專利名稱：：使用mntf肽及其類似物治療神經(jīng)紊亂的方法使用MNTF肽及其類似物治療神經(jīng)紊亂的方法
背景技術(shù)：
：本發(fā)明公開總體上涉及使用MNTF肽及其類似物治療神經(jīng)紊亂的組合物和方法。下文包括了可以用于理解本發(fā)明公開的信息。并非承認(rèn)，本文所提供的任何信息對于本發(fā)明公開而言是現(xiàn)有技術(shù)或相關(guān)技術(shù)，或者并非承認(rèn)，以明確的或隱含的方式引用的任何出版公開或文件是現(xiàn)有技術(shù)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，胚胎運動神經(jīng)元的存活取決于由相關(guān)的、發(fā)育中的骨骼肌衍生而來的特定的營養(yǎng)物質(zhì)。已經(jīng)報道，某些骨骼肌產(chǎn)生能夠通過防止胚胎神經(jīng)元發(fā)生退化以及隨后的自然細(xì)胞死亡來增強神經(jīng)元的存活和發(fā)育的物質(zhì)。這些物質(zhì)已經(jīng)被廣泛地描述為神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)，其為這樣一類專門的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)發(fā)揮作用以促進所選的多群神經(jīng)元的存活、生長、維持和功能的能力(例如Chau，R.M.W.，etal.，6Chin.JNeuroanatomy129，1990)。影響中樞和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)的多種神經(jīng)退行性、神經(jīng)肌肉和神經(jīng)元的疾病、紊亂或病況可以完全地或部分地表征為功能神經(jīng)組織的急性或進行性喪失。其包括諸如脊髓損傷(SCI)、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)或缺血(例如腦缺血)、亨廷頓氏疾病(HD)、帕金森氏疾病(PD)、多發(fā)性硬化(MS)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、阿茲海默氏疾病(AD)和糖尿病神經(jīng)病變之類的病況。US6309877、US7183373、US6841531、US6759389和US20060052299報道了被稱為運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)的特定神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)，所述的因子具有對運動神經(jīng)元以營養(yǎng)作用的能力。所述文獻的內(nèi)容在此以引用方式全文并入本文。發(fā)明概述本文描述了具有許多特征和實施方案的技術(shù)，這些特征和實施方案包括，但不限于在本發(fā)明概述中列出、描述或引用的那些。無意于將所有的特征和實施方案都包括在內(nèi)，并且權(quán)利要求也不限于本發(fā)明概述中所表明的特征或?qū)嵤┓桨?，這些特征和實施方案僅是為了說明的而并非為了限制的目的被包括在本說明中的。因此，在一個方面中，本發(fā)明公開涉及包含MNTF分子的部分的新型肽和組合物，其中所述的MNTF分子可用于調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生存能力和增殖，從而提供了可以容易地合成的并且在治療中樞和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)中的多種神經(jīng)退行性、神經(jīng)肌肉的疾病、紊亂或病況中具有治療有效性的神經(jīng)營養(yǎng)肽。在一個方面中，提供了治療受試者運動神經(jīng)缺陷和/或神經(jīng)元紊亂的方法，該方法包括向有此需要的受試者施用運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，其中所述的神經(jīng)元紊亂選自脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)或缺血、亨廷頓氏疾病、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、ALS、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變，其中所述的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)以足以治療所迷的神經(jīng)元紊亂的量來施用。在一個方面中，本發(fā)明公開涉及合成的和/或純化的MNTF肽類似物，其中所述的MNTF肽類似物包含WMLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域的部分(包括WMLSAFS,FSRYAR，以及SEQIDNO:1-142的其他結(jié)構(gòu)域)，并且本發(fā)明公開還涉及模擬了上述類似物的結(jié)構(gòu)和/或功能的、用于誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生存能力和生長的分子，包括截短的序列同源物和類似物。在某些實施方案中，MNTF肽類似物可以包括含有SEQIDNO:I-7以及SEQIDNO:8-142的序列類似物(參見圖25)。LGTFWGDTLN，LSAFSRYARCLAEGHDGPTQ(SEQIDNO:1)FSRYAR(SEQIDNO:2)■SAFS(SEQIDNO:3)MLSAFSRYAR(SEQIDNO:4)8FSRYARCLAEG(SEQIDNO:5)CWMLSAFSRYARC(SEQIDNO:6)MLSAFSRYARCLAEGHDGPTQ(SEQIDNO:7)本文中所描述的MNTF肽類似物為衍生自MNTF的多肽(即，得自SEQIDNO:1)以及此類衍生多肽的類似物。這些化合物包括具有SEQIDNO:1-142中的一條序列(例如SEQIDNO:2-7中的任一條)的氨基酸序列的多肽。此外，所述的化合物還包括SEQIDNO:1-7中所述的MNTF肽類似物的功能衍生物。上文所述多肽的鹽、酯和其他普通劑型也可用于本文所述的技術(shù)中，如其中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)被非天然(例如D-異構(gòu)體)的氨基酸殘基替代的多肽一樣。如本文所述，其他類似物(包括保守性地替代SEQIDNO:1中所公開的那些氨基酸殘基的氨基酸殘基)可以用于替代一個或多個這些殘基。在另一方面中，提供了這樣的組合物和方法，其通過體外向細(xì)胞培養(yǎng)物施用MNTF肽類似物或者體內(nèi)向患有神經(jīng)損傷或神經(jīng)退行性紊亂的個體施用MNTF肽類似物以促進細(xì)胞增殖或穩(wěn)定不適當(dāng)?shù)募?xì)胞死亡、和/或在上述任一種情況下以恢復(fù)正常細(xì)胞的行為，來調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生存能力和/或生長。在一個方面中，提供了一種修復(fù)受試者中損害的神經(jīng)通路的方法，該方法包括向有此需要的受試者施用運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，其中所述損害的神經(jīng)通路與脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)或缺血、亨廷頓氏疾病、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、ALS、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變有關(guān)，其中所述的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物以足以治療所述的神經(jīng)元紊亂的量來進行施用，從而在所述的受試者中損害的神經(jīng)通路得以修復(fù)。在一個方面中，提供了一種改善患有神經(jīng)通路損害癥狀的受試者的運動功能的方法，該方法包括向有此需要的患者施用運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，其中所述的損傷的神經(jīng)通路與脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)或缺血、亨廷頓氏疾病、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、ALS、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變有關(guān)，其中所述的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物以足以治療所述受試者中所述損害的神經(jīng)通路的量來進行施用，從而運動功能得以改善。圖1。示出了野生型小鼠的腦中示例性MNTF-6聚體肽類似物(GM6;FSRYAR，SEQIDNO:2)的水平。野生型小鼠載體對照(鹽水)，0.2mg的MNTF或者2mg/kg的MNTF。在時間0時，施用所示的測試制品，并在4小時后收集腦以便通過ELISA進行分析。圖2A。示出了在發(fā)生暫時性缺血的小鼠中，示例性MNTF-6聚體肽(FSRYAR，GM602或SEQIDNO:2)對梗塞體積的作用。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后的24小時的再灌注。在缺血結(jié)束時，以lmg/kg或5mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或者GM602。在第2天處死動物，并進行處理以測定梗塞體積。圖2B。其為經(jīng)歷缺血/再灌注損傷、然后經(jīng)歷IV注射一個劑量的GM602或栽體的兩個腦的圖像，其中GM602(左側(cè)，經(jīng)治療的腦的4個部分)顯示出極小的損傷(白色區(qū)域)，而載體(右側(cè)，對照腦的4個部分)顯示出腦中過度的損傷。其為得自經(jīng)歷1小時缺血及24小時再灌注的小鼠腦的代表性照片。在缺血結(jié)束時，對動物注射GM602(5mg/kg)或載體。圖3。示出了得自腦血流量的估測的數(shù)據(jù)，其中所述的腦血流量得自經(jīng)歷缺血/再關(guān)注損傷的動物。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后的24小時的再灌注。在缺血結(jié)束時，以lmg/kg或5mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或者GM602。對于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過程中(第二根柱)以及在注入測試制品之后(第三根柱)，測定血流量。圖4。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的血壓測定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后的24小時的再灌注。在缺血結(jié)束時，以lmg/kg或5mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或者GM602。對于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過程中(第二根柱)以及在注入測試制品之后(第三根柱)，測定血流圖5。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的心率測定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后的24小時的再灌注。在缺血結(jié)束時，以lmg/kg或5mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或者GM602。對于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過程中(第二根柱)以及在注入測試制品之后(第三根柱)，測定心率。圖6。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的血氣測定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后的24小時的再灌注。在缺血結(jié)束時，以lmg/kg或5mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或者GM602。對于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過程中(第二根柱)以及在注入測試制品之后(第三根柱)，測定血液氣體(p02和pC02)。圖7。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的pH測定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后的24小時的再灌注。在缺血結(jié)束時，以lmg/kg或5mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或者GM602。對于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過程中(第二根柱)以及在注入測試制品之后(第三根柱)，測定pH。圖8。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的神經(jīng)缺損測定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后的24小時的再灌注。在缺血結(jié)束時，以lmg/kg或5mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或者GM602。在再灌注的末期測定神經(jīng)缺損情況。圖9。示出了在發(fā)生脊髓損傷后的小鼠中，示例性MNTF肽類似物GM603(FSRYAR，SEQIDNO:2)對病變體積的作用。所有的小鼠都經(jīng)歷了脊髓損傷、及其后的14天的恢復(fù)。在損傷后，并在在每天都對動物靜脈內(nèi)注射栽體(對照)和GM603,直至處死。在第14天將動物處死，然后進行處理以測定病變體積。圖10。其為在經(jīng)歷脊髓損傷(SCI)之后脊髓的損害區(qū)域。所有的小鼠都經(jīng)歷了脊髓損傷、及其后的14天的恢復(fù)。切除組織切片，并進行處理以用于評價損害區(qū)域。A:經(jīng)載體治療的患有SCI的小鼠。B:使用5mg/kgGM603治療的小鼠。損害的區(qū)域染成了紅色，而未受損害的區(qū)域被染成了藍色。如圖所示，在GM603治療的動物中，圖B所示的損害區(qū)域明顯較小。圖11。示出了經(jīng)歷脊髓損傷的動物的轉(zhuǎn)棒踏車(Rota-RodTreadmill)測試的結(jié)果。所有的小鼠都經(jīng)歷了脊髓損傷、及其后的圖中指示的天數(shù)。在損傷之后測定行為分析情況。圖12。其為在經(jīng)歷脊髓損傷的小鼠中的曠場(open-field)行為測定情況。所有的小鼠都經(jīng)歷了脊髓損傷、及其后的圖中指示的天數(shù)。在損傷之后測定行為分析情況。圖13。其為在ALS小鼠中，示例性MNTF肽類似物GM604(FSRYAR，SEQIDNO:2)對疾病發(fā)作年齡的作用。在第80天，并且在直至處死前每天都對所有的小鼠靜脈內(nèi)注射載體(對照)或GM6(M。針對疾病發(fā)作的時間對動物進行記錄。圖14。其為在ALS小鼠中，示例性MNTF肽類似物GM604對死亡年齡的作用。在第80天，并且在直至處死前每天都對所有的小鼠靜脈內(nèi)注射載體(對照)或GM604?；诤笾c瘓的情況，針對疾病發(fā)作的時間對動物進4亍記錄。圖15。其為對ALS動物的轉(zhuǎn)棒踏車測試情況。所有的小鼠都是轉(zhuǎn)基因的，發(fā)生了G93ASOD突變，并如指示的使用鹽水或者示例性MNTF肽類似物GM604進行治療。在指示的時間測定行為分析情況。圖16。其為對ALS動物的抓力測試。所有的小鼠都是轉(zhuǎn)基因的，發(fā)生了G93ASOD突變，并如指示的使用鹽水或者GM604進行治療。對ALS動物進行臨床評分。所有的小鼠都是轉(zhuǎn)基因的，發(fā)生了G93AS0D突變，并如指示的使用鹽水或者GM604進行治療。按照在方法部分中概括的那樣，在指示的時間測定臨床評分。未見虛弱跡象(0);顫抖和喪失張開反射(l);一只后肢輕癱(2);兩只后肢輕癱(3);—只或兩只后肢癱瘓(4)(參見圖16B)。圖17。其為在經(jīng)歷豬毛菜酚(salsolinol)治療后的SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞中，示例性MNTF肽類似物(GB測試制品)對細(xì)胞生存能力的作用。按照在方法部分中所概況的那樣，所有的培養(yǎng)物都生長在培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物與載體(對照)、各種濃度的MNTF肽類似物GM6、+/-豬毛菜酚(Sal)溫育。此外，將多個培養(yǎng)物與渥曼青霉素(W)溫育，從而測定作用的機制。將培養(yǎng)物與多種化合物溫育24小時，并分析細(xì)胞的生存能力。圖18。通過CSF，在原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在培養(yǎng)12天后，將得自對照和各種神經(jīng)紊亂的CSF應(yīng)用到原代大鼠神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中，為期2天。在時間0時施用所示的測試制品，并通過MTT分析測定培養(yǎng)物的細(xì)胞生存能力。圖19。其為在CSF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中，示例性MNTF肽對抗神經(jīng)元細(xì)胞損失的保護性作用。在培養(yǎng)1,2天后，將得自對照和各種神經(jīng)紊亂的CSF應(yīng)用到原代大鼠神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中，為期2天。加入MNTF(+M)，2小時后加入CSF。在時間0時施用所示的測試制品，并通過MTT分析測定培養(yǎng)物的細(xì)胞生存能力。圖20A和20B。其為在PD誘導(dǎo)和GM6處理后，小鼠中的行為測定情況。對雄性C57BL/6小鼠注射MPTP，然后以所示的劑量注射GM6,為期5天。評價動物的行為變化情況。圖21A、21B和21C。示出了在經(jīng)歷MPTP治療后一元胺和代謝物的水平。對雄性C57BL/6小鼠注射MPTP，然后以所示的劑量注射GM6，為期5天。在所述研究結(jié)束時評價動物中一元胺和代謝物的水平。圖22。其為在PD誘導(dǎo)和GM6處理后，小鼠的黑質(zhì)致密部(Substantianigraparscompacta)中細(xì)胞的數(shù)量。對雄性C57BL/6小鼠注射MPTP，然后以所述的劑量注射GM6,為期5天。在所述研究結(jié)束時，評價動物中的細(xì)胞計數(shù)。圖23。其為在MS誘導(dǎo)和GM6處理后，小鼠中的平均臨床分?jǐn)?shù)。對雌性JJL/J小鼠注射PLP，然后以所示的劑量注射GM6,為期7天。每隔一天評價動物的臨床分?jǐn)?shù)。圖24A和24B。24A:其為在MS誘導(dǎo)和GM6處理后，小鼠的腦中13的病變的數(shù)量。對雌性JJL/J小鼠注射PLP，然后以指示的劑量注射GM6，為期7天。在所述研究結(jié)束時，評價動物中的腦病變情況。24B:其為在MS誘導(dǎo)和GM6處理后，小鼠脊髓中的病變的數(shù)量。對雌性JJL/J小鼠注射PLP，然后以指示的劑量注射GM6，為期7天。在所述研究結(jié)束時，評價動物中的脊髓病變情況。圖25,其由圖25A、25B、25C、25D、25E、25F和25G構(gòu)成，為示例性MNTF肽類似物的部分列表。與各個SEQIDNO相應(yīng)的序列被突出表示。圖26。示出了在經(jīng)歷瞬時缺血的小鼠中GM602對梗塞體積的作用的研究中得到的數(shù)據(jù)。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血后，在指示的時間(3、6、12、24小時)，以5mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射栽體(對照)或者GM602。此外，在損傷后的3天中每天都對動物進行注射。在第14天處死動物，并對其進行處理以測定梗塞體積。圖27。示出了在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的動物中腦血流量研究中得到的數(shù)據(jù)。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血發(fā)作后的第3、6、12和24小時施用測試制品。在發(fā)生缺血前、在缺血后以及再灌注后測定血流量。圖28。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的血壓測定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血發(fā)作后的第3、6、12和24小時施用測試制品。在發(fā)生缺血前、在缺血過程中以及在缺血結(jié)束時之后測定血壓。圖29。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的心率測定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血發(fā)作后的第3、6、12和24小時施用測試制品。在發(fā)生缺血前、在缺血過程中以及在缺血結(jié)束時之后測定心率。圖30A和30B。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的血液氣體測定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血發(fā)作后的第3、6、12和24小時施用測試制品。在發(fā)生缺血前、在缺血過程中以及在缺血結(jié)束時之后測定血液氣體pO2(30A)和pC02(30B)。圖31。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的pH測定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血發(fā)作后的第3、6、12和24小時施用測試制品。在發(fā)生缺血前、在缺血過程中以及在缺血結(jié)束時之后測定pH。圖32。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中神經(jīng)缺損的測定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血發(fā)作后的第3、6、12和24小時施用測試制品。在再灌注結(jié)束時，測定神經(jīng)缺損情況。圖33。其為在經(jīng)歷缺血之后的大鼠中，GM602對梗塞體積的作用。所有的大鼠都經(jīng)歷的為期28天的持續(xù)的腦缺血。在缺血開始之后的3小時，以0，2.5，10或20mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或GM602。在第28天處死動物，并對其進行處理以測定梗塞體積。圖34。其為得自經(jīng)歷缺血的動物的腦血液。所有的大鼠都經(jīng)歷了腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時，以2.5、10或20mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或GM602。對于各研究組而言，在發(fā)生缺血前(第一根柱，缺血前基線下的CBF)，在缺血過程中(第二根柱，在持續(xù)缺血之后、但在施用測試制品之前3小時的CBF),以及在注射了測試制品之后(第三根柱，在施用測試制品之后1小時的CBF)測定血液流量。圖35。其為在經(jīng)歷缺血的大鼠中的血液測定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時，以2.5、10或20mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或GM602。對于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過程中(第二根柱)以及在注入測試制品之后(第三根柱)，測定血壓。圖36。其為在經(jīng)歷缺血的大鼠中的心率測定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時，以2.5、10或20mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或GM602。對于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過程中(第二根柱)以及在注入測試制品之后(第三根柱)，測定心率。圖37A和37B。其為在經(jīng)歷缺血的大鼠中的血液氣體測定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了持續(xù)的腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時，以2.5、10或20mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或GM602。對于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一才艮柱)、在缺血過程中(第二根柱)以及在注入測試制品之后(第三才艮柱)，測定血液氣體p02(參見圖37A)和pC02(參見圖37B)。圖38。其為在經(jīng)歷缺血的大鼠中的pH測定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了持續(xù)的腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時，以2.5、IO或20mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射載體(對照)或GM602。對于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過程中(第二才艮柱)以及在注入測試制品之后(第三才艮柱)，測定pH。圖39。其為在經(jīng)歷缺血的大鼠中的神經(jīng)缺損測定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了持續(xù)的腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時，以2.5、10或20mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射栽體(對照)或GM602。圖39A:其為前肢放置情況。圖39B:其為后肢放置情況。圖39C:其為平衡木情況。圖39D:其為在所述研究結(jié)束時，測定的神經(jīng)缺損情況(自發(fā)運動活動性)。在圖39D中，第一根條柱是在施用測試制品之前的評分，而第二根條柱是在給要測試制品之后的第28天時的評分。圖40。其為在經(jīng)歷缺血損傷的大鼠中的生物標(biāo)志物測定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了持續(xù)的腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時，以2.5、10或20mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射栽體(對照)或GM602。