專利名稱：：具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)物質(zhì)及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白和生產(chǎn)這些蛋白的方法。更具體地，本發(fā)明涉及人類膠原類似物和它們的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的一個目的是提供由對生物機體安全的并且可以輕易地純化并獲得的人類重組蛋白組成的膠原類似物，以及它們的生產(chǎn)方法。更具體地，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)由重組蛋白組成的膠原類似物的方法，該重組蛋白中引入的基因全部是人類的基因，其中通過穩(wěn)定地將插入了包含人類膠原的重組蛋白的CDNA的哺乳動物表達載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中來實施該方法。
背景技術(shù)：
：近年來，再生醫(yī)學(xué)中最重要的材料之一的實例是膠原。膠原是一種典型的蛋白，其分布于生物機體的幾乎所有組織中(皮膚，骨骼，軟骨，等等)，并且公知在生物機體中具有重要功能，如通過成為細胞的支架來維持生物學(xué)組織和器官的結(jié)構(gòu)。而且，它具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和遷移的各種生理學(xué)功能。由于這些事實，它正通過與細胞、生長因子等等一起用于組織工程醫(yī)學(xué)中而受到再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注。迄今為止，膠原已經(jīng)廣泛用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，用作人造器官移植物(專利文獻1)、持續(xù)性藥物釋放基質(zhì)(專利文獻i)、人造皮膚(專利文獻3)和用于傷口的繃帶基質(zhì)以及用于傷口治療的基質(zhì)的生物相容材料的組分(專利文獻4)。生物機體的全部膠原的40%存在于皮膚中，皮膚/腱干重的70%或更多為膠原。因此，膠原在人造皮膚的開發(fā)中是很重要的。特別地，膠原用作生物材料用于修復(fù)生物體中的損傷。例如，已經(jīng)報道了它用作涂覆材料用于皮膚損害如灼傷的位點的治愈和改善作用(非專利文獻1和幻。這意味著其具有很大的希望應(yīng)用于目前顯著發(fā)展的再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。而且，它用作可用于細胞和器官的培養(yǎng)技術(shù)的材料(專利文獻5和6)。另外，已經(jīng)指出口服膠原(II型膠原)等等可用于抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(非專利文獻3)。而且，通過設(shè)計表達人類膠原(VII型膠原)的部分肽的基因，并引入低分子量膠原基因到表皮水皰癥細胞中進行治療的可能性也已經(jīng)被報道過(非專利文獻4)。目前使用的很多膠原都來自非人哺乳動物物種如?；蜇i。據(jù)報道當(dāng)這些膠原被移植到人類中時，大約3%的患者出現(xiàn)過敏反應(yīng)(非專利文獻5和6)。而且，近年來，來自非人哺乳動物物種的膠原具有朊病毒或病原體的污染風(fēng)險已經(jīng)成為一個主要問題。因此，強烈需要一種用于生產(chǎn)低抗原性而且沒有病原體污染的安全的人類膠原的系統(tǒng)。為了避免這種問題，一些發(fā)明人已經(jīng)發(fā)明了一種通過用插入了編碼人膠原的cDNA的重組病毒感染昆蟲細胞以生產(chǎn)具有與人體中相同的三螺旋結(jié)構(gòu)的重組人膠原方法，而且已經(jīng)申請了專利(專利文獻7)。而且，也已發(fā)明了使用哺乳動物細胞或酵母細胞生產(chǎn)人膠原的方法(專利文獻8)。[現(xiàn)有技術(shù)文獻][專利文獻][專利文獻1]日本特開2007-204881號公報[專利文獻2]日本特開2001-316^2號公報[專利文獻3]日本特開2005-314號公報[專利文獻4]日本特開2007-160092號公報[專利文獻5]日本特開2002-142753號公報[專利文獻6]日本特再表2005-014774號公報[專利文獻7]日本特開8-23979號公報[專利文獻8]日本特表平7-501939號公報[非專利文獻][非專利文獻1]Surg.Forum,10,303(1960)[非專利文獻2]J.Surg.Res.，10，485-491(1960)[非專利文獻3]Science，261，1727-1730(1993)[非專利文獻4]THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY275卷，第32期，8月第1110,24429-24435頁，2000[非專利文獻5]J.Immunol.136:877-882,1986[非專利文獻6]Biomaterials11:176-180,1990
發(fā)明內(nèi)容可見，膠原是一種可用作藥物產(chǎn)品或用于活體供體移植或再生醫(yī)學(xué)的生物材料的物質(zhì)；但是，通常使用的膠原來自于非人哺乳動物物種如豬和牛的組織。膠原本來就是一種具有低免疫原性的蛋白，而且正被作為生物材料移植、包埋或注射到人體中。但是，盡管頻率較低仍有報道說來自于非人哺乳動物物種的組織的膠原引起免疫反應(yīng)，(J.Immunol.，136,877-882(1986)；Biomaterials,11,176-180(1990))而且，由于牛的朊病毒污染的可能性，不可能使用源自牛的膠原。此外，目前用于膠原純化和提取的哺乳動物，例如豬中，無法保證不含有未知的污染物(病原性病毒等等)如朊病毒污染，來自于非人哺乳動物的膠原應(yīng)用于人類的同時，也引起了安全問題。另外，生物學(xué)來源的膠原的一個問題是，由于包含大量雜蛋白，純化期間多步純化變得必要，這樣純化方法變得復(fù)雜?？紤]到以上問題，人類來源的膠原作為直接應(yīng)用于人類的生物材料是合乎需要的。可以從人類來源(如人的胎盤)純化人類來源的膠原(美國專利5，002，071和5，428，022)。但是，使用人類來源的膠原時也存在幾個問題(1)由于該材料是人組織，該材料的供應(yīng)有限；(不能完全消除具有病原性病毒如肝炎病毒和人類免疫缺陷性病毒(HIV)污染的可能性；C3)從胎盤收集的膠原種類是不均勻的而且品質(zhì)不完全相同；和(4)從人類提取和純化膠原存在倫理問題。由于獲得的膠原中形成非特異性的橋接，導(dǎo)致純化變得困難，因此還存在質(zhì)量問題。迄今，已經(jīng)研究了使用基因工程技術(shù)生產(chǎn)膠原的方法，以消除病原體污染的風(fēng)險并獲得分離和純化步驟簡單的大量膠原(Biochem.Soc.，28，350-353(2000))。但是，膠原分子的分子量為100000或更多，而且非常大，用于引入到宿主細胞中的表達載體的制備非常復(fù)雜。另外，常規(guī)方法無法獲得維持實際應(yīng)用的生產(chǎn)水平低。此外，膠原是一種采用3條多肽鏈締合的三螺旋結(jié)構(gòu)的分子，而且這種結(jié)構(gòu)是通過大量翻譯后修飾而形成的(N.Engl.J.Med.,311,376-386(1984))，但是預(yù)計只有特定的細胞具有這種修飾能力。眾所周知為了使膠原形成三螺旋結(jié)構(gòu)，膠原結(jié)構(gòu)域中的脯氨酸必須是羥基化的。為了生產(chǎn)具有三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原，提供了一種通過在昆蟲細胞中共表達人類膠原和脯氨酸羥化酶生產(chǎn)重組膠原的方法(日本特開2002-315580號公報)。但是，為了共表達脯氨酸羥化酶，必須共表達至少3個基因，即膠原與脯氨酸羥化酶的α亞單位和β亞單位，而且細胞的克隆變得非常復(fù)雜。在此之前已經(jīng)試驗使用倉鼠胚胎細胞、小鼠成纖維細胞等等作為宿主生產(chǎn)人類來源的重組膠原(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，84，764-768(1987);J.Biol.Chem.，264,20683-20687(1989))。這些例子中獲得的膠原的分子結(jié)構(gòu)是正常的，但是混合了宿主細胞來源的膠原和外源基因來源的膠原。而且，在人纖維肉瘤細胞HT1080中表達II型膠原的例子中(Biochem.J.，298，31-37(1994))，生產(chǎn)水平較低(每IL培養(yǎng)物0.5Img)，而且不能持續(xù)用于實際應(yīng)用。而且，觀察到與外源基因來源的II型膠原相等含量的人纖維肉瘤細胞HT1080來源的IV型膠原。因此，必須從內(nèi)源的IV型膠原分離外源基因來源的II型膠原，而且在這點上它也是不實用的。因此，即使使用一種表達系統(tǒng)，檢驗精細的純化條件成為必要，而且認為甚至在混合雜質(zhì)的條件下，一種簡單可操作的純化方法也是必需的。