專利名稱：冷凍保存細(xì)胞的系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及用于冷凍保存細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物的細(xì)胞)以及組織樣本/樣品的儲(chǔ)存方法和相關(guān)裝置。
背景技術(shù)：
細(xì)胞和組織經(jīng)常被冷凍保存以暫時(shí)地延長(zhǎng)其生物醫(yī)學(xué)上的生存能力和有效性。冷凍保存的過(guò)程部分地包括將細(xì)胞放進(jìn)包含電解液和在冷凍過(guò)程期間保護(hù)細(xì)胞的化學(xué)化合物(防凍劑)的水溶液中。該防凍劑通常是小分子量的分子，例如甘油、丙二醇、乙二醇或二甲亞砜(DMSO)。當(dāng)這些溶液被冷卻到稍低于其凝固點(diǎn)的溫度時(shí)，溶液保持處于液體狀態(tài)。這種在溶液的相變溫度下其保持液態(tài)的情況稱為過(guò)冷現(xiàn)象。當(dāng)水溶液被進(jìn)一步冷卻到其凝固點(diǎn)之下時(shí)，過(guò)冷的程度加劇。在不干預(yù)時(shí)，在通常凝固點(diǎn)之下不大于15°C的點(diǎn)處，溶液中的水分子將自然結(jié)晶，并且純水將凝結(jié)為冰。在從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)的轉(zhuǎn)變過(guò)程中，溶液從高自由能狀態(tài)移到低自由能狀態(tài)，從而導(dǎo)致放熱反應(yīng)。在該相變期間產(chǎn)生的熱量使樣本瞬時(shí)變熱，在該過(guò)程中樣本溫度升高。同時(shí)周圍環(huán)境(例如正冷凍保存樣本的裝置)保持在恒溫狀態(tài)或繼續(xù)冷卻(取決于使用的冷卻方法)。接著，隨著樣本中的熱量消散，在該事件期間在樣本和冷卻裝置之間的熱的不平衡使樣本經(jīng)歷快速冷卻速率以重新建立熱平衡。在許多情況下這種快速冷卻速率導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰的形成，這通常導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這種細(xì)胞內(nèi)冰的形成通常取決于樣本的質(zhì)量、樣本容器的傳熱特性、使用的冷卻方案以及細(xì)胞的基本低溫生物特性。凍結(jié)狀態(tài)與生物系統(tǒng)之間的關(guān)系已吸引人類很多年了。早在1683年，玻意耳 (Robert Boyle)發(fā)現(xiàn)一些魚和青蛙在低于冰點(diǎn)的溫度可以存活短暫的時(shí)間段，如果其體內(nèi)水分的一部保持未被凍結(jié)。人工誘導(dǎo)冷凍保存首先在1948年由Polge、Smith和Parkes通過(guò)偶然發(fā)現(xiàn)甘油對(duì)家禽和牛精子以及隨后對(duì)于紅血球的防冷凍特性而被發(fā)現(xiàn)。在更近的時(shí)期，對(duì)與冷凍生物系統(tǒng)相關(guān)的自然現(xiàn)象和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用有興趣的科學(xué)家已開始研究控制關(guān)系的基本過(guò)程。首先，已知的是，下降的溫度導(dǎo)致代謝活動(dòng)被抑制，并因此導(dǎo)致速率的減小， 在該減小的速率下無(wú)營(yíng)養(yǎng)的生物系統(tǒng)的退化將會(huì)發(fā)生。但是，冷凍過(guò)程并不能如人所設(shè)想的開始；其通常導(dǎo)致可以預(yù)計(jì)到的化學(xué)的、熱量的和電特性的極端變化，以改變細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、細(xì)胞膜以及與組織和器官相關(guān)的精密的細(xì)胞間交互作用系統(tǒng)。當(dāng)然，已知即使最簡(jiǎn)單的生物細(xì)胞的極端復(fù)雜性，因此值得注意的是由冷凍所得的假死的可逆狀態(tài)是完全可能的。由于甘油的防冷凍作用的首先發(fā)現(xiàn)以及廣泛使用的滲透防凍劑二甲亞砜(DMSO) 的隨后發(fā)現(xiàn)，許多研究者已致力于主要通過(guò)經(jīng)驗(yàn)的方法的細(xì)胞或組織的保存。大多數(shù)細(xì)胞懸浮液冷凍保存方案已建立了使用克分子濃度的滲透防冷凍添加劑以能實(shí)現(xiàn)冰凍存活率。 通過(guò)使用這些人工防凍劑，許多靈活性被添加到冷凍保存過(guò)程。例如，為了在沒(méi)有添加防冷凍劑(CPA)的情況下達(dá)到最佳存活率，人類紅血球需要以1000°C/min左右的速率被冷卻。 但是在存在3. 3M(30% )的甘油的情況下，這種細(xì)胞類型的存活率在冷卻速率2-31og范圍 (2-31og range)上保持90%左右。如可以預(yù)見(jiàn)的，CPA濃度越高，在添加/去除物質(zhì)期間滲透破壞的可能性越大，并因此在這些過(guò)程中需要更多的關(guān)注。在任一冷凍保存過(guò)程中，所包含的溶液將在其凝固點(diǎn)以下過(guò)冷，直到其找到結(jié)晶的任意成核點(diǎn)。當(dāng)通過(guò)冷凍-解凍方法冷凍保存時(shí)，細(xì)胞外介質(zhì)內(nèi)的結(jié)冰通過(guò)處于過(guò)冷的低度處的引晶故意地引發(fā)。如果結(jié)冰不是由引晶引起，那么當(dāng)溶液被足夠低地冷卻到其平衡凝固點(diǎn)之下時(shí)，冰將會(huì)自然形成。因?yàn)樵撨^(guò)程實(shí)際上是任意的，所以結(jié)冰將在任意地不可預(yù)測(cè)的溫度下發(fā)生；從而，在利用同一冷凍方案的重復(fù)的試驗(yàn)之間的樣本存活率將是高度可變的。而且，導(dǎo)致形成冰時(shí)高度過(guò)冷溶液的極度快速的結(jié)晶會(huì)導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞和組織的損壞。 進(jìn)一步，已顯示，如果細(xì)胞外結(jié)冰在過(guò)冷的高度時(shí)引發(fā)，那么有損壞性的細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的可能性將顯著增加。這種現(xiàn)象是由于冰凍引起的細(xì)胞脫水延遲開始，這導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分保留增加并因此導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的更大的可能性。如上所述，在從液態(tài)向固態(tài)的轉(zhuǎn)變期間，溶液從高自由能狀態(tài)移到低自由能狀態(tài)， 這導(dǎo)致繼續(xù)變熱的樣本與繼續(xù)冷卻的冷卻裝置之間的熱不平衡。