在第28天處死動物，并對腦切片進行處理以用于TNF免疫組織化學(xué)分析。圖41。其為在經(jīng)歷缺血損傷的大鼠中的生物標(biāo)志物測定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了持續(xù)的腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時，以2.5、10或20mg/kg的量對動物靜脈內(nèi)注射栽體(對照)或GM602。在第28天處死動物，并對腦部分進行處理以用于Fluoro-jade免疫組織化學(xué)分析。發(fā)明詳述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，胚胎運動神經(jīng)元的存活取決于由相關(guān)的、發(fā)育中的骨骼肌衍生而來的特定的營養(yǎng)物質(zhì)。已經(jīng)報道，骨骼肌產(chǎn)生能夠通過抑制胚胎神經(jīng)元發(fā)生退化以及隨后的自然細(xì)胞死亡來增強運動神經(jīng)元的存活和發(fā)育的物質(zhì)(0'Brian，R.J.andFischbach，G.D.，6J.Neurosci.3265(1986);Hollyday，M.andHamburger,V.，170J.Comp.Neurol.311(1976).McMa麵an,J.L.，etal.,263J.Biol.Chem.5890(1988);Oppenheim，R.W.,etal.，240Science,919(1988);和Smith,R.G.，etal.，6J.Neurosci.439(1986))。人運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)是一種得自骨骼肌組織的特殊的NTF，已經(jīng)顯示其能夠減少運動神經(jīng)損傷位置處的炎癥，增強神經(jīng)再生，以及促進運動神經(jīng)元的存活。已經(jīng)在大鼠的多種神經(jīng)系統(tǒng)中對MNTF進行了測試，其中所述的神經(jīng)系統(tǒng)包括外周坐骨神經(jīng)(控制下肢肌肉)，外周肌皮神經(jīng)(控制上肢肌肉)，頭部和面部神經(jīng)(控制面部和頭部肌肉)，頭部舌下神經(jīng)(控制舌頭)，以及控制頸部、胸腔和上肢中的肌肉的部分脊髓。在脊髓模型中，將MNTF施加在大鼠的半橫切脊髓中的神經(jīng)移植物上；MNTF減少了炎癥、限制了惡化并增強了嫁接神經(jīng)的再生。許多研究已經(jīng)證實了當(dāng)將MNTF或其肽類似物直接施加到所述的神經(jīng)上時，這些合成的MNTF或其肽類似物在大鼠外周神經(jīng)模型中在營養(yǎng)和熱效應(yīng)方面的效力。此外，MNTF已經(jīng)顯示出能夠促進運動神經(jīng)元的再生和存活。在生長和形成的某些時期，在脊推動物的神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生神經(jīng)元細(xì)胞死亡。因此，加入得自相關(guān)目標(biāo)組織的可溶性神經(jīng)元營養(yǎng)因子可以起到減輕神經(jīng)元死亡的這種現(xiàn)象。因此，本發(fā)明公開的多個方面和實施方案提供了用于治療神經(jīng)元紊亂的、包含MNTF肽類似物及其衍生物的方法和組合物。本發(fā)明公開的多個方面和實施方案涉及與運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子的17作用有關(guān)的功能蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被識別并且在MNTF1分子中被繪制成短的重疊序列。這些這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(包括"WMLSAFSRYAR"，"WMLSAFS"，"FSRYAR"以及得自SEQIDNO:1-142的其他結(jié)構(gòu)域)足以調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生存能力和增殖。此外，包含這些結(jié)構(gòu)域的多種截短的MNTF1種類或類似物(序列片段類似物或其功能類似物)他們本身足以證明運動神經(jīng)元/成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞雜交體的刺激生物活性。定義以下列出在描述本發(fā)明公開所屬技術(shù)的內(nèi)容中使用的某些術(shù)語。除非另作說明，否則以下術(shù)語當(dāng)在本文中以及在所附的^=又利要求書中使用時具有以下含義。在以下說明書或者在本說明書中的其他處沒有定義的那些術(shù)語具有他們本領(lǐng)域所公認(rèn)的含義。如本文所使用的，"運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子"包括涉及運動神經(jīng)元的營養(yǎng)或維持的那些因子。術(shù)語"運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子"、"MNTF"、"MNTF肽，，、"運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子類似物"和"MNTF類似物，，可以互換使用，只要它們具有本文限定的功能特性。他們可以包括參照NMTF序列的序列以及功能同源物。運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子可以促進定型的神經(jīng)祖細(xì)胞的發(fā)育和分化，或者它們可以誘導(dǎo)或增強分化的神經(jīng)細(xì)胞的生長(例如神經(jīng)突長出)和存活。本發(fā)明的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子一般以有效產(chǎn)生CNS或PNS的完全分化的神經(jīng)細(xì)胞(例如，運動神經(jīng)元)的量提供。關(guān)于量的指導(dǎo)在本文中提供，并且可以由技術(shù)人員基于已知操作和本文公開的方法容易地確定。示例性的MNTF肽及其肽類似物可以包括在Chau，R.M.W.，etal.，MuscleNeuronotrophicFactorsSpecificforAnteriorHornMotoneuronsofRatSpinalCord.In:RecentAdvancesinCellularandMolecularBiology,Vol.5，PeetersPress,Leuven，Belgium,pp.89-94(1992)中所報道的那些，以及在(例如)US6309877、US7183373、US6841531、US6759389和US20060052299中發(fā)現(xiàn)的那些。這些文獻的內(nèi)容全文并入本文。在某些實施方案中，實例可以包括可用于誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生存能力和生長的、經(jīng)合成和/或純化18的、包含有部分WMLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域(包括WMLSAFS、FSRYAR以及得自SEQIDNO:1-142的其他結(jié)構(gòu)域)的MNTF肽類似物，以及模擬了其類似物的結(jié)構(gòu)和/或功能的分子(包括截短的序列同源物和類似物)。此外，示例性的MNTF肽及其肽類似物還可以包括在Chau，R.M.W.，etal.，TheEffectofa30kDProteinfromTectalExtractofRatonCulturedRetinalNeurons,34ScienceinChina,SeriesB，908(1991);Chau，R.M.W.，etal.，MuscleNeuronotrophicFactorsSpecificforAnteriorHornMotoneuronsofRatSpinalCord.In:RecentAdvancesinCellularandMolecularBiology,Vol.5，PeetersPress,Le講n，Belgium,pp.89-94(1992);Chau，R.M.W.，etal.，TheEffectofa30kDProteinfromTectalExtractofRatonCulturedRetinalNeurons,34ScienceinChina,SeriesB，908(1991);Chau,R.M.W.，etal.，CloningofGenesforMuscle-DerivedMotoneuronotrophicFactor1(MNTF1)andItsReceptorbyMonoclonalAntibodyProbes,(abstract)19Soc.forNeurosci.part1，252(1993)，Chau，R.M.W.，etal.，CloningofGenesforMuscle-DerivedMotoneuronotrophicFactor1(MNTFOandItsReceptorbyMonoclonalAntibodyProbes,(abstract)19Soc.forNeurosci.part1，252(1993)中所描述的那些，這些文獻的全部內(nèi)容均以參考方式并入本文。在某些實施方案中，所述的MNTF或其類似物是合成的或純化的。在某些實施方案中，MNTF肽類似物可以包括得自MNTF結(jié)構(gòu)域的活性位點之一的序列(例如6個氨基酸的MNTF類似物，例如SEQIDNO:2)。在某些實施方案中，MNTF肽類似物可以包括含有SEQIDNO:1-142的序列類似物。在某些實施方案中，MNTF肽乘似物可以包括如在SEQIDNO:1-142中所迷的肽類似物的功能衍生物。在某些實施方案中，所述的MNTF肽類似物及其衍生物可以由在19SEQIDNO:1-142中所述的序列構(gòu)成。如本申請所用，"類似物"是指這樣的肽，其中在參照序列中的一個或多個氨基酸被改變，而基本上沒有影響MNTF的活性。在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明公開的類似物包括"保守性"的取代。保守性的氨基酸取代包括使用具有相同基團的同義氨基酸進行的氨基酸替代，其中所述的同義氨基酸具有足夠相同相似的物理化學(xué)性質(zhì)，從而使得同類成員之間的取代將保留所述分子的生物學(xué)功能，Grantham,Science,Vol.185，pp.862-864(1974)。同義氨基酸基團包括在表I、II和III中定義的那些。表I寬泛種類的同義氨基酸氨基酸一同義種類Ser—Ser，Thr，Gly，AsnArg—Arg，Gln，Lys，Glu，HisLeu—lie,Phe，Tyr，Met,Val，LeuPro—Gly，Ala,Thr,ProThr—Pro,Ser，Ala，Gly，His,Gln，Ala—Gly，Thr，Pro,AlaVal—Met,Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGly—Ala,Thr，Pro,Ser，Glylie—Met,Tyr,Phe，Val，Lou,IlePhe一Trp,Met,Tyr，Ile，Val，Leu,Tyr—Trp，Met,Phe，lie,Val，Leu，Cys一Ser，Thr，CysHis—Glu，Lys，Gln，Thr，Arg,HisGinGlu，Lys，Asn，His,Thr,Arg，Asn—Gln，Asp,Ser，AsnLys—Glu，Gln，His,Arg，LysAsp—Glu，Asn，Asp20Glu—Asp，Lys，Asn，Gln，His,Arg,GluMet—Phe，lie,Val，Leu，MetTrp—Trp表II中等程度種類的同氨基酸一同義種類Ser—SerArg—His,Lys，Leu—Ile，Phe，Pro—Aia，ProThr—ThrAla—Pro,AlaVal—Met,lie,Gly—Gly"lieIle,Met,Phe—Met,Tyr，Tyr—Phe，TyrCys—Ser，CysHis—Arg，Gln，Gin—Glu，His,Asn—Asp,AsnLys—Arg，LysAsp—Asn,AspGlu—Gln，GluMet—Phe，Ile,Trp—Trpt氨基酸ArgMet,LeuValPhe,Val,Leulie,Leu，PheHisGlnVal，Uu，Met表III狹窄范圍種類的同義氨基酸氨基酸一同義種類Ser—SerArg—ArgLeu—lie,Met,LeuPro—ProThr—ThrAla—AlaVal—ValGly—Glylie—lie,Met,LeuPhe—PheTyr—TyrCys—Ser，CysHis—HisGin—GinAsn—AsnLys—LysAsp—AspGlu—GluMet—lie,Leu，MetTrp—Trp在本文所提供的化合物(例如肽和蛋白質(zhì))中所使用的氨基酸可以是遺傳編碼的氨基酸，天然形成的非遺傳編碼的氨基酸，或者合成的氨基酸。上述任何氨基酸的L-和D-對映體都可以用于所述的化合物中。本文中，以下縮寫可以用于以下遺傳編碼的氨基酸(及其殘基)中丙氨酸(Ala，A);精氨酸(Arg，R);天冬酰胺(Asn，N);天冬氨酸(Asp,D);半胱氨酸(Cys，C);甘氨酸(Gly，G);谷氨酸(Glu，E);谷氨酰胺(Gln，Q);組氨酸(His,H);異亮氨酸(Ile，I);亮氨酸(Leu，L);賴氨酸(Lys，K);甲疏氨酸(Met，M);苯丙氨酸(Phe，F(xiàn));脯氨酸(Pro，P);絲氨酸(Ser，S);蘇氨酸(Thr，T);色氨酸(Trp，W);酪氨酸(Tyr，Y);以及纈氨酸(Val，V)。的氨基酸包括(但不限于)P-丙氨酸(b-Ala)以及其他cc-氨基酸，例如3-氨基丙酸(Dap)，2，3-二氨基丙酸(Dpr，Z)，4-氨基丁酸等；ot-氨基異丁酸(Aib);s-氨基已酸(Aha);5-氨基戊酸(Ava);曱基甘氨酸(MeGly);鳥氨酸(0rn);瓜氨酸(Cit);叔丁基丙氨酸(t-BuA);叔丁基甘氨酸(t-BuG);N-甲基異亮氨酸(Melle);苯基甘氨酸(Phg);環(huán)己基丙氨酸(Cha);正亮氨酸(Nle，J);2-萘基丙氨酸(2-Nal);4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-Cl));2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F));3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F));4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F));青霉胺(Pen);1,2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic);P-2-噻吩丙氨酸(Thi);甲疏氨酸亞砜(MS0);高精氨酸(hArg);N-乙酰基賴氨酸(AcLys);2，3-二氨基丁酸(Dab);2，3-二氨基丁酸(Dbu);對氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2));N-曱基纈氨酸(MeVal);高半胱氨酸(hCys);3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸(BztAla，B);以及高絲氨酸(hSer)。所考慮的其他氨基酸類似物包括磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、磷酸酪氨酸、羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸酯、馬尿酸、八氫吲味-2-羧酸、施德丁(Statine)、a-曱基-丙氨酸、對苯酰-苯基丙氨酸、炔丙基甘氨酸以及肌氨酸。無論是目前或是在將來，本文所述的肽在L-或D-構(gòu)型中可以具有任何之前所述的氨基酸，或者可以具有本文所述的或本領(lǐng)域已知的任何其他氨基酸。可以彼此取代其他的氨基酸通常在相似的類別或亞類中。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的那樣，主要根據(jù)氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)和物理性質(zhì)，許多氨基酸可以被放置到不同的類別中。例如，一些氨基酸通常被認(rèn)為是親水性的或者是極性的氨基酸，而其他的氨基酸被認(rèn)為是疏水性的或者是非極性的氨基酸。極性氨基酸包括具有酸性、堿性或親水性側(cè)鏈的氨基酸，而非極性氨基酸包括具有芳香或疏水性側(cè)鏈的氨基酸。非極性氨基酸可以被進一步再細(xì)分，其中包括脂肪族氨基酸等。本文所用的氨基酸類別的定義如下所示"非極性氨基酸"指具有在生理pH下不帶電，非極性和一般被水溶液排斥的側(cè)鏈的氨基酸。遺傳編碼的疏水性氨基酸的例子包括Ala、Ile、Leu、Met、Trp、Tyr和Val。非遺傳編碼的非極性氨基酸的例子包括t-BuA、Cha和Nle。"芳香族氨基酸"指具有這樣的側(cè)鏈的非極性氨基酸，所述側(cè)鏈包含至少一個具有綴合的7T-電子系統(tǒng)(芳香族基團)的環(huán)。芳香族基團可以進一步替換為取代基例如烷基、烯基、炔基、羥基、磺?；?、硝基和氨基以及其他。遺傳編碼的芳香族氨基酸的例子包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。常見的非遺傳編碼的芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、|3-2-噻吩丙氨酸、3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸、1，2，3,4-四氫異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。"脂肪族氨基酸"指具有飽和或未飽和的直鏈、分支或環(huán)狀烴側(cè)鏈的非極性氨基酸。遺傳編碼的芳香族氨基酸的例子包括Ala、Leu、Val和Ile。非編碼的芳香族氨基酸的例子包括Nle。"極性氨基酸"指具有這樣的側(cè)鏈的親水性氨基酸，所述側(cè)鏈在生理pH下是帶電的或不帶電的，并且具有其中由2個原子共同分享的電子對通過原子之一保持更緊密的鍵。極性氨基酸一般是親水性的，意指它們具有由水溶液吸引的側(cè)鏈的氨基酸。遺傳編碼的極性氨基酸的例子包括天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸和絲氨酸。非遺傳編碼的極性氨基酸的例子包括瓜氨酸、高半胱氨酸、N-乙酰賴氨酸和曱石危氨酸亞砜。"酸性氨基酸"指具有小于7的側(cè)鏈pK值的親水性氨基酸。由于氫離子的喪失，酸性氨基酸在生理pH下一般具有帶負(fù)電的側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸(天冬氨酸鹽)和谷氨酸(谷氨酸鹽)。"堿性氨基酸"指具有大于7的側(cè)鏈pK值的親水性氨基酸。由于水合氬離子的喪失，堿性氨基酸在生理pH下一般具有帶正電的側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸的例子包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。非遺傳編碼的堿性氨基酸的例子包括鳥氨酸、2,3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。"可電離的氨基酸，，指在生理pH下可以帶電的氨基酸。此類可電離的氨基酸包括酸性和堿性氨基酸，例如D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-組氨酸、D-精氨酸、D-賴氨酸、D-羥賴氨酸、D-鳥氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸、L-羥賴氨酸或L-鳥氨酸。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，上文分類法不是絕對的。幾種氨基酸顯示出超過一種的特征性質(zhì)，并且因此可以包括在超過一種的類別中。例如，酪氨酸具有非極性芳香族環(huán)和極性羥基。因此，酪氨酸具有可以被描述為非極性、芳香族和極性的幾個特征。然而，非極性環(huán)是占優(yōu)勢的并且因此酪氨酸一般被視為非極性的。類似地，除了能夠形成二硫鍵外，半胱氨酸也具有非極性特性。因此，盡管沒有嚴(yán)格分類為疏水性或非極性氨基酸，但在許多情況下半胱氨酸可以用于給肽賦予疏水性或非極性。在某些實施方案中，由本發(fā)明考慮的極性氨基酸包括，例如，精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、高半胱氨酸、賴氨酸、羥賴氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸。在一個實施方案中，極性氨基酸是可電離的氨基酸，例如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、羥賴氨酸、賴氨酸或鳥氨酸?？梢岳玫臉O性或非極性氨基酸殘基的例子包括例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等。本文中的術(shù)語"鹽"是指羧基鹽以及本文所述的的肽或其類似物的氨基形成的酸加成鹽。羧基鹽可以通過本領(lǐng)域中已知的方法來形成，并且包括無機鹽(例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽、鋅鹽等)以及與有機堿(如與胺(例如三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶、魯普卡因等)形成的那些堿)形成的鹽。酸性鹽包括例如與礦物酸(例如鹽酸或硫25酸)形成的鹽，以及與有機酸(例如乙酸或草酸)形成的鹽。當(dāng)然，任何所述的鹽都必需與本發(fā)明所公開的肽具有基本相似的活性。如本文所使用的，定義"功能衍生物"是指這樣的衍生物，該衍生物可以根據(jù)已知的方法由存在于所述氨基酸部分的側(cè)鏈上或者存在于N-基團或C-基團上的官能團來制備得到，并且當(dāng)該衍生物是藥學(xué)上可接受的時，即，當(dāng)他們不會破壞所述蛋白質(zhì)的活性或者不會使包含他們的藥物組合物具有毒性時，這些衍生物將被包含在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)。這些衍生物可以包括例如游離氨基的羧基和N-?；苌锏孽セ蛑咀艴０坊蛘哂坞x羥基的O-?；?，并且這些衍生物可以是與酰基(例如alcanoyl或者芳?；?形成的。"前體"是在人或動物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為本文所公開的肽的化合物。本發(fā)明公開的肽可以通過任何已知的方法來制備，例如固相合成或者液相合成方法。例如，就固相合成而言，將待合成的肽的C末端相應(yīng)的氨基酸與栽體結(jié)合，該載體不溶于有機溶劑，并通過交替反復(fù)的反應(yīng)，其中所述的反應(yīng)為使其中其oc-氨基和側(cè)鏈官能團是由合適的保護基團所保護的氨基酸以由C末端至N末端的順序依次濃縮的反應(yīng)；以及使與樹脂或者所述肽的ct-氨基的保護基團結(jié)合的氨基酸被釋放出來的反應(yīng)，由此，按照這種方式所述的肽鏈被延長。根據(jù)所用的包含基團的種類，固相合成方法在很大程度上被分為tBoc方法和Fmoc方法。常用的保護基團包括用于氨基的tBoc(叔丁氧基羰基)，Cl-Z(2-氯千氧基羰基)，Br-Z(2-溴千氧基羰基)，Bzl(芐基)，F(xiàn)moc(9-芴甲氧基羰基)，Mbh(4，4'-dimethoxydibenzhydryl)，Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三曱基苯磺?；?，Trt(三苯曱基)，Tos(甲苯磺?；?，Z(芐氧羰基)以及C12-Bzl(2，6-二氯千基)，用于胍基的N02(硝基)和Pmc(2，2，5，7，8-五曱基色原烷-6-磺酰基)；以及用于羥基的tBu(叔丁基)。在合成所需的肽之后，應(yīng)該對該肽進行脫保護反應(yīng)，并從固相載體上切下來。對于Boc方法而言，這種肽的切除反應(yīng)可以使用氟化氬或者三氟曱磺酸來進行，而對于Fmoc方法而言，上述肽的切除反應(yīng)可以使用TFA來進行。然后，對如此得到的肽粗品進行純化。通過可以達到上述目的的任何一種方法來進行純化，即，涉及提取、沉淀、色譜、電泳等的任何傳統(tǒng)方法。例如，可以使用HPLC(高效液相色譜)?？梢允褂玫鞍踪|(zhì)純化常用的水-乙腈基的溶劑來進行洗脫。本文所述的肽可以以基本純化的形式來提供，由此使其在需要MNTF活性和/或調(diào)節(jié)的病理學(xué)中作為活性組分而適用于藥物組合物中。如本文所使用的，術(shù)語"生物活性肽"和"生物活性片段"指依照上文描述的運動神經(jīng)元分化因子(MNDF)或運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)的肽或多肽，其中MNDF使千細(xì)胞分化成運動神經(jīng)元，和MNTF顯示出神經(jīng)保護、修復(fù)和治療功能。術(shù)語"互補的"一般指例如在允許的鹽和溫度條件下，經(jīng)由堿基配對的多核苷酸的天然結(jié)合。例如，序列"A-G-T"與互補序列"T-C-A"結(jié)合。2個單鏈分子之間的互補性可以是"部分的"，從而使得只有某些核酸結(jié)合，或其可以是"完全的"，從而使得總體互補性存在于單鏈分子之間。核酸分子之間的互補性程度對它們之間的雜交效率和強度具有顯著影響。"可雜交的，，和"互補的"是這樣的術(shù)語，其用于指出互補性的足夠程度，從而使得足以執(zhí)行預(yù)期作用的結(jié)合優(yōu)選地穩(wěn)定的結(jié)合例如在核酸之間發(fā)生。應(yīng)當(dāng)理解寡核苷酸無需與其可雜交的靶核酸序列100%互補。術(shù)語"組合物"旨在包括含有一種或多種成分的產(chǎn)物。術(shù)語"分化的"是相對術(shù)語，其中"分化細(xì)胞，，是比待比較的細(xì)胞已沿著發(fā)育途徑進一步進展的細(xì)胞。如本文進一步所使用的，"分化的神經(jīng)細(xì)胞"一般指中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的部分分化或完全分化的細(xì)胞。祖細(xì)胞是在發(fā)育和分化期間通過一系列細(xì)胞分裂產(chǎn)生不同的細(xì)胞譜系的母細(xì)胞。例如，神經(jīng)祖細(xì)胞被定型為最終將發(fā)育成CNS或PNS的完全分化的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞諮系；然而，此類神經(jīng)祖細(xì)胞可能尚未獻身于特定類型，或亞類的神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)27這樣的細(xì)胞系，其將分化成特定類型的神經(jīng)細(xì)胞，并且其后產(chǎn)生完全分化的神經(jīng)細(xì)胞。因此，本發(fā)明的部分分化的神經(jīng)細(xì)胞可以是具有神經(jīng)標(biāo)識的細(xì)胞，其已獲得定向或定位特性，或已定型為發(fā)育成特定種類的神經(jīng)細(xì)胞，但并非完全分化的神經(jīng)細(xì)胞。例如，依照本發(fā)明用單獨或與成形素(例如RA)組合的MNTF肽處理ES細(xì)胞可以產(chǎn)生部分分化的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞。"紊亂，，是將從使用本發(fā)明的分子或組合物的治療中獲益的任何病況。這包括慢性和急性紊亂或疾病，包括使哺乳動物易患所述病癥的那些病理學(xué)條件。"飼養(yǎng)細(xì)胞"或"祠養(yǎng)物"包括一種類型的細(xì)胞，其與另一種類型的細(xì)胞共培養(yǎng)，一般用于提供其中第二種類型的細(xì)胞可以生長的環(huán)境。例如，某些類型的pPS細(xì)胞可以由原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、永生化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、或由hES細(xì)胞分化的人成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞得到支持。"