除了以上所述，有許多利用酵母(日本特表平07-501939號公報)、昆蟲細胞(日本特開平08-23979號公報)、短芽孢桿菌(日本特開平11-178574號公報)和大腸桿菌(日本特開2002-325584號公報)表達人膠原的例子。然而，它們可能存在生產(chǎn)與那些天然存在的人膠原具有不同翻譯后修飾的膠原的風(fēng)險。如上所述，迄今指出的所有方法都不能持續(xù)的實際用作通過基因工程定性和定量地生產(chǎn)人膠原的方法。而且，至今還沒有研究生產(chǎn)大量具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白的方法，如設(shè)計具有低分子量的重組膠原。鑒于上述情況，申請人已經(jīng)通過應(yīng)用基因工程技術(shù)獲得非抗原性膠原，消除病原體污染的危險，并獲得易于分離和純化的膠原來研究了人I型膠原的生產(chǎn)(國際公開WO2006/106970)。盡管常規(guī)方法可以保證一定的生產(chǎn)水平，更需要形成多個三螺旋結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)。表達水平方面的改善也認為是必要的。鑒于上述情況，完成了本發(fā)明。本發(fā)明的一個目的是提供安全的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的人類膠原類似物蛋白以及生產(chǎn)它們的方法。本發(fā)明人進行了各種實驗以解決上述問題，并且通過將構(gòu)建體引入到宿主細胞中，成功地生成了具有三螺旋結(jié)構(gòu)、且分子量小于天然存在的膠原、易于純化的膠原類似物(微膠原)，所述構(gòu)建體通過將人膠原凝集素的信號肽結(jié)構(gòu)域基因與人膠原凝集素的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因融合到的膠原(作為具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)之一)基因的膠原結(jié)構(gòu)域的氨基末端側(cè)、將人膠原凝集素的頸結(jié)構(gòu)域(neckdomain)基因與人膠原凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域基因融合到膠原基因的膠原結(jié)構(gòu)域的羧基末端側(cè)而生成。具有三螺旋結(jié)構(gòu)的已知蛋白的例子包括人甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)與共凝集素。通過降低本發(fā)明的膠原類似物的分子量接近于這些蛋白的分子量(其至今是難以實現(xiàn)的)，成功生產(chǎn)了具有降低的分子量的三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原類似物蛋白。而且，這些膠原類似物蛋白顯示具有三螺旋結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性。天然存在的人膠原具有較差的水溶性，而本發(fā)明的膠原類似物顯示較高的水溶性，因為它們包含人膠原凝集素的富含水溶性半胱氨酸結(jié)構(gòu)域、頸結(jié)構(gòu)域和糖識別結(jié)構(gòu)域。因此，相較于具有高分子量的天然存在的膠原，它們更易于處理。本發(fā)明人通過添加高濃度的中性鹽促進原纖維形成來沉淀膠原類似物，而且通過離心成功并容易地純化了具有三螺旋結(jié)構(gòu)的纖維性膠原類似物。而且，本發(fā)明人利用糖識別結(jié)構(gòu)域與甘露聚糖的結(jié)合，用甘露聚糖瓊脂糖通過簡單的一步純化法成功地純化了水溶性膠原類似物。使用上述的不同純化方法，本發(fā)明人成功地純化了兩種具有不同物理特性的膠原類似物具有高物理強度的纖維性膠原類似物；和與甘露聚糖結(jié)合且具有高溶解度的水溶性膠原。當(dāng)用作人類粘附細胞中的生物材料時，這些膠原類似物顯示具有與天然存在的膠原相同程度的細胞粘附性和伸長特性。本發(fā)明的膠原類似物預(yù)期可用作來源于非人哺乳動物種類的常規(guī)使用的膠原的代替物，或用作用于人類的生物材料。作為為解決上述問題而進行的各種實驗的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)明了一種可以很容易地純化、具有低分子量同時保持與天然存在的膠原相同的三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原的基因構(gòu)建體。具體地說，由于CR-D(信號肽)具有糖識別結(jié)構(gòu)域，因此能通過親和純化進行一步純化。通過用MBL的類膠原結(jié)構(gòu)基因部分取代本發(fā)明的人膠原結(jié)構(gòu)基因部分，使得獲得大量和高純度的保持三螺旋結(jié)構(gòu)的低分子量膠原變得可能。更具體地說，通過利用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞作為宿主，引入構(gòu)建體，本發(fā)明人成功地生產(chǎn)了大量人膠原類似物，該構(gòu)建體中本發(fā)明的膠原類似物基因包含于能高度表達外源基因的載體中，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(1)已經(jīng)用于生產(chǎn)藥物而且被證實是安全的，并且O)由于它們是哺乳動物細胞，而被認為具有與人類蛋白接近的糖鏈修飾及蛋白。更具體地說，利用具有低表達水平的膠原(具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白)的哺乳動物細胞作為宿主，通過最小化宿主來源的膠原和外源基因來源的膠原的混合，本發(fā)明人成功地開發(fā)了一種不需要復(fù)雜的純化步驟的生產(chǎn)大量本發(fā)明的膠原類似物的方法。根據(jù)如上內(nèi)容，完成了本發(fā)明。具體地說，本發(fā)明提供了[1]具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其包含由從氨基末端依次包含下列(i)到(V)的多核苷酸編碼的蛋白(i)人膠原凝集素的信號肽結(jié)構(gòu)域基因；(ii)人膠原凝集素的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因；(iii)人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因；(iv)人膠原凝集素的頸結(jié)構(gòu)域基因；和(ν)人膠原凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域基因；[2][1]的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中人膠原凝集素的信號肽結(jié)構(gòu)域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的信號肽結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO:4的多核苷酸；[3][1]的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中人膠原凝集素的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO5的多核苷酸；[4][1]的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中人膠原凝集素的頸結(jié)構(gòu)域基因是人甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的頸結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO:6的多核苷酸；[5][1]的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中人膠原凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域基因是人甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的糖識別結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO7的多核苷酸；[6][1]的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因包含至少一種或多種α-鏈人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因；[7][1]的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因是包含α-鏈人膠原的人I型膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因