這種不平衡最后導(dǎo)致與特定細(xì)胞類型的規(guī)定的冷卻速率的嚴(yán)重偏差，并導(dǎo)致在該過(guò)程中細(xì)胞損壞的可能性。為了防止這些可能的損壞情況發(fā)生，在冷凍保存過(guò)程中的步驟經(jīng)常包括干預(yù)，以在溶液凝固點(diǎn)附近在細(xì)胞外溶液中引入冰晶。稱為“引晶”的這一過(guò)程通過(guò)將樣本冷卻至溶液凝固點(diǎn)附近來(lái)進(jìn)行，然后用在低溫流體(例如液氮)中預(yù)冷的金屬裝置(例如鑷子或金屬棒)接觸樣本容器的外面。此引晶步驟在細(xì)胞外溶液中產(chǎn)生冰晶，并提供“樣板”，通過(guò)樣板，溶液中的過(guò)冷水分子有機(jī)化并產(chǎn)生更多冰。但是，在此方式中的引晶樣本是費(fèi)時(shí)的， 并在其被暫時(shí)從用于此程序的冷卻裝置移出的情況下并因?yàn)榇艘Х椒梢圆唤?jīng)意地引起細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰而使樣本處于風(fēng)險(xiǎn)中。需要避免上述與不平衡狀況相關(guān)的問(wèn)題的冷凍保存系統(tǒng)。還需要無(wú)需目前被執(zhí)行以引發(fā)控制的冰晶形成的輔助引晶步驟的這樣的系統(tǒng)。還需要便于上述問(wèn)題的解決的冷凍保存裝置。所需要的冷凍保存裝置還可提供簡(jiǎn)化其用于獲得和存儲(chǔ)要冷凍保存的細(xì)胞和組織的方法。

發(fā)明內(nèi)容
在冷凍保存領(lǐng)域的這些和其他需要可以通過(guò)本發(fā)明的幾個(gè)方面來(lái)滿足。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，設(shè)置有自動(dòng)成核裝置，用于在冷凍保存儲(chǔ)存器中包含的液體冷凍前引入到冷凍保存儲(chǔ)存器內(nèi)。所述裝置包括大小適合于引入到冷凍保存儲(chǔ)存器內(nèi)的細(xì)長(zhǎng)中空管和設(shè)置在中空管內(nèi)的形成冰核的合成物。管的兩端被密封，而至少一端是用薄膜密封，該薄膜對(duì)于形成冰核的合成物是不能滲透的而對(duì)于包含在冷凍保存儲(chǔ)存器內(nèi)的液體是可滲透的。優(yōu)選地，兩端包括該薄膜以允許樣本液體流入裝置并通過(guò)裝置。在優(yōu)選的實(shí)施例中，形成冰核的合成物是固醇，并且更優(yōu)選地是膽固醇。膽固醇可以是中空管內(nèi)部上的涂層，或者可以設(shè)置為管內(nèi)的固體基質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面中，提供了冷凍保存儲(chǔ)存器，其可與自動(dòng)成核裝置一起使用。 在一個(gè)實(shí)施例中，冷凍保存儲(chǔ)存器包括彈性管狀主體，其具有在開始開放用于將液體樣本引入到主體內(nèi)的一端和在主體的相反端處限定的封閉端口。該端口適于由注射針刺穿以抽出液體樣本。在液體樣本被引入儲(chǔ)存器內(nèi)后開口端被熱密封。自動(dòng)成核裝置與入口偏置地固定到管狀主體的內(nèi)部，以使其不會(huì)被刺穿封閉的端口的注射針接觸到。在另一實(shí)施例中，冷凍保存裝置包括用于接收和儲(chǔ)存液體樣本的容器，該容器具有開口到容器內(nèi)的入口配件和安裝到配件的適配器。適配器具有第一管狀支路和第二管狀支路，第二管狀支路端接到管接合配件中。隔膜封閉第一管狀支路，其中隔膜適于被注射針刺穿。冷凍保存裝置還設(shè)置有在一端接合到第二管狀支路上的管接合配件的管，以及處于管的相反端處的封閉件。用于第二支路的封閉件首先是隔膜，該隔膜可以被注射針刺穿以將樣本液體引入儲(chǔ)存器中。容器可以在開始處于大氣壓以下的壓力以增進(jìn)樣本液體從注射器輸送到儲(chǔ)存器內(nèi)。一旦樣本液體已被輸送，則第二支路上的管被熱密封并就在管接合配件之上被切斷以形成第二支路的最終封閉件。封閉的裝置然后經(jīng)歷冰凍和解冰方案。解凍后，可以使用注射器通過(guò)適配器的第一支路內(nèi)的隔膜抽出樣本液體?？梢灶A(yù)見(jiàn)，本發(fā)明將提供一種簡(jiǎn)單的可再生的系統(tǒng)，用于在許多不同的細(xì)胞冷凍應(yīng)用中引入冰以及減少過(guò)冷。本發(fā)明構(gòu)思了方法和裝置，用于通過(guò)固體基質(zhì)裝置的建立在冷凍保存細(xì)胞和組織期間控制的細(xì)胞外冰晶的誘導(dǎo)，在固體基質(zhì)裝置上冰核將自然地形成。本發(fā)明勝過(guò)現(xiàn)有系統(tǒng)和方法具有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)在，引發(fā)可控冰核的大多數(shù)方法是麻煩的、難以再生，并且雖然當(dāng)使用技術(shù)時(shí)指向許多細(xì)胞和組織的增大的冷凍-解凍存活率的很大的字體，仍要多次檢查。至今，大多數(shù)通常使用的方法范圍是從用冷凍的(通常冷凍至-196°C )的金屬物體或棉拭簡(jiǎn)單地接觸管狀瓶或細(xì)管的側(cè)面到設(shè)計(jì)用于在樣本的小區(qū)域上噴射液氮的精制裝置。但是，即使在最佳條件下執(zhí)行，以這種方式的機(jī)械地引入冰晶會(huì)導(dǎo)致不能形成足夠大的冰晶以允許在整個(gè)細(xì)胞外溶液中完全地繁殖，或由于最接近于金屬物體或液氮噴射在容器上指向的位置的樣本部分中觀察到的極大的冷凍速率，從而導(dǎo)致細(xì)胞損壞和損失。在一個(gè)結(jié)構(gòu)中，液體樣本裝置包括用于接收和儲(chǔ)存液體樣本的容器，容器由一體的細(xì)長(zhǎng)主體形成。主體從開口端限定中空內(nèi)部并在相反端處通過(guò)開口到中空內(nèi)部的入口管配件和通風(fēng)管配件封閉。在一方面，一體主體還限定延伸到中空內(nèi)部中并設(shè)置在入口管配件和通風(fēng)管配件之間的壁。容器的開口端由注射針隔膜封閉。裝置還包括安裝到各管配件的適配器主體，適配器主體具有入口管狀支路和通風(fēng)管狀支路，通風(fēng)管形支路包括設(shè)置在其中的過(guò)濾器元件。在另一方面，設(shè)置有支撐蓋，其具有可拆卸地接合到容器的下部，以及當(dāng)支撐蓋接合到容器時(shí)在容器的相反端處延伸超出入口管配件和通風(fēng)管配件的上部。容器在其外表面可以限定至少兩個(gè)凹部，同時(shí)支撐蓋的下部包括至少兩個(gè)可彈性偏轉(zhuǎn)的細(xì)長(zhǎng)凸部，各細(xì)長(zhǎng)凸部具有構(gòu)造成可移出地接收到凹部中的相應(yīng)一個(gè)內(nèi)的向內(nèi)指向的突出部。在一方面，支撐蓋的上部包括包圍入口管配件和通風(fēng)管配件的圓柱形壁，而且還包括位于入口管配件和通風(fēng)管配件的相對(duì)側(cè)的側(cè)面的內(nèi)壁。