配制，滅菌前分裝三角瓶(500mL瓶、裝IOOmL 液)，常規(guī)滅菌，冷卻后在超凈工作臺上，用水洗法直接洗下斜面菌體接入發(fā)酵三角瓶中，搖瓶培養(yǎng)，300C，200r/min,培養(yǎng)48h。馬上轉入發(fā)酵罐發(fā)酵，參照細菌發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配制， 滅菌，冷卻后接種與發(fā)酵，300C，200r/min,培養(yǎng)48h中止發(fā)酵，馬上用罐裝塑料袋包裝發(fā)酵液。固體粉劑參照細菌搖瓶培養(yǎng)基的配制，滅菌前分裝三角瓶(500mL瓶、裝IOOmL 液)，常規(guī)滅菌，冷卻后在超凈工作臺上，用水洗法直接洗下斜面菌體接入發(fā)酵三角瓶中，搖瓶培養(yǎng)，300C，200r/min,培養(yǎng)48h。馬上轉入發(fā)酵罐發(fā)酵，參照細菌發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配制，滅菌，冷卻后接種與發(fā)酵，300C，200r/min,培養(yǎng)48h后中止發(fā)酵，離心發(fā)酵液，得到菌體，向其中加入草木炭吸附菌體，用罐裝塑料袋進行包裝。實施例6橋石短芽孢桿菌X23對多種植物病原菌的抑制作用采用平板對峙法，測試橋石短芽孢桿菌X23對煙草黑脛病菌、水稻稻瘟病菌、煙草赤星病菌和馬鈴薯晚疫病菌等4種病原真菌的拮抗效果，在PDA平板中央接入直徑為5mm 的靶標菌絲塊，隨后在距離靶標菌絲塊相同的距離按“實施案例1”所述的方法打孔。對稱的2孔加入按“實施案例1”制備的橋石短芽孢桿菌X23無菌發(fā)酵液各20 μ L，其余的2孔內加入無菌的NB液體培養(yǎng)基做為對照。除接種馬鈴薯晚疫病菌的培養(yǎng)皿置16°C培養(yǎng)箱外， 其余培養(yǎng)皿均在28°C培養(yǎng)。4-5d后測量并記錄抑菌圈的直徑。結果表明，橋石短芽孢桿菌 X23的抑菌譜廣，對上述4種病原真菌均有明顯的抑制作用。見附圖3-6和表1。從附圖3 中可以觀察到橋石短芽孢桿菌X23對煙草黑脛病菌有明顯的抑制作用；從附圖4中可以觀察到橋石短芽孢桿菌X23對水稻稻瘟病菌的抑制作用；從附圖5中可以觀察到橋石短芽孢桿菌X23對煙草赤星病菌的抑制作用；從附圖6中可以觀察到橋石短芽孢桿菌X23對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用； 表1枯草芽孢桿菌對幾種病原真菌的抑制作用

權利要求
1.一種具有抑制青枯病菌的橋石短芽孢桿菌X23 (Brevibacillus choshinensisX23)， 所述菌株已于2011年1月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號CGMCC NO :45340
2.一種包含權利要求1所述橋石短芽孢桿菌的微生態(tài)抑菌劑。
3.權利要求2所述的微生態(tài)抑菌劑，其中還包括該菌株所代謝的產物。
4.一種權利要求1所述橋石短芽孢桿菌Χ23的應用，其特征在于對煙草黑脛病菌、水稻稻瘟病菌、煙草赤星病菌和馬鈴薯晚疫病菌等多種病原真菌都有拮抗作用。
5.權利要求1所述的橋石短芽芽孢桿菌或權利要求2或3所述的抑菌劑在番茄、煙草和水稻等作物生產及其產品加工中用于抑制病菌的用途。
6.權利要求4所述的用途，其中用微生態(tài)抑菌劑(含液體制劑和固體粉劑)適量清水稀釋拌種(現(xiàn)拌現(xiàn)播番茄和煙草等作物種子)育苗工藝，可抑制病菌在苗期侵害作物幼苗， 提高出芽率，減少病苗。
7.權利要求4所述的用途，其中將微生態(tài)抑菌劑用于噴施作物生長期的田間管理工藝。
全文摘要
本發(fā)明針對現(xiàn)有防治青枯病菌危害作物對技術的不足，提供一套防止青枯病菌在茄科作物中生長繁殖的生產工藝技術，從而提高作物的產量。由于橋石短芽孢桿菌X23抑菌譜廣，對煙草黑脛病菌、水稻稻瘟病菌、煙草赤星病菌和馬鈴薯晚疫病菌等多種病原真菌都有拮抗作用，環(huán)境安全性好，具有良好的開發(fā)前景和應用潛力。
文檔編號A01P3/00GK102154175SQ201110026458
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權日2011年1月25日
發(fā)明者盧芳國, 周清明, 張薇, 王運生, 羅寬, 肖啟明, 陳武, 黎定軍 申請人:周清明