功能等價物"意指具有基本上類似于例如MLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域的生物活性的肽，及其保守的、同源6-聚體(例如SEQIDN0:2)、7-聚體、8-聚體、9-聚體或10-聚體衍生物。其包括具有此活性或特征的"片段"、"變體"、"類似物"、"同系物"或"化學(xué)衍生物"。MLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域的功能等價物和上述其他隨后可以共享或不共享相同的氨基酸序列，并且常規(guī)或非常規(guī)氨基酸的保守或非保守的氨基酸置換是可能的。如本文所使用的，術(shù)語"MLSAFSRYAR,WMLSAFS和FSRYAR結(jié)構(gòu)域"域，以及能夠模仿所述結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和/或功能的肽和/或分子。其他的結(jié)構(gòu)域示于SEQIDN0:1-142中。在某些方面中，提供了包含任何序列IDNO:1-142中的氨基酸的肽，及其功能等價物。術(shù)語"基因產(chǎn)物"是指由基因轉(zhuǎn)錄的RNA分子，或者由基因編碼或由所述RNA翻譯的多肽。"生長環(huán)境"是其中目的細(xì)胞在合適的條件下可以在體外增殖、分化或成熟的環(huán)境。此類條件可以包括例如，其中細(xì)胞進行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以存在的任何生長因子或分化誘導(dǎo)因子，和固體表面或支持結(jié)構(gòu)。如本文所使用的，各種形式的術(shù)語"調(diào)節(jié)劑，，和"調(diào)節(jié)"預(yù)期包含特定靶的表達或作用或活性的全部或部分抑制。為了本公開內(nèi)容的目的，術(shù)語"神經(jīng)祖細(xì)胞"或"神經(jīng)前體細(xì)胞"包括可以產(chǎn)生這樣的后代的細(xì)胞，所述后代是神經(jīng)元細(xì)胞(例如，神經(jīng)元前體或成熟神經(jīng)元)或膠質(zhì)細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)前體、成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞或成熟少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)。細(xì)胞一般表達具有神經(jīng)讒系特征的某些表型標(biāo)記，并且當(dāng)在體外單獨進行培養(yǎng)時，它們一般不產(chǎn)生其他胚胎胚層的后代。"神經(jīng)元祖細(xì)胞，，或"神經(jīng)元前體細(xì)胞"包括可以產(chǎn)生這樣的后代的細(xì)胞，所述后代是成熟神經(jīng)元并且有時還具有產(chǎn)生膠質(zhì)細(xì)胞的能力。"多潛能神經(jīng)祖細(xì)胞群"包括具有產(chǎn)生這樣的后代的能力的細(xì)胞群，所述后代是神經(jīng)元細(xì)胞，是膠質(zhì)細(xì)胞，并且有時是其他類型的細(xì)胞。這個術(shù)語不要求群體內(nèi)的個別細(xì)胞具有形成2種類型的后代的能力，盡管可以存在是多潛能神經(jīng)前體的個別細(xì)胞。術(shù)語"擬肽"和"模擬物"包括可以基本上具有它們模擬的蛋白質(zhì)區(qū)域相同的結(jié)構(gòu)和功能特征的天然的和合成的化學(xué)化合物。具有類似于模板肽的那些的性質(zhì)的肽類似物可以是非肽藥物。"肽模擬物"或"擬肽"包括基于肽的化合物，還包括此類基于非肽的化合物(Fauchere，J.Adv.DrugRes.15:29(1986);Veber和Freidinger;TINS;392(1985);和Evans等人，J.Med.Chem.30:1229(1987);BeeleyN.，TrendsBiotechnol.Jim;12(6):213-6(1994);Kieber-EmmonsT，等人；CurrOpinBiotechnol.Aug;8(4):"5-41(1997)。在結(jié)構(gòu)上類似于治療上有用的肽的肽模擬物可以用于產(chǎn)生等價的或增強的治療或預(yù)后效果。一般而言，擬肽在結(jié)構(gòu)上等同或類似于示例多肽(即，具有生物或藥理學(xué)功能或活性的多肽)，但還可以具有任選地被選自下述的鍵替換的一個或多個肽鍵例如，-C歸H-、-CH2S-、-CH「CH2-、-CH-CH-(順式和反式)、-C0CH廣、-CH(OH)CH2-和-CH2S0-。模擬物可以完全由天然氨基酸或氨基酸的非天然類似物組成，或者是部分天然的肽氨基酸和部分氨基酸的非天然類似物的嵌合分子。模擬物還可以包含任何量的天然氨基酸的保守置換，只要此類置換同樣基本上不改變模擬物活性。如本文所使用的，"預(yù)防"是指完全或部分預(yù)防，或者改善或控制。如本文所使用的，術(shù)語"治療，，是指治療性處理以及預(yù)防的或預(yù)防性措施。需要治療的那些對象包括已經(jīng)患有所述的紊亂的那些，以及傾向于患有所述的紊亂或者被診斷出所述的紊亂的那些，或者所述的紊亂有待預(yù)防的那些。如本文所使用的，關(guān)于本文中所述的化合物或組合物的"有效量"是指足以誘導(dǎo)出所需的生物學(xué)結(jié)果、藥物學(xué)結(jié)果或治療結(jié)果的量。所述的結(jié)果可以為疾病、紊亂或病況的跡象、癥狀或原因的減輕，或者生物系統(tǒng)的任何其他所需的改變。如本文所使用的，"同時地"用于指將MNTF組合物與一種或多種其他治療劑同時施用，而術(shù)語"組合"用于指如果所述的MNTF組合物與一種或多種其他治療劑如果不同時施用或者以物理組合的方式施用，則為在一定的時間框(他們均可利用，從而起治療作用)內(nèi)，"依次"施用。因此，"依次"施用可以允許一種試劑在其他試劑之后的若干分鐘(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30)、大約若干小時、天、星期、月的時間范圍內(nèi)進行施用，前體條件是MNTF與一種或多種其他治療劑同時以有效量存在。在多種成分施用之間的時間延遲期間會發(fā)生變化，這取決于所述成分的精確的性質(zhì)，成分之間的相互作用，以及這些成分的各自的半衰期。如本文所使用的，術(shù)語"肽類似物"是指具有與模板肽相類似的性質(zhì)的化合物，并且可以為非肽類藥物。"肽的模擬物"或者"肽模30擬物"包括肽基化合物，還包括所述的非肽基化合物，例如肽類似物。與具有治療用途的肽結(jié)構(gòu)類似的肽模擬物可用于產(chǎn)生等效的或增強的治療或預(yù)后效果。通常，肽類似物與示范多肽(即，具有生物學(xué)或藥理學(xué)功能或活性的多肽)為結(jié)構(gòu)或功能的模擬物(即，同一性或相似性)，而且還可以具有一個或多個可任選地被其他鍵替代的肽鍵，其中所述的其他鍵選自(例如)-CH2NH-，-CH2S-,-CH2-CH2-，-CH-CH-(順式和反式)，-COCH廣，-CH(OH)CH廣，以及-CH2S0-。所述的模擬物可以完全由天然氨基酸、合成的化學(xué)化合物或氨基酸的非天然類似物組成，分子。所述的模擬物還可以包含任意量的天然氨基酸的保守性置換，只要這種置換同樣基本上不改變模擬物活性。如本文所使用的，術(shù)語"蛋白質(zhì)"指經(jīng)由肽鍵連接的2個或更多單個氨基酸(無論是不是天然存在的)的任何聚合物，如在下述情況下發(fā)生的一樣，當(dāng)與l個氨基酸(或氨基酸殘基)的oc-碳鍵合的羧酸基團的羧基碳原子變得和與鄰近氨基酸的oc-碳鍵合的氨基的氨基氮原子共價結(jié)合時。這些肽鍵連接，和包含其的原子(即，a-碳原子、羧基碳原子(及其取代氧原子)，和氨基氮原子(及其取代氫原子)形成蛋白質(zhì)的"多肽主鏈"。此外，如本文所使用的，術(shù)語"蛋白質(zhì)，，應(yīng)當(dāng)理解為包括術(shù)語"多肽"和"肽，，(它們有時可以在本文中互換使用)。類似地，蛋白質(zhì)片段、類似物、衍生物和變體在本文中可以被稱為"蛋白質(zhì)"，并且除非另有說明應(yīng)被視為"蛋白質(zhì)"。術(shù)語蛋白質(zhì)的"片段"指包含少于蛋白質(zhì)的所有氨基酸殘基的多肽。蛋白質(zhì)的"結(jié)構(gòu)域"也是片段，并且包含通常是賦予活性或功能所需的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基。短語"百分比00同一性"是指在對比兩條或多條序列中所發(fā)現(xiàn)的序列相似性的百分比。例如，可以采用任何合適的軟件來以電子方式測定百分比同一性。同樣地，兩條序列(或者任一條序列或者這兩條序列的一個或多個部分)之間的"相似性"可以通過將一條序列與第二條序列進行序列比對來測定。組合物或制劑的"藥學(xué)上可接受的"化合物和其他成分，例如栽體、稀釋劑或賦形劑是適合于給其受體施用的那些。術(shù)語"嚴(yán)格條件"指允許編碼目的MNTF肽的多核苷酸之間雜交的條件。嚴(yán)格條件可以由鹽濃度、有機溶劑(例如，甲酰胺)的濃度、溫度和本領(lǐng)域眾所周知的其他條件進行限定。通過減少鹽的濃度、增加有機溶劑(例如，曱酰胺)的濃度、或提高雜交溫度可以增加嚴(yán)格性。例如，嚴(yán)格鹽濃度通常將小于約750mMNaCl和75mM檸檬酸三鈉，例如小于約500mMNaCl和50mM檸檬酸三鈉，和小于約250mMNaCl和25mM檸檬酸三鈉。低嚴(yán)格性雜交可以在不存在有機溶劑例如甲酰胺的情況下獲得，而高嚴(yán)格性雜交可以在有機溶劑(例如，至少約35%甲酰胺，最優(yōu)選地至少約50%甲酰胺)的存在下獲得。嚴(yán)格溫度條件通常將包括至少約3(TC，至少約37。C，和至少約42'C的溫度。各種附加參數(shù)，例如，雜交時間，去污劑例如十二烷基硫酸鈉(SDS)的濃度，以及載體DNA的包括或排除，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。且在本領(lǐng)域的技術(shù)內(nèi)。嚴(yán)格雜交條件還可以由低于靶序列的解鏈溫度(Tm)約5'C-約2(TC或25。C中的條件，以及與耙具有精確或接近精確的互補性的探針來限定。如本文所使用的，解鏈溫度是在其下雙鏈核酸分子群體變得半解離成單鏈的溫度。用于計算核酸的Tm的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見，例如，Berger和Ki隱l，MethodsInEnzymology，笫152巻GuideToMolecularCloningTechniques,SanDiego(1987):AcademicPress,Inc.和Sambrook等人,MolecularCloning(1989):ALaboratoryMa畫l，第2版，第l-3巻，ColdSpringHarborLaboratory)。如由標(biāo)準(zhǔn)參考文獻指出的，Tm值的簡單估計可以通過下式進行計算Tm=81.5+0.41(%G+C)，當(dāng)核酸在1MNaCl的tK溶液中時(參見例如，Anderson和Young,"QuantitativeFi1terHybridization"inNucleicAcidHybridization(1985))。雜合體的解離溫度(和因此關(guān)于嚴(yán)格雜交的條件)受到各種因素的影響，例如探針的長度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)和耙的性質(zhì)(DNA、32RNA、堿基組成、存在于溶液中或固定的等)，以及鹽和其他組分(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)的濃度。這些因素的效應(yīng)是眾所周知的并且在本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻中得到討論，參見，例如，Sambrook，同上，和Ausubel，同上。一般地，嚴(yán)格雜交條件是在pH7.0-8.3下小于約1.0M鈉離子、一般約0.01-1.0M鈉離子的鹽濃度，和對于短探針(例如，10-50個核苷酸)至少約30。C和對于長探針(例如，大于50個核苷酸)至少約6(TC的溫度。如指出的，嚴(yán)格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來達到，在這種情況下可以使用較低的溫度。在本文所述，多核苷酸可以是在中至高嚴(yán)格性的條件下與耙mRM雜交的多核苷酸，所述條件例如0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉在約50-約60攝氏度下。如本文所使用的，"受試者"指分類為哺乳動物的任何動物，包括人、馴養(yǎng)和農(nóng)場動物、和動物園、運動或?qū)櫸飫游铮?，犬、馬、貓、綿羊、豬、牛等。優(yōu)選受試者是人。術(shù)語"治療有效量"意指將引發(fā)所需應(yīng)答的受試化合物的量，所述所需應(yīng)答例如由例如研究者、獸醫(yī)、醫(yī)師或其他臨床醫(yī)生尋求的組織、系統(tǒng)、動物或人的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答。"治療"指治療性處理和預(yù)防性或預(yù)防措施。需要治療的那些包括已具有病癥的那些以及其中待預(yù)防病癥的那些。術(shù)語"載體"指用于將核酸遞送給細(xì)胞的質(zhì)粒、噬菌體、病毒或其他系統(tǒng)(它是天然的或合成的)形式的核酸分子擴增、復(fù)制和/或表達媒介物，其中質(zhì)粒、噬菌體或病毒可以與細(xì)菌、酵母、無脊推動物和/或哺乳動物宿主細(xì)胞一起發(fā)揮作用。載體可以保持獨立于宿主細(xì)胞基因組DNA或可以與基因組DNA全部或部分整合。栽體一般將包含但不必包含所有必需元件，以便在它與之相容的任何宿主細(xì)胞中起作用。"表達載體"是在合適的條件下能夠指導(dǎo)外源多核苷酸，例如編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白的多核苷酸表達的載體。如本文所描述的，術(shù)語"同源性和同系物"包括可以是含有與目的蛋白質(zhì)序列序列同源的氨基酸序列的肽。此類肽一般與相關(guān)序列具有至少約70%的同源性，優(yōu)選地至少約80%、90%、95%、97°/。或99%的同源性，例如在至少約15、20、30、40、50、100或更多鄰接核苷酸(同源序列的)的區(qū)域上。同源性可以基于本領(lǐng)域的任何方法進行計算。例如UWGCGPackage提供了BESTFIT程序，其可以用于計算同源性(例如以其缺省設(shè)置使用)(Devereux等人，NucleicAcidsResearch12，第387-395頁(1984))。PILEUP和BLAST算法可以用于計算同源性或排列序列(一般以其缺省設(shè)置)，例如，如AUschulS.F.;JMolEvol36:290-300(1993);Altschul，S.F.等人;JMolBiol215:403-10(1990)中所述。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件是可通過美國國立生物信息中心(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/L)公開獲得的。這種算法包括首先通過鑒定查詢序列中長度W的短字來鑒定高得分序列對，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時，所述短字匹配或滿足某些正值閾值得分T。T被稱為鄰近字得分閾值(AUschul等人，同上)。這些起始鄰近字命中充當(dāng)種子用于起始搜索以找到包含其的HSPs。字命中沿著每個序列在2個方向上進行延伸直至累積比對得分可以得到增加。關(guān)于字命中在每個方向上的延伸在下述情況下停止累積比對得分與其達到的最大值減少量X;由于一個或多個負(fù)得分殘基比對的積累，累積得分變成零或以下；或達到任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的敏感性和速度。BLAST程序使用字長(W)11、BU)SUM62評分矩P車(參見Henikoff和HenikoffProc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919(1992))比對(B)50、期望值(E)10、M=5、N=4和2條鏈的比較作為缺省值。BLAST算法執(zhí)行2個序列之間的相似性的統(tǒng)計分析；參見，例如，Karlin和AltschulPro"Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787(1993)。由BLAST算法提供的一種相似性測量是最小總和概率(P(N))，其提供了2個核苷酸或氨基酸序列之間的匹配將偶然發(fā)生的概率指示。例如，如果在第一個序列的比較中最小總和概率小于約1、以及小于約O.1、0.01或0.001，那么序列被視為與另一個序列類似。同源序列一般通過至少(或通過不超過)約1個、2個、5個、10個、15個或20個或更多突變(它可以是置換、刪除或插入)不同于相關(guān)序列。這些突變可以在上文提及的任何區(qū)域上相對于計算的同源性進行測量。同源序列一般在顯著超過背景的水平上與原始序列選擇性雜交。選擇性雜交一般使用中至高嚴(yán)格性(例如0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉在約50°C-約6(TC下)的條件達到。然而，此類雜交可以在本領(lǐng)域已知的任何合適的條件下進行(參見Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989))。例如，如果需要高嚴(yán)格性，那么合適的條件包括O.2xSSC在60。C下。如果需要低嚴(yán)格性，那么合適的條件包括2xSSC在60。C下。術(shù)語"重組"指在體外合成或以其他方式處理的多核苷酸(例如，"重組多核苷酸")，指使用重組多核普酸在細(xì)胞或其他生物系統(tǒng)中生產(chǎn)基因產(chǎn)物的方法，或指由重組多核苷酸編碼的多肽("重組蛋白質(zhì)")。因此，"重組，，多核普酸由其生產(chǎn)方法或其結(jié)構(gòu)來限定。關(guān)于其生產(chǎn)方法，該過程指重組核酸技術(shù)的使用，例如，涉及核苷酸序列中的人為干預(yù)，一般為選擇或生產(chǎn)。備選地，它可以是通過產(chǎn)生包含2個或更多片段的融合物的序列制備的多核苷酸，所述片段并非天然地彼此鄰接。因此，包含了例如通過用任何非天然存在的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞制備的產(chǎn)物，如包含使用任何合成寡核苷酸方法衍生的序列的多核苷酸。類似地，"重組"多肽是由重組多核普酸表達的多肽。"重組宿主細(xì)胞"是包含載體例如克隆載體或表達栽體的細(xì)胞，或已通過重組技術(shù)在其他方面進行處理以表達目的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。治療的普通方面提供了治療患有神經(jīng)元紊亂的受試者的方法，該方法包括向所述的受試者施用運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)肽類似物。如本文所使用的，神經(jīng)元紊亂可以包括完全地或部分地與功能神經(jīng)組織的急性、進行性或逐漸性喪失有關(guān)的，或者特征在于完全地或部分地功能神經(jīng)組織的急性、進行性或逐漸喪失的疾病、紊亂或病況。示例性的神經(jīng)元紊亂可以包括脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)或者35短暫或延長的缺血狀況(例如腦缺血)、亨廷頓氏疾病(HD)、帕金森氏疾病(PD)、多發(fā)性硬化(MS)、ALS、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變、脊髓性肌萎縮(SMA)、以及橫貫性脊髓炎。此外，示例性的神經(jīng)退行性疾病還可以包括亞歷山大疾病、阿耳珀疾病、毛細(xì)管擴張性共濟失調(diào)、Batten疾病(也稱為Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten疾病)、牛海綿狀腦病(BSE)、卡納萬疾病、科可因氏綜合征、皮質(zhì)基底退化癥(Corticobasaldegeneration)、克-雅二氏疾病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、HIV相關(guān)性癡呆、Kennedy疾病、克拉伯疾病、Lewy小體癡呆、Machado-Joseph疾病(3型脊髓小腦性共濟失調(diào)(Spinocerebellarataxia))、多系統(tǒng)萎縮、發(fā)作性嗜睡病、神經(jīng)疏螺旋體病、Pelizaeus-Merzbacher疾病、皮克疾病、原發(fā)性側(cè)索硬化、朊病毒疾病、Refsum疾病、Sandhoff疾病以及Schilder疾病。"神經(jīng)退行性疾病"是指與中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)的病況，其中所述的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的特征在于功能神經(jīng)組織的進行性、漸進性喪失。"肌萎縮性側(cè)索硬化，，或"ALS，，為本領(lǐng)域所理解的術(shù)語，并且如本文所使用的，其是指可以影響上運動神經(jīng)元(腦中的運動神經(jīng)元)和/或下運動神經(jīng)元(脊髓中的運動神經(jīng)元)、并且可以導(dǎo)致運動神經(jīng)元死亡的進行性神經(jīng)退化疾病。如本文所使用的，術(shù)語"ALS"包括本領(lǐng)域已知的ALS的所有類別，包括，但不限于典型ALS(通常影響上和下運動神經(jīng)元)、原發(fā)性側(cè)索硬化(PLS,通常只影響上運動神經(jīng)元)、進行性延髓麻痹(PBP或延髓發(fā)作(BulbarOnset)，一種通常以吞咽、咀嚼和說話困難開始的ALS)、進行性肌萎縮(PMA，通常僅影響下運動神經(jīng)元)和家族性ALS(遺傳型ALS)。ALS的示例性臨床癥狀包括肌無力、肌萎縮(musclewasting)、肌肉痙攣(musclecramping)、肌顫搐、模糊或緩慢的口齒、吞咽苦難、吞咽緩慢、運動不協(xié)調(diào)。ALS的其他示例性臨床癥狀包括可在生物樣品中檢測的那些，其中所述的生物樣品得自患有或疑似患有ALS(例36如與正常相比，CD4:CD8細(xì)胞的比例增大；與正常相比，CD14+細(xì)胞的數(shù)量減少；與正常CD14+細(xì)胞相比，CD14+細(xì)胞上的HLA-DR的表達增多；與正常細(xì)胞相比，活化的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的水平增多；發(fā)生巨噬細(xì)胞增殖；以及與正常相比，血清IgG和/或IgM減少，其中本文中所用的"正常"是指未受ALS影響的受試者或來自這種未受影響的受試者的細(xì)胞)的受試者。因此，"處理"涵蓋了取得一種或多種臨床癥狀的減少，這種減少可能具有理想的伴隨效果，例如減輕、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減慢或延遲疾病的進程，延遲和/或甚至預(yù)防疾病的發(fā)作。"多發(fā)性硬化"或"MS"是本領(lǐng)域所理解的術(shù)語，并且如本文所使用的，其是指導(dǎo)致覆蓋神經(jīng)細(xì)胞，特別是腦和脊髓的神經(jīng)細(xì)胞的髓磷脂(myelin)被破壞的進行性神經(jīng)退化疾病。如本文所使用的，"MS"包括本領(lǐng)域已知的所有類別的MS，包括但不限于復(fù)發(fā)緩解型MS(RRMS)(通常表征為在疾病侵襲(也稱為惡化、復(fù)發(fā)或驟發(fā))后的部分或完全恢復(fù))；繼發(fā)性進行性MS(SPMS)(通常表征為較少復(fù)發(fā)，并伴有殘疾情況增加以及多個癥狀)，以及原發(fā)性進行性MS(PPMS)(通常表征為癥狀以及殘疾的發(fā)展，而沒有減輕)。MS的示例性臨床癥狀包括疲勞(也稱為MS疲乏)、肌肉疲勞、感覺異常、行走和/或平衡問題產(chǎn)生困難、感覺異常(例如麻木、刺痛或"發(fā)麻"、疼痛、膀胱功能障礙、腸功能障礙、認(rèn)知功能改變(包括記憶、注意力、集中、判斷和解決問題方面都發(fā)生問題)、頭暈和眩暈、情緒問題(例如抑郁)、性功能障礙、以及視覺問題)。嚴(yán)重的情況可能涉及部分或完全癱瘓(例如視覺模糊或復(fù)視覺、紅-綠色盲、單眼失明)。其他癥狀包括頭疼、聽覺損失、瘙癢、癲癇、痙攣、語言和吞咽紊亂、以及顫抖。MS的其他示例性臨床癥狀包括可在生物樣品中檢測的那些，其中所述的生物樣品得自患有或疑似患有MS(例如與正常相比，CD4:CD8細(xì)胞的比例增大；與正常相比，CD14+細(xì)胞的數(shù)量減少；與正常CD14+細(xì)胞相比，CD14+細(xì)胞上的HLA-DR的表達增多；與正常細(xì)胞相比，活化的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的水平增多；發(fā)生巨噬細(xì)胞增殖；以及與正常相比，血清IgG和/或IgM減少，其中本文中所用的"正常，，是指未受MS影響的受試者或來自這種未受影響的受試者的細(xì)胞。因此"處理"包括實現(xiàn)一種或多種臨床癥狀的減少，所述減少可以具有希望的伴隨作用，例如減輕、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減慢或延遲疾病的發(fā)展，延遲和/或甚至阻止疾病的發(fā)作。"阿茲海默氏疾病"或"AD"是本領(lǐng)域所理解的術(shù)語，并且如本文所使用的，其是指進行性神經(jīng)退化疾病，其特征在于癡呆，并且由美國精神病學(xué)會(AmericanPsychiatricAssociation)(在DSMIV中)根據(jù)多發(fā)性認(rèn)知缺陷(其包括記憶受損)的發(fā)展情況來定義。AD的示例性臨床癥狀包括輕度的健忘，包括對近期事件、活動或熟悉的人的名字或事情發(fā)生記憶障礙；難以解答簡單的數(shù)學(xué)問題；難以記憶怎樣做簡單的工作(例如刷牙或梳理頭發(fā))；不能清楚地思考；說、理解、閱讀或?qū)懚及l(fā)生困難；以及焦慮或攻擊行為，或者趨向于離家出走。如本文所使用的，術(shù)語"受試者"可以為脊推動物，例如哺乳動物，例如人。哺乳動物包括但不限于家畜、運動動物、嚙齒動物、靈長動物和寵物。如本文所使用的，帕金森氏疾病(也稱為帕金森病或PD)的特征在于全或部分的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病況，這種病況通常會削弱患者的運動技巧和語言。帕金森氏疾病屬于一種被稱為運動紊亂的病況。其特征部分在于肌肉僵直、顫抖、物理運動緩慢(運動徐緩)，極端情況下為物理運動喪失(運動不能)。原發(fā)癥狀是基底核對運動皮質(zhì)的刺激發(fā)生減少的結(jié)果，這通常是由于多巴胺的形成和作用不足所導(dǎo)致，其中所述的多巴胺由腦中的多巴胺能神經(jīng)元所產(chǎn)生。繼發(fā)癥狀可以包括高水平的認(rèn)知功能障礙和細(xì)微語言問題。PD為慢性的，且為進行性的。PD為帕金森綜合征(一系列相似的癥狀)的最常見的原因。PD還稱為"原發(fā)帕金森綜合征"或"先天PD"(原因未知)。雖然多數(shù)形式的帕金森綜合征是先天性的，但是存在這樣一些情況，其中一些癥狀可以由毒性、藥品、基因突變、頭部損傷或其他醫(yī)學(xué)紊亂所導(dǎo)致。38亨廷頓氏疾病(HD)的特征在于常染色體顯性神經(jīng)退化紊亂，其是由于在Huntington(HU)基因的外顯子1中發(fā)生CAGE三核苷酸延伸所導(dǎo)致的(E.g.Perutzetal.，TrendsBiochem.Sci.1999;24:58-63;andRubinszteinetal.