在另一個(gè)實(shí)施例中，支撐蓋的下部包括兩個(gè)相對(duì)的細(xì)長(zhǎng)支腿，每個(gè)支腿包括在其自由端處向外指向的突出部。細(xì)長(zhǎng)支腿可以比細(xì)長(zhǎng)凸部更長(zhǎng)。使用所述裝置獲得用于分析或用于冷凍保存的液體樣本的方法，被構(gòu)思為包括以下開始步驟將適配器主體安裝到各管配件上，適配器主體具有對(duì)應(yīng)于入口管配件和通風(fēng)管配件的入口管形支路和通風(fēng)管形支路，并將入口管形支路連接到液體源。方法以下面步驟繼續(xù)進(jìn)行通過(guò)入口管配件將液體引入到容器內(nèi)，同時(shí)通過(guò)通風(fēng)管配件和通風(fēng)管形支路將容器內(nèi)的空氣排出，然后在支撐帽的上部?jī)?nèi)的一位置處切斷并密封入口管形支路和通風(fēng)管形支路。在容器完全封閉時(shí)，支撐帽被安裝在容器上。該組合體被安裝在離心機(jī)內(nèi)，該離心機(jī)被操作以用離心力將浮在表面上的東西與液體分離，浮在表面上的東西直接暴露于注射針隔膜。使用延伸通過(guò)隔膜的注射針，將浮在表面上的東西從容器內(nèi)抽出。然后，剩余的液體可以被冷凍保存，其中支撐帽被安裝或不安裝到容器上。


圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的自動(dòng)成核裝置的視圖；圖2是結(jié)合圖1所示的自動(dòng)成核裝置的已知的冷凍保存儲(chǔ)存器的視圖；圖3a是根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例的用于冷凍保存液體樣本的彈性封閉的系統(tǒng)管狀瓶的視圖，管狀瓶表示為用于輸送樣本的初始狀態(tài)；圖北是圖3a所示的管狀瓶的視圖，表示為管狀瓶端部被密封；圖4是根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例的細(xì)胞冷凍保存裝置的透視圖；圖5是用于圖4所示的裝置中的適配器的透視圖；圖6是圖4所示的裝置的分解圖；圖7是根據(jù)另一實(shí)施例的細(xì)胞冷凍保存裝置的透視圖；圖8是圖7所示的裝置的頂部的側(cè)向剖視圖；圖9是圖7所示的裝置的底部的透視剖視圖；圖10是根據(jù)另一實(shí)施例的冷凍保存裝置的透視圖；圖11是圖10的冷凍保存裝置的透視圖，根據(jù)公開于其中的另一特征的支撐蓋安裝于該裝置上；圖12是圖11所示的裝置和支撐蓋的分解剖視圖；圖13是圖11-12所示的裝置和支撐蓋的頂部的放大透視圖；圖14是根據(jù)可選實(shí)施例的支撐蓋的透視圖；圖15a和15b是根據(jù)兩種用途的圖10的冷凍保存裝置的示意圖；圖16是根據(jù)其中一種用途的圖14的冷凍保存裝置和支撐蓋的示意圖。
具體實(shí)施例方式為了促進(jìn)對(duì)本發(fā)明的原理的理解，現(xiàn)在參照附圖中所示的和隨后的所寫說(shuō)明中所描述的實(shí)施例。可以理解的是并不由此意圖限制本發(fā)明的范圍?？梢赃M(jìn)一步理解的是本發(fā)明包括對(duì)所描述的實(shí)施例的任何改變和修正，并且還包括如對(duì)于本發(fā)明涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員通常會(huì)想到的本發(fā)明的原理的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了自動(dòng)成核裝置10，如圖1所示，其涉及能形成冰核的合成物的使用。根據(jù)本發(fā)明，形成冰核的合成物20結(jié)合于開口中空管12的內(nèi)表面14。 在優(yōu)選實(shí)施例中，管由塑料制成。足夠量的成核合成物被引入管中以在管中形成固體基質(zhì)， 同時(shí)允許液體流動(dòng)通過(guò)管。在優(yōu)選實(shí)施例中，成核合成物是晶體膽固醇。固醇合成物的使用，特別是膽固醇， 在其它領(lǐng)域是已知的，例如在如美國(guó)專利4擬8493中所示的冷卻水系統(tǒng)。在這些其它使用中，粉末狀的合成物放置在容器中，用于暴露于水以有助于冰的形成。如下所述，實(shí)驗(yàn)后能確定的是晶體膽固醇對(duì)于準(zhǔn)備用于冷凍保存的樣本細(xì)胞和液體(例如血液、干細(xì)胞溶液和精子)是無(wú)毒的。管的端部16由可滲透溶液的薄膜18密封。特別地，薄膜對(duì)于冷凍保存液體是可滲透的，而對(duì)于要保存的細(xì)胞或組織是不可滲透的。保持分離并防止細(xì)胞/組織和形成冰核的合成物之間的直接接觸是重要的。在各端部處的薄膜還包括任意膽固醇晶體，其可從管移走并防止晶體污染周圍的液體。薄膜允許冷凍保存液體自由流動(dòng)進(jìn)入管12內(nèi)也是重要的。管和固體基質(zhì)成核合成物內(nèi)的空隙最初也可充滿有等滲壓緩沖溶液。該自動(dòng)成核裝置10的大小設(shè)計(jì)成能被放置到冷凍保存儲(chǔ)存器內(nèi)，例如如圖2所示的管狀瓶30或血袋40。裝置在儲(chǔ)存器內(nèi)可以是不固定的或是被固定到內(nèi)表面。由于裝置意圖作為用于冰形成的成核位置，因此其不必特別大。在特定實(shí)施例中，管12是0. 25英寸長(zhǎng)、直徑是0. 0625英寸。冷凍保存儲(chǔ)存器可以充滿特定的樣品或樣本和如在本領(lǐng)域已知的適當(dāng)?shù)睦鋬霰４嫒芤?，同時(shí)裝置10保持在容器中。然后容器30或40被執(zhí)行冷凍保存方案。 由于在裝置內(nèi)冷凍保存液體與形成冰核的合成物20接觸，所以冰從裝置10的管12內(nèi)在稍微或沒(méi)有過(guò)冷的情況下自發(fā)地形成。接著冰遠(yuǎn)離管繼續(xù)形成到周圍的溶液內(nèi)，從而導(dǎo)致在很少或沒(méi)有過(guò)冷以及最小限度的細(xì)胞內(nèi)冰形成的情況下冷凍細(xì)胞懸浮液。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，第一實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)用于確定物理地結(jié)合到冷凍保存儲(chǔ)存器的里面的膽固醇將誘發(fā)冰核。在該實(shí)施例中，起作用的固醇溶液通過(guò)將0. 025g的干膽固醇添加到:3ml甲醇中來(lái)制備。得到的懸浮液隨后被放置到70°C的干燥槽中并間歇地?fù)u動(dòng)，直到所有固態(tài)固醇已溶解。商業(yè)上可得到的管狀瓶被涂覆100μ 1固醇溶液并放置在75°C的干燥槽中以使甲醇蒸發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)膽固醇的再結(jié)晶和粘附。管狀瓶然后用1毫升PBS沖洗 2-3次以去除任何散落的晶體。接著，6%甘油溶液(以復(fù)制典型的精子庫(kù)冷凍保存介質(zhì))和10%的DMSO溶液(以復(fù)制普通細(xì)胞系冷凍系統(tǒng))在PBS中制備，并通過(guò)在固醇涂覆的瓶形管和未涂覆(控制) 瓶形管內(nèi)以_5°C /min的速率進(jìn)行冷卻來(lái)評(píng)估。為了達(dá)到統(tǒng)計(jì)率，20個(gè)包含DMSO瓶形管和 12個(gè)包括甘油的瓶形管被評(píng)估。用熱電偶以1秒的間隔監(jiān)測(cè)各瓶形管內(nèi)的溫度，以使凝固點(diǎn)溶液的分解和融化的潛熱的釋放。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明在DMSO和甘油中凝固點(diǎn)更高并且在融化發(fā)熱(ΔΤ)期間對(duì)于由固醇涂覆的瓶形管溫度變化減小。這些結(jié)果總結(jié)在下表中
