專利名稱：具有殺蟲活性的蛋白的制作方法
技術領域：
本申請涉及一般控制有害有機體，更具體地說，組成成分和方法，控制方法和白蠟 窄吉丁( ‘ ΑΒ的”)，Agrilus曲柳窄吉丁。
背景技術：
蘇云金桿菌(“Bt基因”)是一個孢子形成，桿狀，革蘭氏陽性菌密切相關，蠟樣芽 胞桿菌。大量的Bt基因已被發(fā)現(xiàn)并分離到亞種，分組，如蘇云金芽孢桿菌蘇云金桿菌，蘇云 金芽孢桿菌kurstaki，蘇云金芽孢桿菌aizawai的基礎上，分類計劃最初由博納富瓦，并在 1963年開發(fā)德巴爾雅克等。轉Bt顯然是從其他桿菌區(qū)別在于細胞內晶體s，這是不溶性的 蛋白生產(chǎn)中的存款，其中許多人對各種昆蟲物種的殺蟲活性。在芽孢形成過程中，綜合了大 量轉Bt —個或幾個蛋白S的然后晶體利澤成各種形狀的。轉Bt基因為基礎的昆蟲icides制定與孢子S和轉Bt發(fā)酵過程中產(chǎn)生的材料， 但主要的活性成分S是這些昆蟲icidal蛋白晶體S作為第已知哭毒素哭了一個天然毒素 毒性后，兩者均致命劑量攝入通路涉及的易感主機1)由適當?shù)腜H值在中腸晶體毒素原增 溶作用的結果；2)酶切割的毒素原分子在特定地點的活化形式的結果該毒素；3)活化毒素 分子受體結合具體的刷狀緣膜，導致腸上皮細胞裂解；4)不可彌補的損害編隊在腸道中腸 細菌進入血腔造成的；及5)死亡敗血癥(Knowles和埃拉爾1992年，鮑爾和潘克拉茨1992 年)。該基因編碼的轉Bt晶體蛋白被稱為“哭，因為它的晶體-表型的生產(chǎn)”。第一次哭 基因，后來被指定哭生長素，克隆約由施奈夫和懷特利(1981年，國立。Natl。ACAD的?？?技。美國78個，2893年至2897年)20年前。從那時起，額外的cry基因的克隆許多報告已 經(jīng)出版。即使在一轉Bt生產(chǎn)菌株的晶體蛋白在昆蟲s品種特性不同。大多數(shù)轉Bt晶體生 產(chǎn)線昆蟲icidal蛋白的角度衡量，鱗翅目物種活躍。此外，還有轉Bt菌株產(chǎn)生晶體線昆蟲 icidal蛋白活火山對雙翅目和鞘翅目昆蟲物種。截至1997年，約190Bt基因為基礎的微生物昆蟲icides登記在美國的某些鱗翅 目，雙翅目控制和鞘翅目害蟲fl (施奈夫等。1993年)。由于蛋白秒，轉Bt的哭聲基因用于 賦予昆蟲抗性植物和微生物秒使用基因工程在轉Bt晶體蛋白，Cry3，Cry7，Cry8，Cry9和Cry43已知的對鞘翅目物種活躍。 其中，CrySCa報道，對付圣甲蟲甲蟲活躍(大場等。，1992年，j的耳目一新。微生物。14， 54-57)。在2003年，淺野等人。(2003年，生物防治28 (2003)，191-196)公布了一個新的轉Bt菌株稱為SDS502這顯示了對鯧cuprea，甲側柏，和非常高的水平弧麗金龜活動調查粳 稻，這是圣甲蟲甲蟲物種。體育粳稻，日本甲蟲，是在美國特別重要的基因高山口 SDS502粳 稻活動負責已被隔離并命名crySDa。該基因編碼的蛋白，CrySDa，發(fā)現(xiàn)有一高，對日本甲蟲 的具體活動，至少高一倍作為CrySCa和Cry43Aa，另外兩個轉Bt晶體蛋白S與具體活動對 日本甲蟲和其他金龜子殺蟲活性。進一步資料SDS502，CrySDa，并CrySDa可能會發(fā)現(xiàn)在美 國專利號6962977'，發(fā)出2005年11月8日，這是此納入?yún)⒖嫉娜?。在昆蟲害蟲的，任何已知的殺蟲活性哭了先前發(fā)現(xiàn)，白蠟窄吉丁(EAB的)，花曲柳 窄吉丁(鞘翅目吉丁科)，可能是其中最具破壞性的。在白蠟窄吉丁是蛀木蟲，原產(chǎn)于中 國，日本，韓國，蒙古，俄羅斯遠東地區(qū)，以及臺灣(于1992年)。成蟲從樹上開始出現(xiàn)在5月底，在6月的高峰出現(xiàn)。在白蠟樹葉完全刷新了這個 時候。EAB的成蟲比較長壽命(在實驗室2個月)和灰樹木的樹葉在其整個生命。他們的 日子大多是在花的檐篷，并要求飼養(yǎng)3周前的成熟開始產(chǎn)卵。有一些交錯出現(xiàn)，因為EAB的 發(fā)展在一或兩年，這取決于對蟲害的下降階段，由于灰衛(wèi)生早在侵擾他們需要2年時間攻 擊分行上層林冠削弱樹。一旦冠下降是廣泛的，他們攻擊的主要干道和發(fā)展，是在一年內完 成。2002年，被確定為EAB的廣泛灰(白蠟屬的原因。)在密歇根州和東南部附近的 安大略省，加拿大死亡率。EAB的已造成約自其在北美(抵達Cappaert等2500萬下密歇根 州白蠟樹。2005年，波蘭和麥卡洛2006年)。EAB的也蔓延到美國密歇根州上半島，俄亥 俄，印第安納州，馬里蘭州，弗吉尼亞州和伊利諾伊州。