；[8][6]或[7]的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中α-鏈人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因是包含核苷酸序列SEQIDNO8的多核苷酸；[9][1]的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其包括含有氨基酸序列SEQIDNO1的蛋白；[10][1]的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中多核苷酸是包含核苷酸序列SEQIDNO3的多核苷酸；[11]一種生產(chǎn)具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白的方法，其中該方法包括以下步驟(a)將從氨基末端依次包含下列⑴到(ν)的多核苷酸引入到載體中(i)人膠原凝集素的信號肽結(jié)構(gòu)域基因；(ii)人膠原凝集素的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因；(iii)人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因；(iv)人膠原凝集素的頸結(jié)構(gòu)域(neckdomain)基因；(ν)人膠原凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域基因；(b)使用該載體，通過基因引入轉(zhuǎn)化宿主細胞；和(c)培養(yǎng)或培育轉(zhuǎn)化體，并從細胞或它的培養(yǎng)物上清液收集具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白；[12][11]的方法，其中人膠原凝集素的信號肽結(jié)構(gòu)域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的信號肽結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO:4的多核苷酸；[13][11]的方法，其中人膠原凝集素的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO:5的多核苷酸；[14][11]的方法，其中人膠原凝集素的頸結(jié)構(gòu)域基因是人甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的頸結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO6的多核苷酸；[15][11]的方法，其中人膠原凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域基因是人甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的糖識別結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO7的多核苷酸；[16][11]的方法，其中人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因包含至少一種或多種α-鏈人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因；[17][11]的方法，其中人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因是包含α-鏈人膠原的人I型膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因；[18][16]或[17]的方法，其中α-鏈人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因是包含核苷酸序列SEQIDNO8的多核苷酸；[19][11]的方法，其中步驟(a)中使用的載體是SEQIDNO2的pNCl；和[20][11]的方法，其中步驟(a)中使用的載體是SEQIDNO9的pDC6/CF。圖1顯示了pNCl/I型微膠原構(gòu)建體，各自的縮寫如下所示。PCMV巨細胞病毒啟動子；INRBG兔生長激素內(nèi)含子；I型微膠原微膠原DNA；PABGH牛生長激素基因聚腺苷酸(PolyA)添加信號；PdSV增強子缺失的猿猴病毒40啟動子；NPT新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶cDNA；PASV猿猴病毒40聚腺苷酸添加信號；和Amplr大腸桿菌中的選擇標(biāo)記(氨芐青霉素抗性)。圖2顯示了pDC6/CF_I型微膠原構(gòu)建體，各自的縮寫如下所示。PCMV5巨細胞病毒5啟動子；I型微膠原微膠原DNA；PABGH牛生長激素基因聚腺苷酸添加信號；PdSV增強子缺失的猿猴病毒40啟動子；cdlSODHFR通過把從DHFR的核苷酸序列的5，末端開始的180個堿基范圍內(nèi)的密碼子改變?yōu)椴溉閯游镏凶畈怀Ｊ褂玫拿艽a子，而產(chǎn)生的翻譯弱化的NPT基因；PASV猿猴病毒40聚腺苷酸添加信號；和Amplr大腸桿菌中的選擇標(biāo)記(氨芐青霉素抗性)。圖3是微膠原純化的流程圖。除非另有說明，所有的步驟都在4°C下進行。該圖中，表示用ISCHO-⑶W/水解物(IS日本)培養(yǎng)基將細胞調(diào)整到2.OXIO5個細胞/mL，并在5%二氧化碳存在下、于37°C在T-75培養(yǎng)瓶(FALCON)中靜置培養(yǎng)14天(HERA細胞150，Heraeus)的步驟，所述培養(yǎng)基添加有終濃度為4mM的GlutaMAXtm-I(GIBCO),0.4mgG418SulfateCellCultureTested(CALBIOCHEM)和IxHT補充液(GIBCO)。*2表示以1750Xg離心1小時的步驟(ΕΧ-126，Τ0ΜΥ)。。表示添加氯化鈉(Wako)到上清液(1.4L)中以達到0.4M的步驟。表示在4°C下使用氫氧化鈉(Wako)調(diào)節(jié)pH到7.4(F_51，H0RIBA)的步驟。表示使用交叉流過濾(VIVAFL0W50；10,000MWC0PES；VIVASIENCE)濃縮培養(yǎng)物上清液到它體積的1/20的步驟。*6表示用含有5mMEDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)透析3天的步驟(Spectra/Pro生物技術(shù)透析膜(BiotechDialysisMembrane)；10,000MWCO；SpectrumLaboratories,he)。*7表示分別添加氯化鈣(Wako)和氯化鈉(Wako)到20mM禾口2M的步驟。*8表示用MilliQ水(MILLIP0RE)透析(Spectra/Pro生物技術(shù)纖維素酯(CE)透析膜(BiotechCelluloseEster(CE)DialysisMembrane)；25,000MWC0；SpectrumLaboratories,Inc.)5天的步驟。表示用4.5mL甘露聚糖瓊脂糖凝膠(SIGMA)填充Econo-柱(Bio-RAD)，用45mL含有5mMEDTA的TBS(TBS粉末，Takara)(Dojindo)和含有5mM氯化鈣(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)洗滌和平衡凝膠，以1.OmL/min的流速通過循環(huán)裝填上清液17.5小時，除去上清液，然后用IOmL含有5mM氯化鈣(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)洗滌，并用20mL含有5mMEDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)洗脫微膠原的步驟。*10表示用0.4M氯化鈉-0.IMTris-鹽酸鹽緩沖液(pH7.4，4°C)透析(Spectra/Pro生物技術(shù)透析膜；10，000MWCO；SpectrumLaboratories，Inc.)5天的步驟。*11表示使用AmiconUltra-15(10，000MWC0；MILLIP0RE)，通過以1750Xg超濾30分鐘濃縮到1/10體積的步驟。圖4在圖片中顯示了從培養(yǎng)物上清液純化的蛋白和水溶性微膠原在還原條件下(添加2-巰基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析結(jié)果。泳道1顯示作為沉淀的純化后的蛋白，泳道2是在甘露聚糖瓊脂糖柱上純化的水溶性微膠原。圖片上標(biāo)注了分子量和微膠原寡聚體。圖5在圖片中顯示了從培養(yǎng)物上清液純化的蛋白和水溶性微膠原在非還原條件下(未添加2-巰基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析結(jié)果。泳道1顯示作為沉淀的純化后的蛋白，泳道2是在甘露聚糖瓊脂糖柱上純化的水溶性微膠原。圖片上標(biāo)注了分子量和微膠原寡聚體。