凝固點(diǎn)ΔΤ涂覆固醇的；DMSO-4.56 土 1.72 0C0.37 土 1.29 0C未涂覆的；DMSO-10.61 ±3.52 0C5.63 ± 4.36 °C涂覆固醇的；甘油-2.97 ± 1.14 0C1.54 土 1.47 0C未涂覆的；甘油-9.33 ±4.01 0C7.24 ±3.61 0C在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，還可以觀察到晶體的一些脫落或碎裂(以及在DMSO樣本中一定程度的分解)，從而導(dǎo)致溶液污染(或者部分地由于容器和溶液的不可避免的物理操作)。為了解決這一問(wèn)題，提供了自動(dòng)成核裝置10的一個(gè)實(shí)施例，其中0. 25英寸中空管在內(nèi)部被涂覆有100 μ 1固醇溶液并被干燥48小時(shí)。管的一端用可滲透的棉塞密封，而管的另一端利用環(huán)氧樹脂附接到瓶形管蓋的里面并被干燥1414小時(shí)。支架被設(shè)計(jì)用于在隔離的環(huán)境中保持結(jié)合的膽固醇，同時(shí)還允許溶液(但不允許細(xì)胞)進(jìn)入以形成接觸。在第二實(shí)驗(yàn)中，人類精子利用這種自動(dòng)成核裝置10來(lái)冷凍保存并被具體地分析以確定根據(jù)本發(fā)明冷凍保存的樣本與使用標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)造的管狀瓶冷凍的精子相比是否具有更高的解凍后存活力。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，獲得丟棄的人類精子樣本(來(lái)自四個(gè)捐贈(zèng)人的20個(gè)樣本)，并被放置到潮濕的37°C孵育器(5%的二氧化碳，95%的空氣)中持續(xù)30-60直至被液化。一旦被液化，利用等壓PBS (保持37°C)將樣本調(diào)整到5ml并利用計(jì)算機(jī)輔助的精子分析裝置進(jìn)行評(píng)估以測(cè)量并記錄總的初始總量和活動(dòng)性。然后樣本在TEST蛋黃緩沖液中通過(guò)步進(jìn)方式累加程序被平衡到6%甘油。平衡之后，各樣本被分成三個(gè)1. 5ml試樣量并被存入到(1)包含裝置10的管狀瓶中；( 將要人工引晶(積極地控制)的標(biāo)準(zhǔn)管狀瓶中；(3) 將不接受引晶(消極的控制)標(biāo)準(zhǔn)管狀瓶中。所有樣本被放置到控制速率的制冷器中并以-5 °C /min的速率從22 °C冷卻到_8°C。3分鐘后在_8°C下，已浸透在液氮中的棉簽被用于在人工引晶的管狀瓶中開始引晶。另外的7分鐘后在_8°C下，樣品以-10°C /min的速率被再冷卻下降_40°C。在_40°C 下，速率被提高到_20°C/min，在-80°C樣本被投入液氮(liQ中。冷凍后，通過(guò)放置在試驗(yàn)臺(tái)上解凍樣本(對(duì)應(yīng)于_300°C /min的解凍速率)。一旦僅剩的冰已融化，接著甘油以滴入的方式通過(guò)添加PBS在10分鐘的時(shí)段內(nèi)被稀釋；然后樣本被沖洗并在沒(méi)有甘油的PBS中被懸浮。最后，在解凍后總量和活動(dòng)性評(píng)估前，將樣本培育 (37°C，潮濕的環(huán)境，5%二氧化碳，95%空氣)至少一個(gè)小時(shí)。第二實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明利用本發(fā)明的自動(dòng)成核裝置冷凍的樣本與利用人工引晶 (56. 0士3. 8% )冷凍的那些樣本相比保持明顯(ρ < 0. 05)更高的活動(dòng)性(66. 1 士4. 7%平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤(mean士SEM))。如利用方差技術(shù)的分析所確定的，兩個(gè)引晶方案明顯高(ρ <0.05)于未引晶的消極控制的樣本1 士3.7%)。
在第三實(shí)驗(yàn)中，確定的是在長(zhǎng)時(shí)間周期內(nèi)結(jié)合的膽固醇對(duì)于培養(yǎng)精子不會(huì)產(chǎn)生毒害細(xì)胞的作用。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，液化的精子樣本暴露于已涂覆有100 μ 1固醇溶液的培養(yǎng)板。在培育1、2、4和8小時(shí)時(shí)進(jìn)行的活動(dòng)性評(píng)估表示在8小時(shí)的培養(yǎng)期間與結(jié)合的膽固醇直接接觸對(duì)于人類精子沒(méi)有明顯的毒害作用。因此，在精子冷凍保存過(guò)程中，與使用人工引晶或沒(méi)有引晶相比，本發(fā)明的自動(dòng)成核裝置10被證明能產(chǎn)生更好的解凍后活動(dòng)性。這些實(shí)驗(yàn)證明固醇引發(fā)的冰核是穩(wěn)定、可靠的方法，其能減少過(guò)冷并因此在具有更好結(jié)果的情況下減少在過(guò)冷溶液冷凍事件典型的冰晶形成的“閃現(xiàn)”之后的相關(guān)的溫度的快速升高。本發(fā)明的裝置和方法允許樣本在整個(gè)冷凍期間內(nèi)能未被打亂地保持在冷卻腔室內(nèi)，因此不需要現(xiàn)有技術(shù)的人工引晶技術(shù)。能確信的是本發(fā)明的裝置和方法特別適合于標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)的精子庫(kù)存方法。在標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)的精子庫(kù)存環(huán)境中，要處理許多樣本，而時(shí)間/人力限定不能總是允許控制速率的制冷或在實(shí)驗(yàn)室中能達(dá)到的精心的處理?？