盡管州政府和聯(lián)邦政府旨在遏制EAB的，缺乏有效的方法來檢測EAB的遍布樹木 和蟲害面積隔離導致了監(jiān)管機構從一個貧窮戰(zhàn)略轉變?yōu)楣芾?。在美國，EAB的根除努力涉 及所有在周圍白蠟樹(美國農業(yè)部動植物檢疫局2006年)著名蟲害的Vi英里區(qū)搬遷。到 被發(fā)現(xiàn)的感染和治療時間，然而，EAB的了通常已經(jīng)消滅這些外區(qū)分散。青銅樺木鏜床，甲anxius，美國一個天然的EAB的相對已知傳播在10至20英里 的速度，每一年，這已被視為一個EAB的'自然擴散率(估計2003年提出的聯(lián)邦登記冊)。 EAB的飛行和分散的格局最近的研究發(fā)現(xiàn)孕女性強制移民；一飛一女交配2公里，每天平均 在4天飛行近10公里(泰勒等人。2006年)。除了自然擴散，蔓延的EAB的是加速通過人 類輔助布滿灰的木柴，木材，實木包裝材料的運動，和苗木。這導致了 EAB的蔓延從密歇根 州的馬里蘭州和弗吉尼亞州在2003年；檢疫遵守和執(zhí)行仍然是一個問題。由于EAB的整個 北美，管理機構，土地管理者和公眾傳播正在尋求諸如微生物和生物控制的可持續(xù)管理工 具，以減少EAB的人口密度，減緩其傳播(Cappaert等人。2005年，高2006年的報告，波蘭 和麥卡洛2006年，BenDor等。2006年)。EAB的帶來的風險，在北美灰資源是巨大的。對粉煤灰的60種，白蠟屬。全世界已 知的16種天然到北美洲(哈克等人。2002年)。灰種北美特有的森林和已知的易受EAB 的包括白色灰(樓美洲)，綠灰(樓permsylvanica)，灰，黑(黑樓)樹，是森林的重要組 成部分；布盧阿什(樓quadrangulata)和南瓜灰(陳大良號)，這是不太常見的物種。有 越來越多的證據(jù)表明，EAB的攻擊都將白蠟屬。，雖然先天易感性的物種和品種而異(劉等 人。2003年)，魏等人。2004年，Rebek等。2005年，劉等人。印刷中)。每個白蠟屬。適應是在森林生態(tài)系統(tǒng)略有不同的棲息地。幾個品種的不良的場所和潮濕的土壤排水寬容，保護環(huán)境敏感的沿岸地區(qū)；如灰黑色的純林生長在沼澤和沼澤中， 他們提供瀏覽，熱蓋北部地區(qū)，保護野生動物，如鹿和駝鹿。在農業(yè)和防護林區(qū)，為牲畜提供 了至關重要的灰住房；例如約25年的北達科他州所有的樹木％是白蠟屬。年輕的白蠟樹 的樹皮，包括海貍，兔哺乳動物青睞食品，和豪豬；老樹木提供諸如木材鴨，啄木鳥，山雀腔 筑巢鳥類的棲息地，和紅胸幣鳥；種子消耗鴨，歌曲和游戲鳥類，小型哺乳動物和昆蟲第根 據(jù)最近美國農業(yè)部森林服務清單，有約80億美元，其中美國的林地約6. 93億美元在密歇根 州發(fā)生(美國農業(yè)部2006年財政司司長)白蠟樹。截至2006年，經(jīng)理們估計25密歇根 白蠟樹萬元屈服于EAB的。作者EAB的對林區(qū)生態(tài)環(huán)境的影響是難以量化或預測，雖然一 2. 6%的林地平均有白蠟樹屬植物。(美國農業(yè)部財政司司長2006年)。阿什木材價值為需要強大的硬木材的應用，但剛性不足楓木。在美國東部，一個 114億元的凈灰板英尺鋸木材采伐量，包括7. 5的所有闊葉樹種量％。由不同國家的影響， 但僅在密歇根州的木材灰估計為770億板英尺收獲一次。2001年，灰分超過1. 49億美元在 美國白蠟生產(chǎn)的木材產(chǎn)品板英尺占主要商業(yè)硬木是在生產(chǎn)中使用的工具手柄，球棒，家具， 地板，集裝箱，汽車和鐵路聯(lián)系，劃艇槳，雪鞋，船，門，柜，是為灰綠色，如申請使用實木板條 箱，盒，把手，并在生產(chǎn)高檔紙纖維，黑色灰通常用于室內家具，櫥柜，和天然的美國人需要 為竹編藝術這一物種。除了制造業(yè)，白蠟樹參與了城市景觀，由于其歷史抵抗害蟲和不利的生長條件，如 土壤板結和干旱，容忍了重要作用。許多灰樹，現(xiàn)在街頭，樹蔭服務和景觀樹木種植，以取代 荷蘭榆樹病摧毀榆樹，白蠟樹現(xiàn)在包括5-20在整個北Ameri約所有街道樹木％在美國，城 市地區(qū)覆蓋約3. 5%的土地總面積，包含超過75%的人口，支持約38億美元的樹木。美國 芝加哥市約603，000，提供葉面積的14. 4(2003年聯(lián)邦登記冊)％白蠟樹。樹被認為是至關 重要的，因為他們對城市的衛(wèi)生隔離氣態(tài)空氣污染物及微粒物質，幫助人們透過樹蔭下保 護他們提供能量，協(xié)助雨水分散，為城市群防護林帶，并有助于審美快感生活的城市，居民 和游客。阿什顯然是城市森林的重要組成部分為經(jīng)濟和環(huán)境的潛在影響，如果這種木材無聊害蟲的人，成為在美國成立，是廣泛 的。