圖6在圖片中顯示了從培養(yǎng)物上清液純化的蛋白和水溶性微膠原在非變性條件下(未添加2-巰基乙醇和SDQ的聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析結(jié)果。泳道1顯示作為沉淀的純化的蛋白，泳道2是在甘露聚糖瓊脂糖柱上純化的水溶性微膠原。圖片上標(biāo)注了分子量和微膠原寡聚體。圖7在圖片中顯示了通過進行從培養(yǎng)物上清液純化的蛋白和水溶性微膠原在還原條件下(添加2-巰基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用兔抗-MBL(糖識別結(jié)構(gòu)域(CRD))多克隆抗體進行蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)，并將化學(xué)熒光檢測圖片的明暗對比反轉(zhuǎn)后獲得的結(jié)果。泳道1顯示作為沉淀的純化后蛋白，泳道2是在甘露聚糖瓊脂糖柱上純化的水溶性微膠原。圖片上標(biāo)注了分子量和微膠原寡聚體。圖8在圖片中顯示了通過進行從培養(yǎng)物上清液純化的蛋白然和水溶性微膠原在非還原條件下(未添加2-巰基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用兔抗-MBL(糖識別結(jié)構(gòu)域(CRD))多克隆抗體進行蛋白質(zhì)印跡，然后將化學(xué)熒光檢測圖片的明暗對比反轉(zhuǎn)后獲得的結(jié)果。泳道1顯示作為沉淀的純化后的蛋白，泳道2是在甘露聚糖瓊脂糖柱上純化的水溶性微膠原。圖片上標(biāo)注了分子量和微膠原寡聚體。圖9在圖片中顯示了在酸性條件下用胃蛋白酶消化的純化的蛋白和天然存在的人I型去端肽膠原(atelocollagen)，在還原條件下(添加2_巰基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析結(jié)果。圖片上標(biāo)注了微膠原，消化后保留的微膠原的膠原結(jié)構(gòu)域和胃蛋白酶的條帶位置。泳道1分子量標(biāo)記；泳道2未用胃蛋白酶消化的純化蛋白；泳道3用胃蛋白酶消化的純化蛋白；泳道4未用胃蛋白酶消化的天然存在的人I型去端肽膠原；泳道5用胃蛋白酶消化的天然存在的人I型去端肽膠原；和泳道6單獨添加的胃蛋白酶。圖10在圖片中顯示了通過在30°C到50°C的溫度范圍中對純化蛋白進行熱處理、在膠原沒有消化的條件下使用高度濃縮的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的組合進行酶處理、在還原條件下(添加2-巰基乙醇)進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的熱穩(wěn)定性分析的結(jié)果。圖片上標(biāo)注了微膠原，消化后保留的微膠原的膠原結(jié)構(gòu)域，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的條帶位置。泳道1是分子量標(biāo)記，泳道2是未進行酶處理的純化蛋白，泳道315是在30°C到50°C的溫度范圍內(nèi)經(jīng)受熱處理、然后經(jīng)受胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶處理的純化蛋白，泳道16是單獨的胰蛋白酶，和泳道17是單獨的胰凝乳蛋白酶。圖11是解鏈曲線圖，顯示了基于使用圖10的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶對純化蛋白進行熱穩(wěn)定性分析的結(jié)果，根據(jù)加熱溫度所消化的膠原結(jié)構(gòu)域條帶的比例。圖12是使用沉淀法進行微膠原純化的流程圖。除非另有說明，所有的步驟都在4°C下進行。在該圖中，表示用ISCHO-⑶w/水解物(IS日本)培養(yǎng)基將表達微膠原的CHO細胞(pNC7/MC-21)調(diào)整到2.OXIO5個細胞/mL，并在5%二氧化碳存在下，在T-75培養(yǎng)瓶(FALCON)中于37°C靜置培養(yǎng)14天(HERA細胞150，Heraeus)的步驟，所述培養(yǎng)基添加有終濃度為4mM的GlutaMAXtm-I(GIBCO)、0.4mg/mLG418SulfateCellCultureTested(CALBIOCHEM)、和IXHT補充液(GIBCO)。*2表示以1750Xg離心10分鐘的步驟(ΕΧ-126，Τ0ΜΥ)。*3表示添加氯化鈉(Wako)到上清液中以達到0.4Μ(ρΗ7·4)，并于4°C孵育的步驟。表示以IOOOOXg離心30分鐘的步驟(ΕΧ-146，Τ0ΜΥ)。表示使用交叉流過濾(VIVAFL0W50；10,000MWC0PES；VIVASIENCE)濃縮培養(yǎng)物上清液到體積為320mL的步驟。％表示添加氯化鈉(Wako)到達到4M(pH7.4)并于4°C孵育的步驟。*7表示以9400Xg離心30分鐘的步驟(EX-176，T0MY)。*8表示添加1.5mL的50mM乙酸(Wako)溶液到沉淀中的步驟。表示用50mM乙酸(Wako)溶液透析(Spectra/Pro生物技術(shù)纖維素酯(CE)透析膜；10,000MWCO；SpectrumLaboratories,Inc.)5天的步驟。*10表示添加7.4mL的50mM乙酸(Wako)溶液到沉淀中的步驟。圖13是使用與甘露聚糖結(jié)合進行微膠原純化的流程圖。除非另有說明，所有的步驟都于4°C下進行。在該圖中，表示用ISCHO-⑶w/水解物(IS日本)培養(yǎng)基將表達微膠原的CHO細胞(pNC7/MC-21)調(diào)整到2.OXIO5個細胞/mL，并在5%二氧化碳存在下，在T-75培養(yǎng)瓶(FALCON)中于37°C靜置培養(yǎng)14天(HERA細胞150，Heraeus)的步驟，所述培養(yǎng)基添加有終濃度為4mM的GlutaMAXtm-I(GIBCO)、0·4mg/mLG418SulfateCellCultureTested(CALBIOCHEM)、和IxHT補充液O^IBCO)。*2表示以1750Xg離心10分鐘的步驟(ΕΧ-126，Τ0ΜΥ)。*3表示添加氯化鈉(Wako)到上清液中以達到0.4Μ(ρΗ7·4)，并于4°C孵育的步驟。表示以IOOOOXg離心30分鐘的步驟(ΕΧ-146，Τ0ΜΥ)。表示使用交叉流過濾(VIVAFL0W50；10,000MWC0PES；VIVASIENCE)濃縮培養(yǎng)物上清液到體積為320mL的步驟。％表示添加氯化鈉(Wako)以達到4M(pH7.4)，并于4°C孵育的步驟。表示以9400Xg離心30分鐘的步驟(ΕΧ-176，Τ0ΜΥ)。*8表示添加IM氯化鈣溶液以達到20mM，然后于4°C孵育18小時的步驟。*9表示使用交叉流過濾(VIVAFL0W200;30，00(MWC0PES；VIVASIENCE)濃縮體積到56mL的步驟。*10表示用含有5mMEDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)透析(Spectra/Pro生物技術(shù)透析膜；10，000MWC0；SpectrumLaboratories,he)7天的步驟。*11表示用5mL甘露聚糖瓊脂糖凝膠(SIGMA)填充Econo-柱(Bio-RAD)，用15mL含有5mMEDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)和45mL含有5mM氯化鈣(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)洗滌和平衡凝膠，以1.OmL/min的流速裝填上清液，然后用40mL含有5mM氯化鈣(Wako)的TBS(TBS粉末，Takara)洗滌，并用15mL含有5mMEDTA(Dojindo)的TBS(TBS粉末，Takara)洗脫微膠原，以收集第一個峰(9mL)的步驟。表示用0.4M氯化鈉、0.IMTris-鹽酸鹽緩沖液(pH7.4，4°C)透析(Spectra/Pro生物技術(shù)透析膜；10，000MWC0；SpectrumLaboratories,Inc.)該洗脫物5天的步驟。圖14顯示了在37°C下使粘附細胞(MG-63細胞系，ATCC)與包被有天然存在的I型人去端肽膠原、天然存在的I型牛去端肽膠原、MC-Salt、MC-Man、3%(w/v)熱變性的BSA溶液和PBS的平板上粘附1小時后，通過洗滌除去未粘附的細胞，添加MTS，然后將平板于37°C培養(yǎng)3小時后對其吸光度的測定結(jié)果?？v坐標(biāo)表示用655nm波長作為對照，于490nm波長處測定的吸光度，橫坐標(biāo)表示涂布于平板上的每個樣品的名稱。圖15的圖片中顯示了在37°C下使人成骨細胞與包被有天然存在的人I型去端肽膠原、天然存在的I型牛去端肽膠原、MC-Salt、MC-Man、3%(w/v)熱變性的BSA溶液和PBS的平板上粘附1小時，并通過洗滌除去未粘附細胞以后，細胞的相位差顯微圖。該圖片顯示了粘附到包被有1為天然存在的人I型去端肽膠原；2為天然存在的牛I型去端肽膠原；3為MC-Salt；4為MC-Man；5為3%(w/v)熱變性的BSA溶液；和6為PBS的平板上的人成骨細胞的狀態(tài)。