，J.Med.Genet.1999;36:265-270)。HD患者可以表征為存在異常的肌體運動、癡呆和精神問題。綜述來自大鼠肌肉組織的2種運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF1和MNTF2)的分離和表征以及衍生自人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤cDNA文庫的重組MNTF1-F6基因的隨后克隆在美國專利號6,309,877、6，759，389和6,841,531(以及共同未決的美國專利申請序列號10/858,144、10/858,286、10/858，543和10/858,545)中得到描述;所述所有專利在此整體引入作為參考。MNTF1-F6基因序列編碼在本文中如SEQIDNO:4所示的33個氨基酸的序列。如國際申請?zhí)朠CT/US2004/038651中所述，發(fā)現(xiàn)編碼MNTF1多肽的核苷酸序列位于人染色體16q22內(nèi)，所述專利在此整體引入作為參考。看起來對于MNTF1的已知生物活性足夠的MNTF1-F6分子內(nèi)的2個重疊結(jié)構(gòu)域得到鑒定。參見，國際申請?zhí)朠CT/US04/01468或美國專利申請序列號10/541，343，所述專利在此整體引入作為參考。在本文中命名為"WMLSAFS"和"FSRYAR"結(jié)構(gòu)域的這些結(jié)構(gòu)域中的每一個足以刺激運動神經(jīng)元衍生的細(xì)胞系增殖，其方式類似于MNTF1-F633-聚體。類似地，"FSRYAR"結(jié)構(gòu)域足以在體內(nèi)指導(dǎo)經(jīng)由運動神經(jīng)元的肌肉靶的選擇性神經(jīng)再支配，其方式類似于MNTF1-F633-聚體。此外，"FSRYAR"結(jié)構(gòu)域提供了足以產(chǎn)生抗體的抗原表位，所述抗體識別包含"FSRYAR"序列的任何MNTF肽，包括MNTF1-F633-聚體。運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)在人胎兒妊娠期中第9周時在表達中達到峰值(Di，X.等人，ActaAnatomicaSinica29:86-89，1998)?；贛NTF在發(fā)育中的人中的表達，我們推斷MNTF可能促進運動神經(jīng)元的分化和/或存活。為了檢查這點，我們確定MNTF是否調(diào)節(jié)多能胚胎干細(xì)胞分化成運動神經(jīng)元并且是否增強ES細(xì)胞衍生的運動神經(jīng)元的存活。如本文公開的，本發(fā)明人已確定ES細(xì)胞暴露于RA和MNTF類似物指導(dǎo)這些細(xì)胞產(chǎn)生運動神經(jīng)元。使用方法包括但不限于包含MLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域的那些的MNTF和截短的MNTF分子，所述MLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域在本文中被稱為運動神經(jīng)元分化因子(MDNF)，在本文中被證實誘導(dǎo)干細(xì)胞或部分分化的神經(jīng)元細(xì)胞分化成運動神經(jīng)元。此類試劑提供了用于從干細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生和/或分離運動神經(jīng)元群體的新方法。本發(fā)明的方法包括使胚胎干細(xì)胞與視黃酸(RA)和運動神經(jīng)元分化因子(MNDF)接觸。在本發(fā)明的一個實施方案中，使胚胎干細(xì)胞與RA連同運動神經(jīng)元分化因子接觸。備選地，該方法包括使部分分化的神經(jīng)元細(xì)胞與運動神經(jīng)元分化因子接觸。因子以有效產(chǎn)生分化的神經(jīng)細(xì)胞的量提供。這些量可以由技術(shù)人員基于已知操作和本文公開的方法容易地確定。MNTF1和/或其肽類似物還在體外促進哺乳動物運動神經(jīng)元的存活。因此，本文所述的技術(shù)提供了MNTF肽類似物作為關(guān)于神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的生長因子/補充物的用途，包括通過在體外用有效量的MNTF肽類似物培養(yǎng)干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞，用于促進干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)^l包系的存活的方法。本發(fā)明人也已發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)營養(yǎng)因子的存在下培養(yǎng)的神經(jīng)元存活并產(chǎn)生突起。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括使干細(xì)胞衍生的運動神經(jīng)元與至少一種MNTF肽類似物接觸，例如，在與RA和運動神經(jīng)元分化因子例如如本文所描述的MNTF肽類似物或備選地音猬(SonicHedgehog,Shh)接觸后，所述音猬包括Shh激動劑。分化的運動神經(jīng)元可以例如通過FACS分選進行分離或富集。例如經(jīng)元的純?nèi)后w。我們已使用這種方案用于從來自胚狀體的細(xì)胞混合群體中分離細(xì)胞的純運動神經(jīng)元群體。使用膠原酶和分散酶使胚狀體分解成單細(xì)胞。這些單細(xì)胞隨后對于GFP進行FACS分選，因為由HB9啟動子控制表達GFP的細(xì)胞是群體中真正的運動神經(jīng)元。因此，本文所述技術(shù)的另一個方面涉及通過下述用于分離和/或純化分化的神經(jīng)細(xì)胞群的方法(a)獲得或產(chǎn)生在運動神經(jīng)元特異性啟動子的控制下表達G增強型綠色熒光蛋白(eGFP)的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)使胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)物與有效產(chǎn)生表達eGFP的分化的神經(jīng)細(xì)胞的量的RA和MNTF接觸；(d)檢測分化的神經(jīng)細(xì)胞中的eGFP表達；和(f)分離表達eGFP的分化的神經(jīng)細(xì)胞。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)由于其促進哺乳動物神經(jīng)元的存活、生長、增殖和/或維持的能力，MNTF和某些MNTF類似物對于治療神經(jīng)元紊亂是有用的。本發(fā)明人已進一步發(fā)現(xiàn)根據(jù)某些實施方案，MNTF肽或MNTF類似物調(diào)節(jié)不依賴于音猬通路(例如取決于實施方案，部分或完全不依賴)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。同樣地，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)MNTF肽和MNTF類似物調(diào)節(jié)某些蛋白激酶通路，包括某些酪氨酸激酶和生長因子受體的表達或活性。得到調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或蛋白激酶通路包括例如，音猬非依賴性通路。音猬(Shh)是負(fù)責(zé)尾部化的(caudalized)神經(jīng)元腹部化(ventralization)的關(guān)鍵組分，經(jīng)由其跨膜受體組分i7a/^力ecr-s邁oo^e"ecT發(fā)揮作用。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示，在視黃酸的存在下鼠類ES細(xì)胞在體外分化成運動神經(jīng)元方面，MNTF肽有效代替音猬(實施例5)。給這些ES培養(yǎng)物添加MNTF導(dǎo)致成熟運動神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄因子(HB9和Islet1/2)的表達、成熟運動神經(jīng)元標(biāo)記膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的表達、和能夠傳導(dǎo)動作電位的神經(jīng)元的產(chǎn)生。數(shù)椐還顯示在smoothened受體信號的特異性抑制劑(環(huán)杷明-KAAD)的存在下，MNTF肽能夠產(chǎn)生有絲分裂后的成熟運動神經(jīng)元。盡管不希望被束綽于任何具體理論或機制，但本發(fā)明人認(rèn)為數(shù)據(jù)顯示MNTF通過與Shh或smoothened的下游不同的途徑發(fā)信號?；诒疚某尸F(xiàn)的數(shù)椐，本發(fā)明人已進一步確定MNTF肽通過本文描述的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，以促進哺乳動物神經(jīng)元的存活、生長、增殖和/或維持。因此，在本發(fā)明41的另一個方面，施用MNTF因子或MNTF類似物以調(diào)節(jié)某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分的表達或活性。我們的數(shù)據(jù)進一步證實ES細(xì)胞的MNTF處理導(dǎo)致胰島素受體(IR)的Tyr972和Tyrl162/1163的自磷酸化(實施例5)。這些殘基是IR活化的標(biāo)記。此外，免疫共沉淀研究顯示由于對于ES細(xì)胞的MNTF處理，特異性SH2結(jié)構(gòu)域與IR(關(guān)于PI3激酶的p85亞單位)的結(jié)合。實施例5還顯示阻斷IGF-1R對MNTF產(chǎn)生運動神經(jīng)元的能力沒有影響，但阻斷IR消除了這種能力。在某些實施方案中，響應(yīng)給患者或給靶器官、組織或細(xì)胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，胰島素受體底物蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。胰島素受體底物蛋白質(zhì)(IRS-蛋白質(zhì))是胰島素和IGF起始信號的效應(yīng)子。它們共享在其N末端附近的PH和PTB結(jié)構(gòu)域，和在其C末端區(qū)域中的多個Tyr磷酸化基序。與酪氨酸-磷酸化的IRS-蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)包括PI3激酶p85、GRB2、SHP2、Nck、Crk和Fyn。IRS-1看起來主要涉及IGF信號和細(xì)胞骨架生長。IRS-2看起來是胰島素信號的重要介質(zhì)，因為遺傳去除導(dǎo)致II型糖尿病。IRS-3主要在脂細(xì)胞中表達，并且是PI3激酶的罕有地有效活化劑。IRS-4缺乏在其他IRS-蛋白質(zhì)中與SHP2結(jié)合的酪氨酸殘基。在某些實施方案中，響應(yīng)給患者或給靼器官、組織或細(xì)胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，IGF-1、IGF-II或任一的受體的蛋白質(zhì)表達或活性得到調(diào)節(jié)。IGF-I和-II通過與胰島素受體同源的IGF-I受體發(fā)信號。IGF-II受體的高親和力在信號傳導(dǎo)中不發(fā)揮直接的作用，但調(diào)控游離IGF-II的濃度。IGFs涉及骨骼生長，并且對于預(yù)防凋亡是必需的。游離IGFs的血清水平通過隔離IGF的IGF結(jié)合蛋白質(zhì)(IGFBPs)的作用保持很低。IGFBPs的過量表達可以誘導(dǎo)凋亡，推測是通過游離IGF的減少；IGFBP水平在某些癌癥中也是被改變的。IGF-1受體不象某些其他生長因子受體一樣是促有絲分裂的，但其通過胰島素受體底物(IRS)蛋白質(zhì)激活PI3激酶途徑的能力對于調(diào)節(jié)細(xì)胞存活是非常重要的。在某些實施方案中，響應(yīng)給患者或給耙器官、組織或細(xì)胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，磷脂酰肌醇3-激酶蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)負(fù)責(zé)PI(4，5)P2的肌醇環(huán)的3位的磷酸化，以產(chǎn)生存活信號所需的有效第二信使PI(3，4，5)P3，和胰島素作用。PI3激酶是由85kDa調(diào)節(jié)亞單位和110kDa催化亞單位組成的異二聚復(fù)合物。生長因子受體的酪氨酸磷酸化產(chǎn)生停泊位點用于結(jié)合受體上的p85(通過其SH2結(jié)構(gòu)域)；p85給其帶來pl10,所述pllO隨后接近于其在膜上的磷脂底物。PI3激酶還通過Ras,和異三聚的G蛋白質(zhì)的P:y亞單位得到激活。PI3激酶可被渥曼青霉素抑制，所述渥曼青霹素是用于研究PI3激酶信號途徑的有用工具。在某些實施方案中，響應(yīng)給患者或給耙器官、組織或細(xì)胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，Akt激酶蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。Akt是PI3激酶通路的主要已知效應(yīng)子。PIP3的產(chǎn)生導(dǎo)致使Akt上的Thr308磷酸化的PDK1,和使Akt上的Ser473磷酸化的另一種激酶(預(yù)期為PDK2)的活化。這些磷酸化另外激活A(yù)ktSer/Thr激酶活性，和針對這些位點中任一的磷酸化狀態(tài)特異性抗體的使用能意p未著Akt活化。Akt的活化可以通過免疫沉淀隨后為用方文射性標(biāo)記的ATP使已知底物磷酸化進行直接測量。Akt使Bad上的Serl36磷酸化，導(dǎo)致保護不受凋亡。Akt的其他底物包括GLUT4、心臟PFK2和GSK3，其通過這種磷酸化被滅活。在某些實施方案中，響應(yīng)給患者或給靶器官、組織或細(xì)胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，Bad激酶蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。Bad或"細(xì)胞死亡的Bcl-2拮抗劑"是Bcl-2家族的成員以及生存對死亡的重要調(diào)節(jié)物。非磷酸化的Bad與Bel-2和Bcl-XL成為二聚物，中和其抗凋亡活性。PI3激酶途徑的活化導(dǎo)致Akt的活化，這使Bad上的ser-136磷酸化。MAP激酶途徑使BAD上的ser-112磷酸化，并且近來，已顯示PKA使BAD上的ser-155磷酸化。磷酸化的Bad結(jié)合14-3-3蛋白質(zhì)和可能的其他因子，所述14-3-3蛋白質(zhì)和因子使Bad與其促凋亡作用隔離。使用對這些位點特異的磷酸化狀態(tài)特異性抗體的測定法充當(dāng)細(xì)胞存活通路活化的記錄。在某些實施方案中，響應(yīng)給患者或給靶器官、組織或細(xì)胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，PI(3,4,5)P3依賴性激酶蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。PI(3，4，5)P3依賴性激酶l(PDK1)是具有PH結(jié)構(gòu)域并且受PIP3強烈刺激的Ser/Thr激酶。PDK1的最佳表征的底物是Akt，所述Akt通過PDK1上的Thr308進行磷酸化，促成Akt活化。PDK1的2種同種型已得到鑒定。PDK1也被認(rèn)為在p70S6激酶的活化中起作用，并且在T細(xì)胞活化期間對于從T細(xì)胞受體到NFKB信號傳導(dǎo)是重要的。在某些實施方案中，響應(yīng)給患者或給靶器官、組織或細(xì)胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，Bax蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。與Bcl-2共享高度保守的結(jié)構(gòu)域的Bax蛋白質(zhì)，可以在線粒體的脂雙層中形成離子傳導(dǎo)通道，這通過將凋亡基因蛋白質(zhì)釋放到細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)在許多細(xì)胞的凋亡通路中起必要作用。Bax為許多涉及凋亡的疾病提供了有趣的治療靶，所述疾病例如癌癥或神經(jīng)變性病癥。在某些實施方案中，響應(yīng)給患者或給單巴器官、組織或細(xì)胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，p53基因產(chǎn)物的表達或活性得到調(diào)節(jié)。p53在所有人癌癥的大約一半中是突變的。它的基因產(chǎn)物涉及針對細(xì)胞毒性應(yīng)激的細(xì)胞應(yīng)答，并且連同pl9ARF—起i秀導(dǎo)p21Cipl的表達，以引起細(xì)胞周期停滯。此外，p53能夠通過轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄機制誘導(dǎo)凋亡。p53的氨基末端的83個氨基酸包含反式激活結(jié)構(gòu)域，以及涉及轉(zhuǎn)錄非依賴性生長抑制的區(qū)域。羧基末端區(qū)域包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其通過3種磷酸化事件，以及潛在地通過乙?；玫秸{(diào)節(jié)。在某些實施方案中，響應(yīng)給患者或給靶器官、組織或細(xì)胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，一氧化氮合酶蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。一氧化氮合酶(NOS)是二聚的，含亞鐵血紅素的酶，其產(chǎn)生一氧化氮，并且包含C末端還原酶和N末端氧合酶結(jié)構(gòu)域。NOS的3個類別包括主要在神經(jīng)元組織中表達的nNOS/NOS1/N0S1，通過炎癥刺激在巨噬細(xì)胞和某些其他細(xì)胞中可誘導(dǎo)的iN0S/NOSII/N0S2,和組成性表達的N0S的上皮形式的eN0S/N0SIII/N0S3。組成性表達的nNOS和eNOS需要Ca2+用于活性，并且通過Ca2+內(nèi)流進行調(diào)節(jié)。iNOS不依賴于Ca2+。不同同種型在許多位點上的磷酸化對蛋白質(zhì)活性具有不同的影響；某些是抑制的和某些是活化的。在某些實施方案中，響應(yīng)給患者或給靼器官、組織或細(xì)胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，糖原合酶激酶3蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。糖原合酶激酶3(GSK)不同于大多數(shù)絲氨酸/蘇氨酸激酶的地方在于它在不存在信號傳導(dǎo)途徑作用的情況下是活性的。存在2種同種型，GSK3a和GSK3P。GSK3的功能是使糖原合酶磷酸化并且從而使其滅活。胰島素作用刺激PI3激酶通路，導(dǎo)致Akt活化，這使GSK3磷酸化并且使其滅活。糖原合酶隨后迅速地去磷酸化并且被活化。其他GSK3底物包括Jun(在抑制位點上)和elF2B。通過GSK3使Tau磷酸化可能涉及阿爾茨海默氏疾病的發(fā)展。針對GSK3上的Akt位點(Ser21)的磷酸化狀態(tài)特異性抗體適合于代替測定途徑的活化狀態(tài)。在某些實施方案中，響應(yīng)給患者或給靶器官、組織或細(xì)胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，半胱天冬酶蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。涉及線蟲(C.elegans)CED-3死亡蛋白質(zhì)的半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶包含半胱天冬酶家族。所有作為通過蛋白質(zhì)水解活化的酶原被表達。就其在凋亡中的作用而言，取決于它們是通過受體群集(起始)還是通過線粒體通透性轉(zhuǎn)變(效應(yīng))得到活化，可以將半胱天冬酶再分成起始(半胱天冬酶8、9、1Q)和效應(yīng)(半胱天冬酶3、6、7)半胱天冬酶。效應(yīng)半胱天冬酶，最顯著地是半胱天冬酶3，切割眾多底物以實現(xiàn)與凋亡相關(guān)的形態(tài)學(xué)變化。在半胱天冬酶3的底物中有DFF45/ICAD，其釋放DFF的DNA酶亞單位以引起染色質(zhì)降解，以及凝溶膠蛋白、PAK2、D4GDI(所有這些都涉及細(xì)胞骨架組織)、核層纖蛋白和PARP。PARP切割的意義仍不明了，但它是關(guān)于半胱天冬酶活化的極佳標(biāo)記和正在進行的凋亡的推測。在某些實施方案中，響應(yīng)給患者或給靼器官、組織或細(xì)胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，RAS基因產(chǎn)物的表達或活性得到調(diào)節(jié)。Ras蛋白質(zhì)是小GTP結(jié)合蛋白，其與異三聚的G蛋白質(zhì)不同，在單個多肽內(nèi)包含所有GTPase和效應(yīng)子作用。存在Ras的至少3種同種型，Ki-Ras、Ha-Ras和N-Ras，具有不同的表達模式但相似的信號活性。Ras在羧基末端處進行棕櫚?；头峄蛊溴^定在膜上。在靜止細(xì)胞中，Ras裝載GDP，并且在受體的生長受體刺激之后被活化，這將Ras鳥噪呤核苷酸交換因子召募至膜的平面。交換因子與Ras蛋白質(zhì)的接近引起GDP的釋放，以及其被GTP替換。在其GTP結(jié)合形式中，Ras結(jié)合幾種蛋白質(zhì)，包括Raf、RalGDS和PI3激酶。Ras的滅活通過GTP水解發(fā)生，這極大地受到RasGAP或NF-1這2種已知的RasGTP酶活化蛋白的促進。通過使裂解物與Raf-l的Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域一起溫育可以測定Ras活化，所述Raf-l與Ras:GTP選擇性結(jié)合。干細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干(ES)細(xì)胞是培養(yǎng)的細(xì)胞，衍生自能夠無限復(fù)制的胚泡期胚胎的多能內(nèi)細(xì)胞群。一般而言，ES細(xì)胞具有分化成其他細(xì)胞的潛能(即，它們是多能的)；因此，它們可以充當(dāng)新細(xì)胞的持續(xù)來源。用于在本發(fā)明中使用的胚胎干細(xì)胞可以得自任何動物，但優(yōu)選得自哺乳動物(例如，人、馴養(yǎng)動物或商業(yè)動物)。在本發(fā)明的一個實施方案中，胚胎干細(xì)胞是鼠類胚胎干細(xì)胞。在另一個實施方案中，胚胎干細(xì)胞得自人。用于培養(yǎng)哺乳動物干細(xì)胞的合適方法是本領(lǐng)域已知的，例如，如美國專利申請?zhí)?0/362,437、10/789,266、10/789,308、10/928,805和美國專利號6,833,269中所述，所述專利全部整體引入本文。除非另有明確說明，本文所述的技術(shù)可以使用任何脊推動物物種的千細(xì)胞(例如，來自人；以及非人靈長類動物、馴養(yǎng)動物、家畜和其他非人哺乳動物的干細(xì)胞)進行實踐。在適合于在本發(fā)明中使用的干細(xì)胞中包括了衍生自在妊娠后形成的組織例如胚泡，或在妊娠期間的任何時候獲取的胎兒或胚胎組織的靈長類多能干(pPS)細(xì)胞。非限制性例子是胚胎千細(xì)胞或胚胎生殖細(xì)胞的原代培養(yǎng)物或建立的系。在某些實施方案中，使用原型"靈長類多能干細(xì)胞(pPS細(xì)胞)。pPS細(xì)胞包括衍生自在受精后任何時候的胚胎前、胚胎或胎兒組織的多能細(xì)胞。在合適的條件下，它們能夠產(chǎn)生三個胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)衍生物的幾種不同細(xì)胞類型的后代。pPS細(xì)胞包含各種類型的胚胎細(xì)胞，包括如由Thomson等人，Science282:1145(1998)描述的人胚胎干(hES)細(xì)胞；來自其他靈長類動物的胚胎干細(xì)胞，例如恒河猴干細(xì)胞(Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844,(1995))、絨猴干細(xì)胞(Thomson等人，Biol.Reprod.55:254(1996)和人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad,Sci.USA95:13726(1998)，以及本領(lǐng)域已知的其他類型的多能細(xì)胞。包括能夠產(chǎn)生所有三個胚層衍生物的后代的靈長類動物起源的任何細(xì)胞，不管它們是衍生自胚胎組織、胎兒組織還是其他來源。pPS細(xì)胞一般不衍生自惡性來源，并且優(yōu)選細(xì)胞是核型正常的。當(dāng)群體中大比例的干細(xì)胞及其衍生物顯示未分化細(xì)胞的形態(tài)特征時，pPS細(xì)胞培養(yǎng)物被描述為"未分化的"，當(dāng)與胚胎或成人起源的分化細(xì)胞比較時，所述未分化細(xì)胞是顯而易見的。未分化的pPS細(xì)胞由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地識別，并且一般在具有高核/質(zhì)比和明顯核仁的細(xì)胞集落的顯微鏡視野的2個平面中出現(xiàn)。群體內(nèi)未分化細(xì)胞的集落通常由分化的鄰近細(xì)胞圍繞這是常見的。分化的神經(jīng)細(xì)胞用于培養(yǎng)前體、部分分化和完全分化的神經(jīng)細(xì)胞的合適方法是本領(lǐng)域已知的，例如，如美國專利申請?zhí)?0/362,437、10/789,266、10/789,308、10/928，805和美國專利號6，833，269中所述的，所述專利全部整體引入本文。此外，如本文所使用的，"神經(jīng)元細(xì)胞"或"神經(jīng)元，，是神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)或神經(jīng)細(xì)胞，其一般由下述組成包含核和周圍細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞體(核周體)；幾個短的、照射狀突起(樹突)；以及于終止細(xì)枝樣分支(終樹突)，和可以具有沿著其路線伸出的分支(側(cè)突)的一個長突起(軸突)。神經(jīng)元的例子包括運動神經(jīng)元。分化的神經(jīng)細(xì)胞的表征測分化成部分或完全分化的神經(jīng)細(xì)胞的ES細(xì)胞。例如，可以就神經(jīng)元標(biāo)記例如NeuN(神經(jīng)元標(biāo)記)和/或特異性運動神經(jīng)元標(biāo)記如HB9或ChAT探測細(xì)胞培養(yǎng)物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，如本文所描述的，分化的神經(jīng)細(xì)胞是遺傳標(biāo)記的，因為它表達增強型綠色熒光蛋白(eGFP)。eGFP遺傳標(biāo)記在用于分離和/或純化分化的神經(jīng)細(xì)胞群的方法中，或在用于監(jiān)控脊髓再駐的方法中可以是特別有用的。視黃酸視黃酸(RA)或維生素A是被認(rèn)為是成形素的醛分子。RA是容易獲得的；它可以例如得自SigmaChemicalCo.(St.Louis，Mo.)。用終濃度約0.0.001-1的RA處理導(dǎo)致干細(xì)胞有效分化成神經(jīng)前體。MNTF肽如本領(lǐng)域和本發(fā)明的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，包含MNTF活性結(jié)構(gòu)域和治療性作用。