作者在美國的7553萬增長林地補償價值白蠟樹估計二千八百二十二億五千萬美元?，F(xiàn)正研究開發(fā)EAB的管理工具，使用常規(guī)昆蟲icides，然而，這些化合物大致毒 性，價格昂貴，最有效的昆蟲icides要求持牌施藥處理，使他們在公園的使用，林地，森林， 濕地和沿岸地區(qū)經(jīng)濟和環(huán)境不可接受(鮑爾等人。2005年)。對森林昆蟲控制的主要管理 工具登記微生物昆蟲與昆蟲病原細菌蘇云金桿菌(Bt)的制定icides。公共飛播套用的轉 Bt基因為基礎的微生物昆蟲icides接受，主要用于在美國的吉普賽蛾的控制，是高，因為 Bt基因是有效的，自然發(fā)生的，相對的主機具體的，可生物降解，生物控制，如兼容其他管理 策略，并保留后，整個世界(麥卡洛和鮑爾2000年，西格爾2000)使用20年良好的安全記 錄。林業(yè)是其中的微生物昆蟲icides已取代常規(guī)昆蟲icides幾個市場之一。這產(chǎn)生 于對昆蟲害蟲舞毒蛾等森林管理Bt基因為基礎的昆蟲icides發(fā)展和云杉在60年代和70 年代青蟲。在20世紀80年代和90年代，包括發(fā)現(xiàn)和蘇云金芽孢桿菌亞種的商業(yè)化技術發(fā) 展。kurstaki高清我(Btk制劑)，高效力的產(chǎn)品改進配方的稀釋在超低量空中噴灑，和廣 泛的業(yè)務經(jīng)驗，導致在兩落葉針葉林的管理和使用效益及環(huán)保標準昆蟲icides森林食葉類群昆蟲整個世界。1990年至1998年，Btk制劑應用于約四百五十〇萬英畝(180萬公頃) 的落葉昆蟲第林地管理后EAB的2002年發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)絡實名制注冊評估了 4個轉Bt對鱗翅目昆蟲的控制方 法icides活動和/或對鞘翅目害蟲白蠟窄吉丁成蟲fi。這些產(chǎn)品對EAB的證明無效，支持進 一步研究需要確定一個EAB的積極轉Bt菌株(鮑爾等人。2005年)。這涉及到一些克隆 毒素及約30鞘翅目歐米茄積極轉Bt菌株從美的文化和收藏品獲得專利正在進行的EAB的 成蟲和幼蟲生物測定。發(fā)明概述本公開包括能夠產(chǎn)生毒性蛋白的微生物蘇云金桿菌血清變型蠟螟SDS502菌株， 所述毒性蛋白可以起到有害有機體控制劑的活性成分的作用，其對于白蠟窄吉丁(EAB)、花 曲柳窄吉丁(鞘翅目吉丁科)具有高特異性殺蟲活性。本公開還證實衍生自SDS502菌株的下列材料都對EAB具有活性毒素原和毒素形 式的CrySDa純化蛋白、CrySDa晶體毒素和孢子混合物、和衍生自SDS502菌株的發(fā)酵液的 發(fā)酵材料。本公開的另外的實施方案證實，當和分離自黃粉蟲(鞘翅目擬步甲科)的鈣 黏著蛋白樣蛋白混合時，SDS502材料對于昆蟲害蟲(包括EAB)的增強的殺蟲活性。該 肽rTmCadlp由來自黃粉蟲的一部分Cry3Aa毒素粘結鈣黏著蛋白(TmCadl)制成，當其和 SDS502材料混合時，增加EAB的死亡率。本公開的另外的實施方案證實了液滴吸收生物測定法，其被開發(fā)以測定各種材料 針對成年EAB的活性。附圖簡要說明


圖1示出液滴吸收生物測定，其被開發(fā)以測定衍生自SDS502的各種材料對于成年 EAB的活性。圖2示出當兩種形式的蛋白在SDS-PAGE凝膠上運行時，Cry8Da毒素原和Cry8Da 活化毒素之間的分子量差別。毒素原形式的蛋白的分子量為135KDa，而活化形式為約 65KDa。圖3示出CrySDa毒素原和CrySDa活化毒素對于成年EAB的生物測定結果，它們 溶于50mM NaPO4緩沖液(pH 8. 0)中，這證實0. 04至0. 10 μ g Cry毒素的96_h中間致死劑 量(LD50)具有相對高的毒性。毒素原和活化毒素的類似毒性表示EAB中腸酶能夠活化該 毒素。變性CrySDa毒素對于接受2. 5 μ g毒素劑量的EAB成蟲沒有毒性，所述毒素通過在 50mM CAPS緩沖液(pH 10)中煮沸20分鐘而變性，而所有EAB成蟲在接受類似劑量的非變 性Cry8Da毒素72h內死亡。這證實在我們的生物測定中EAB成蟲死亡率由SDS502 Cry8Da 蛋白引起，其是首先證實對于EAB具有毒性的Cry毒素。評價CrySDa對于EAB幼蟲的毒性 的生物測定同樣證實對于幼年形式的EAB的殺蟲活性。圖4示出SDS502孢子和晶體的混合物。白色箭頭指向包含CrySDa毒素的晶。更 大的橢圓形目標為孢子。圖5示出針對成年EAB測試時，多種孢子_蛋白毒素晶體混合物的死亡率％，包括 15種不同菌株的Bt和它們的相對毒性對成年EAB至SDS502孢子-晶體混合物。