箭頭指示觀察到伸長的細胞。圖16的圖片中顯示了在37°C下使人成骨細胞與包被有天然存在的人I型去端肽膠原、天然存在的牛I型去端肽膠原、MC-Salt、MC-Man、3%(w/v)熱變性的BSA溶液和PBS的平板上粘附1小時，通過洗滌除去未粘附細胞，并將平板于37°C孵育3小時以后，細胞的相位差顯微圖。圖片顯示了粘附到包被有1為天然存在的人I型去端肽膠原；2為天然存在的牛I型去端肽膠原；3為MC-Salt；4為MC-Man；5為3%(w/v)熱變性的BSA溶液；和6為PBS的平板上的人成骨細胞的狀態(tài)。箭頭指示觀察到伸長的細胞。圖17顯示了I型微膠原和MC-GPP的結(jié)構(gòu)。顯示了A人表面活性蛋白D(SP-D)的信號肽結(jié)構(gòu)域；B=SP-D的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域；C人I型膠原(COLlAl)的三螺旋(593-769)；D=COLlAl三螺旋(1178-1192)；E人甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)的頸結(jié)構(gòu)域；FMBL的糖識別結(jié)構(gòu)域；禾口G:6XHis區(qū)。圖18顯示了pDC6/MC-GPP構(gòu)建體，各自的縮寫如下所示。PCMV巨細胞病毒啟動子；INRBG兔生長激素內(nèi)含子；MC-GPP缺少從C-末端區(qū)到GPP區(qū)部分的微膠原的cDNA；PABGH牛生長激素基因聚腺苷酸添加信號；PdSV增強子缺失的猿猴病毒40啟動子；cdlSODHFR通過把從DHFR的核苷酸序列的5，末端開始的180個堿基范圍內(nèi)的密碼子改變?yōu)椴溉閯游镏凶畈怀Ｊ褂玫拿艽a子，而產(chǎn)生的翻譯弱化的DHFR基因；PASV猿猴病毒40聚腺苷酸添加信號；和An^大腸桿菌中的選擇標(biāo)記(氨芐青霉素抗性)。圖19在圖片中顯示了從培養(yǎng)物上清液純化的MC-GPP在還原條件下(添加2_巰基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析結(jié)果。泳道1是純化的MC-GPP，圖片上標(biāo)示了分子量和MC-GPP寡聚體。圖20在圖片中顯示了從培養(yǎng)物上清液純化的MC-GPP在非還原的條件下(未添加2-巰基乙醇)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析結(jié)果。泳道1是純化的MC-GPP，圖片上標(biāo)示了分子量和MC-GPP寡聚體。圖21在圖片中顯示了從培養(yǎng)物上清液純化的MC-GPP在非變性條件下(未添加2-巰基乙醇和SDS)的聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析結(jié)果。泳道1是純化的MC-GPP，圖片上標(biāo)示了分子量和MC-GPP寡聚體。圖22在圖片中顯示了從培養(yǎng)物上清液純化的MC-GPP在還原條件下(添加2_巰基乙醇)，進行蛋白質(zhì)印跡并將化學(xué)熒光檢測圖片的明暗對比反轉(zhuǎn)后獲得的結(jié)果。泳道1是純化的MC-GPP，圖片上標(biāo)示了分子量和MC-GPP寡聚體。圖23在圖片中顯示了從培養(yǎng)物上清液純化的MC-GPP在非還原的條件下(未添加2-巰基乙醇)，進行蛋白質(zhì)印跡并將化學(xué)熒光檢測圖片的明暗對比反轉(zhuǎn)后獲得的結(jié)果。泳道1是純化的MC-GPP，圖片上標(biāo)示了分子量和MC-GPP寡聚體。圖M在圖片中顯示了將MC-GPP、天然存在的人I型去端肽膠原和純化的纖維性微膠原酸性條件下用胃蛋白酶消化、在還原條件下(添加2-巰基乙醇)進行的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析結(jié)果。圖片上標(biāo)示了MC-GPP、天然存在的人去端肽膠原(α，α2，β和Y鏈)、微膠原、消化以后微膠原或MC-GPP的剩余膠原結(jié)構(gòu)域、和胃蛋白酶的條帶的位置。泳道1添加MC-GPP；泳道2添加胃蛋白酶消化的MC-GPP；泳道3單獨添加胃蛋白酶(與泳道2中相同的含量)；泳道4添加天然存在的人I型去端肽膠原；泳道5添加胃蛋白酶消化的天然存在的人I型去端肽膠原；泳道6單獨添加胃蛋白酶(與泳道5中相同的含量)；泳道7添加純化的纖維性微膠原；泳道8添加胃蛋白酶消化的純化的纖維性微膠原；泳道9單獨添加胃蛋白酶(與泳道8中相同的含量)；和泳道10未添加MC-GPP、天然存在的人I型去端肽膠原、微膠原和胃蛋白酶。圖25是在酸性條件下用胃蛋白酶消化MC-GPP和純化的纖維性微膠原，并使用ImageJ分析來自在還原條件下(添加2_巰基乙醇)進行的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的圖像的條帶以后，所獲得的曲線圖。是MC-GPP，巧是胃蛋白酶消化的MC-GPP，。是單獨的胃蛋白酶(與巧中相同的含量)，、是純化的纖維性微膠原，*5是胃蛋白酶消化的純化的纖維性微膠原，和％是單獨的胃蛋白酶(與卞中相同的含量)。如圖中所示分析的標(biāo)記條帶和它們的分子量。具體實施例方式以下，展示了實施本發(fā)明的方式，并對本發(fā)明進行了更加詳細的說明。本發(fā)明涉及一種具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其包含由從氨基末端依次包含下列(i)到(ν)的多核苷酸所編碼的蛋白(i)人膠原凝集素的信號肽結(jié)構(gòu)域基因；(ii)人膠原凝集素的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因；(iii)人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因；(iv)人膠原凝集素的頸結(jié)構(gòu)域基因；和(ν)人膠原凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域基因。本發(fā)明中，“具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白”可以是通過培養(yǎng)在生產(chǎn)階段構(gòu)建的三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白，或者通過培養(yǎng)生產(chǎn)以后的操作如純化形成的三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白。雖然它是采用三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白，但是可以單鏈結(jié)構(gòu)的形式大量生產(chǎn)?？梢孕纬扇菪Y(jié)構(gòu)的蛋白可以是表達的蛋白的一部分。本發(fā)明中，“人膠原凝集素的信號肽結(jié)構(gòu)域基因”沒有特別限定，但是優(yōu)選地由“人表面活性蛋白D(SP-D)的信號肽結(jié)構(gòu)域基因”例示，或更優(yōu)選包含核苷酸序列SEQIDNO4的多核苷酸。本發(fā)明中，“人膠原凝集素的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因”沒有特別限定，但是優(yōu)選地由“人表面活性蛋白D(SP-D)的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因”例示，或更優(yōu)選包含核苷酸序列SEQIDNO5的多核苷酸。本發(fā)明中，“人膠原凝集素的頸結(jié)構(gòu)域基因”沒有特別限定，但是優(yōu)選地由“人甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的頸結(jié)構(gòu)域基因”例示，或更優(yōu)選包含核苷酸序列SEQIDNO:6的多核苷酸。本發(fā)明中，“人膠原凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域基因”沒有特別限定，但是優(yōu)選地由“人甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的糖識別結(jié)構(gòu)域基因”例示，或更優(yōu)選包含核苷酸序列SEQIDNO7的多核苷酸。本發(fā)明中，“人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因”沒有特別限定，但是該基因優(yōu)選地包含至少一種或多種α-鏈人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因的基因。而且，該基因優(yōu)選地是由α鏈人膠原組成的人I型膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因。本發(fā)明α-鏈人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因的一個例子更優(yōu)選地是包含核苷酸序列SEQIDNO:8的多核苷酸。