梢源_信的是本發(fā)明允許具有勝過(guò)現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)果的可重復(fù)的樣本冷凍保存。此外，本發(fā)明還能實(shí)現(xiàn)成功的冷凍以及具有低活動(dòng)性的樣本的恢復(fù)，具有低活動(dòng)性的樣本通常被排除于捐贈(zèng)者群體。類似地，本發(fā)明的裝置10和方法對(duì)于以這樣的方式儲(chǔ)存冷凍保存的造血干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞(PCB HPC)的能力具有顯著的影響該方式允許庫(kù)存和足夠的時(shí)間用于要進(jìn)行的足夠的傳染病篩選以及HLA分型。冷凍保存為保存來(lái)自將受益于基因療法或由于疾病或通過(guò)放療或化療由醫(yī)生治療引起的處于喪失正常的造血功能風(fēng)險(xiǎn)中的新生患者的PCB源HPC提供了機(jī)會(huì)。近來(lái)，更多的努力致力于提純祖細(xì)胞選擇方法。保存這些相對(duì) “純”的祖細(xì)胞群(例如表示CD34表面糖蛋白的細(xì)胞)的能力可能使移植的細(xì)胞懸浮液的總體積最小化。但是，因?yàn)橥ǔＫ@得的PCB的體積比骨髓樣本小得多，因此能獲得每千克受體重量的HPC的有限數(shù)量。這使得對(duì)于PCB源HPC的有效和最佳冷凍保存方法與其它源的HPC(例如骨髓、周邊血)的情況相比重要得多。本發(fā)明的自動(dòng)成核裝置與此時(shí)以前可利用的裝置相比提供更有效和更優(yōu)選的用于冷凍保存和恢復(fù)這些易損樣本的方式?？梢源_信的是裝置10結(jié)合到正在進(jìn)行的改善的臍帶血干細(xì)胞冷凍保存方法的研究和發(fā)展中將導(dǎo)致獨(dú)特的方案，以在更少的人力更高的恢復(fù)率的情況下保存這種細(xì)胞類型。已經(jīng)開發(fā)實(shí)驗(yàn)方案用于驗(yàn)證在PCB和臍帶血以及用于商業(yè)人工授精設(shè)備中的牛精子冷凍保存中本發(fā)明的裝置和方法的存活力。這些方案在上面參考的臨時(shí)申請(qǐng)60/814982中，該描述通過(guò)參考合并到此處。本發(fā)明的另一方面提出冷凍保存各種臍帶血源干/祖細(xì)胞要求完全不同的程序， 并因此要求不同于在現(xiàn)有已知的程序下存在的儲(chǔ)存容器。為了庫(kù)存和儲(chǔ)存源自臍帶血的多種細(xì)胞類型，優(yōu)選地使用包括不同的冷凍/升溫速率的非常不同的冷凍方案?，F(xiàn)有技術(shù)使用冷凍儲(chǔ)存袋(一些袋具有多個(gè)腔室)或管狀瓶。但是這兩個(gè)系統(tǒng)具有實(shí)質(zhì)缺陷。多腔室袋不允許不同的冷凍速率或要用在不同腔室中的CPA。管狀瓶本身在冷凍保存溫度下不能被認(rèn)為是“封閉”系統(tǒng)，除非使用熱密封的外包裝，外包裝的應(yīng)用會(huì)損害敏感樣本。為了克服這一局限，本發(fā)明的另一實(shí)施例在于形式為彈性密封系統(tǒng)管狀瓶50的冷凍保存儲(chǔ)存器，如圖3a和: 所示，其使樣本在分離單元之間被分離從而在封閉的系統(tǒng)中使用不同的方案被冷凍。管狀瓶50包括在一端具有端口 M的彈性管狀主體52。端口優(yōu)選地由與彈性主體相同但適合在解凍之后被注射針刺穿以無(wú)菌地抽出樣本的材料密封。
如圖3a所示，管狀瓶的相反端56開始時(shí)是開放的以允許引入液體樣本。一旦管狀瓶50已被充滿，端56例如通過(guò)熱密封條58被封閉，如圖北所示，這樣就獲得了封閉系統(tǒng)管狀瓶50用于單個(gè)單元的冷凍和儲(chǔ)存。任選地，但優(yōu)選地，各管狀瓶包括上述自動(dòng)成核裝置10。如圖3a所示，裝置10優(yōu)選固定到主體52的內(nèi)壁，以使其不會(huì)被穿過(guò)端口 52的注射針進(jìn)入。可以預(yù)測(cè)的是本實(shí)施例的管狀瓶50可以用于在分離的冷凍容器中的多個(gè)冷凍/ 解凍方案。因此，成排的管狀瓶50可以支撐在固定裝置內(nèi)，可使用開口端56用于引入多個(gè)液體樣本試樣量。當(dāng)各管狀瓶被充滿時(shí)，相應(yīng)端被密封以提供用于冷凍保存的封閉系統(tǒng)管狀瓶。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，提供了如圖4-6所示的冷凍保存裝置60，其進(jìn)一步簡(jiǎn)化了獲得樣本并將其備用于冷凍的過(guò)程。裝置包括大小用于接收液體樣本的容器62。容器 62在一端包括入口配件64。如圖6所示，自動(dòng)成核裝置10可以通過(guò)入口配件64被引入到容器中。入口配件容納適配器65，如在圖5中詳細(xì)示出的。適配器包括下管狀部66，其大小適于緊密地裝配在入口配件64內(nèi)。下部66可以使用環(huán)氧樹脂或熱密封或其他適合方式被密封到入口配件以在容器62和適配器65之間提供氣密和液密密封。適配器包括兩個(gè)管形支路67和69。支路67端接在端部68中，端部68構(gòu)造成接合注射針隔膜72(圖6)。第二支路69端接在有缺口的配件70中。該有缺口的配件70與管道74的端部7 密封地接合。管道74的自由端74b接收其本身的注射針隔膜75。兩個(gè)注射針隔膜72和75被構(gòu)造成在兩個(gè)支路67和69的端部處提供氣密和液密密封。而且， 隔膜72、75被構(gòu)造成能由注射針以已知的方式刺穿并且一旦移走注射針就會(huì)自密封。在一個(gè)具體實(shí)施例中，提供有管道夾80以當(dāng)管道74接合到適配器65時(shí)穩(wěn)定管道 74。夾80包括構(gòu)造成在適配器的支路67上滑動(dòng)的部分80以附接的部分84，附接的部分被構(gòu)造用于在管道74上滑動(dòng)，如圖4所示。冷凍保存裝置60的容器62尺寸設(shè)置為能被容納在標(biāo)準(zhǔn)的“蛋品包裝紙盒”式分隔器中，該分隔器用于輸送和儲(chǔ)存用于冷凍和最終解凍的細(xì)胞樣本。可以預(yù)見(jiàn)的是裝載來(lái)自共用源的細(xì)胞樣本的若干個(gè)這種冷凍保存裝置60可以被裝在共用的蛋品包裝紙盒式分隔器中。使用時(shí)，裝置60開始被儲(chǔ)存在圖4所示的構(gòu)造中，即管道74從細(xì)胞容器本身向上突出。適配器65的尺寸設(shè)置使得其不延伸超出容器的豎直外殼并因此不會(huì)與儲(chǔ)存的其它類似裝置60干涉。管道74示出為具有延伸到豎直外殼外面的彎部。如果在蛋品包裝紙盒式容器內(nèi)的裝置被適當(dāng)?shù)嘏帕校敲垂艿?4不會(huì)與其它細(xì)胞容器干涉。但是，根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，可以預(yù)見(jiàn)管道74可以是彈性的以使其能根據(jù)需要被設(shè)置以避免與同一蛋品包裝紙盒式分隔器中的其它容器62干涉。管道74還因?yàn)榱硗獾脑騼?yōu)選是彈性的。具體地，支路69和固定的管道74用于填充裝置60的容器62。因此，根據(jù)本發(fā)明，彈性管道74可以被操作以允許新提取的細(xì)胞樣本引入到容器內(nèi)。該引入一方面通過(guò)包括提取的液體樣本的注射器針刺穿隔膜75進(jìn)行。 可選地，可以從彈性管道的端部74b去除隔膜75，以使得樣本能被直接注入管道內(nèi)而無(wú)需刺穿薄膜。在這兩種情況下，由于管道可以根據(jù)需要進(jìn)行操作而容器保持在蛋品包裝紙盒式容器中，所以彈性管道74有利于填充容器62的步驟。