Bt培養(yǎng) 物在DSMG培養(yǎng)基中在振蕩水浴培養(yǎng)下生長，晶體/孢子以27，OOOg旋轉，并使用無菌DiH20和NaCl在20，OOOg下洗滌，重懸于無菌DiH20中，超聲，稀釋液負載到SDSPAGE上，并且使 用凝膠Doc利用比重計測定的蛋白濃度和作為標準曲線的BSA相關聯(lián)。圖6示出SDS502天然孢子-晶體混合物對于成年EAB的中間致死劑量(LD50)。 甚至成年菌落的雄心和雌性EAB成蟲都單獨給予0. 5 μ L的SDS502晶體/孢子復合物液 滴，其是使用已知濃度的CrySDa毒素凍干的粉末。該粉末混懸于DiH20中，并將該混懸液 無菌稀釋以制備劑量為0. 03125,0. 0625,0. 125,0. 25和0. 5 μ g Cry毒素，使用DiH20作為 對照。對于6個處理/生物測定，十五個EAB被單獨給藥，重復兩次生物測定，用SAS Proc Probit 分析。圖7示出在給予各種濃度的SDS502天然孢子-晶體混合物后的天數(shù)內，成年EAB
累積死亡率％。圖8示出將白蠟樹葉浸漬到混懸于Silwet中的SDS502原粉中后，在葉浸漬測定 中的成年EAB死亡率％。圖9示出當混合或不混合鈣黏著蛋白樣蛋白時，純化CrySDa毒素對于成年EAB的 相對毒性的生物測定結果，肽rTmCadlp由分離自黃粉蟲(鞘翅目擬步甲科)的一部分鈣 黏著蛋白TmCadl制成。
圖10示出由來自T. molitorCTmCadl)的一部分Cry3Aa毒素粘結鈣黏著蛋白制 成的肽rTmCadlp，其包括預測的毒素粘結區(qū)域。TmCadl肽片段對應于全長蛋白(核苷酸 4，076-4，661的翻譯)的氨基酸殘基1，322-1，516。黑體和下劃線表示TmCadl氨基酸(195 個殘基)，而氨基酸末端處的37個殘基來自pETl 51-D-T0P0載體，包括組氨酸標簽、V5抗 原決定部位標簽和TEV蛋白酶切割位點。該肽在體外E. coli中表達并且純化以用于生物 測定。
圖11示出生物測定裝置，其用于暴露于白蠟樹葉上的BtSDS502制劑的EAB成蟲。 箭頭表示SDS502制劑的干燥液滴。
圖12是示出在暴露于使用SDS502制劑液滴的白蠟樹葉的過程中EAB成蟲的累積 死亡率％的圖。序列表簡要說明SEQ ID NO 1 示出衍生自 SDS502 菌的 Cry8Da 蛋白。SEQ ID NO :2 示出 rTmCadlp 肽，其由來自 T. molitor (TmCadl)的一部分 Cry3 Aa 毒素粘結鈣黏著蛋白制成。SEQ ID NO 3示出一部分rTmCadlp肽，其對應于T. molitor的全長TmCadl蛋白 的TmCadl氨基酸殘基1，322-1，516。發(fā)明詳述綜述CrySDa蛋白的篩選證實對于白蠟窄吉丁(EAB)，花曲柳窄吉丁(鞘翅目吉丁科) 具有活性。這種高活性對EAB的具體體現(xiàn)在實驗室生物測定的EAB的S與成人和幼蟲都 Cry8Da毒素原和Cry8Da活化毒素，并與一對Cry8Da晶體和孢子組成的混合材料。這證實 了我們的生物測定s EAB的死亡率是由SDS502 Cry8Da蛋白引起的。本公開提供了一個微生物蘇云金桿菌血清變型蠟螟SDS502菌株從該生物成分來自，以及SDS502菌株本身，具有殺蟲對白蠟窄吉丁活性(EAB的)，花曲柳窄吉丁(鞘翅目 吉丁科)。SDS502菌株有能力產(chǎn)生一個蛋白是毒性為EAB的幼蟲和成蟲，并可以作為一個 EAB的控制劑在一個菌株的SDS502是通過對各種化學物質數(shù)量制定發(fā)酵形成活性成分是 否作為地面或空中噴灑或作為地面應用顆?？蓾裥苑蹌┗蛞后w。生物成分具有本毒性活性是Cry8Da蛋白具有殺蟲活性的菌株，或下列之一 1蛋 白的氨基酸序列有從CrySDa蛋白氨基酸序列產(chǎn)生索取此外，刪除或替代的一 S和多元化的 氨基酸有類似殺蟲活性，在DNA編碼CrySDa蛋白具有殺蟲活性，包括合成DNA或基因，與 DNA,與一個氨基酸序列蛋白有95 %，90 %，85 —個微生物轉化％，80 %或75 %的序列同源 性的序列如SEQ ID號1，具有殺蟲活性。另外，本公開介紹了一種添加劑，當混在SDS502菌株及其殺蟲蛋白，控制的有害 有機體對EAB的SDS502菌株特點是增加了。這個添加劑是鈣黏著蛋白樣蛋白分離黃粉蟲 (鞘翅目擬步甲科)。在另外的實施方案中，添加劑可能是蛋白或肽有95%，90%，85%， 80%或75%序列同源性為如SEQ肽ID號2或的SEQ ID號3。B.通常技術對本公開實踐的方法通常會使用，除非另有說明，常規(guī)的分子生物學，微生物學， 細胞生物學，生物化學技術，免疫學，這屬于是最先進的技術。