而且，它可以是缺少從膠原結(jié)構(gòu)域基因的C-末端區(qū)到GPP區(qū)的區(qū)域的膠原結(jié)構(gòu)域基因。這種缺少C-末端區(qū)到GPP區(qū)的部分的膠原結(jié)構(gòu)域基因的一個例子更優(yōu)選地是包含核苷酸序列SEQIDN0:15的多核苷酸。超過20種不同類型的膠原和大約25種構(gòu)成α鏈?zhǔn)且阎摹Ｒ呀?jīng)克隆了編碼它們的基因，并已經(jīng)闡明了其核苷酸序列(“ConnectiveTissueandItsHeritableDisorders”，145-165頁，Weily-LissInc.出版(1992))。可以把這些基因引入到本發(fā)明中使用的載體中，該載體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因重組技術(shù)高度表達外源基因(例如，“分子克隆(MolecularCloning)”第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress出版(1989))。本發(fā)明中使用的人膠原cDNA可以是膠原的這些克隆的cDNA中的任何一個，而且包括部分膠原肽的cDNA。本發(fā)明的膠原類型沒有特別限定，但是優(yōu)選哺乳動物型的膠原，而且更優(yōu)選人型的膠原。而且，本發(fā)明的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白還包括通過取代、缺失等部分修飾了氨基酸序列并具有本發(fā)明的三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白。而且，通過將載體引入到宿主哺乳動物細胞中獲得表達蛋白質(zhì)分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的方法是已知的。類似的方法可用于本發(fā)明。本發(fā)明的“具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白”，更優(yōu)選地由具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白例示，包括含有氨基酸序列SEQIDNO:1的蛋白，和由包含核苷酸序列SEQIDNO:3的多核苷酸所編碼的蛋白。而且，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白的方法，包括以下步驟(a)將從氨基末端依次包含下列(i)到(ν)的多核苷酸引入到載體中(i)人膠原凝集素的信號肽結(jié)構(gòu)域基因；(ii)人膠原凝集素的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因；(iii)人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因；(iv)人膠原凝集素的頸結(jié)構(gòu)域基因；和(ν)人膠原凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域基因；(b)使用該載體，通過基因引入轉(zhuǎn)化宿主細胞；和(c)培養(yǎng)或培育轉(zhuǎn)化體，并從這些細胞或從它們的培養(yǎng)物上清液收集具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。下列方法可用于檢驗引入了上述載體的細胞是否合成了作為重組蛋白的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白。具體地說，使用特異性結(jié)合人膠原的市售抗體，通過免疫化學(xué)方法如蛋白質(zhì)印跡鑒定膠原肽。根據(jù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子量，膠原通常不遷移(Nature，227，680-685(1970))。因而，可以根據(jù)Matsudaira等(J.Biol.Chem.，洸1，10035-10038(1987))的方法，在樣品電泳的同時用膠原作為標(biāo)記，并在轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素膜以后，可用抗膠原抗體檢驗樣品的反應(yīng)性。而且，可以按如下檢驗具有三螺旋結(jié)構(gòu)的分子是否存在于表達載體產(chǎn)生的重組膠原產(chǎn)品中。典型的纖維性膠原是由3個亞單位(α鏈)形成的3鏈分子，而且具有分子內(nèi)的三螺旋結(jié)構(gòu)。此外，已知具有三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原能抵抗胃蛋白酶消化。因此，可通過酸性條件下，用胃蛋白酶消化引入了上述高外源基因表達載體的細胞的培養(yǎng)物上清液，并檢驗樣品是否具有能抵抗胃蛋白酶的結(jié)構(gòu)，來證實蛋白樣品中3鏈分子的存在。具體地說，本發(fā)明中，將胃蛋白酶處理的蛋白樣品在還原條件下進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)果，獲得的重組膠原顯示具有與天然膠原相似的胃蛋白酶抗性，因此引入了高外源基因表達載體的細胞的培養(yǎng)物上清液中預(yù)計包含具有能抵抗胃蛋白酶的特性的膠原肽。上述結(jié)果表明本發(fā)明的表達載體能在宿主細胞中合成具有胃蛋白酶抗性的膠原，該特性與在活體中發(fā)現(xiàn)的膠原的特性相同。生產(chǎn)和純化具有三螺旋結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的蛋白的方法如下所示，但不限于此。在本發(fā)明中的作為宿主細胞培養(yǎng)的哺乳動物細胞沒有特別限定，但是優(yōu)選CHO細胞?？赏ㄟ^懸浮培養(yǎng)進行本發(fā)明中使用的CHO細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。例如，可以使用IOOmlIL培養(yǎng)基，在振蕩燒瓶或旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)引入了人膠原-表達載體的IXIO81XIO9個重組CHO細胞，該人膠原-表達載體含有弱化的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、小鼠二氫葉酸還原酶基因、和編碼人膠原或其部分肽的cDNA。培養(yǎng)這些細胞一段合適的時間以后，可以從收集的培養(yǎng)物上清液大量提取蛋白。在引入了人膠原-表達載體的重組CHO細胞的培養(yǎng)物上清液中，不僅存在具有三螺旋結(jié)構(gòu)的3鏈蛋白質(zhì)分子，還存在沒有形成正常的3鏈分子的蛋白，該人膠原-表達載體含有弱化的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、小鼠二氫葉酸還原酶基因、和編碼人膠原或其部分肽的cDNA。如上所述，胃蛋白酶能消化不具有三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原樣蛋白。從而，可以通過胃蛋白酶消化除去缺乏三螺旋結(jié)構(gòu)的類膠原蛋白。這種處理可同時降解和除去培養(yǎng)物上清液中除了具有三螺旋結(jié)構(gòu)的3鏈蛋白質(zhì)分子以外的蛋白。利用上述特性，可通過對引入了人膠原表達載體的重組CHO細胞的培養(yǎng)物上清液中存在的總蛋白直接進行胃蛋白酶處理，來消化和除去非膠原蛋白和缺乏三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白，該人膠原表達載體含有弱化的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、小鼠二氫葉酸還原酶基因、和編碼人膠原或其部分肽的cDNA。本發(fā)明中，目標(biāo)人膠原是所有的人膠原，包括目前已知的I型到XXI型膠原，而且還包括其部分肽。本發(fā)明的膠原的類型沒有特別限定，但是包括，作為代表性例子的I型、II型、III型、IV型、V型、VII型、IX型、XI型、XII型、XVII型和XVIII型，而且優(yōu)選I型、II型、III型。I、IV、V、IX和XI型由兩種或三種α鏈組成，而II、III、VII、XII、XVII和XVIII型由一種α鏈組成。它們各自具有下列分子組成1型[α1(Ι)]2α2(Ι)，II型[aI(II)J3,III型[αI(III)]3，IV型[α1(IV)]2α2(IV)，V型[α1(V)]2α2(V)和αI(V)α2(V)α3(V)，VII型[αI(VII)J3,IXMαI(IX)α2(IX)α3(IX)，XI型αI(XI)α2(XI)α3(XI)，XII型[α1(XII)]3,XVII型[α1(XVII)]3或XVIII型[α1(XVIII)]3；但是，本發(fā)明的膠原的分子組成沒有特別限定。而且，本發(fā)明的膠原的分子組成不限于天然膠原的分子組成，并且可以由3種不同類型的α鏈人工組成。