—旦樣本已被引入容器62中，可以預(yù)見(jiàn)的是適配器的支路69就被永久地密封。 在優(yōu)先實(shí)施例中，該密封通過(guò)恰好在有缺口的配件70上方密封彈性管道來(lái)進(jìn)行。一旦被密封，由于不再需要，管道的剩余部分就可被去除。在一個(gè)特定實(shí)施例中，已知的箍縮熔接棒可以用于同時(shí)使管道變平、熱密封變平的部分并切斷多余的部分。該密封和切割優(yōu)選地盡可能地靠近有缺口的配件70進(jìn)行以使彈性管道74沒(méi)有剩余部分超出容器62的豎直外殼。理想的是密封和切割步驟不會(huì)危害冷凍保存裝置60的無(wú)菌完整性或封閉密封方面。當(dāng)通過(guò)隔膜75注射樣本時(shí)，支路69在整個(gè)過(guò)程中保持密封，即使在移除注射針之后。 一旦支路69被密封，包含液體樣本的裝置60就準(zhǔn)備用于冷凍和儲(chǔ)存在同一蛋品包裝紙盒式容器中，該蛋品包裝紙盒式容器在填充步驟期間容納該裝置。當(dāng)希望取回樣本時(shí)，裝置60 可以從蛋品包裝紙盒式容器取出用于與保持在蛋品包裝紙盒式容器中的其它裝置分開而單獨(dú)地解凍。支路67的注射針隔膜72提供了用于無(wú)菌抽取樣本的途徑。因此可以使用針頭和注射器刺穿隔膜并將液體樣本抽取到注射器內(nèi)。然后可以丟棄空的裝置60。在可選的實(shí)施例中，提供有如圖7-9所示的冷凍保存裝置100。裝置包括容器102， 其在用于冷凍保存細(xì)胞懸浮液的能力方面與上述的容器62類似，具有或不具有設(shè)置于其中的自動(dòng)成核裝置10。在某些實(shí)施例中，容器102具有2-5毫升的儲(chǔ)存容量。容器102具有開口的頂部103和限定開口 105的底部104。頂部103是通過(guò)蓋110氣密地密封，如圖8 的剖面視圖所示。頂部限定環(huán)形凸緣107，蓋110的下裙緣116安裝在環(huán)形凸緣107上。該下裙緣優(yōu)選地以傳統(tǒng)的方式熱密封到環(huán)形凸緣上，以形成能抵抗冷凍保存溫度的液體密封接頭。蓋110支撐入口支路112和通氣支路114，這兩個(gè)支路中的每一個(gè)都可以是無(wú)菌管道的形式。入口支路112可以設(shè)置有標(biāo)準(zhǔn)的注射針隔膜，例如上述隔膜75。兩個(gè)支路112、 114安裝在相應(yīng)的配件118、120上，每個(gè)配件限定與容器112連通的通道119、121。每個(gè)支路氣密地密封在相應(yīng)的配件上以再形成液體密封的能冷凍保存的接頭。在圖7-9的實(shí)施例中，支路114作為通風(fēng)支路，而不是作為如前面的裝置60中的出口支路。過(guò)濾器元件125可以設(shè)置在配件120的通道121內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該過(guò)濾器零件是3 μ m的無(wú)菌微過(guò)濾器。微過(guò)濾器125是氣體可滲透的，但對(duì)于儲(chǔ)存在容器內(nèi)的液體樣本或細(xì)胞懸浮液基本上是不可滲透的。在該實(shí)施例中，裝置100設(shè)置成通過(guò)容器102的底部104去除儲(chǔ)存的懸浮液，而不是如前面的實(shí)施例通過(guò)蓋去除。因此，如圖9的剖面圖所示，容器內(nèi)的開口 105由注射針隔膜130密封。出口隔膜130被適當(dāng)?shù)貧饷艿孛芊獾饺萜?02，例如通過(guò)熱密封。為了保護(hù)隔膜，提供了可拆卸的罩132，其圍繞隔膜固定于容器。罩132可以限定更薄或變?nèi)醯膮^(qū)域形式的撕裂部133，其能使罩的中心部135被去除?？梢蕴峁┤鐖D7所示的垂片135，以便于中心部135的去除。罩可以是箔膜，其在其周圍固定于容器102的底部104。冷凍保存裝置100的使用方式與上述裝置60相似。具體地，細(xì)胞懸浮液通過(guò)入口支路112被引入容器102內(nèi)，并且特別地是通過(guò)上述注射針隔膜引入。可選地，入口支路可以設(shè)置有標(biāo)準(zhǔn)的注射針端口或無(wú)針端口。當(dāng)細(xì)胞懸浮液被注入容器內(nèi)時(shí)，其中的空氣通過(guò)通風(fēng)支路114中的過(guò)濾器125被排出。在某些實(shí)施例中，微過(guò)濾器125構(gòu)造成對(duì)于細(xì)胞懸浮液基本上不能滲透。因此，一旦容器內(nèi)的懸浮液的水平到達(dá)過(guò)濾器125，那么懸浮液不會(huì)通過(guò)過(guò)濾器，從而壓力的升高將終止液體流入容器內(nèi)。
一旦容器102被充滿，兩個(gè)支路將使用例如上述箍縮熔接器進(jìn)行熱密封，以使容器被完全的、氣密地密封。當(dāng)然，可以理解的是，當(dāng)容器102被充滿時(shí)注射針隔膜130和罩 132仍保持完整。充滿并密封的裝置100然后可以被冷凍儲(chǔ)存。當(dāng)希望抽取細(xì)胞懸浮液時(shí)，裝置和內(nèi)容物首先被以已知的方式解凍。一旦解凍，罩 132被去除以露出隔膜130。通風(fēng)支路113被切斷以打開通風(fēng)通道121。然后可以通過(guò)注射器或類似裝置刺穿隔膜130抽取細(xì)胞懸浮液。容器的底部104可以形成一系列凸部106，其適合接合抽取裝置或注射器。在一些實(shí)施例中，凸部106構(gòu)造用于對(duì)接抽取裝置，而在其它實(shí)施例中，凸部可以設(shè)置有管螺紋(LUER threads)，用于接合抽取注射器上的管接頭(LUER fitting)ο根據(jù)另一實(shí)施例，冷凍保存儲(chǔ)存器200包括可以被標(biāo)上刻度的容器或管狀瓶201， 如圖10所示。儲(chǔ)存器200具有開口的下端302和封閉的上端205。由圖12可見(jiàn)，容器201 是從開口的下端203形成中空內(nèi)部202的基本上一體的主體。在封閉的上端205處，一體的主體被構(gòu)造以形成開到中空內(nèi)部202內(nèi)的一對(duì)管適配器207、208。兩個(gè)管適配器開到內(nèi)部?jī)?nèi)的開口由壁210分隔開。如前面的實(shí)施例一樣，適配器207可以連接到排風(fēng)口，而適配器208可以被連接到要被冷凍保存在儲(chǔ)存器200內(nèi)的液體源。