這種技術完全解釋文獻中，例 如，在細胞生物學一個實驗室筆記本，在分子生物學(當前的協(xié)議調頻奧蘇貝爾等人。合 編，1987)，在分子短議定書生物學(Wiley和Sons，1999)。此外，程序采用的商用檢測試劑 盒和試劑將按照通常被用來制造商定義的協(xié)議，除非另有說明。C.定義術語“原粉”在這里描述的物質從SDS502菌株的發(fā)酵液后的處理(如噴霧干燥或 冷凍干燥開始培養(yǎng)發(fā)酵液產(chǎn)生的)來產(chǎn)生干原粉。該粉末包含SDS502有機體、其晶體毒素 和孢子。術語“EAB控制劑”或“有害有機體控制劑”用于描述SDS502基原粉的制劑，其可 應用于各種應用程序通過的方法，各種不同的環(huán)境與控制EAB的目的數(shù)目。例如，試劑可以 是地面或空中噴灑液體或可濕性粉劑，或可為地面應用顆粒。術語“基因”泛指任何具有生物功能相關的DNA片段?；虬ň幋a序列和/或所 需的表達以及序列是否允許在對本公開的其中兩個基因的序列是通過一個連接器融合，生 產(chǎn)出更復雜的一個新的基因組合功能的方法，個案調控序列生物學功能?；蜻€包括非表 達的DNA片段對基因表達的這一需要，如其他蛋白序列識別多種功能?；蚩蓮亩喾N來源， 包括從克隆的利益來源，例如任何生物體，或已知或預測的綜合序列信息，并可能包括旨在 人工序列具有理想特性。術語“同源性”或“同源百分比”在兩個或兩個以上核酸或多肽序列的情況下，是 指兩個或兩個以上的序列或子序列是相同的。兩個序列是“基本上同源的”如果兩個序列 有一個氨基酸殘基或核苷酸，它們是相同的(即60 %的身份，可任選地65 %，70 %，75 %， 80%，85%，90%，95%或99%的身份在指定區(qū)域，或者沒有指定時，在整個序列)，相比，最 大程度地排列在一個比較對應的窗口，或指定的區(qū)域作為測量使用下列其中一個序列比較 算法或手工調整和視覺檢查?？扇芜x地，身份存在過一個約50核苷酸(或10個氨基酸)的長度，或在一個區(qū)域是100至500或1000或以上的核苷酸(或最好是至少20，50，200或
更多區(qū)域的氨基酸)的長度。對于序列比較，通常一個序列作為一個參考序列，對此測試序列進行了比較。當使 用一個序列比較算法，測試和參考序列為輸入電腦，指定坐標序列，如果必要，序列算法程 序參數(shù)指定。默認程序的參數(shù)可以使用，或替代參數(shù)可以指定。序列比較算法，然后計算為 百分之測試序列特征序列相對于參考序列的基礎上程序參數(shù)。本文中使用的“比較窗口，，包括提述的任何職位，包括連續(xù)的一個部分，但不限于 從20到600，通常大約在200至50，更通常大約在100至150這可能是一個序列后比較兩個 序列的相鄰位置的相同數(shù)目的最佳參考序列一致。序列比對的方法進行比較是眾所周知的 藝術。最優(yōu)序列比對可以進行比較，例如通過Smith和Waterman的局部邊緣算法(1970) Adv. Appl. Math. 2 :482c ；Needleman 和 Wunsch 的均勻算法.MoL Biol. 48 :443，1970 ；尋找 類似性的方法，Pearson 和 Lipman，Proc. Nat' 1. Acad. ScL USA 85 :2444，1988 ；這些算法 的計算機補充(GAP，BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI)、或手工算法禾口 肉目艮 觀察(例如參見 Brent et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed.，2003))。兩種算法是決定百分之序列同源性和相似性序列合適的例子是2. 0高爐和BLAST 算法，這在下列文獻中有所描述Altschul et al.，Nuc. Acids Res. 25 :3389_3402，1977 ； 和Altschul et al.，J. MoL Biol. 215 :403_410，1990。為履行高爐分析軟件可通過公開 的國家生物技術信息中心。該算法，首先是確定，確定在查詢序列，或者符合或滿足了一些 積極的值閾值評分時，對同一數(shù)據(jù)庫中的序列長度字對齊的話短長的T W高得分序列對 (HSP)的。T是被稱為閾值附近評分(Altschul et al. , supra)。這些初步的鄰里字點擊 發(fā)起搜索，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白含有這些不再作為種子的行為。