本文所述的MNTF因子可以合成或重組生產(chǎn)，或從天然細(xì)胞中分離。包含本發(fā)明的MNTF肽類似物的蛋白質(zhì)或肽中的氨基酸殘基序列在本文中通過使用其常用的三字母命名法或通過其單字母命名法進行命名。這些三字母和單字母命名法的列表可以在教科書例如Biochemistry,第2版,Lehninger，A.，WorthPublishers，NewYork,N.Y.(1975)中找到。當(dāng)氨基酸序列橫向列出時，氨基末端旨在位于左端，而羧基末端旨在位于右端。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解包含各種MNTF肽類似物的肽的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)將依許多因素而變。例如，給定多肽可以作為酸性或堿性鹽或以中性形式獲得，因為在分子中發(fā)現(xiàn)可電離的羧基和氨基。因此，為了本發(fā)明的目的，保留MNTF133聚體肽的生物活性，包含WMLSAFS、FSRYAR或MLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域的任何形式的肽，意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。圖25舉例說明了依照本發(fā)明的MNTF肽的某些優(yōu)選實施方案。MNTF1-F633-聚體在美國專利No.6，309，877中，提供了具有以下氨基酸序列的多肽，所述的序列為LGTFWGDTLNCWMLSAFSRYARCLAEGHDGPTQ(SEQIDNO:1)。具有該序列的多肽在本文中被稱為MNTF133-聚體。包含該序列的重組蛋白質(zhì)與針對MNTF-1的單克隆抗體反應(yīng)，維持運動神經(jīng)元的生存力，增加神經(jīng)突的長出，減少運動神經(jīng)元細(xì)胞死亡/凋亡，并且支持運動神經(jīng)元生長和"擴展"到具有延伸的含生長錐軸突的巨大的、活性神經(jīng)元內(nèi)。MNTF133聚體通過用于在下文實施例中使用的固相合成進行合成。這種MNTF-1分子在下文中將被稱為"33聚體"。當(dāng)與低濃度的RA結(jié)合使用時，線性33-聚體誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成運動神經(jīng)元。此外，MNTF1誘導(dǎo)的ES細(xì)胞分化不受音猬信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑的阻斷。用MNTF133-聚體處理胚狀體與胰島素受體(IR)和/或胰島素樣生長因子受體(IGF-R)的自磷酸化相關(guān)，這意味著MNTF通過IR/IGF-R介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起作用。本發(fā)明公開包括MNTF1的肽類似物的用途，其中所述的MNTF1的肽類似物保持了MNTF1的能力，所述的能力為發(fā)揮神經(jīng)保護作用；促進運動神經(jīng)元的存活、保持和/或修復(fù)；或者在某些情況下，使干細(xì)胞分化形成運動神經(jīng)元。通常，用于本文所述用途的MNTF肽類似物的長度為6至33個氨基酸，并且包含與SEQIDNO:1的氨基酸殘基12至18相應(yīng)的WMLSAFS結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:3);或者與SEQIDNO:1的氨基酸殘基17至22相應(yīng)的FSRYAR結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:2)。此外，某些實施方案的MNTF肽類似物包括含有所述活性結(jié)構(gòu)域的、SEQIDNO:1的6至33個連續(xù)氨基酸殘基片段(SEQIDNO:2或3)。在備選實施方案中，通過BLAST分析測定，運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子肽類似物的氨基酸序列與SEQIDNO:4所示的IO個連續(xù)氨基酸殘基,與SEQIDNO:4所示的IO個連續(xù)氨基酸殘基的同一性為至少70%,與SEQIDNO:4所示的10個連續(xù)氨基酸殘基的同一性為至少80%,以及與SEQIDNO:4所示的10個連續(xù)氨基酸殘基的同一性為至少90%。為了比較多肽序列與相應(yīng)的SEQIDNO:l片段，可以使用可通過美國國立生物信息中心(在萬維網(wǎng)上ncbi.nlm.nih.gov處)公開獲得的BLAST程序進行序列的總體比對。在進行總體比對前，可以將SEQIDNO:l提交給GenBank。對于總體比對可以使用由美國國立生物信息中心提供的缺省參數(shù)。10-聚體在一個實施方案中，提供了一種具有以下氨基酸序列的肽MLSAFSRYAR(SEQIDNO:4)，其與SEQIDNO:1所示的氨基酸殘基13-22相對應(yīng)。示例性的MNTF片段可以包含WMLSAFS結(jié)構(gòu)域的大部分以及完整的FSRYAR結(jié)構(gòu)域。該片段及其變體保留了MNTF1的能力，所述的能力為發(fā)揮神經(jīng)保護作用；促進運動神經(jīng)元的存活、保持和/或修復(fù)；或者在某些情況下，使干細(xì)胞分化形成運動神經(jīng)元。MNTF10聚體在低至0.01Mg/ml的濃度時在體外刺激胚胎干細(xì)胞分化成運動神經(jīng)元方面至少與全長MNTF33聚體一樣有效(參見圖2)。此外，MNTF10聚體在增強干細(xì)胞衍生的運動神經(jīng)元的存活方面幾乎與MNTF33聚體一樣有效。MNTF-l分子的這個部分在下文中將被稱為"IO聚體"。6-聚體及類似物在另一實施方案中，提供了具有以下氨基酸序列的肽FSRYAR(SEQIDNO:2)，其與SEQIDNO:1所示的氨基酸殘基17-22相對應(yīng)。該片段及其變體保留了MNTF1的能力，所述的能力為發(fā)揮神經(jīng)保護作用；促進運動神經(jīng)元(包括干細(xì)胞衍生的運動神經(jīng)元)的存活、保持和/或修復(fù)。這一部分MNTF-l分子在下文中被稱為"6聚體"。在某些實施方案中，MNTF肽類似物可以包含6-聚體肽的功能類似物的序列。7-聚體在另一實施方案中，提供了具有以下氨基酸序列的肽WMLSAFS(SEQIDNO:3)，其與SEQIDNO:1所示的氨基酸殘基12-18相對應(yīng)。MNTF1的這種7個氨基酸片段與FSRYAR結(jié)構(gòu)域的FS殘基交疊。該片段及其變體保留了MNTF1的能力，所述的能力為發(fā)揮神經(jīng)保護作用；促進運動神經(jīng)元(包括干細(xì)胞衍生的運動神經(jīng)元)的存活、保持和/或修復(fù)。這一部分MNTF-1分子在下文中被稱為"7聚體"。ll-聚體在另一實施方案中，提供了具有以下氨基酸序列的肽FSRYARCLAEG(SEQIDNO:5)，其與SEQIDNO:1所示的氨基酸殘基17-27相對應(yīng)。MNTF1ll-聚體包含F(xiàn)SRYAR結(jié)構(gòu)域。該片段及其變體保留了MNTF1的能力，所述的能力為發(fā)揮神經(jīng)保護作用；促進運動神經(jīng)元(包括千細(xì)胞衍生的運動神經(jīng)元)的存活、保持和/或修復(fù)。這一部分MNTF-l分子在下文中被稱為"ll聚體"。21-聚體在另一實施方案中，提供了具有以下氨基酸序列的肽MLSAFSRYARCLAEGHDGPTQ(SEQIDNO:6)，其與SEQIDNO:1所示的氨基酸殘基13至33相對應(yīng)。MNTF121-聚體包含"WMLSAFS"結(jié)構(gòu)域的大部分以及完整的FSRYAR結(jié)構(gòu)域。該片段及其變體保留了MNTF1的能力，所述的能力為發(fā)揮神經(jīng)保護作用；促進運動神經(jīng)元(包括干細(xì)胞衍生的運動神經(jīng)元)的存活、保持和/或修復(fù)。這一部分MNTF-1分子在下文中被稱為"21聚體"。MNTF肽類似物應(yīng)當(dāng)理解本文所述的技術(shù)包括其中一個或多個氨基酸替換為其他氨基酸的肽類似物的使用。在一個優(yōu)選的備選方案中，運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子肽類似物包含針對SEQIDNO:1的6-32個連續(xù)氨基酸殘基的片段的一個或多個保守氨基酸置換。MNTF肽類似物可以是MNTF1肽的改變形式，條件當(dāng)然一般是該肽的必需活性基本上保持不變。如本文所使用的，術(shù)語"改變的形式"指已進行處理以改變其天然存在的結(jié)構(gòu)的肽。改變的形式可以通過下述進行制備，例如通過MNTF1肽片段的共價修飾，通過使MNTF1肽片段與不溶性支持基質(zhì)交聯(lián)，或通過使MNTF1肽片段與載體蛋白交聯(lián)。MNTF1肽類似物可以是在抗原上與MNTF1肽片段相關(guān)的肽片段。在抗原上相關(guān)的2種肽顯示免疫交叉反應(yīng)性。例如，針對第一種肽的抗體同樣識別第二種肽。MNTF1肽類似物可以是包含與異源蛋白附著的MNTF1肽片段的融合蛋白。異源蛋白具有與MNTF1肽片段基本上不相似的氨基酸序列。異源蛋白可以與MNTF1肽片段的N末端或C末端融合。融合蛋白可以包括但不限于，聚-His融合物、MYC-標(biāo)記的融合物、Ig融合物和酶促融合蛋白例如(3-半乳糖苷酶融合物。此類融合蛋白，特別是聚-His融合物可以促進重組MNTF1肽片段的純化。MNTF肽的擬肽也包括在本文所述技術(shù)的范圍內(nèi)，并且可以充當(dāng)藥物用于調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生存力和生長，通過例如阻斷包含WMLSAFS、FSRYAR或者SEQIDNO:1-142中所述的任何其他序列或功能結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的功能。擬肽在制藥工業(yè)中通常理解為包括具有與模擬的肽的那些類似性質(zhì)的非肽藥物。擬肽設(shè)計的原則和實踐是本領(lǐng)域已知的，并且在例如FauchereJ.,Adv.DrugRes.15:29(1986)'，和Evans等人，J.Med.Chem.30:1229(1987)中得到描述。具有對于治療上有用的肽的結(jié)構(gòu)相似性的擬肽可以用于產(chǎn)生等價的治療或預(yù)防效果。一般地，此類擬肽具有任選地被鍵替換的一個或多個肽鍵，這可以改變所需性質(zhì)例如對體內(nèi)化學(xué)破壞的抵抗力。此類鍵可以包括一CH2NH—、—CH2S—、—CH2—CH「-、—CH-CH--、—C0CH2—、—CH(OH)CH2—和一CH2S0—。擬肽可以顯示出增強的藥理性質(zhì)(生物半衰期、吸收率等)，不同的特異性，增加的穩(wěn)定性，生產(chǎn)經(jīng)濟，減少抗原性等，這使得它們能夠作為特別需要的治療劑使用。基于建模(例如在實驗上測定的)肽結(jié)構(gòu)，使用推理性藥物設(shè)計的已知方法，可以由技術(shù)人員進行WMLSAFS、FSRYAR或其他類似結(jié)構(gòu)域模擬物或結(jié)合分子的推理性設(shè)計。推理性藥物設(shè)計的目的是生產(chǎn)生物活性多肽或乾化合物的結(jié)構(gòu)類似物。通過制備此類類似物，可以形成藥物，所述藥物比天然分子更有活性或穩(wěn)定，具有針對改變的不同敏感性，或可以影響各種其他分子的功能。在一種方法中，將產(chǎn)生關(guān)于靶分子或其片段的三維結(jié)構(gòu)。這可以通過X射線晶體學(xué)，計算機建模或通過2種方法的組合來完成。制備方法應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的MNTF肽組合物可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法來制備，包括但不限于，通過固相合成的化學(xué)合成和通過HPLC純化使其不含化學(xué)反應(yīng)的其他產(chǎn)物，或通過在體外翻譯系統(tǒng)或在活細(xì)胞中表達編碼包含本發(fā)明的MNTF肽的肽或多肽的核酸序列(例如，DNA序列)生產(chǎn)。優(yōu)選地組合物的MNTF肽得到分離并進行廣泛透析，以去除一種或多種不希望有的小分子量分子，和/或進行凍干以更容易配制到所需媒介物內(nèi)。應(yīng)進一步理解在MNTF肽組分中制備的存在的任何另外的氨基酸、突變、化學(xué)修飾等，將優(yōu)選地基本上不干擾MNTF停泊序列的受體識別。對應(yīng)MNTF1的一種或多種片段的肽或多肽長度一般應(yīng)為至少6個氨基酸殘基，并且可以包含多至約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約15個、約20個或約30個殘基左右。肽序列可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法進行合成，例如，使用自動化肽合成才幾器的肽合成，例如可從AppliedBiosystems(FosterCity,CA)獲得的那些。本文所述技術(shù)包括衍生自(SEQIDNO:1)和(SEQIDNO:6)的環(huán)狀肽的合成和使用。內(nèi)，所述有機衍生劑能夠與選擇的側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)。^使用有機衍生劑的多肽共價修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，可以使半胱氨酰殘基與cc-卣乙酸鹽(haloacetates)(和相應(yīng)的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)，以產(chǎn)生羧甲基或羧氨基甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。組氨酰殘基可以通過在pH5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應(yīng)，或在pH6下在1M二甲基胂酸鈉中與對溴苯酰甲基溴反應(yīng)進行衍生。賴氨酰和氨基末端殘基可以與琥珀酸或其他羧酸酐進行反應(yīng)。精氨酰殘基可以通過與一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)進行修飾，在所述常規(guī)試劑中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己胺二酮和茚三酮。通過與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)可以將光譜標(biāo)記引入酪氨酰殘基內(nèi)；最常見地，使用N-乙酰咪唑(acetylimidizol)和四硝基甲烷以分別形成0-乙酰酪氨酰種類和3-硝基衍生物。羧基側(cè)基(天冬氨?；蚬劝滨?可以通過與碳化二亞胺(R，-N-C-N-R，)反應(yīng)進行選擇性修飾，例如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳化二亞胺或l-乙基-3(4氮鑰4，4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，通過與銨離子反應(yīng)將天冬氨酰和谷氨酰殘基轉(zhuǎn)變成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基可以脫去酰胺基為相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的ot-氨基的曱基化(T.E.Creighton，1983，Proteins:Structure和MoleculeProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,笫79-86頁)，N末端胺的乙?；?，和在某些情況下C末端羧基的酰胺化。本文所述的MNTF肽類似物可以以游離形式或與載體分子(例如蛋白質(zhì)或固體顆粒，以及與標(biāo)記物或示蹤物(例如生物素或異石克氰酸熒光素)連接的經(jīng)修飾的肽)連接的形式而用于檢測及檢測試劑盒中。使MNTF1肽片段與水不溶性支持基質(zhì)交聯(lián)可以用本領(lǐng)域眾所周知的雙功能劑來進行，包括l，l二(重氮乙?；?2苯乙烷，戊二酪，N-羥基琥珀酰亞胺酯，例如，與4-疊氮水楊酸的酯，同雙功能酰亞胺酯，包括二琥珀酰亞胺酯例如3，3，-二巰基二(琥珀酰亞胺基丙酸酯)，和雙功能馬來酰亞胺例如二-N-馬來酰亞胺-1，8-辛烷。雙功能劑例如甲基-3-[(對疊氮苯基)二疏代]亞胺丙酯產(chǎn)生在光的存在下能夠形成交聯(lián)的光可激活的中間產(chǎn)物。備選地，可以使用反應(yīng)性水不溶性基質(zhì)例如溴化氰活化的碳水化合物用于蛋白質(zhì)固定化?？梢允褂帽疚乃龅碾p功能試劑來進行MNTF1肽片段與第二種蛋白質(zhì)(包括第二種MNTF1肽片段)的交聯(lián)。在另一種備選的情況中，存在有插入的間隔物，例如二巰基或二氨基，或者多個氨基酸殘基(例如甘氨酸)。所述的間隔物還可以為同源的或異源的雙功能交聯(lián)劑，例如異源雙功能交聯(lián)劑N-(4-羧基-環(huán)己基-甲基)-馬來酰亞胺?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)制備較長的肽或多肽，例如融合蛋白。例如，編碼MNTF1肽片段的DNA片段可以克隆在已包含異源蛋白的商購可得的表達栽體中，而結(jié)果是在框內(nèi)與異源蛋白融合的MNTF1肽片段。在某些實施方案中，編碼MNTF1肽的核酸和/或本文所述的成分可如，在某些實施方案中，編碼MNTF1肽的核酸是例如重組細(xì)胞中的栽體的組分?？梢员磉_核酸以生產(chǎn)包含MNTF1肽序列的肽或多肽。肽或多肽可以從細(xì)胞中分泌出來，或作為細(xì)胞的部分，或在細(xì)胞內(nèi)?；衔锏暮Y選在另一個實施方案中，鑒定了改變MNTF肽或涉及MNTF肽細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)的表達水平的化合物。在某些實施方案中，這些化合物被靼向用于治療本文描述的各種神經(jīng)病癥。通過本文描述和本領(lǐng)域已知的使用神經(jīng)元細(xì)胞的后續(xù)測試，可以區(qū)別神經(jīng)保護的激動劑和拮抗劑，并且可以評估化合物的功效。基于其在領(lǐng)域公認(rèn)的動物細(xì)胞培養(yǎng)疾病和紊亂模型系統(tǒng)中治療神經(jīng)元紊亂的能力，可以進一步區(qū)別通過本文描述的篩選搮作鑒定的化合物，并且可以評估化合物的功效。在測試化合物和天然提取物文庫的許多藥物篩選測定法中，需要高通量測定法以便使給定時間段內(nèi)檢查的化合物數(shù)目最大。在無細(xì)胞系統(tǒng)中進行，例如可以用純化或部分純化的蛋白質(zhì)獲得的測定法，作為"初步"篩選通常是優(yōu)選的，因為它們可以被產(chǎn)生以允許快速發(fā)展和相對容易的檢測由測試化合物介導(dǎo)的分子靶中的改變。此外，測試化合物的細(xì)胞毒性和/或生物利用度的效應(yīng)在體外系統(tǒng)中一般是可以被忽略的，相反該測定法主要集中于藥物對分子靶的影響，如可以在與受體蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力的改變中表現(xiàn)的。因此在另一個方面，提供了鑒定用于促進運動神經(jīng)元的生長或存活的化合物的方法。在一個實施方案中，該方法包括下述步驟i)制備包含候選化合物的樣品，ii)使細(xì)胞與所述樣品接觸，iii)測定涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的化合物的表達或活性是否得到調(diào)節(jié)，和iv)測定樣品是否能夠促進運動神經(jīng)元的生長或存活。在某些實施方案中，該方法進一步包括測定包含候選化合物的樣品是否在體外或體內(nèi)刺激胰島素受體的Tyr972和Tyrl162/1163的自磷酸化。在其他實施方案中，該方法進一步包括測定包含候選化合物的樣品是否調(diào)控MNTF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在其他實施方案中，該方法進一步包括測定包含候選化合物的樣品是否調(diào)節(jié)選自下述的一種或多種蛋白質(zhì)的表達或活性胰島素受體、IGF-1受體、IGF-2受體、Shh、Akt、Bad(bcl-2的細(xì)胞死亡拮抗劑)、PI(3,4，5)P3依賴性激酶1(PDK1)、Bax、p53基因產(chǎn)物、pp60-Src、JAK2、一氧化氮合酶(NOS)、糖原合酶激酶3(GSK)、半胱天冬酶、PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)和Ras。在其他實施方案中，該方法進一步包括測定包含候選化合物的樣品是否受MNTF類似物的調(diào)控，或備選地調(diào)控MNTF類似物(例如活性、表達等)。在另一個方面，本發(fā)明提供了通過施用由本文描述的篩選操作鑒定的化合物促進運動神經(jīng)元生長或存活或用于治療神經(jīng)元病癥的方法。在示例性篩選測定法中，目的化合物在其中一般能夠結(jié)合MNTF肽的條件下與包括MNTF結(jié)合蛋白質(zhì)(例如，表達MNTF肽受體的細(xì)胞)和MNTF肽的混合物接觸。隨后向混合物中加入包含測試化合物的組合物。受體/MNTF肽復(fù)合物的檢測和量化提供了用于測定測試化合物在抑制(或加強)受體蛋白質(zhì)和MNTF肽之間的復(fù)合物形成方面的功效的方法。還可以執(zhí)行對照測定法以提供用于比較的基線，其中向受體蛋白質(zhì)中添加分離的和純化的MNTF肽，并且在不存在測試化合物的情況下定量受體/MNTF肽復(fù)合物的形成。例如，復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)可以使用例如可檢測標(biāo)記的蛋白質(zhì)例如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或酶促標(biāo)記的MNTF肽，通過免疫測定法或通過色譜檢測進行定量。對于無細(xì)胞測定法，一般將希望使MNTF肽或MNTF肽結(jié)合蛋白固定，以促進受體/MNTF肽復(fù)合物與未復(fù)合形式的蛋白質(zhì)之一的分離，以及調(diào)節(jié)測定法的自動化。例如可以提供添加允許蛋白質(zhì)與基質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。例如，谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶/受體(GST/受體)融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽瓊脂糖珠(SigmaChemical,St.Louis,Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，其隨后與MNTF肽例如35S標(biāo)記的MNTF肽和測試化合物組合，并且在有助于復(fù)合物形成的條件下進行溫育，例如在對于鹽和pH的生理條件下，盡管略微更嚴(yán)格的條件可以是希望的。溫育后，洗滌珠以去除任何未結(jié)合的MNTF肽，并且直接地或在受體/猬復(fù)合物解離后的上清液中測定基質(zhì)珠結(jié)合的放射性標(biāo)記(例如，置于閃爍體中的珠)。備選地，復(fù)合物可以與珠解離，通過SDS-PAGE凝膠分開，并且使用標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)定量來自凝膠的在珠中發(fā)現(xiàn)的MNTF肽水平。用于使蛋白質(zhì)固定在基質(zhì)上的其他技術(shù)也可用于在受試測定法中使用。例如，MNTF肽的可溶性部分可以使用生物素和鏈霉親和素的綴合進行固定。例如，使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)(例如，生物素化試劑盒，PierceChemicals,Rockford，111.)生物素化的受體可以從生物素-NHS(N-幾基-琥珀酰亞胺)進行制備，并且固定在鏈霉親和素包被的96孔板(PierceChemical)的孔中。備選地，與MNTF肽反應(yīng)但不干擾猬結(jié)合的抗體可以衍生至平板的孔，并且受體通過抗體綴合捕獲在孔中。如上所述，MNTF肽和測試化合物的制劑在平板的受體呈遞孔中進行溫育，并且可以定量孔中捕獲的受體/猬復(fù)合物的量。用于檢測此類復(fù)合物的示例性方法，除了上文描述的關(guān)于GST-固定復(fù)合物的那些外，包括使用與MNTF肽反應(yīng)，或與受體蛋白質(zhì)反應(yīng)并且竟?fàn)幗Y(jié)合MNTF肽的抗體的復(fù)合物的免疫檢測；以及依賴于與MNTF肽相關(guān)的酶促活性檢測的酶聯(lián)測定法。在后者的情況下，酶可以與MNTF肽進行化學(xué)綴合或作為含MNTF肽的融合蛋白提供。為了舉例說明，MNTF肽可以與堿性磷酸酶進行化學(xué)交聯(lián)或遺傳融合，并且復(fù)合物中捕獲的MNTF肽的量可以使用酶的生色底物例如對硝基磷酸苯酯進行評估。同樣地，可以提供包含MNTF肽和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白，并且通過使用l-氯-2，4二硝基苯檢測GST活性定量復(fù)合物形成(Habig等人，JBiolChem，249:7130(1974))。對于用于定量復(fù)合物中捕獲的抗體之一的免疫檢測，可以使用針對蛋白質(zhì)的抗體，例如抗MNTF肽抗體。備選地，復(fù)合物中待檢測的蛋白質(zhì)可以以融合蛋白的形式"附加表位，，，除了MNTF肽或MNTF肽序列外，所述融合蛋白還包括對于其可容易獲得抗體的笫二種多肽(例如，來自商業(yè)來源)。例如，使用針對GST部分的抗體，上文描述的GST融合蛋白也可以用于結(jié)合的定量。其他有用的附加表位包括myc-表位(例如，參見Ellison等人，JBiolChem266:21150-21157(1991))，其包括來自c-myc的10殘基序歹'J，以及pFLAG系統(tǒng)(InternationalBiotechnologies,Inc.)或pEZZ-蛋白A系統(tǒng)(Pharamacia，N.J.)。組合物藥物組合物可以包含本發(fā)明公開的一種或多種MNTF肽類似物以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑和/或栽體。合適的載體/稀釋劑是本領(lǐng)域公知的，其包括鹽水或其他無菌水性介質(zhì)，任選地包含其他成分，例如緩沖鹽和防腐劑，或者糖、淀粉、鹽或它們的混合物。包含MNTF肽的組合物可以以適于施用方案和/或患者需要的任何合適的形式提供于應(yīng)用中。本文所述的技術(shù)包括培養(yǎng)基，其可用于建立和繁殖干細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、分化的神經(jīng)細(xì)胞以及干細(xì)胞衍生的運動神經(jīng)元。所述的培養(yǎng)I、，、一、本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基理想地補充有成形素和/或生長因子，并且根據(jù)需要培養(yǎng)的個別細(xì)胞類型進行優(yōu)化。此類補充和優(yōu)化在本領(lǐng)域的普通技術(shù)內(nèi)。在某些優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以補充下述近似水平(或在1個有效數(shù)字內(nèi))的任何或所有下述成形素和/或生長因子的0.001-1RA，0.001-1Shh或Shh激動劑，和/或0.01一250pg/ml的一種或多種MNTF肽類似物。作為任選成分，本發(fā)明的藥物制劑可以包括藥學(xué)上可接受的栽體、稀釋劑、穩(wěn)定或乳化劑、和本領(lǐng)域可獲得的類型的鹽。此類物質(zhì)的例子包括標(biāo)準(zhǔn)鹽水溶液例如生理學(xué)緩沖鹽水溶液和水。