SEQIDNO10表示編碼本發(fā)明的I型膠原的α1鏈的DNA的核苷酸序列，SEQIDNO=Il表示編碼I型膠原的α2鏈的DNA的核苷酸序列，SEQIDNO12表示編碼II型膠原的α1鏈的DNA的核苷酸序列，SEQIDNO13表示編碼III型膠原的α1鏈的DNA的核苷酸序列。編碼本發(fā)明的膠原的DNA包括含有任一核苷酸序列SEQIDNO10到SEQIDNO13的寡核苷酸，優(yōu)選地包括與含有任一核苷酸序列SEQIDNO:10到SEQIDNO13的寡核苷酸選擇性雜交的寡核苷酸?！斑x擇性雜交”指在合適的嚴(yán)謹(jǐn)度的雜交條件下，與DNA或RNA樣品中存在的具有預(yù)定序列(也即，第二個多肽)的分子雜交、形成雙鏈或基本上結(jié)合的核酸分子。嚴(yán)謹(jǐn)條件是，例如，42°C、2xSSC和0.SDS的通常條件，優(yōu)選50°C、2xSSC和0.1%SDS的條件，更優(yōu)選65°C、0.IxSSC和0.1%SDS的條件，但是不特別限定于這些條件。影響雜交嚴(yán)謹(jǐn)度的因素可包括多種因素如溫度和鹽濃度，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)剡x擇這些因素以獲得最合適的嚴(yán)謹(jǐn)度。本發(fā)明生產(chǎn)的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白可以是前膠原分子，其中前肽與膠原結(jié)構(gòu)域中的N-和C-末端連接，或者可以是其中前肽被除去的形式。本發(fā)明中，“膠原的部分肽”指由編碼膠原的cDNA的多核苷酸的20%或更多(例如，20，30，40，50，60，70，80或90%)編碼的多肽(以下稱為微膠原)。該肽還包括其中膠原氨基酸序列被部分修飾的，或具有添加的非膠原氨基酸序列的那些肽。本發(fā)明中，“具有低膠原表達的哺乳動物細胞”指當(dāng)以IXIO6個細胞/mL培養(yǎng)時，產(chǎn)生50ng/mL膠原或更少膠原的細胞；優(yōu)選的例子是CHO細胞。本發(fā)明中，“高表達”指通過5.OXIO5個細胞/mL引入了基因的CHO細胞，培養(yǎng)72小時以后，1μg/mL的微膠原表達或更多表達，優(yōu)選5μg/mL或更多的微膠原表達。本發(fā)明中，“可高度表達外源基因的載體”指，例如，包含具有弱活性用于在哺乳動物細胞中進行藥物篩選的標(biāo)記基因的載體，以便這種插入選擇性發(fā)生于哺乳動物細胞染色體上活躍轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。這種載體優(yōu)選地包括PNCl載體(SEQIDN0:2)，更優(yōu)選地包括pDC6/CF載體(SEQIDNO:9)。本發(fā)明的表達載體的例子包括實施例中具體描述的表達載體，但是不限于那些。本發(fā)明中，培養(yǎng)方法可以是懸浮或者粘附培養(yǎng)。本說明書中引用的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻都并入此處作為參考。實施例[實施例l]pNCl/I型微膠原的構(gòu)建使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，通過用SEQIDNO3的編碼微膠原的cDNA(在下文中描述為I型微膠原)取代SEQIDNO2中描述的pNCl載體的第1274個核苷酸序列構(gòu)建pNCl/I型微膠原(圖1)。[實施例2]將pNCl/I型微膠原引入到CHO細胞中，并使用⑶培養(yǎng)基或通過添加非動物基的添加劑到CD培養(yǎng)基中產(chǎn)生的培養(yǎng)基進行G418篩選利用脂質(zhì)體方法(Lipofectinmethod)(使用LipofectamineLTX,Invitrogen)，在25cm2-培養(yǎng)瓶中將10μgpNCl/I型微膠原轉(zhuǎn)染到5.OXlOtHO細胞中(CHODG44細胞)中。轉(zhuǎn)染方法根據(jù)制造商的手冊來進行。轉(zhuǎn)染48小時以后，進行細胞計數(shù)，然后在含有4mMGlutaMAXtm-I(Invitrogen)的ISCHO-CDw/水解物培養(yǎng)基(IS日本)中稀釋這些細胞。將細胞以1000個細胞/孔和100個細胞/孔的濃度分別鋪板到5個96孔微量滴定板上，共10個板(960孔)，在5%二氧化碳氣體存在下、37°C培養(yǎng)大約3周，觀察到存活的細胞(G418抗性的克隆)。從存活的細胞中任意挑選72個G418抗性克隆，隨后測定培養(yǎng)物上清液中微膠原的生產(chǎn)水平。[實施例3]經(jīng)pNCl/I型微膠原-轉(zhuǎn)染的克隆生產(chǎn)微膠原的水平的測定通過ELISA測定生產(chǎn)水平。如圖1中所示，由于微膠原在它的C末端部分包含人MBL的糖識別結(jié)構(gòu)域，所以人MBL抗體用于檢測微膠原。在4°C下使用1μg/mL用包被緩沖液(15mMNa2C03,35mMNaHCO3,0.05%NaN3,pH9.6)稀釋的抗人MBL抗體(獲贈于日本旭川醫(yī)科大學(xué)的大谷博士)包被96孔板(F96MAXISORPNunc-Immunoplate,Cat.no.442404,Nunc)16小時。用4%BlockAce(大日本住友制藥株式會社)封閉以后，添加轉(zhuǎn)染以后14天的培養(yǎng)物上清液(1/10稀釋度)、純化的人MBL(獲贈于日本旭川醫(yī)科大學(xué)的大谷博士)在用于CHO細胞無血清培養(yǎng)基的ISCHO-CDw/水解物培養(yǎng)基(IS日本)中的兩倍稀釋系列(200.3125ng/mL)和ISCHOw/水解物培養(yǎng)基(IS日本)各100μL/孔，并于37°C孵育1小時。另夕卜，以100μL/孔添加0.1μg/mL生物素化的人MBL單克隆抗體(獲贈于日本旭川醫(yī)科大學(xué)的大谷博士)，并于37°C孵育1小時。已經(jīng)于37°C孵育30分鐘的VECTASTAI0NEliteABCkitSTANDARD(2滴試劑A，2滴試劑B/5mL，Vector)，以100μL/孔添加，并于37°C反應(yīng)45分鐘。PEROXIDASESUBSTRATEKITTMBO滴緩沖液，3滴TMB，2滴過氧化氫/5mL，Vector)，其已經(jīng)于室溫孵育30分鐘，再以IOOyL/孔添加。在室溫中反應(yīng)15分鐘以后，以100μL/孔添加IM磷酸以終止反應(yīng)。通過使用酶標(biāo)儀(Model680，BioRad制造)，并于450nm測定吸光度，從純化的人MBL的校準(zhǔn)曲線計算微膠原濃度。根據(jù)ELISA獲得的結(jié)果，確定具有最高微膠原生產(chǎn)水平的前十個樣品。這前十個樣品進一步傳代，與含有4mMGlutaMAXtm-I(Invitrogen)的ISCHO-CDw//K解物培養(yǎng)基(IS日本)一起轉(zhuǎn)入24孔平板上，并培養(yǎng)細胞直到它們占據(jù)每個孔的1/3或更多。每個系取0.4mL置于無菌試管中，并以200Xg離心2分鐘。丟棄上清液，細胞懸浮于新鮮的培養(yǎng)基中(含有4mMGlutaMAXtm-I(Invitrogen)的ISCHO-⑶w/水解物培養(yǎng)基(IS日本))，并測定細胞數(shù)。然后通過在培養(yǎng)基中稀釋將細胞數(shù)調(diào)整到5XIO5個細胞/mL，轉(zhuǎn)移0.2mL這種稀釋液到新的M孔板中，并在5%二氧化碳氣體存在下于37°C孵育72小時。以9300Xg離心2分鐘以后，收集上清液。隨后，測定培養(yǎng)物上清液中微膠原的生產(chǎn)水平。通過ELISA測定生產(chǎn)水平。在4°C下使用1μg/mL用包被緩沖液(15mMNa2CO3,35mMNaHCO3,0.05%NaN3,pH9.6)稀釋的抗人MBL抗體(獲贈于日本旭川醫(yī)科大學(xué)的大谷博士)包被96孔板(F96MAXISORPNunc-Immunoplate，Cat.no.442404，Nunc)16小時。用4%BlockAce(大日本住友制藥株式會社)封閉以后，添加72小時培養(yǎng)物上清液(1/1000稀釋度)、純化的人MBL(獲贈于日本旭川醫(yī)科大學(xué)的大谷博士)在用于CHO細胞的無血清培養(yǎng)基的ISCHO-⑶w/水解物培養(yǎng)基(IS日本)中的兩倍稀釋系列(200.3125ng/mL)和ISCHOw/水解物培養(yǎng)基(IS日本)各100μL/孔，并于37°C孵育1小時。而且，以100μL/孔添加0.1μg/mL生物素化的人MBL單克隆抗體(獲贈于日本旭川醫(yī)科大學(xué)的大谷博士)，并于37°C孵育1小時。已經(jīng)于37°C孵育30分鐘的VECTASTAI0NEliteABCkitSTANDARD(2滴試劑A，2滴試劑B/5mL，Vector)，以100μmL/孔添加，并于37°C反應(yīng)45分鐘。PEROXIDASESUBSTRATEKITTMB(2滴緩沖液，3滴TMB,2滴過氧化氫/5mL,Vector)，其已經(jīng)于室溫孵育30分鐘，進一步以100μL/孔添加。