這個詞的點擊率是每一個序列 擴展到沿兩個方向為盡可能的累積得分排列可以增加。累積分數(shù)計算，為核苷酸序列，參 數(shù)m(—對匹配的殘留獎勵分；總是>0)和N(錯配罰分，此外，殘留；快捷聯(lián)系人0)。對于 氨基酸序列秒，計分矩陣，用來計算累積得分。這個詞在各個方向延伸命中是停止時對齊 的累積得分下降的數(shù)量X從關閉它的最大價值實現(xiàn)；的累積得分去零或以下，由于一個或 多個負累積得分殘留路線；或任一序列的結尾為止。該BLAST算法參數(shù)w，睪酮，和X確定 的靈敏度和定位速度。該方案的核苷酸序列BLASTN程序()使用的默認11字長(寬)，期 望(E)或10，女=5，氮=-4和1兩個股比較。對于氨基酸序列時，經(jīng)BLASTp方案默認使 用了 3字長，并期望10(E)和計分矩陣的BL0SUM62(參見Henikoff and Henikoff，Proc. Natl. Acad. ScL USA 89 10915,1989)alignments(B)of 50,expectation (E) of 10, M = 5, N = -4，并且兩股進行比較。該BLAST算法也進行了相似的兩個序列的統(tǒng)計分析(例如參見，Karlin and Altschul,Proc. Natl. Acad. ScL USA 90 :5873_5787，1993)。一個由 BLAST算法提供了相似 的措施是最小的總和概率(P(N)的)，它提供了一個的概率，其中一兩個核苷酸或者氨基酸 序列s匹配會出現(xiàn)偶然的跡象。例如，核酸被認為類似于一個參考序列，如果在一個測試對 比總結概率最小的參考核酸核酸是小于0. 2，更低于約0. 01最好，最好小于約0. 001。D.方法和應用
本公開涉及具有EAB殺蟲活性的蛋白、編碼蛋白的DNA、EAB控制劑和控制方法、以 及能夠產(chǎn)生毒性蛋白的微生物蘇云金桿菌血清變型蠟螟SDS502菌株，所述毒性蛋白可以 起到EAB-控制劑的活性成分的作用。使用衍生自SDS502的數(shù)種不同的毒性蛋白材料，本公開證實SDS502 Cry8Da蛋白 針對EAB成蟲和幼蟲具有殺蟲活性。在另一發(fā)面，本公開提供增強殺蟲活性的方法，該方法包括通過加入肽rTmCadlp， 增強SDS502的針對EAB幼蟲和成蟲的特定毒性活性和活度。提供下列實施例來表明本公開的方法可用于產(chǎn)生SDS502基控制劑，所述控制劑 可用于控制白蠟窄吉丁(EAB)、花曲柳窄吉丁(鞘翅目吉丁科)?？上騍DS502基控制劑中 加入鈣黏著蛋白樣蛋白來增強所述控制劑控制昆蟲的由所述控制劑對準的效果。本領域技術人員將認識到盡管描述和說明了特定實施方案，但它們并非旨在限制 本文中公開的發(fā)明。
實施例實施例1 :Cry8Da蛋白對EAB成蟲和幼蟲是毒性的Cry8Da毒素原和Cry8Da活化毒素對于成年EAB的生物測定結果，它們溶于50mM NaPO4緩沖液(pH 8. 0)中，這證實0. 04至0. 10 μ gCry毒素的96_h LD50具有相對高的毒 性。毒素原和活化毒素的類似毒性表示EAB中腸酶能夠活化該毒素。變性CrySDa毒素對 于接受2. 5 μ g毒素劑量的EAB成蟲沒有毒性，所述毒素通過在50mM CAPS緩沖液(pH 10) 中煮沸20分鐘而變性，而所有EAB成蟲在接受類似劑量的非變性CrySDa毒素72h內死亡。 這證實在我們的生物測定中EAB成蟲死亡率由SDS502 CrySDa蛋白引起，其是首先證實對 于EAB具有毒性的Cry毒素。評價CrySDa對于EAB幼蟲的毒性的生物測定同樣證實對于 幼年形式的EAB的殺蟲活性。實施例2 :Cry8Da蛋白晶體-孢子混合物對于EAB成蟲和幼蟲是毒性的除了純化形式的CrySDa蛋白，也測試了天然形式的該蛋白針對EAB成蟲和幼蟲的 活性。Bt培養(yǎng)物在DSMG培養(yǎng)基中在振蕩水浴培養(yǎng)下生長，晶體/孢子以27，OOOg旋轉， 并使用無菌DiH20和NaCl在20，OOOg下洗滌，重懸于無菌DiH20中，超聲，稀釋液負載到SDS PAGE上，并且使用凝膠Doc利用比重計測定的蛋白濃度和作為標準曲線的BSA相關聯(lián)。簡言之，甚至成年菌落的雄心和雌性EAB成蟲都單獨給予0. 5 μ L的SDS502晶體 /孢子復合物液滴，其是使用已知濃度的CrySDa毒素凍干的粉末。該粉末混懸于DW中，并 將該混懸液無菌稀釋以制備劑量為0. 03125,0. 0625,0. 125,0. 25和0. 5 μ g Cry毒素，使用 Dff作為對照。我們對于6個處理/生物測定，十五個EAB被單獨給藥，重復兩次生物測定， 用 SAS Proc Probit 分析。實施例3 :SDS502原粉對于EAB成蟲和幼蟲是毒性的我們證實白蠟樹葉浸漬到混懸于Silwet中的SDS502原粉中后，在葉浸漬測定中 的成年EAB死亡率。SDS502菌株在這樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中細菌可通過常規(guī)發(fā)酵技術來生長。在5 升SDS502的發(fā)酵液中使用下列培養(yǎng)基來制備原粉