在本發(fā)明的藥物可接受的緩沖鹽水溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液pH7.0-8.0。合適的藥學(xué)載體包括但不限于，無菌水，鹽溶液(例如林格氏溶液)，醇，聚乙烯二醇，明膠，碳水化合物例如乳糖、直鏈淀粉或淀粉，硬脂酸鎂，滑石，硅酸，粘性石蠟，脂肪酸酯，幾甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮等。藥物制劑可以進行滅菌并且需要時和不與活性化合物有害地反應(yīng)的助劑混合，所述助劑例如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑和/或芳香族物質(zhì)等。需要時它們還可以與其他活性物質(zhì)例如酶抑制劑組合，以減少代謝性降解。本文提供的化合物可以在藥物組合物中進行配制，除了肽外所述藥物組合物還可以包括藥學(xué)上可接受的栽體、增稠劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、中性或陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)復(fù)合物、脂質(zhì)體、滲透增強劑、載體化合物和其他藥學(xué)上可接受的栽體或賦形劑等。藥物組合物一般配制用于治療用途施用。藥物組合物還可以包括一種或多種活性成分例如干擾素、抗微生物劑、抗炎劑、麻醉劑等。用于腸胃外施用的制劑可以包括無菌水溶液，所述無菌水溶液還可以包含緩沖劑、脂質(zhì)體、稀釋劑和其他合適的添加劑。包含本文提供的肽的藥物組合物可以包括滲透增強劑，以便增強肽的消化遞送。穿透增強劑可以分類為屬于5個廣泛類別之一，即，脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、表面活性劑和非表面活性劑(Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems8,91-192(1991);Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems7,1-33(1990))?？梢园▉碜赃@些廣泛類別中的一個或多個的一種或多種滲透增強劑。充當(dāng)滲透增強劑的各種脂肪酸及其衍生物包括例如，油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、荒麻油酸酯(recinleate)、甘油單油酸酯(ak.a.l-單油?；?rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、甘油基l-單癸酸酯、1-十二烷基環(huán)庚烷-2-酮、?；舛緣A、酰基膽堿、單和雙甘油酯及其生理學(xué)可接受的鹽(即油酸鹽、月桂酸鹽、癸酸鹽、肉豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、亞油酸鹽等)。Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems笫92頁(1991)'，Muranishi，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems7,l(1990);El-Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.44,651-654(1992))。膽汁的生理學(xué)作用包括促進脂質(zhì)和脂溶性維生素的分散和吸收(Brunton，Chapter38In:Goodman&Gilman，sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第9版，Hardman等人McGraw-Hill,NewYork,N.Y.,第934-935頁(1996))。各種天然膽汁鹽及其合成衍生物充當(dāng)滲透增強劑。因此，術(shù)語"膽汁鹽"包括膽汁的任何天然組分及其任何合成衍生物?？梢允褂冒环N或多種滲透增強劑的復(fù)合制劑。例如，膽汁鹽可以與脂肪酸組合使用以制備復(fù)合制劑。螯合劑包括但不限于，乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如，水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鹽和同香蘭草鹽)、膠原的N-?；苌?、月桂醇聚醚和p-二酮的N氨基?；苌?烯胺)[Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems第92頁(1991);Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems7，1-33(1990);Buur等人，J.ControlRel.14，43-51(1990))。螯合劑還具有充當(dāng)DNA酶抑制劑的另外優(yōu)點。表面活性劑包括例如月桂硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂醚和聚氧乙烯-20-鯨蠟醚(Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems第92頁(1991));和全氟化合物乳狀液，例如60FC-43(Takahashi等人，J.Pharm.Ph纖col.40,252-257(1988))。非表面活性劑包括例如，未飽和的環(huán)狀脲、1-烷基-和1-烯基氮雜環(huán)-坑酉同4汙生物(Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems第92頁(1991));和非甾體抗炎劑例如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和保泰松(Yamashita等人，J.Pharm.Pharmacol.39,621-626(1987))。一般的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于，結(jié)合劑(例如，預(yù)膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基曱基纖維素等)；填充劑(例如，乳糖和其他糖、微晶纖維素、膠質(zhì)、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、硅石、二氧化硅膠體、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽、氫化植物油、玉米淀粉、聚乙烯二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等)；崩解劑(例如，淀粉、淀粉羥乙酸拿等)；或濕潤劑(例如，月桂磷酸鈉等)。本文提供的組合物可以另外包含以其領(lǐng)域確定的使用水平的，在藥物組合物中通常發(fā)現(xiàn)的其他附屬組分。因此，例如，組合物可以包含另外的相容性藥學(xué)活性材料，例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或的^外材^:例如染料、調(diào)味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，當(dāng)添加時此類材料不應(yīng)不適當(dāng)?shù)馗蓴_本文提供的組合物組分的生物活性。不管化合物通過其引入患者內(nèi)的方法，膠態(tài)分散系統(tǒng)可以用作遞送媒介物，以增強肽的體內(nèi)穩(wěn)定性和/或使肽耙向特定器官、組織或細(xì)胞類型。膠態(tài)分散系統(tǒng)包括但不限于，大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球體、珠和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)包括水包油乳狀液、微膠粒、混合微膠粒、脂質(zhì)體和未表征結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)肽復(fù)合物。優(yōu)選的膠態(tài)分散系統(tǒng)是多個脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是由脂質(zhì)構(gòu)成以雙層構(gòu)型排列的，具有由一個或多個外層圍繞的水核心的孩吏觀球體(一般參見，Chonn等人，CurrentOp.Biotech.6，698-708(1995))。在某些實施方案中，MNTF肽和MNTF類似物可以摻入生物分布導(dǎo)向部分內(nèi)，或與生物分布導(dǎo)向部分結(jié)合使用，所述生物分布導(dǎo)向部分包括一種或多種聚合物，以指導(dǎo)MNTF肽或MNTF類似物或本文提供的其他化合物的生物分布至所需耙的附近，或允許其持續(xù)釋放?；钚詣┌ɡ?，用于增加治療功效、用于優(yōu)化生物分布和生物利用度、用于減少組織損傷、用于促進愈合、或用于增加患者舒適的化合物；示例性活性劑包括血管活性劑、麻醉劑、用于缺血的治療劑、生長因子和細(xì)胞因子。備選地，微顆?；蚣{米顆粒聚合珠劑型可以在本文提供的組合物中使用。本文提供的化合物可以與活性劑組合使用，或連同與其附著的許多配體或抗配體分子一起包裹在顆粒劑型中。以這種方式，單獨地或與其他活性劑組合的MNTF肽和MNTF類似物以及本文提供的其他化合物隨著時間在那個位點處釋放，以提供持續(xù)的治療益處。相對于本發(fā)明實踐中有用的其他活性劑，例如生長因子、細(xì)胞西子等，持續(xù)釋放劑型也是有用的?；钚詣谋景l(fā)明的顆粒劑型中的釋放可以由于擴散和顆粒基質(zhì)腐蝕而發(fā)生。生物降解率直接影響活性劑釋放動力學(xué)。在某些實施方案中，本發(fā)明的MNTF肽、MNTF類似物和化合物的控制釋放腸胃外制劑可以制備為植入劑、油性注射劑或作為顆粒系統(tǒng)。顆粒系統(tǒng)包括微球體、微粒、微膠囊、納米膠嚢、納米球和納米微粒。微膠嚢包含治療蛋白質(zhì)作為中央核心。在微球體中，治療劑分散在整個顆粒中。脂質(zhì)體可以用于控制釋放以及誘陷藥物的藥物靶向。在某些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物，包括MNTF肽和MNTF類似物可以地方性地、局部地、經(jīng)鼻、經(jīng)口、胃腸道、支氣管內(nèi)、膀胱內(nèi)、陰道內(nèi)施用到子宮內(nèi)，皮下、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)周、關(guān)節(jié)內(nèi)施用到腦脊髓液(ICSF)內(nèi)、腦組織內(nèi)(例如顱內(nèi)施用)、脊髓內(nèi)、創(chuàng)傷內(nèi)、腹膜內(nèi)或胸膜內(nèi)，或全身地，例如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肝門內(nèi)或直接施用到器官內(nèi)。如本領(lǐng)域已知的，各種導(dǎo)管和遞送途徑可以用于達到冠狀動脈內(nèi)遞送。例如，適合于在本發(fā)明中使用的各種通用導(dǎo)管以及改良導(dǎo)管可從商業(yè)供應(yīng)商例如AdvancedCardiovascularSystems(ACS)、TargetTherapeutics和Cordis獲得。同樣地，當(dāng)通過直接注射到冠狀動脈內(nèi)(這是目前最優(yōu)選的)來完成給心肌的遞送時，如本領(lǐng)域已知的，許多方法可用于將導(dǎo)管引入冠狀動脈內(nèi)。作為舉例說明，導(dǎo)管可以方便地引入股動脈內(nèi)并且向后穿過髂動脈和腹主動脈并且進入冠狀動脈內(nèi)。備選地，導(dǎo)管可以首先引入臂或頸動脈內(nèi)并且向后穿過至冠狀動脈。這些和其他技術(shù)的詳細(xì)描述可以在本領(lǐng)域中找到(參見，例如，Topol，EJ(編輯)，TheTextbookofInterventionalCardiology,第2版(W.B.SaundersCo.1994);Rutherford,RB,VascularSurgery,第3版(W.B.SaundersCo.1989);WyngaardenJB等人(編輯)，TheCecilTextbookofMedicine,第19版(W,B.Saunders,1992);和Sabiston，D,TheTextbookofSurgery,第14版(W.B.SaundersCo.1991))。本文提供的化合物可以腸胃外(parentally)施用。有時優(yōu)選某些化合物與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合，以產(chǎn)生藥物組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。組合物可以配制用于腸胃外、肌內(nèi)、大腦內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或經(jīng)皮施用。施用的制劑可以包含此類試劑。這些試劑的例子包括陽離子試劑(例如磷酸《丐和DEAE-葡聚糖)和lipofectants(例如lipofectamTM和transfectamTM)。用于局部施用的制劑可以包括經(jīng)皮貼劑、軟骨、洗劑、乳青、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)藥學(xué)載體，水、粉末或油基，增稠劑等可能是必需或希望的。包被手套、避孕套等也可能是有用的。用于口部施用的組合物包括粉劑或顆粒劑、在水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠嚢、嚢劑或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是希望的。用于腸胃外施用的組合物可以包括無菌水溶液，其還可以包含緩沖劑、稀釋劑和其他合適的添加劑。在某些情況下，用肽與其他常規(guī)治療形式結(jié)合治療患者可能是更有效的，以便增加治療方案的功效。如本文所使用的，術(shù)語"治療方案"意欲包含治療、姑息和預(yù)防形式。給藥劑量可以取決于許多因素，包括待治療疾病狀態(tài)的嚴(yán)重度和應(yīng)答性，并且療程從數(shù)天持續(xù)至數(shù)月，或直至實現(xiàn)治愈或達到疾病狀態(tài)減少。本文提供的化合物的毒性和治療功效可以通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)操作在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏羞M行確定。例如，為了確定LD5。(對50%群體致死的劑量)和ED5。(在50%群體中治療上有效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比是治療指數(shù)，并且它可以表示為比LD5。/ED5。。顯示出大治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。盡管可以使用顯示出有毒副作用的化合物，但應(yīng)慎重設(shè)計使此類化合物乾向受累組織位點的遞送系統(tǒng)，以便使對未感染細(xì)胞的潛在損害降到最低，并且從而減少副作用。劑量范圍配制;使用。此類化合物的劑量優(yōu):地位于循環(huán)濃度范圍內(nèi):所述循環(huán)濃度范圍包括具有很少毒性或沒有毒性的ED5。。取決于使用的劑型和利用的施用途徑，劑量可以在這個范圍內(nèi)變化。對于在本發(fā)明的方法中使用的任何化合物，治療有效劑量可以最初由細(xì)胞培養(yǎng)測定法進行評估。劑量可以在動物模型中進行配制，以達到包括如在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的IC5。(即，達到癥狀的半最大抑制的測試化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。此類信息可以用于更精確地確定在人中的有用劑量。在血漿中的水平可以例如通過高效液相層析進行測量。給藥方案可以由患者體內(nèi)的藥物蓄積測量進行計算。劑量可以依單個化合物包括MNTF肽和MNTF類似物的相對功效而變，并且一般可以基于發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)動物模型中有效的EC50進行評估。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，優(yōu)選劑量將以MNTF肽如何和何處施用(例如體外、體內(nèi)、局部地、全身地等)而變。例如，在一個方面，可以施用MNTF肽和MNTF類似物，以在靶位點處(例如在ES千細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)中)達到終濃度約0.01微克/毫升(jag/ml)-約lmg/ml、約0.1pg/mL-約50mg/mL、約0.1mg/mL一約150Mg/mL、約liag/mL—約200jag/mL、和約O.lMg/mL-約500lag/mL，包括在這些范圍內(nèi)的任何范圍。取決于施用途徑，備選的合適劑量可以例如從約0.lug到多至約1克的總劑量不同。關(guān)于具體劑量和遞送方法的指導(dǎo)在文獻中提供并且對于本領(lǐng)域從業(yè)者一般是可得到的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將利用對于核苷酸與對于蛋白質(zhì)或其抑制劑不同的制劑。類似地，本文提供的多核苷酸、多肽和化合物的遞送將對具體細(xì)胞、條件和位置特異。一般而言，劑量一般為O.Olmg/kg-1000mg/kg體重，和更一般地，例如，約0.1mg/kg-300mg/kg體重，并且可以每天、每周、每月或每年給予一次或多次，或甚至在2-20年的時間間隔期間給予一次或多次。在某些實施方案中，劑量可以從手術(shù)后緊接著到24小時給予，在另一個實施方案中；劑量從2小時到高達24小時給予。取決于具體制劑的半衰期和清除率，長效組合物可以每3-4天、每周或每2周進行施用。基于在體液或組織中測量的藥物停留時間和濃度，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地估計用于給藥的重復(fù)率。成功治療后，可能希望使患者經(jīng)歷維持療法以預(yù)防疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)，其中所選化合物以0.01mg/kg-IOOmg/kg體重的維持劑量施用，每天一次或多次至每20年一次。在某些病狀的治療或預(yù)防中，合適的劑量水平一般為約0.001-100mg/kg患者體重/天，其可以以單次或多次劑量施用。合適的劑量水平可以為約1-約40mg/kg/天。在某些實施方案中，本文提供的化合物，包括MNTF肽和MNTF肽類似物以這樣的量施用以達到下述體內(nèi)濃度在損害位點上約l微摩爾-約1毫摩爾、約IO微摩爾-約500微摩爾、或約30微摩爾-約300微摩爾、和約25微摩爾-約300微摩爾終濃度，并且包括在損害位點上約25微摩爾、或約160微摩爾、或約300微摩爾終濃度，并且更一般地約1微摩爾-約IOO微摩爾。在某些實施方案中，可以施用1、5、10、20、50、100、150或者200mg/kg的劑量。本文描述的化合物可以在診斷、治療、預(yù)防中、以及作為研究試劑和在試劑盒中使用。用于檢測目的化合物(例如MNTF肽和MNTF類似物)的方法供應(yīng)可以常規(guī)地完成。此類供應(yīng)可以包括酶綴合物、放射性標(biāo)記或任何其他合適的檢測系統(tǒng)。還可以制備用于檢測目的化合物存在或不存在的試劑盒。如本文所使用的，脊髓損傷可以包括由胂瘤、機械外傷和化學(xué)外傷所導(dǎo)致的損傷。相同或相似的方法被考慮用于恢復(fù)患有肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化或脊髓損傷的受試者的運動功能。在某些實施方案中，施用一種MNTF類似物還提供了預(yù)防功能。這種施用情況具有保護受試者或者處于患有肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化或脊髓損傷風(fēng)險的受試者的運動功能的作用。在某些實施方案中，施用MNTF類似物保護了MNTF通路的完整性。具體而言，用于治療(在發(fā)現(xiàn)癥狀前或發(fā)現(xiàn)癥狀后)脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)或腦缺血、亨廷頓氏疾病、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、ALS、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變的方法包括施用選自SEQIDNO:1-142中的MNTF肽類似物。在某些方面中，提供了多種組合物以及治療性處理方法，該方法包括在神經(jīng)通路受到損傷或者是在預(yù)計到發(fā)生這種損傷時，以足以維持神經(jīng)通路(包括修復(fù)損害的通路或抑制神經(jīng)通路發(fā)生額外的損傷)的濃度向受試者施用治療有效量的本文所述的MNTF類似物蛋白質(zhì)，并持續(xù)一段時間。在另一方面中，本文所述的技術(shù)包括用于保持神經(jīng)通路的組合物和治療性處理方法。這種處理方法包括在神經(jīng)通路受到損傷或者是在預(yù)計到發(fā)生這種損傷時，向所述的受試者施用刺激治療有效濃度的內(nèi)源MNTF的化合物。本文所述的多個方面和多種實施方案提供了用于保護神經(jīng)元免于法。在某些實施方案中，提供了用于刺激對損害的神經(jīng)元和神經(jīng)通路進行細(xì)胞修復(fù)(包括損害的樹突或軸突的再生)的方法、組合物和裝置。在一個方面中，本文所述的MNTF類似物可用于修復(fù)外周神經(jīng)系統(tǒng)中損害的神經(jīng)通路。特別是，MNTF可用于修復(fù)損傷的神經(jīng)通路，包括橫切的神經(jīng)纖維或者是損傷的神經(jīng)纖維。具體而言，本文所述的MNTF能夠刺激完全軸突神經(jīng)的再生，包括髓鞘的血管化和再形成。MNTF可以在處于具有生物相容性和生物吸收性的載體(其能夠保持MNTF處于損傷位點處)中的情況下而被提供于所述的位點處，并且在必要的情況下，MNTF提供了用于指導(dǎo)軸突由鄰近的位點處生長至嚴(yán)重神經(jīng)元的遠端的手段。例如，在神經(jīng)再生有待于被誘導(dǎo)越過延長的距離(例如大于lOinni)的情況下，可能需要用于指導(dǎo)軸突生長的手段。能夠提供上述功能的許多栽體是可預(yù)見的。例如，有用的載體包括基本上不溶的材料，或者按照本文所公開的方法制備的粘性溶液，包括層粘蛋白，透明質(zhì)酸或膠原，或者其他合適的、合成的、具有生物相容性的聚合物材料(例如聚乳酸、聚羥基乙酸、聚丁酸和/或它們的共聚物)。在某些實施方案中，將MNTF類似物置于其距離跨越了損害通路的神經(jīng)導(dǎo)管中。所述的導(dǎo)管起到了保護性覆蓋物和用于定向神經(jīng)突生長的物理手段的作用。可用的導(dǎo)管包括結(jié)構(gòu)可以為管狀生物相容性膜，該膜具有足以跨越有待修復(fù)的神經(jīng)間隙的維度，并且具有適于容納嚴(yán)重神經(jīng)末梢的開口。所述的膜可以由任何具有生物相容性的無刺激性材料(例如有機硅或生物相容性聚合物，如聚乙烯或聚乙烯-醋酸乙烯)構(gòu)成，其中所述的聚合物包括例如膠原、透明質(zhì)酸、聚乳酸、聚丁酸和聚羥基乙酸。在一個實施方案中，所述導(dǎo)管的外表面基本上是不可滲透的。在另一方面中，本文所述的MNTF可用于保護對抗損害，該損害與針對神經(jīng)組織最初的損傷而產(chǎn)生的肌體免疫和炎性應(yīng)答有關(guān)。所述的應(yīng)答可以發(fā)生在神經(jīng)組織發(fā)生外傷(例如通過自體免疫功能紊亂、腫瘤病變、感染、化學(xué)或4幾械外傷、疾病、通過中斷血液流入到神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，或者通過對神經(jīng)或周圍物質(zhì)造成的其他外傷所引起)之后。例如，認(rèn)為在神經(jīng)血液供應(yīng)被閉塞之后，由組織缺氧或缺血-再灌注導(dǎo)致的原發(fā)性損害(如同在栓塞性中風(fēng)中)具有免疫相關(guān)性。此外，與大量原發(fā)性腦腫瘤有關(guān)的至少部分損傷還表現(xiàn)出具有免疫相關(guān)性。MNTF類似物的應(yīng)用直接或系統(tǒng)性的減輕和/或抑制了針對神經(jīng)損傷所產(chǎn)生的免疫相關(guān)性應(yīng)答。在另一實施方案中，本文所述的技術(shù)涵蓋了本文所述的任何MNTF蛋白質(zhì)的生物活性種類(系統(tǒng)發(fā)生的)變體的用途，其中所述的變體包括但不限于保守的氨基酸序列變體，由兼并核苷酸序列變體編碼的蛋白質(zhì)，以及共享保守的MNTF結(jié)構(gòu)域的、并且由在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格條件MNTF蛋白質(zhì)。本發(fā)明的化合物還可以用于研究目的。因此，由肽顯示出的特異性雜交可以用于測定法、純化、細(xì)胞產(chǎn)物制備和通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解的其他方法中。除非另有說明，本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。本文參考本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法?？梢詤⒖嫉年U述此類已知方法的出版物和其他材料整體引入本文作為參考，如詳細(xì)闡述一樣。闡述重組DNA技術(shù)的一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考著作包括Sambrook,J.，等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Planview,N.Y.(1989)和MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版(Sambrook和Russel，2001)，在本文中共同和單獨地稱為"Sambrook";McPherson,M.J.，Ed.，DirectedMutagenesis:APracticalApproach,IRLPress,0xford(1991);Jones,J.,AminoAcidandPeptideSynthesis,OxfordSciencePublications,Oxford(1992);Austen,B.M.和Westwood，0.M.R.,ProteinTargetingandSecretion,IRLPress,Oxford(1991);OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,編輯，1984);AnimalCel1Culture(R.I.Freshney，編輯，1987);HandbookofExperimentalImmunology(D.M.Weir&C.C.Blackwell，編輯)；GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.Miller&M.P.Calos，編輯，1987);CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人，編輯，1987包括直到2001年的補充)；PCR:ThePolymeraseChainReaction,(Mullis等人，編輯，1994);CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coligan等人，編輯，1991);TheImmunoassayHandbook(D.Wild,編輯，StocktonPressNY，1994);Bio函jugateTechniques(GregT.Hermanson,編輯，AcademicPress,1996);MethodsofImmunologicalAnalysis(R.Masseyeff，W.H.Albert和N.A.Staines,編輯，Weinheim:VCHVerlagsgesellschaftmbH，1993)，Harlow和Lane(1988)Antibodies,ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPublications,NewYork和Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(在本文中共同和單獨地稱為Harlow和Lane)，Beaucage等人編輯，CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistryJohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,2000);和Agrawal，編輯,ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs,SynthesisandPropertiesHumanaPressInc.,NewJersey，1993);Teratocarcinomasandembryonicstemcells:Apracticalapproach(E.J.Robertson,編輯，IRLPressUd.