壁210防止通過(guò)適配器208 進(jìn)入的液體立即從適配器207被抽出，特別是當(dāng)如此處所述的向適配器207施加負(fù)壓時(shí)。容器201的開口端203由注射針隔膜215封閉，注射針隔膜215可被構(gòu)造成類似于上述注射針隔膜130并起到與其類似的作用。注射針隔膜215由罩217保持，罩217通過(guò)常規(guī)方式被密封到容器的開口端203，以提供防露密封。儲(chǔ)存器200進(jìn)一步包括通風(fēng)管221和入口管223的適配器主體220。管的端部以適合的方式安裝到相應(yīng)的配件207、208上以提供永久的防露密封的接合。通風(fēng)管221可以優(yōu)選地包括容納在管內(nèi)的過(guò)濾器元件225，其類似于上述過(guò)濾器125。入口管223可以包括展開端226，用于與管適配器接合，如此處所述的。如這樣進(jìn)一步描述的，儲(chǔ)存器200類似于儲(chǔ)存器100。但是，容器201被修改以容納支撐蓋對(duì)0，如圖11-13所示。支撐蓋240包括下部242和上部M4，上部和下部都大致為圓柱形構(gòu)造并且大小適合滑配合到容器201上。下部242包括具有向內(nèi)指向的突出部 247的至少兩個(gè)凸部M6。突出部247大小制成并設(shè)置成鎖定在形成于容器201上相應(yīng)的凹部250內(nèi)(圖10)。突出部M7向內(nèi)指向以使得當(dāng)蓋240在容器上滑動(dòng)時(shí)必須通過(guò)偏轉(zhuǎn)凸部246來(lái)向外移動(dòng)突出部。突出部包括傾斜的上表面247a，當(dāng)希望去除蓋時(shí)，傾斜的上表面使突出部能被平滑地從凹部250拉出。突出部247被設(shè)置在凸部246的中部，以使得凸部的下部在突出部的下面延伸用于手動(dòng)接合以從凹部中釋放突出部。下部
提供了杠桿作用以有利于釋放突出部，同時(shí)還防止突出部由于意外接觸導(dǎo)致的移出。蓋MO的上部244被構(gòu)造以保護(hù)從容器頂部延伸的管221和223。因此，上部244 包括環(huán)形壁252，其具有設(shè)置成位于管側(cè)面的側(cè)面的內(nèi)壁254，如圖13所示。因此，在管與儲(chǔ)存器200的適配器207和208結(jié)合時(shí)，壁防止管彎曲，這避免了破壞不透水的密封以及污染內(nèi)容物。修改的蓋260如圖14所示。該蓋具體地構(gòu)造成在離心機(jī)或其它器具中支撐冷凍保存儲(chǔ)存器200。在一些示例中，希望用離心機(jī)分離儲(chǔ)存器200的內(nèi)容物，例如從浮在表面上的東西分離細(xì)胞粒。容器201可能不易安裝到離心機(jī)內(nèi)，所以修改的蓋沈0為容器提供了額外的支撐。具體地，蓋260包括下部262和上部沈4。上部264可以類似于蓋240的上部244被構(gòu)造包括內(nèi)壁沈5以保護(hù)管道。此外，類似于蓋M0，蓋沈0的下部262包括至少兩個(gè)凸部沈6，凸部266具有構(gòu)造成接合容器201內(nèi)的凹部250的突出部沈8。但是，下部262包括支腿270，支腿270延伸超出凸部沈6的端部。而且這些支腿270端接于向外突出的突出部272。因此支腿270從凹部250沿容器201的長(zhǎng)度的主要部分延伸。向外的突出部272被構(gòu)造以接合器具(例如上述離心機(jī))的凹部或安裝部件。更長(zhǎng)的支腿270不僅為容器提供了支撐，支腿并且具體地是突出部272還提供一種機(jī)構(gòu)，用于可釋放地接合器具，從而在器具內(nèi)充分地支撐冷凍保存儲(chǔ)存器200。在圖1 和15b中描述了儲(chǔ)存器200的使用。在兩種使用中，容器被連接到液體源，例如血袋觀0。血袋包括管觀2，管282連接到適配器主體220的入口支路223。在一個(gè)實(shí)施例中，適配器284可以被接合在入口支路的展開端2 和血袋管282之間。在圖1 所示的一種方案中，血通過(guò)重力自輸入到容器201中，空氣通過(guò)通風(fēng)支路221溢出。在另一種方案中，如圖1 所示，整個(gè)系統(tǒng)是封閉的，注射器290連接到通風(fēng)支路221。注射器被拉開以向容器201施加負(fù)壓，從而將血從袋280抽到容器內(nèi)。一旦要冷凍保存的血液或其它液體已被抽到容器內(nèi)，管道就被切斷并密封，如圖 16所示。密封的管的端部295被切斷以當(dāng)蓋被接合到容器201上時(shí)存在于蓋沈0的上部 264的端部下面。因此，如圖16所示，管的端部被完全地包圍并保護(hù)?？衫蒙w260的突出部272將儲(chǔ)存器200安裝在離心機(jī)或其它儲(chǔ)存裝置中。能進(jìn)一步理解的是，蓋260作為支架以支撐具有向上朝向的注射針隔膜215的儲(chǔ)存器。當(dāng)容器的內(nèi)容物用離心機(jī)分離時(shí)，浮在表面上的東西將自然地向上移動(dòng)，在該位置其能通過(guò)穿過(guò)隔膜的注射針被容易地接近并抽出。一旦浮在表面上的東西被去除，就可以從容器201去除蓋沈0，然后內(nèi)容物就可以被冷凍保存?？梢赃M(jìn)一步理解的是，圖15a_15b所述的過(guò)程可以在沒(méi)有隨后的冷凍保存的情況下使用。例如，根據(jù)美國(guó)血庫(kù)學(xué)會(huì)(AABB)標(biāo)準(zhǔn)的血液庫(kù)存的當(dāng)前血液檢測(cè)要求規(guī)定了已被檢測(cè)的血液?jiǎn)卧钠茐模捎诋?dāng)前沒(méi)有辦法有效地將血液試樣量移入檢測(cè)容器內(nèi)而沒(méi)有污染整個(gè)單元的可能性。該要求導(dǎo)致由所有血庫(kù)處理的大約百分之一的血液?jiǎn)卧钠茐模@在成本和血液缺乏方面是效果顯著的。檢測(cè)容器必須允許用于細(xì)胞?；碾x心作用，同時(shí)保持封閉的系統(tǒng)以避免污染。儲(chǔ)存器200符合AABB標(biāo)準(zhǔn)，以使血庫(kù)或醫(yī)師能直接從血液?jiǎn)卧槿⊙簶颖径粫?huì)危及血液?jiǎn)卧氖Ｓ嗖糠?。一旦血液樣本被從血?80抽入容器201中，血袋管282可以被密封并從適配器284脫離，由此保護(hù)血袋觀0中的血液?jiǎn)卧?。然后容?01內(nèi)的血液樣本可以被安裝在蓋260內(nèi)，以被輸送到實(shí)驗(yàn)室并用離心機(jī)分離。注射針隔膜215允許無(wú)菌地抽取浮在表面上的東西用于進(jìn)一步分析，例如確定細(xì)胞數(shù)，或者檢測(cè)血液樣本中血紅蛋白或微生物的存在。可以預(yù)見(jiàn)，在一些實(shí)施例中，冷凍保存儲(chǔ)存器60、100和200的容器62、102和201