Glucose Fed-Batch 型發(fā)酵液4% (40g/L)脫脂大豆面粉lg/L NH4Cl1. 5g/L KH2PO43. 5g/L K2HPO40. 5g/L MgS047H20lOmg/L FeSO4 7H20lOmg/L MnSO4 H2O pH 用 KOH 或 H2SO4 調節(jié)至 7. O使用葡萄糖加料運行加料批次(加料速度0. 0125%的培養(yǎng)基體積/hr (0. 125g/ L/hr))，從3hr至16hr。在發(fā)酵后，離心固體材料并噴霧干燥。然后測試材料。和使用SDS502菌株SDS502菌株-產(chǎn)生的晶體蛋白作為單一活性成分的情況相 反，也可以將其混合除草劑、各種殺蟲劑、細菌和植物生長調節(jié)劑，它們對于其他有害有機 體是有效的，協(xié)同多種效果，引誘劑，以及植物營養(yǎng)劑，肥料等，這旨在獲得其他功能。實施例4 向CrySDa蛋白中加入鈣黏著蛋白樣蛋白增強對于EAB成蟲和幼蟲的毒 性一種增強殺蟲活性的方法，包括證實通過加入蛋白-鈣黏著蛋白樣蛋白，SDS502 針對EAB幼蟲和成蟲的特定毒性活性。由來自T. Hi0Iitor(TmCadl)的一部分Cry3Aa毒素 粘結鈣黏著蛋白制成的肽rTmCadlp，其包括預測的毒素粘結區(qū)域。TmCadl肽片段對應于 全長蛋白(核苷酸4，076-4，661的翻譯)的氨基酸殘基1，322-1，516。黑體和下劃線表示 TmCadl氨基酸(195個殘基)，而氨基酸末端處的37個殘基來自pETl 51-D-T0P0載體，包 括組氨酸標簽、V5抗原決定部位標簽和TEV蛋白酶切割位點。該肽在體外E. coli中表達 并且純化以用于生物測定。
圖10示出rTmCadlp肽的序列。使用液滴吸收方法，甚至成年菌落的EAB成蟲都給予純化的CrySDa毒素，它們 溶于磷酸鹽緩沖液中并進行下列處理1) Cry8Da毒素，2) Cry8Da毒素and rTmCadl，3) rTmCadl, or 4)緩沖液對照。以恒定的Cry8Da劑量，rTmCadl增強CryDa毒素在EAB成蟲 中的毒性。這些結果(圖9)支持可以使用該肽來改善來自SDS502的CrySDa的毒性，以用 于控制EAB。實施例5 配制的SDS502原粉對于EAB成蟲是毒性的，并且通過白蠟樹葉的EAB成 蟲來抑制進食，所述白蠟樹葉已經(jīng)用SDS502制劑(組合物)處理Bt生物殺蟲劑通常通過下列方式制備噴霧干燥或凍干形成孢子的Bt培養(yǎng)物 (稱為Bt原粉或工業(yè)級活性成分(〃 TGAI “))，使用噴霧助劑(延展劑、粘結劑、UV保護 劑)來配制，并加入刺激劑。配制的Bt噴霧施用并沉積為葉表面上的非常小的液滴，噴霧 液滴的尺寸和數(shù)量已知影響B(tài)t噴霧的毒性，其必須被吃掉以引起死亡。為了進行評價，必 須配制SDS502原粉。然而由于在昆蟲中腸中的毒性作用，必須消耗Cry毒素，在消化后迅 速發(fā)生停止進食，因此通常向制劑中加入進食刺激劑。對于白蠟樹葉的液滴吸收我們制備了 Bt SDS502制劑以測試由SDS502天然晶體和孢子構成的情況，其混懸在10%蔗糖溶液中。蔗糖用于改善Bt粉末和葉的粘附(“增粘 劑")并克服Bt進食抑制(“進食刺激劑")。為了評價SDS502制劑的效果，0. 02 μ L的材料液滴按照下列方式施加十滴以不同圖案施加至Ι-cm2的白蠟樹葉(沿著葉的邊、沿著中間、分散)。每滴含約0.3yg CrySDa 毒素，30個測量的液滴的平均直徑為819 μ m(
圖11)。EAB成蟲單獨暴露于處理或對照(只 有蔗糖而沒有TGAI)的葉96h，并且監(jiān)控每日死亡率。如果消耗，葉用未處理的頁來代替。
對照EAB成蟲消耗約90至> 100 %的l_cm2的葉，而Bt-處理的EA成蟲消耗約 < 5至60%的葉。在24h小時后，約15%的EAB死亡，在48h后60至80%的EAB死亡，到 96h，> 90%的成蟲(在Bt處理的葉上進食)死亡，12%的對照死亡(
圖12)。當沿著葉的 邊、沿著中間、或分散暴露時，EAB成蟲的死亡率響應類似。每個葉(從0至10)觀察到消 耗平均2. 2個液滴，這暗示甲蟲消耗平均0. 66 μ g，這幾乎是EAB中該Bt SDS502的LD50的 三倍。