(1987);GuidetoTechniquesinMouseDevelopment(P.M.Wasserman等人編輯，AcademicPress(1993);EmbryonicStemCellDifferentiationinvitro(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225:900(1993);PropertiesandusesofEmbryonicStemCells:ProspectsforApplicationtoHumanBiologyandGeneTherapy(P.D.Rathjen等人，Reprod.Fertil.Dev.，10:31(1998));CNSRegeneration:BasicScienceandClinicalAdvances,M.H.Tuszynski&J.H.Kordower，編輯，AcademicPress,(1999)。在本發(fā)明實踐中可能有用的某些技術(shù)在各種專利和專利申請中得到描述，包括報道了從腦組織獲得多潛能神經(jīng)千細(xì)胞的美國專利號5，851，832，報道了由新生大腦半球生產(chǎn)成神經(jīng)細(xì)胞的美國專利號5,766,948，報道了哺乳動物神經(jīng)嵴干細(xì)胞的使用的美國專利號5，654，183和5，849，553,報道了從哺乳動物多潛能CNS干細(xì)胞在體外產(chǎn)生分化的神經(jīng)元的美國專利號6，040，180,報道了神經(jīng)上皮干細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞前體、和語系受限的神經(jīng)元前體的產(chǎn)生和分離的WO98/50526和WO99/01159，和報道了從胚胎前腦獲得并用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的美國專利號5，968，829，所述培養(yǎng)基包含葡萄糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、硒、孕酮和幾種其他的生長因子。盡管在本發(fā)明的執(zhí)行中可以利用技術(shù)人員已知的任何合適的材料和/或方法；然而，本文還是描述了非限制性優(yōu)選的材料和/或方法。本發(fā)明在某些方面可以參考下述實施例進行理解，所迷實施例為了舉例說明而不是為了限制而提供。除非另有說明，下述實施例中參考的材料、試劑等可從商業(yè)來源獲得。以下描述的某些實施例包含了下文提供的引用文獻ChauRMW,RenF，HuangW，JenLS.Muscleneurotrophicfactorsspecificforanteriorhornmotoneuronsofratspinalcord.RecentAdvancesinCell.AndMol.Biol.1992，5:89-94.CopelandJr，LeggettYA，Ka廳nYM，TaylorRE,TizabiY.Neuroprotectiveeffectsofnicotineagainstsalsolino卜inducedcytotoxicity:implicationsforParkinson'sdisease.NeurotoxRes.2005Nov;8(3-4):289-93.KMBiotech.PublishedPCTPatentApplication:W098/13492，1998.MaruyamaW，YiH，TakahashiT，ShimazuS,0hdeH，YonedaF，IwasaK，NaoiM.NeuroprotectivefunctionofR-(-)-l-(benzofuran-2-yl)-2-propylaminopentane，[R-(_)-BPAP]，againstapoptosisinducedbyN-methyl(R)salsolinol，anendogenousdopaminergicneurotoxin,inhumandopaminergicneuroblastomaSH-SY5Ycells.LifeSci.2004May21;75(1):107-17.NussbaumD，AshD，JabsE，BrushartT.Mononeurontrophicfactor(MNTF)FromGenetoFunction.Soc.ForNeuroscience,NewOrleans,LA，2003.ShavaliS，RenJ，EbadiM.Insulin-likegrowthfactor-lprotectshumandopaminergicSH-SY5Ycellsfromsalsolinol-inducedtoxicity.NeurosciLett.2003Apr10;340(2):79-82.WangAM,ChauRMW，ChowSP，ZhangZY，LiZM.Effectsofmyogenic22and35kDneurotrophicfactorsonaxonalregenerationinfreeperipheralautograftsintoratspinalcord.1995,5(6):248-252.DubaiDB，ZhuH，YuJ，RauSW，ShughruePJ，MerchenthalerI，KindyMS，WisePM.Estrogenreceptoralpha,notbeta,isacriticallinkinestradiol-mediatedprotectionagainstbraininjury.ProcNatlAcadSciUSA.2001，98:1952-1957.EllsworthJL，GarciaR，YuJ，KindyMS.Timewindowoffibroblastgrowthfactor-18-mediatedneuroprotectionafterocclusionofthemiddlecerebralarteryinrats.JCerebBloodFlowMetab.2004，24:114—123.EllsworthJL，GarciaR，YuJ，KindyMS.Fibroblastgrowthfactor—18reducedinfarctvolumesandbehavioraldeficitsaftertransientocclusionofthemiddlecerebralarteryinrats.Stroke.2003，34:1507-1512.GaryDS，Bruce-KellerAJ，KindyMS,MattsonMP.Ischemicandexcitotoxicbraininjuryisenhancedinmicelackingthep55tumornecrosisfactorreceptor.JCerebBloodFlowMetab.1998，18:1283-1287.KMBiotech.InternationalPatentWO98/13492，1998.MattsonMP,ZhuH，YuJ，KindyMS.Presenilin-lmutationincreasesneuronalvulnerabilitytofocalischemiainvivoandtohypoxiaandglucosedeprivationincellculture:involvementofperturbedcalciumhomeostasis.JNeurosci.2000，20:1358-1364.DiX，HuangW.Localizationandmorphometricstudyonmotoneuronotrophicfactor1anditsreceptorindevelopingchorionicvi11iofhumanplacenta.ActaAnatomicaSinica，1998，29:86-89.XinyuD，WeiquanH.Localizationandmorphometricstudyonmotoneuronotrophicfactor1anditsreceptorindevelopingchorionicvi11iofhumanplacenta.ActaAnatomicaSinica，1998，29:86-89.如本文所使用的，應(yīng)該預(yù)計到MNTF肽、及其序列和/或功能類似物的效力可以通過與以下實施例中所述的基本相似和/或一致的方案來測定。此外，應(yīng)該預(yù)計到SEQIDNO:1-142中列出的任<可MNTF肽類似物、及其變體的效力可以根據(jù)本文所述的實驗條件來測定。如本文所使用的，示例性的MNTF肽類似物GM6、GM602、GM603、GM604、MNTF6聚體都稱為含有序列FSRYAR(SEQIDNO:2)的MNTF6-聚體。實施例1MNTF血腦屏障滲透的測試用于本實施例的縮寫/術(shù)語。"MNTF"是指運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子；或其肽類似物。"GM6"和"6聚體"是指MNTF的示例性6個氨基酸的肽類似物，即，F(xiàn)SRYAR(SEQIDNO:2)。"BBB"是指血腦屏障。"Genervon，，和"GB"是指GenervonBiopharmaceuticals，LLC。"I.V."是指靜脈內(nèi)。"抗-6聚體的抗體"是指抗-GM6的抗體。"NTS"是指NeurologicalTestingService,其為合同研究組織。對運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)的合成的6氨基酸類似物(GM^FSRYAR)穿過血腦屏障并進入腦的能力進行測試。GM6為合成的6個氨基酸肽MNTF的類似物。GM6以固體的形式提供，并且制劑(儲存在4。C下的溶液)由NTS來制備。已經(jīng)在大鼠的多種神經(jīng)系統(tǒng)中對匪TF進行了測試，其中所迷的神經(jīng)系統(tǒng)包括外周坐骨神經(jīng)、外周肌皮神經(jīng)，頭部和面部神經(jīng)、頭部舌下神經(jīng)以及控制頸部、胸腔和上肢中的肌肉的部分脊髓。在所述的脊髓模型中，將MNTF應(yīng)用在大鼠的半橫切脊髓中的神經(jīng)移植物上。MNTF減少了炎癥、限制了惡化并增強了嫁接神經(jīng)的再生。許多研究已經(jīng)證實了當(dāng)將MNTF或GM6直接應(yīng)用到神經(jīng)上時，合成的MNTF或GM6在良好建立的大鼠外周神經(jīng)模型中對營養(yǎng)和熱作用的效力。此外，MNTF已經(jīng)顯示出能夠促進運動神經(jīng)元的再生和存活。此外，選擇具有雙隱性基因的Wobbler小鼠模型(運動神經(jīng)元病小鼠模型)作為代用品，來在上述小鼠品系中研究MNTF挽救運動神經(jīng)元免于發(fā)生基因缺陷(該缺陷會導(dǎo)致運動神經(jīng)元退行性疾病)的能力。在預(yù)備實驗中，在六周齡時肌肉內(nèi)給予一劑量的MNTF減緩了運動神經(jīng)元疾病的發(fā)展。在經(jīng)處理的運動神經(jīng)元病小鼠中，未經(jīng)治療的運動神經(jīng)元病小鼠的存活由9至12周明顯增加至28至63周。對MNTF和GM6在多種動物系統(tǒng)中的作用進行評估。在對超過1000只SpragueDawley大鼠和15組運動神經(jīng)元病小鼠及其正常的同窩出生的幼鼠進行的實驗中，未鑒定出安全問題。由于具有潛在作用的MNTF起到了神經(jīng)保護、發(fā)炎和神經(jīng)元再生的作用，所以包含MNTF及其肽類似物的藥物組合物被評價為用于治療神經(jīng)疾病。治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和紊亂的一個主要障礙是難以將藥物傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。測定藥物的生物利用度和對多種神經(jīng)紊亂的作用，從而評估藥物的治療潛力。評估通過靜脈內(nèi)注射的gm6對腦的有效性。方法和材料研究設(shè)計對C57BL6小鼠注射所示劑量的GM6,并對腦中的GM6進行檢測。取出一半腦用于針對GM6的免疫細(xì)胞化學(xué)分析，并將另一半(腦)冷凍用于ELISA分析。體內(nèi)方法在實驗前和實驗過程中，使重量大約為25克的雄性C57BL/6小鼠(JacksonLaboratory)自由進食和進水。在實驗前，使動物適應(yīng)環(huán)境，為期1周。將載體或GM6以0.2或2mg/kg的濃度經(jīng)尾靜脈對動物給予靜脈內(nèi)推注給藥。通過使用儲存在4。C下的100%的鹽水溶液重構(gòu)GM6來配制GM6作為原液。栽體對照也包含鹽水溶液。免疫組織化學(xué)分析將組織切片脫蠟，并在pH7.4的Tris緩沖鹽水(TBS)中洗滌，再在合適的血清(山羊)中封閉。將切片在4。C下封閉過夜，然后在4。C下經(jīng)歷一級抗體(抗6-聚體的抗體)過夜。將切片在TBS中洗滌，然后加入二級抗體，再在室溫下溫育l小時。在洗涂后，將切片#4居VectorABCElite試劑盒的指導(dǎo)進行溫育，并用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。在水中終止反應(yīng)，并在用二甲苯處理后蓋上蓋玻片。使用計算機輔助的圖像分析系統(tǒng)測定各切片中的免疫細(xì)胞化學(xué)染色面積，其中所述的計算機輔助圖像分析系統(tǒng)由裝配有QuickCapture圖像采集卡的PowerMacintosh計算機、安裝在Olympus顯微鏡上的HitachiCCD照相機、以及照相才幾支架構(gòu)成。使用NIHImageAnalysisSoftware,v.1.55。獲取圖像，并在10個切片上測定GM6肽的總面積。由對治療狀態(tài)為盲的單個操作者進行所有的測量。ELISA分析使用竟?fàn)幮訣LISA試劑盒測定樣品中GM6的水平。將處于涂敷緩沖劑中的濃度為1Oug/ml的親和力純化兔抗-6聚體涂敷在ELISA板上。在所述的檢測中，使用1uM(最終稀釋度)的6聚體-生物素。將濃度已知的GM6(竟?fàn)幵噭?用作參照標(biāo)準(zhǔn)品，在所述的測試中，所述標(biāo)準(zhǔn)品的起始濃度為80uM，并對采用2倍稀釋法稀釋至0.625uM的該標(biāo)準(zhǔn)品進行滴定，以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，由OD450的觀察結(jié)果估測測試樣品的濃度。在包含100mMTrisHC1，pH7.0，包含2%BSA，1MNaCl，4mMEDTA，2%TritonX-100,0.1°/。疊氮化鈉、以及蛋白酶抑制劑(CompleteTM，Mini,BoehringerMannheim)的細(xì)胞裂解緩沖劑中制備腦組織。在相對組織濕重10個體積的緩沖劑中制備勻漿。將所述的勻漿在14，OOOxg下離心30分鐘。將調(diào)整的合適體積的所得上清液用于ELISA。對于所述的檢測，將抗6聚體pAb在ELISA涂敷緩沖劑中稀釋至10ug/ml。使用經(jīng)稀釋的pAb以100ul/孔的量涂敷96孔微孔板。蓋上所述的微孔板，并保持冷凍過夜。第二天，用3%的BSA以200u1/孔TBS封閉所述的板，然后在RT下保持60分鐘。將板用18510183+0.05%TVeen20)洗滌3X。對各板，制備10mlluM6聚體-生物素和lml的標(biāo)準(zhǔn)混合物luM6聚體-生物素與80uM的6聚體。對于各板，通道1和2用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。除了Al和A2以外，將1uM6聚體-生物素(IOOjul)加入到所有的孔中，而將標(biāo)準(zhǔn)混合物以200ul/孔的量加入到A1和A2中。通過由各孔中取出100ul的樣品、并將其與下一個孔混合一吸管上下抽吸至少8次，從而由孔Al和A2直至孔Hl和H2進行2倍系列稀釋。將最后孔(H1和H2)中的額外的100ul丟棄。將測試樣品(腦勻漿)在Ab稀釋緩沖劑中稀釋，并以l:50與luM的6聚體-生物素混合。在RT下，將所得的板在混合器上以400rpm混合2小時。將得到的樣品用TBST洗滌6X。通過在Ab稀釋緩沖劑中將鏈霉親和素-HRP稀釋至l:2000來制備鏈霉親和素-HRP溶液(每板10ml)。在RT下，將板在混合器上再混合1小時。將樣品用TBST洗滌8X。以50u1/孔的量加入底物(TMBS，Genetel)，并顯色5分鐘。使用50ul1M的HC1終止反應(yīng)，并立刻讀取OD450。統(tǒng)計分析將結(jié)果表示成平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。釆用t檢驗分析ELISA和免疫組織數(shù)據(jù)的差異顯著性。所述研究中動物的排除基于以下若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動物在研究結(jié)束前(在任何時間點上)死亡的動物；在施用測試制品后形成嚴(yán)重并發(fā)癥的動物。處理組所有的組都經(jīng)歷GM6或者作為對照。將栽體或MNTF以指示的劑量經(jīng)尾靜脈對動物(30只動物)給予靜脈內(nèi)推注給藥。表-小鼠BBB模型<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>將所有的測試組都提供給NTS;將GM6以固體材料的形式提供給NTS。測試組中所有的動物都給予上文指示的劑量。在所述研究結(jié)束時，取出1/2的腦以用于針對GM6的免疫細(xì)胞化學(xué)分析。取出另1/2腦以用于針對GM6的ELISA分析。結(jié)果小鼠中的MNTF。血腦屏障研究對GM6在腦中的相對有效性進行評估。數(shù)據(jù)得自靜脈內(nèi)施用載體或GM6的小鼠(野生型)。免疫細(xì)胞化學(xué)分析GM6:在施用MNTF后，取出腦，并^f吏用抗-6聚體的抗體對取出的腦進行針對GM6的免疫細(xì)胞化學(xué)分析。與對照動物相比，在任何動物的組織中都沒有檢測到免疫反應(yīng)性。ELISA分析為了使用竟?fàn)幮訣LISA試劑盒測定腦樣品中GM6的水平，按照上文所述制備樣品，并對其進行ELISA。如圖l和表4所示，釆用ELISA測試，檢測腦中的MNTFGM6。ELISA檢測到了腦中內(nèi)源GM6的基礎(chǔ)水平(O.4iaM)。在注射有0.2mg/kgGM6的動物中，檢測到GM6增長至400%(1.760iaM)，而在注射2mg/kgGM6的4小時之后，腦中的GM6增長至3000%(12.92juM)。這些數(shù)據(jù)表明靜脈內(nèi)注射GM6可以使所述的肽在腦中進行分布。表4.腦中的MNTF(I.V注射)。(示于圖l中)<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>死亡率在該研究中沒發(fā)生死亡。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，MNTF為這樣的營養(yǎng)因子，其能夠提供保護從而免于神經(jīng)疾病，并且可以使神經(jīng)元組織在受損或移植后再生。在此所進行的研究證明了MNTF(GM6)的6氨基酸類似物以有效且高效的方式穿過血腦屏障的能力。靜脈內(nèi)施用0.2和2mg/kg的單推注劑量的GM6證明腦中的GM6的水平呈劑量依賴方式的增加。這表明，GM6通過靜脈內(nèi)施用能夠進入腦，并且可以用于各種疾病模型中，從而確定了其有益效果。當(dāng)通過靜脈內(nèi)進行施用時，發(fā)現(xiàn)GM6在4小時之后存在于腦中。GM6在腦中的水平是劑量依賴方式的，并且表明GM6能夠通過靜脈內(nèi)施用的方式進入腦中。實施例2中風(fēng)在MCAO模型中用MNTF治療中風(fēng)在中腦動脈阻塞(MCAO)的小鼠模型中測試MNTF肽類似物GM602(SEQIDNO:2，F(xiàn)SRYAR)的效力。為了測定GM602在MCAO小鼠模型中的效力，使小鼠經(jīng)歷1小時的缺血和24小時的再灌注。在開始再灌注之后即刻通過尾靜脈以靜脈內(nèi)推注方式對小鼠注射幾種劑量的GM602,并檢測在腦血流量(CBF)、心率(HR)、血壓(BP)、p02、pC02、pH、神經(jīng)缺損(ND)和梗塞體積(IFV)方面的變化。對靜脈(IV)內(nèi)施用的單劑量(l或5mg/kg)GM602檢測。施用GM602證明在HR、BP、p02、pC02或pH方面無變化。觀察到，在再灌注后，施用GM602會使CBF明顯高于對照組，表明GM602會幫助減輕由血流阻斷所導(dǎo)致的缺血作用。在注射GM602之后，檢測在ND和IFV中發(fā)生的劑量依賴方式的變化。lmg/kg和5mg/kg的GM602都表現(xiàn)出了明顯的免于受到梗塞損傷的保護，這解釋了對神經(jīng)缺損的保護作用。所得的這些數(shù)據(jù)表明，在MCAO小鼠模型中，GM602在經(jīng)歷IV注射之后對腦具有神經(jīng)保護作用。用于本實施例的縮寫/術(shù)語。"MNTF"是指運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子。"MNTF6聚體"是指MNTF的6個氨基酸的肽類似物，例如FSRYAR。"GM602"是指用于中風(fēng)的MNTF的6個氨基酸的肽類似物。"GM602(1)"是指劑量為lmg/kg的GM602。"GM602(5)"是指劑量為5mg/kg的GM602。"MCAO"是指中腦動脈阻塞。"GB，，是指GenervonBiopharmaceuticalsUC。"IV"是指靜脈內(nèi)。"CBF"是指腦血流量。"HR，，是指心率。"BP"是指血壓。"ND"是指神經(jīng)缺損。"IFV"是指梗塞體積。MNTF為通過其功能而發(fā)現(xiàn)的、在人染色體上具有特定位置的內(nèi)源神經(jīng)營養(yǎng)因子。MNTF對人的神經(jīng)系統(tǒng)具有高度的特異性，并且在人類胎兒的完整神經(jīng)系統(tǒng)的形成過程中的妊娠期的三個月中被快速表達，并在笫九周時達到峰值(DiandHuang，1998)。MNTF為完全結(jié)合非常特異性的受體的神經(jīng)信號傳導(dǎo)分子。如在動物和體外研究中所證明的功能為使胚胎干細(xì)胞分化形成運動神經(jīng)元；使運動神經(jīng)元得以維持和存活；在其指導(dǎo)下運動軸突的再生；以及目標(biāo)肌肉和器官的再神經(jīng)無力(re-enervation)(Chauetal.，1992;Nussbaumetal.，2003)。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)處于由疾病、紊亂或損傷所導(dǎo)致的攻擊之下時，MNTF針對神經(jīng)再生和修復(fù)形成了保護性和許可的環(huán)境，該環(huán)境為神經(jīng)保護性的、抗細(xì)胞凋亡的、抗氧化的、抗炎的以及抗創(chuàng)傷的。大量的研究已經(jīng)證明了MNTF在大鼠的各種神經(jīng)系統(tǒng)中的效力，其中所述的神經(jīng)系統(tǒng)包括外周坐骨神經(jīng)、外周肌皮神經(jīng)、頭部和面部神經(jīng)、頭部舌下神經(jīng)以及控制頸部、胸腔和上肢中的肌肉的部分脊髓(Wangetal.，1995)。在半橫切的大鼠脊髓模型中，MNTF減少了炎癥、限制了惡化并增強了嫁接神經(jīng)的再生(KMBiotechPCT，1998)。許多研究已經(jīng)證實了合成的MNTF或MNTF6聚體(FSRYAR;SEQIDNO:2)在良好建立的大鼠外周神經(jīng)模型中在營養(yǎng)和熱作用的效力(Nussbaumetal，2003)。此外，MNTF已經(jīng)顯示出促進運動神經(jīng)元的再生和存活(KMBiotechPCT，1998)。此外，在具有雙隱性基因的運動神經(jīng)元病小鼠(NIH)達到6周齡時給予其一劑量的35ng的MNTF，減慢上述品系小鼠的神經(jīng)退行性基因疾病(KMBiotechPCT，1998)。將MNTF的一個活性位點的6個氨基酸(FSRYAR)的類似序列作為具有MNTF活性的藥物候選物進行研究。由使用了自己建立的檢測方法和方案的獨立的研究組進行以下的CNS和PNS實驗1.已經(jīng)顯示出MNTF6聚體類似物能夠通過IV注射而滲透過血腦屏障并進入到腦中。2.L-2-輕基戊二酸(LGA)誘導(dǎo)了神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激和細(xì)^^凋亡。在斑馬魚生物分析中，MNTF6聚體保護了CNS中的由LGA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并將中腦中的細(xì)胞凋亡減少了85%。3.在大鼠的坐骨神經(jīng)斷層(具有8mm間隙)的研究中，經(jīng)MNTF處理的動物中具有呈劑量應(yīng)答方式的運動神經(jīng)元再生明顯的改善(在最佳劑量下，p<0.0002)，并促進了DRG神經(jīng)元的再生。4.在橫切的股神經(jīng)大鼠模型中，在經(jīng)MNTF6聚體處理的動物中，大量的運動神經(jīng)元以劑量應(yīng)答的方式正確投射到肌肉中。在最佳劑量下，正確投射到肌肉中的運動神經(jīng)元的數(shù)量為不正確地投射到皮膚中的運動神經(jīng)元的數(shù)量的3倍(p〈0.0001)。5.在斑馬魚生物分析中，MNTF6聚體保護了PNS中由LGA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并將外周肌神經(jīng)接合點的細(xì)胞凋亡減小49%。評估示例性的MNTF肽GM602(FSRYAR;SEQIDNO:2)，其為運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子的6個氨基酸肽類似物(MNTF6聚體)在保護腦免受急性缺血和再灌注損傷的能力。GM602是在GMP認(rèn)證下化學(xué)合成的(CSBioCo.，MenloPark,CA，GMP013,lotC811)。在NeurologicalTestingService,Inc(NTS,Charleston,SC)的合同下進行上述研究。將GM602以固體形式提供給NTS,并且制劑(儲存在4。C下的溶液)由NTS來制備。方法和材料在實驗前，重量大約為22-25克的動物C57BL/6小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)均給予自由進食和進水。使用氟烷來麻醉動物(70V30。/。NO2/02中1%的氟烷，通過面罩麻醉)。通過尾筒裝置(tailcuffapparatus)監(jiān)測平均動脈血壓(MABP),并收集血液樣品，從而測定動J^pH7jc平、以及PaC02和Pa02。<吏用VisitechSystem血壓監(jiān)測儀記錄MABP和心率。使用插入到顳肌肌肉中的直腸溫度計和熱敏探針來監(jiān)測腦的溫度。通過使用帶有水套的加熱墊，將動物的體溫保持在37°C。在缺血前的1小時至缺血后的6小時監(jiān)測腦的溫度，并每隔30分鐘記錄一次。實驗組所有的動物都經(jīng)歷了1.Oh的缺血、及其后的24h的再灌注。將動物隨機分成栽體組(n-lO)，或靜脈內(nèi)注射劑量為1或5mg/kg的GM602的處理組(11=10)。NTS通過使用儲存在4。C下的標(biāo)準(zhǔn)鹽水溶液重構(gòu)GM602來配制GM6(CSBioCo.,MenloPark,CA，GMP013,lotC811)作為原液。