在室溫中反應(yīng)15分鐘以后，以100μL/孔添加IM磷酸以終止反應(yīng)。通過使用酶標(biāo)儀(Model680，8丨01^(1制造)，并于45011111測定吸光度，從純化的人MBL的校準(zhǔn)曲線計算微膠原濃度。根據(jù)ELISA獲得的結(jié)果確定的具有最高微膠原生產(chǎn)水平的前十個樣品顯示于表1中。[表1]G418抗性克隆的微膠原生產(chǎn)水平權(quán)利要求1.一種具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其包含由從氨基末端依次包含下列(i)(ν)的多核苷酸編碼的蛋白(i)人膠原凝集素的信號肽結(jié)構(gòu)域基因；()人膠原凝集素的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因；(iii)人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因；(iv)人膠原凝集素的頸結(jié)構(gòu)域基因；和(ν)人膠原凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域基因。2.權(quán)利要求1的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中人膠原凝集素的信號肽結(jié)構(gòu)域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的信號肽結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO:4的多核苷酸。3.權(quán)利要求1的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中人膠原凝集素的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO5的多核苷酸。4.權(quán)利要求1的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中人膠原凝集素的頸結(jié)構(gòu)域基因是人甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的頸結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO:6的多核苷酸。5.權(quán)利要求1的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中人膠原凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域基因是人甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的糖識別結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO7的多核苷酸。6.權(quán)利要求1的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因包含至少一種或多種α-鏈人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因。7.權(quán)利要求1的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因是包含α-鏈人膠原的人I型膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因。8.權(quán)利要求6或7的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中α-鏈人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因是包含核苷酸序列SEQIDNO8的多核苷酸。9.權(quán)利要求1的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其包含含有氨基酸序列SEQIDNO1的蛋白。10.權(quán)利要求1的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組蛋白，其中多核苷酸是包含核苷酸序列SEQIDNO3的多核苷酸。11.一種生產(chǎn)具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白的方法，其中該方法包含以下步驟(a)將從氨基末端依次包含下列(i)(ν)的多核苷酸引入到載體中(i)人膠原凝集素的信號肽結(jié)構(gòu)域基因；()人膠原凝集素的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因；(iii)人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因；(iv)人膠原凝集素的頸結(jié)構(gòu)域基因；和(ν)人膠原凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域基因；(b)利用該載體，通過基因引入轉(zhuǎn)化宿主細胞；和(c)培養(yǎng)或培育轉(zhuǎn)化體，并從細胞或它的培養(yǎng)物上清液收集具有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白。12.權(quán)利要求11的方法，其中人凝集素的信號肽結(jié)構(gòu)域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的信號肽結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO:4的多核苷酸。13.權(quán)利要求11的方法，其中人膠原凝集素的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因是人表面活性蛋白D(SP-D)的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO:5的多核苷酸。14.權(quán)利要求11的方法，其中人膠原凝集素的頸結(jié)構(gòu)域基因是人甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的頸結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO:6的多核苷酸。15.權(quán)利要求11的方法，其中人膠原凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域基因是人甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的糖識別結(jié)構(gòu)域基因，而且是包含核苷酸序列SEQIDNO:7的多核苷酸。16.權(quán)利要求11的方法，其中人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因包含至少一種或多種α-鏈人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因。17.權(quán)利要求11的方法，其中人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因是包含α-鏈人膠原的人I型膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因。18.權(quán)利要求16或17的方法，其中α-鏈人膠原的膠原結(jié)構(gòu)域基因是包含核苷酸序列SEQIDNO8的多核苷酸。19.權(quán)利要求11的方法，其中步驟(a)中使用的載體是SEQIDN0:2的pNCl。20.權(quán)利要求11的方法，其中步驟(a)中使用的載體是SEQIDNO:9的pDC6/CF。全文摘要作為致力研究的結(jié)果，本發(fā)明人成功地發(fā)明了一種易純化、在具有低分子量的同時保持有與天然存在的膠原相同的三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原基因構(gòu)建體。具體地，由于CR-D(信號肽)具有糖識別結(jié)構(gòu)域，所以能通過親和純化進行一步純化。通過用MBL的類膠原結(jié)構(gòu)基因部分取代本發(fā)明的人膠原結(jié)構(gòu)基因部分，能獲得高純度和大量的保持三螺旋結(jié)構(gòu)并且熱穩(wěn)定的低分子量膠原。文檔編號C07K14/78GK102325882SQ20098015724公開日2012年1月18日申請日期2009年12月22日優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日發(fā)明者北原讓,山本啟一,田原寬,鈴木定彥,鈴木祐介申請人:國立大學(xué)法人北海道大學(xué),扶桑藥品工業(yè)株式會社