權利要求
1.一種控制花曲柳窄吉丁(Agrilus planipennis Fairmaire)的方法，該方法包括使用對于花曲柳窄吉丁具有殺蟲活性的組合物處理植物；其中所述組合物包含蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)蛋白。
2.權利要求1所述的方法，其中所述蘇云金桿菌蛋白包含和SEQID NO :1具有至少 85 %的序列同源性的氨基酸序列。
3.權利要求2所述的方法，其中所述蘇云金桿菌蛋白包含和SEQID NO :1具有至少 95 %的序列同源性的氨基酸序列。
4.權利要求3所述的方法，其中所述蘇云金桿菌蛋白包含SEQIDN0:1的氨基酸序列。
5.權利要求1所述的方法，其中所述組合物還包含黃粉蟲(TenebriomoIitor)肽。
6.權利要求5所述的方法，其中所述黃粉蟲肽包含和SEQIDNO :3具有至少85%的序 列同源性的氨基酸序列。
7.權利要求6所述的方法，其中所述黃粉蟲肽包含和SEQIDNO :3具有至少95%的序 列同源性的氨基酸序列。
8.權利要求7所述的方法，其中所述黃粉蟲肽包含SEQID NO :3的氨基酸序列。
9.權利要求2所述的方法，其中所述植物是白蠟樹屬種(genusFraxinus) 0
10.權利要求9所述的方法，其中所述白蠟樹屬種的植物選自F.Americana, F.pennsylvanica、F.nigra 禾口 F. profunda。
11.權利要求2所述的方法，其中所述植物滋生花曲柳窄吉丁。
12.權利要求1所述的方法，其中所述組合物選自液體組合物、粉末組合物和顆粒組 合物。
13.權利要求1所述的方法，其中所述組合物對于花曲柳窄吉丁幼蟲具有殺蟲活性。
14.權利要求1所述的方法，其中所述組合物對于花曲柳窄吉丁成蟲具有殺蟲活性。
15.一種控制花曲柳窄吉丁的方法，該方法包括將對于花曲柳窄吉丁具有殺蟲活性的組合物施用至花曲柳窄吉??；其中所述組合物包含蘇云金桿菌蛋白。
16.權利要求15所述的方法，其中所述組合物是口服的。
17.權利要求15所述的方法，其中所述組合物還包含黃粉蟲肽。
18.權利要求17所述的方法，其中所述蘇云金桿菌蛋白包含SEQID N0:1的氨基酸序 列，并且所述黃粉蟲肽包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列。
19.一種控制有害有機體的組合物，包含蘇云金桿菌蛋白；和黃粉蟲肽。
20.權利要求19所述的組合物，其中所述蘇云金桿菌蛋白包含和SEQID NO=I具有至 少85%的序列同源性的氨基酸序列。
21.權利要求20所述的組合物，其中所述蘇云金桿菌蛋白包含和SEQID N0:1具有至 少95%的序列同源性的氨基酸序列。
22.權利要求21所述的組合物，其中所述蘇云金桿菌蛋白包含SEQID NO :1的氨基酸 序列。
23.權利要求19所述的組合物，其中所述黃粉蟲肽包含和SEQIDNO :3具有至少85%的序列同源性的氨基酸序列。
24.權利要求23所述的組合物，其中所述黃粉蟲肽包含和SEQIDNO :3具有至少95% 的序列同源性的氨基酸序列。
25.權利要求24所述的組合物，其中所述黃粉蟲肽包含SEQIDNO :3的氨基酸序列。
26.權利要求19所述的組合物，其中所述組合物對于花曲柳窄吉丁具有殺蟲活性。
27.權利要求26所述的組合物，其中所述組合物對于花曲柳窄吉丁幼蟲具有殺蟲活性。
28.權利要求26所述的組合物，其中所述組合物對于花曲柳窄吉丁成蟲具有殺蟲活性。
29.權利要求19所述的組合物，其中所述組合物選自液體組合物、粉末組合物和顆粒 組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開的有害有機體控制劑對于針對常規(guī)蘇云金桿菌(Bt)殺蟲劑獲得耐藥性的害蟲是有效的，并且對于鞘翅目害蟲、特別是白蠟窄吉丁(EAB)、花曲柳窄吉丁(鞘翅目吉丁科)是有活性的。此外，本發(fā)明公開了能夠產(chǎn)生毒性蛋白(Cry8Da)的微生物蘇云金桿菌血清變型蠟螟SDS502菌株，所述毒性蛋白(Cry8Da)可以起到有害有機體控制劑的活性成分的作用以控制EAB。
文檔編號A01N25/12GK102006881SQ200880126885
公開日2011年4月6日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權日2007年12月11日
發(fā)明者J·L·利比斯, L·S·博爾 申請人:美國農業(yè)部, 菲龍有限責任公司