可以設(shè)置有初始真空。該真空有助于在填充儲(chǔ)存器容器步驟中液體樣本的抽取。由于通向各支路67/69、112/114和221/223被密封(通過(guò)相應(yīng)的隔膜72、75或通過(guò)熱密封)，因此真空可以被保持很長(zhǎng)一段時(shí)間。蓋可以被設(shè)置在各支路上以確定氣密密封。在一個(gè)特定實(shí)施例中，容器62、100和201內(nèi)初始真空可以是處于IOOmmHg(絕對(duì))和160mmHg(絕對(duì))之間的大氣壓之下的壓力。冷凍保存儲(chǔ)存器60、100和200可以由在標(biāo)準(zhǔn)冷凍條件(即低到_196°C的溫度) 下在血液庫(kù)存和長(zhǎng)期保存領(lǐng)域中使用的標(biāo)準(zhǔn)材料制成。當(dāng)前的O.S.H.A.推薦是使適合的塑料部件能達(dá)到符合特定血液承載的病原體標(biāo)準(zhǔn)或其它要求。因此，上述各實(shí)施例中的容器、配件和管道都可以由適合的塑料制成，例如聚苯乙烯或聚丙烯。為了安裝到標(biāo)準(zhǔn)的蛋品包裝紙盒式容器中，儲(chǔ)存器(在密封彈性管道之后)應(yīng)符合IOmm直徑和90mm高之內(nèi)。彈性管道74也必須能抵抗冷凍保存溫度，而不會(huì)損害當(dāng)密封適配器65的支路69時(shí)加熱密封并切斷管道的能力。在一個(gè)特定實(shí)施例中，彈性管道由TYGON 或類似材料制成。雖然已在附圖和前面的描述中詳細(xì)地圖示和描述了本發(fā)明，但要考慮的是其在特征上是示意性的而不是限制的?？梢岳斫獾氖莾H提出了優(yōu)選的實(shí)施例，希望能保護(hù)落入本發(fā)明的主旨的所有改變、修改和進(jìn)一步的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.用于接收從單獨(dú)容器獲得的液體樣本的裝置，包括用于接收液體樣本的容器，所述容器由一體的細(xì)長(zhǎng)主體形成，所述主體從開口端限定中空內(nèi)部，并在相反端處由開口到所述中空內(nèi)部的入口管配件和通風(fēng)管配件封閉，所述一體的主體還限定延伸到所述中空內(nèi)部中并設(shè)置在所述入口管配件和所述通風(fēng)管配件之間的壁；和封閉所述開口端的注射針隔膜。
2.權(quán)利要求1的裝置，還包括安裝到所述管配件的適配器主體，所述適配器主體具有入口管形支路和通風(fēng)管形支路，所述通風(fēng)管形支路包括設(shè)置于其中的過(guò)濾器元件。
3.權(quán)利要求2的裝置，其中所述入口管形支路包括適于接收適配器的展開端，以將所述支路連接到與液體容器相關(guān)聯(lián)的單獨(dú)管。
4.權(quán)利要求1的裝置，其中所述容器由適于儲(chǔ)存血液樣本的塑料制成。
5.權(quán)利要求1的裝置，其中所述容器由適于在冷凍保存溫度下儲(chǔ)存液體樣本的塑料制成。
6.用于儲(chǔ)存從單獨(dú)容器獲得的液體樣本的裝置，包括用于接收液體樣本的容器，所述主體具有從開口端開始的中空內(nèi)部，并在相反端處由開口到所述中空內(nèi)部的入口管配件和通風(fēng)管配件封閉；封閉所述開口端的注射針隔膜；和支撐蓋，其具有可拆卸地接合到所述容器的下部，和當(dāng)支撐蓋接合到容器時(shí)在所述容器的相反端處延伸超出所述入口管配件和所述通風(fēng)管配件的上部。
7.權(quán)利要求6的裝置，其中所述容器在其外表面處限定至少兩個(gè)凹部；以及所述支撐蓋的所述下部包括至少兩個(gè)彈性可偏轉(zhuǎn)的細(xì)長(zhǎng)凸部，每個(gè)細(xì)長(zhǎng)凸部都具有向內(nèi)指向的突出部，向內(nèi)指向的突出部構(gòu)造成可移出地接收在所述凹部中相應(yīng)的一個(gè)內(nèi)。
8.權(quán)利要求7的裝置，其中所述突出部位于沿所述凸部的長(zhǎng)度方向的中部處。
9.權(quán)利要求6的裝置，其中所述上部包括圍繞所述入口管配件和所述通風(fēng)管配件的圓柱形壁，還包括位于所述入口管配件和所述通風(fēng)管配件的相反側(cè)的側(cè)面的內(nèi)壁。
10.權(quán)利要求6的裝置，其中所述支撐蓋的所述下部包括兩個(gè)相對(duì)的細(xì)長(zhǎng)支腿，所述支腿的每一個(gè)都包括位于其自由端處的向外指向的突出部。
11.權(quán)利要求10的裝置，其中，所述細(xì)長(zhǎng)支腿比所述細(xì)長(zhǎng)凸部更長(zhǎng)。
12.權(quán)利要求6的裝置，其中，所述容器由適于儲(chǔ)存血液樣本的塑料制成。
13.權(quán)利要求6的裝置，其中所述容器由適于在冷凍保存溫度下儲(chǔ)存液體樣本的塑料制成。
14.使用權(quán)利要求6的裝置的方法，包括將所述入口管配件連接到液體源；通過(guò)所述入口管配件將液體弓I入所述容器內(nèi)，同時(shí)通過(guò)所述通風(fēng)管配件排出所述容器內(nèi)的空氣；密封所述入口管配件和所述通風(fēng)管配件；將所述支撐蓋安裝到所述容器上；將承載所述容器的所述支撐蓋放置到離心機(jī)內(nèi)；用離心機(jī)從液體分離浮在表面上的東西，浮在表面上的東西直接暴露于所述注射針隔膜；以及使用注射針延伸通過(guò)所述隔膜，從容器內(nèi)抽取浮在表面上的東西。
15.權(quán)利要求14的方法，其中液體通過(guò)重力自輸入被引入容器內(nèi)。
16.權(quán)利要求14的方法，還包括 將注射器連接到所述通風(fēng)管配件；以及使用注射器以在所述容器內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓，從而將液體從液體源抽入容器內(nèi)。
17.權(quán)利要求14的方法，還包括將適配器主體安裝到所述管配件上的開始步驟，所述適配器主體具有對(duì)應(yīng)于所述入口管配件和所述通風(fēng)管配件的入口管形支路和通風(fēng)管形支路； 連接步驟，包括將入口管形支路連接到液體源；以及密封步驟，包括在處于支撐蓋的上部?jī)?nèi)的位置處切斷和密封入口管形支路和通風(fēng)管形支路。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所述液體是血液，所述液體源是血液?jiǎn)卧?br> 全文摘要
公開了冷凍保存細(xì)胞的系統(tǒng)和方法。液體樣本儲(chǔ)存器包括形成在容器的一端處的入口管配件和通風(fēng)管配件，相對(duì)開口端由注射針隔膜封閉。支撐蓋可拆卸地接合到容器以支撐容器并保護(hù)連接到配件的入口管形支路和通風(fēng)管形支路的終端。支撐蓋包括一對(duì)相對(duì)的支腿，其具有向外指向的突出部用于安裝在離心機(jī)內(nèi)，同時(shí)支撐冷凍保存容器。
文檔編號(hào)A01N1/00GK102160546SQ20101052094
公開日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月24日
發(fā)明者E·J·伍茲 申請(qǐng)人:瓦埃爾科有限責(zé)任公司