栽體對照接受鹽水溶液。在再灌注發(fā)生后即刻通過尾靜脈進行IV推注。研究人員對于處理組是盲的。缺血的誘導(dǎo)本研究涉及缺血的瞬時模型。對每只小鼠都進行麻醉，并分離出頸外動脈(ECA)和頸總動脈(CCA)。將熱敏探針插入到直腸和顳肌肌肉中，從而監(jiān)測肌體和腦的溫度，其中通過外部加熱，將所述的溫度保持在36-37。C。通過頸部正中切口使左側(cè)頸總動脈(CCA)暴露出來。對甲狀腺上動脈和枕動脈進行電凝集并分開。將顯微手術(shù)夾;^文置在頸外動脈(ECA)源頭的周圍。將ECA的遠端用6-0絲綁結(jié)，并橫切。將6-0絲松散地系在ECA殘端的周圍。移開所述的手術(shù)夾，并將5-0尼龍縫合線(涂有有機硅)的經(jīng)燒邊的尖端溫和地插入到ECA殘端中。將環(huán)狀的6-0絲系緊在所述殘端的周圍，并且使尼龍縫合線進入并通過頸外動脈(ICA)中大約13mm(根據(jù)體重進行調(diào)節(jié))，直至所述的縫合線停留在前大腦動脈(ACA)中，由此阻塞了前交通動脈和中腦動脈。在將尼龍縫合線放置l小時后，其被拉回到ECA中，并封閉切口。組織學(xué)檢測關(guān)于組織學(xué)檢測，在誘導(dǎo)缺血之后的24小時，采用腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)來麻醉動物。采用穿心灌注(transcardially)的方式，使用4'C的10。/。的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)對腦進行灌注。取出所述的腦，并將其在-2(TC下冷凍15分鐘，然后再放置到嚙齒動物腦矩陣中。制備冠狀切片(lmm厚)，并將其在37。C下用2%的氯化三苯基四氮唑(TTC)染色。由各腦獲得由梗塞的前緣直至尾部范圍的7個連續(xù)的lmm厚冠狀切片，其中所述的梗塞距額極2mm開始。將經(jīng)TTC染色的切片放置在10%中性的緩沖福爾馬林中，并在黑暗狀態(tài)下，在4。C下保持至少24小時。使用計算機輔助的圖像分析系統(tǒng)測定各切片中的梗塞的面積，其中所述的計算機輔助圖像分析系統(tǒng)由裝配有QuickCapture圖像采集卡的PowerMacintosh計算機、安裝在Olympus顯微鏡上的HitachiCCD照相機、以及照相機支架構(gòu)成。使用NIHImageAnalysisSoftware,v.1.55。獲取圖像，并在7個切片上測定損害的總面積。由對治療狀態(tài)為盲的單個操作者進行所有的測量。通過對切片中梗塞體積求和來計算梗塞體積。通過采用以下公式來計算梗塞的尺寸(W以消除水腫影響(對側(cè)體積-同側(cè)未損傷的體積)X100/對側(cè)體積。腦血流量的測量通過使用激光多普勒血流儀監(jiān)測腦血流量(CBF)。CBF值以百分比的形式測定，這是因為由激光多普勒血流儀顯示的值并非為絕對值。如上文所述，使用氟烷來麻醉動物(70%/30%N02/02中1%的氟烷，通過面罩麻醉)。在與MCA阻塞同側(cè)的腦半球中，坐標(biāo)如下點A，前囪點后0.5mm、中線側(cè)部2mm;點B，前囪點后lmm、中線側(cè)部1.2mm;點D,前囪點后lmm、中線側(cè)部1.7mm;點C，在對側(cè)半J求中，前囪點后lmm、距中線2mm。在缺血發(fā)作前15分鐘，在注射測試制品前的缺血過程中(缺血開始之后的15分鐘)，以及在注射制品之后的30分鐘時(在缺血之前的15分鐘至注射所述的化合物結(jié)束之后的30分鐘進行連續(xù)地測定，并且每30分鐘記錄一次)，對比CBF。將MCA阻塞前的平均值作為基線，此后的數(shù)據(jù)以基線值的百分比表示。行為評估在缺血損傷之前和之后的小鼠中測定行為分析(神經(jīng)缺損)。神經(jīng)學(xué)評分如下0，正常的運動功能；1,當(dāng)通過尾巴將動物提起來時，軀干和對側(cè)前肢彎曲；2,當(dāng)通過尾巴將動物按在平面上時，會發(fā)生對側(cè)偏轉(zhuǎn)，但在休息時保持正常的姿態(tài)；3，在休息時發(fā)生對側(cè)傾斜；4，沒有自發(fā)運動活性。所述研究中動物的排除基于以下若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動物在研究結(jié)束前(在任何時間點上)死亡的動物。將至死亡時收集的數(shù)椐提供給GB;在阻塞后腦血流量沒有降低至基線值的20±5%(即，被認(rèn)為為非缺血情況)，或者在再灌注時血流量沒有恢復(fù)至基線值的90±15%;在缺血損傷后產(chǎn)生癲癇狀行為的動物；在缺血過程中或缺血后片刻，檢測到過量出血的動物。統(tǒng)計分析將結(jié)果表示成平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。采用單因素協(xié)方差分析(AN0VA)、再通過Fisher精確檢驗(Fisher'sposthoctest)來分析生理學(xué)和組織學(xué)數(shù)據(jù)中的差異顯著性。在監(jiān)測數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上計算重復(fù)測量的AN0VA，再通過Fisher精確檢驗評價多組中的差異顯著性。處理組。所有的組都經(jīng)歷GM602或者作為對照。以IV劑量方式給予動物(30只動物)以指示劑量的載體或GM602。小鼠中風(fēng)模型<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>結(jié)束GM602在由缺血和再灌注損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)保護方面的作用。針對腦血流量(CBF)、心率(HR)、血壓(BP)、p02、pC02、pH、神經(jīng)缺損(ND)和梗塞體積(IFV)來評價動物。將所有的測試組都提供給NTS;將GM602以固體材料的形式提供給NTS。測試組中所有的動物都以上文指示給藥。結(jié)果小鼠中的缺血(缺血研究)。對上述研究中的缺血的相對嚴(yán)重性進行評估。數(shù)據(jù)得自患有缺血損傷的小鼠，其中所述的小鼠靜脈內(nèi)注射有載體或GM602。梗塞體積與載體注射組相比，在GM602處理組(在lmg/kg和5mg/kg下)中，腦中梗塞體積明顯減小。GM602顯示出使梗塞體積呈劑量依賴性地減小(參見表5)。梗塞體積對GM6的劑量繪制于圖2A中。在腦中梗塞體積減小的百分比示于表5中。如表5所示，缺血后，IV施用0、1或5mg/kg的GM602分別顯示出57%、39%和12%的梗塞尺寸。對于栽體組而言，梗塞體積為73.37mm3;對于1或5mg/kg的GM602處理組而言，梗塞體積分別為45.93mm3和20.29mm3。由此，與載體相比，缺血后IV施用1或5mg/kg的GM602使得梗塞體積分別減小38%和73%。表5.腦中梗塞減小的百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>減小的百分比與各種載體對照動物相比。所有組與對照組相比，p值均〈0.0001。死亡率在本研究中未發(fā)生死亡。生理學(xué)參數(shù)在使用5mg/kg的GM602(其有助于減輕由阻斷血流量所導(dǎo)致的缺血效果)治療的組中，觀察到在再灌注之后腦血流量明顯高于載體組，除此以外，在缺血過程中或者是在再灌注之后，在栽體小鼠和治療小鼠之間，生理學(xué)參數(shù)(平均動脈血壓、血液p02、pC02和pH)不具有顯著性差異，均為基線水平(參見圖3-7)。<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>行為測定基于G至4的分值，針對神經(jīng)缺損對動物進行評估。使用GM602治療的動物顯示出神經(jīng)缺損呈劑量依賴方式的減小(數(shù)據(jù)同樣示于圖8)。化合物神經(jīng)缺損與載體相比的p值載體2.7±0.30GM602(1)1.8±0.249P<0.04GM602(5)1.3±0.153P<0.0006在美國，中風(fēng)是死亡的第三大原因，并且是造成殘疾的主要原因。局灶性腦缺血造成的結(jié)果和所形成的梗塞的尺寸可以通過"壞死性"(細(xì)胞凋亡)細(xì)胞死亡情況以及通過在缺血邊緣帶中延遲的神經(jīng)元細(xì)胞損失(程序性細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡)情況來測定。近期出現(xiàn)的療法用于治療缺血性中風(fēng)。但是，這些治療方法通常涉及溶解血液凝塊，但一旦神經(jīng)元細(xì)胞死亡循環(huán)被引發(fā)不會發(fā)揮神經(jīng)保護、或者減小行為缺陷或腦梗塞體積的作用。理解影響細(xì)胞損傷的基礎(chǔ)機理將有助于能夠減小與缺血性損傷有關(guān)的細(xì)胞死亡的藥物的設(shè)計和應(yīng)用。MNTF為這樣的營養(yǎng)因子，其能夠提供保護從而免于神經(jīng)疾病，并可以在發(fā)生損傷或缺血性中風(fēng)后使神經(jīng)元組織再生。本發(fā)明所進行的研究證明了GM602(MNTF的6個氨基酸(FSRYAR)的類似物)以有效且高效的方式保護腦免于受到由腦缺血和再灌注損傷而造成的有害作用的能力。靜脈內(nèi)施用1和5mg/kg單次推注劑量的GM602證明了通過減小梗塞體積、改善行為性質(zhì)以及增大腦血流量而在腦中產(chǎn)生對抗缺血/再灌注損傷的、呈劑量依賴方式的保護作用。這些研究表明，GM602在中風(fēng)中具有有利的作用。當(dāng)將GM602進行靜脈內(nèi)施用時，發(fā)現(xiàn)其在小鼠中具有對抗缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護作用。這些研究奠定了進一步研究的基礎(chǔ)，以測定GM602在中風(fēng)和其他神經(jīng)退行性紊亂中的有利作用。實施例3脊髓損傷GM603(示例性MNTF6聚體FSRYAR)在脊髓損傷的小鼠模型中的測試。針對在脊髓損傷(SCI)小鼠模型中的效力對MNTF類似物GM603(SEQIDNO:2;FSRYAR)進行測試。為了測定GM603在SCI小鼠模型中的效力，使小鼠經(jīng)歷脊髓受損，和14天的恢復(fù)。在損傷后即刻向小鼠靜脈內(nèi)注射若干劑量的GM603,并且在14天中的每一天均如此。(i.v.)施用多劑量的GM603(1或5mg/kg)的情況進行測試。施用GM603證實了LV和BR方面的變化，其顯示出劑量依賴方式的效果。1和5mg/kg的GM603顯示出病變體積明顯減小，這解釋了對神經(jīng)缺損的保護作用。這些數(shù)據(jù)證明，在對SCI小鼠模型i.v.注射GM603之后，其在脊髓中具有神經(jīng)保護作用。用于本實施例的縮寫/術(shù)語。"MNTF"是指運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子。"MNTF6聚體"是指MNTF的6個氨基酸的肽類似物。"GM603"是指用于SCI的MNTF的6個氨基酸的肽類似物(FSRYAR)。"GM603-1"是指劑量為lmg/kg的GM603;SEQIDNO:2，F(xiàn)SRYAR。"GM603-5"是指劑量為5mg/kg的GM603。"scr是指脊髓損傷。"GB，，是指GenervonBiopharmaceuticals，LLC。"I.V."是指靜脈內(nèi)。"BR"是指行為恢復(fù)。MNTF6聚體是相對小型的，其不具有大型肽在穩(wěn)定性、溶解性、誘變性、免疫原性、或者轉(zhuǎn)基因或重組方法的高制造成本方面的缺點。固相合成6aa的成本是相對低的。在中腦動脈阻塞(MOAC)的小鼠中風(fēng)模型中，通過IV注射MNTF6聚體的后期治療減小了腦中梗塞體積并以劑量應(yīng)答的方式減輕了神經(jīng)缺損。與載體相比，高劑量的MNTF6聚體將腦中梗塞體積減小了74%，并且顯著地減輕了神經(jīng)缺損(p<0.0001)，表明MNTF6聚體在中風(fēng)方面具有有利的作用。L-2-羥基戊二酸(LGA)誘導(dǎo)了神經(jīng)系統(tǒng)中的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。在斑馬魚生物分析中，MNTF6聚體保護了CNS中由LGA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并將中腦中的細(xì)胞凋亡減少85%(Parngetal，2004)。在具有8mm間隙的大鼠坐骨神經(jīng)橫切研究中，經(jīng)MNTF6聚體治療的動物以劑量應(yīng)答的方式明顯地改善了運動神經(jīng)元的再生(p<0.0002，在最佳劑量下)，并促進了DRG神經(jīng)元的再生(Nussbaumetal，2003)。在經(jīng)橫切的股神經(jīng)大鼠模型中，在經(jīng)MNTF6聚體治療的動物中，正確透射到肌肉中的運動神經(jīng)元的數(shù)量呈現(xiàn)劑量應(yīng)答的方式。在最佳劑量下，正確透射到肌肉中的運動神經(jīng)元的數(shù)量是非正確地透射到皮膚中的運動神經(jīng)元的數(shù)量的3倍(p〈0.0001)(Nussbaumetal，2003)。在斑馬魚生物分析中，MNTF6聚體保護了PNS中由LGA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并使外周肌神經(jīng)接合點的細(xì)胞凋亡減少49%(Parngetal,2004)。測定了GBGM603(其為運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF6聚體)的6個氨基酸的肽類似物(FSRYAR;SEQIDNO:2))通過靜脈內(nèi)推注來保護脊髓免于受到損害或損傷的能力(Tyoretal.，2002;Engesser-Cesaretal.，2005)。GM603是在GMP認(rèn)證下化學(xué)合成的(CSBioCo.，MenloPark,CA,GMP013,lotC811)。在NeurologicalTestingService,Inc(NTS,Charleston,SC)的合同下進行上述研究。將GM603以固體形式提供給NTS，并且制劑(儲存在4。C下的溶液)由NTS來制備。方法和材料動物在實驗前，每只重量大約為22-25克的C57BL/6小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)均自由進食和進水。使用良好表征的氣動沖擊裝置，使剛成熟的雌性小鼠(25gm)接受脊髓挫傷。實驗組在實施外科手術(shù)前，根據(jù)隨機分組設(shè)計方案，將小鼠分配到不同的處理組中，使得在任何給定的手術(shù)當(dāng)天，所有的治療都被包括在內(nèi)。研究者對于處理組是盲的。NTS通過使用儲存在4。c下的y。鹽水溶液重構(gòu)GM603來配制GM603(CSBioCo.，MenloPark,CA，GMP013,lotC811)作為原液。栽體對照含有鹽水溶液。在再灌注發(fā)生后即刻通過尾靜脈進行IV推注。脊髓損傷的誘導(dǎo)在對第10個胸推關(guān)節(jié)(T10)進行推板切除術(shù)之前，使用克他命(80mg/kg)和曱苯噻溱(10mg/kg)來麻醉小鼠。使用直角夾具在上胸推(T8)和腰胸推(T11)處將脊柱夾穩(wěn)，并將直徑為2mm的銅針通過空氣作用推進到疊置在背部脊髓上方的、暴露且完整的硬腦脊膜上。立刻除去氣動沖擊裝置，并用鹽水沖洗傷口，再將肌肉和皮膚開口縫合在一起。處理就化合物的應(yīng)用而言，每天i.v.注射GM603，并持續(xù)2周。在損傷后即刻施用2種不同劑量(1mg/kg和5mg/kg)的GM603。由于雌性動物發(fā)生了與損傷有關(guān)的癱瘓并且易于排空膀胱，所以使用這種動物。行為分析旋轉(zhuǎn)棒測試和曠場測試就行為分析而言，在實施手術(shù)前，以及在手術(shù)后的第1、3、5、7和14天對動物進行測試。將動物在曠場室(直徑為120cm,壁高為25cm)中放置4分鐘，以確保所有的受試者都獲得了Basso，Beattie和Bresnahan(BBB)運動評分表中的最大分值21。將小鼠在曠場中放置4分鐘，并錄像以用于評分。此外，測試小鼠保持在旋轉(zhuǎn)棒上的能力。就旋轉(zhuǎn)棒測試而言，使小鼠經(jīng)歷l周的學(xué)習(xí)時間，其后，它們能夠在加速的旋轉(zhuǎn)棒上表演。在第1、3、5、7和14天進行測試，測試小鼠，直到它們在三次連續(xù)的嘗試中不能在旋轉(zhuǎn)棒上保持10秒鐘以上為止，將這種情況確定為旋轉(zhuǎn)棒失敗。將最長的時間設(shè)定為90秒。記錄處理組的分值，并將平均分繪制為損傷后時間的函數(shù)。組織學(xué)在上述研究結(jié)束時，處死動物，并將脊髓固定于4%的多聚甲醛中。就分析而言，將20jam的冷凍切片用鉻花青(EC)染色，以區(qū)分白質(zhì)和細(xì)胞體，從而計算出穿過病變位點處的剩余組織的量。對所述的組織進行免疫細(xì)胞化學(xué)分析。由穿過損傷T10節(jié)段的IO個均勻間隔的部分，通過計算圖像分析來測定組織受量(tissuesparing)。壞死組織的體積除以橫穿部分的總體積，由此被轉(zhuǎn)換為百分比，然后再從100%中減去該百分比。所述研究中動物的排除基于以下若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動物在研究結(jié)束前(在任何時間點上)死亡的動物。將至死亡時收集的數(shù)據(jù)提供給GB;在缺血損傷后發(fā)生癲癇狀行為的動物；在損傷過程中或損傷后片刻，檢測到過量出血的動物。統(tǒng)計分析將所得的結(jié)果表示為平均值土該平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。采用t檢驗來分析病變體積和行為恢復(fù)中的差異顯著性。脊髓損傷的小鼠模型<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>結(jié)束行為缺陷組織學(xué)分析GM603保護免于受到脊髓損傷的作用。針對脊髓損傷來評價動物。已經(jīng)將所有的測試組都提供給NTS;將GM603以固體材料的形式提供給NTS。測試組中所有的動物都如上文指示給藥。結(jié)果小鼠中的脊髓損傷。SCI研究。對上述研究中SCI的相對嚴(yán)重程度進行評估。數(shù)據(jù)得自靜脈內(nèi)注射載體或GM603的SCI小鼠。病變體積與載體注射組相比，在GM603組(1和5mg/kg)中，脊髓中的病變體積明顯減小。1至5mg/kg的GM603顯示出劑量依賴性地減小病變體積(參見表6)。病變體積繪制于圖9中。脊髓中所存在的病變體積的減小百分比列于表6中。如表6所示，與栽體相比，1或5mg/kg的GM603使病變體積分別減小28%或53%。圖IO示出了得自損傷動物的脊髓的代表性照片。圖io顯示，在載體處理的動物中，病變體積(染成紅色)非常大，而在GM603(5mg/kg)處理的動物中，損傷體積(染成紅色)相對較小。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>減小的百分比與各載體對照動物相比*與組1(載體)相比死亡率在本研究中未發(fā)生死亡。行為測定使小鼠經(jīng)歷旋轉(zhuǎn)棒測試。對動物保持在旋轉(zhuǎn)棒上的能力進行測試，最長時間為90秒。在旋轉(zhuǎn)棒測試中對動物進行測試，這可以用于測定運動功能。裝置(DS37型)由直徑為2.5cm的棒構(gòu)成，該棒被直徑為25cm的圓盤分成6個分隔間。使棒以22rpm的恒定速度旋轉(zhuǎn)。在第1、3、5、7和14天對動物進行測試。記錄它們在旋轉(zhuǎn)棒上保持的時間(最長為90秒)。如圖ll所示，所有的動物證實，開始時都不能保持在旋轉(zhuǎn)棒上。但是，3天后，各組間形成了清楚的描繪。在第3天和第5天，差異是顯著的(P^.05)，到第7天顯著性甚至更大(P〈0.01)。將動物在曠場室(直徑為120cm，壁高為25cm)中放置4分鐘，以確保所有的受試者都獲得了Basso，Beattie和Bresnahan(BBB)運動評分表中的最大分值21，從而對動物進行評估。將小鼠在曠場中放置4分鐘，并錄像以用于評分。如圖12所示，在第l天，由于損傷，所有的動物在運動中都顯示出相同的缺陷。但是，到第3天，與載體處理的動物相比，GM603處理的動物都顯示出明顯的改善。到第5天，顯著性P<0.01。討論MNTF為這樣的營養(yǎng)因子，其能夠提供保護從而免于神經(jīng)疾病，并且可以使神經(jīng)元組織在損傷或移植后再生。在此所進行的研究證明了MNTF6聚體類似物GM603以有效且高效的方式保護了得自經(jīng)歷SCI有害作用的脊髓的能力。每日靜脈內(nèi)注射施用1和5mg/kg的GM603持續(xù)14天證明通過減小病變體積和行為性質(zhì)而在脊髓中對抗SCI的劑量依賴性保護作用。這些研究表明，GM603在SCI中具有有利的作用。當(dāng)通過靜脈內(nèi)進行施用時，發(fā)現(xiàn)GM603在小鼠中對抗脊髓損傷的保護作用。實施例4ALS:測試Gm604在肌萎縮性側(cè)索硬化中如何對MNTF肽類似物GM604(FSRYAR;SEQIDNO:2)在肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)小鼠模型中的效力進行測試。為了測定GM604在ALS小鼠模型中的效力，向80天的小鼠靜脈內(nèi)注射兩種劑量的GM604，并持續(xù)直到小鼠死亡。針對在疾病發(fā)作的年齡、死亡年齡、以及疾病的行為表現(xiàn)方面的變化，對動物進行測試。測試多劑量靜脈內(nèi)(i.v.)施用的GM604(1或5mg/kg)。施用GM604證明，在疾病發(fā)作的年齡、死亡年齡和疾病的行為表現(xiàn)方面發(fā)生了變化，這些變化顯示為劑量依賴方式的作用。1和5mg/kg的GM604都顯示出，動物的壽命預(yù)期的明顯延長，這解釋了對神經(jīng)缺損的保護作用。這些數(shù)據(jù)表明，在ALS小鼠模型中GM604可以具有神經(jīng)保護性作用。用于本實施例的縮寫/術(shù)語。"MNTF"是指運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子。"MNTF6聚體"是指MNTF的6個氨基酸的肽類似物。"GM604"是指用于ALS的MNTF的6個氨基酸的肽類似物(FSRYAR)。"GM604-1"是指劑量為lmg/kg的GM604。"GM604-5"是指劑量為5mg/kg的GM604。"ALS"是指肌萎縮性側(cè)索硬化。"GB，，是指GenervonBiopharmaceuticals，L1X。"I.V."是指靜脈內(nèi)。評估運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF6聚體)的GB測試制品GM6(M(6個氨基酸的肽類似物(FSRYAR;SEQIDNO:2))在延遲或調(diào)節(jié)ALS小鼠模型中ALS疾病的臨床跡象的發(fā)作、臨床跡象的改善以及疾病末期方面的能力。使動物經(jīng)歷靜脈內(nèi)注射GM604,其為在GMP認(rèn)證下化學(xué)合成的(CSBioCo.,MenloPark,CA，GMP013,lotC811)。GM604以固體配制物(儲存在4。C下的溶液)的形式提供。方法和材料動物將ALS小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)在無特定病原體(SPF)的條件下喂養(yǎng)和維持。在實驗前，使重量為22-25克的動物均自由進食和進水。使年輕的成熟小鼠(25gm)經(jīng)歷靜脈內(nèi)注射GM604。實驗組在實施外科手術(shù)前，根據(jù)隨機分組設(shè)計方案，將小鼠分配到不同的處理組中，使得在任何給定的手術(shù)當(dāng)天，所有的處理都被包括在內(nèi)。通過使用儲存在4X:下—的鹽水溶液重構(gòu)GM604來配制GM604作為原液。栽體對照含有鹽水溶液。通過尾靜脈進行IV推注。處理就化合物的應(yīng)用而言，每天i.v.注射GM604,直到動物死亡。應(yīng)用2種不同劑量的GM604(1mg/kg和5mg/kg)。由于需要大量的動物進行研究，所以使用了雄性和雌性小鼠。行為分析旋轉(zhuǎn)棒就行為分析而言，在疾病發(fā)作前(80天)并且每隔三天對動物進行一次測試，直到動物死亡。針對小鼠保持在旋轉(zhuǎn)棒上的能力對其進行測試。就旋轉(zhuǎn)棒測試而言，使小鼠經(jīng)歷l周的學(xué)習(xí)時間，其后，它們能夠在加速的旋轉(zhuǎn)棒上表演。每隔三天進行一次測試，測試小鼠，直到它們在三次連續(xù)的嘗試中不能在旋轉(zhuǎn)棒上保持10秒鐘以上為止，將這種情況確定為旋轉(zhuǎn)棒失敗。將最長的時間設(shè)定為180秒。記錄處理組的分值，并將中值繪制為年齡的函數(shù)。抓力檢驗使用抓力計(SanDiegoInstruments)，一周兩次測定小鼠前肢的力量(單位為牛頓)。上述測定測出了當(dāng)拉住小鼠的尾巴將其直線拉離傳感器時，小鼠前肢施加到桿上的力量峰值。在經(jīng)歷4次嘗試后，采用最高的結(jié)果來進行分析。鼠尾測試?yán)∈笪矊⑿∈筇嶂量罩校z測后肢的伸展情況。將后肢缺少伸展確定為鼠尾檢驗失敗。臨床評價基于以下標(biāo)準(zhǔn)，對小鼠進行分值為Q至4的臨床評分。未見虛弱跡象(G);顫抖和喪失張開反射(l);一只后肢輕癱(2);兩只后肢輕癱(3);—只或兩只后肢癱瘓(4)。在水平4的情況下處死小鼠，以用于人為目的。組織學(xué)在上述研究結(jié)束時，處死動物，并將脊髓固定于4%的多聚甲醛中，以用于分析。所述研究中動物的排除基于若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動物在本研究中沒有動物被排除統(tǒng)計分析將所得的結(jié)果表示為平均值士該平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。采用t檢驗來分析在發(fā)作年齡、死亡年齡和行為表現(xiàn)方面的差異顯著性。ALS小鼠模型<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>結(jié)束疾病發(fā)作的年齡死亡的年齡行為缺陷組織學(xué)分析已經(jīng)將所有的測試組都提供給NTS;將GM604以固體材料的形式提供給NTS。測試組中所有的動物均以上文指示給藥。結(jié)果ALS研究。對上述研究中ALS的相對嚴(yán)重程度進行評估。數(shù)據(jù)得自靜脈內(nèi)注射栽體或GM604的ALS小鼠。疾病發(fā)作的年齡與栽體注射組相比，在使用GM604(1和5mg/kg)治療的ALS小鼠中，疾病發(fā)作的年齡明顯延長。1至5mg/kg的GM604顯示出疾病發(fā)作年齡的劑量依賴式延遲(參見表7)。疾病發(fā)作的概況示于表13中。疾病發(fā)作年齡增大的百分比列于表7中。如表7所示，與栽體相比，1或5mg/kg的GM604使疾病發(fā)作的年齡分別增大12%或27%。表7.ALS小鼠中疾病發(fā)作的年齡<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>增大的百分比與各載體對照動物相比*與組1(栽體)相比死亡的年齡與載體注射組相比，在使用GM604(1和5mg/kg)治療的ALS小鼠中，死亡的年齡明顯延長。1至5mg/kg的GM604顯示出死亡年齡的劑量依賴式延遲(參見表8)。死亡的年齡繪制于圖14中。死亡年齡延長的百分比列于表8中。如表8所示，與栽體相比，l或5mg/kg的GM604使死亡的年齡分別增大16°/?；?0°/。。表8ALS小鼠中死亡時的年齡<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>增大的百分比與各載體對照動物相比*與組1(載體)相比死亡率在本研究中未發(fā)生涉及疾病的死亡。行為測試旋轉(zhuǎn)才奉使小鼠經(jīng)歷旋轉(zhuǎn)棒測試。對動物保持在旋轉(zhuǎn)棒上的能力進行測試，最長時間為180秒。在旋轉(zhuǎn)棒測試中對動物進行測試，這可以用于測定運動功能。裝置(DS37型)由直徑為2.5cra的棒構(gòu)成，該棒被直徑為25cm的圓盤分成6個分隔間。使所述的棒以22rpm的恒定速度旋轉(zhuǎn)。在第80天開始對動物每周進行2次測試。記錄它們在旋轉(zhuǎn)棒上保持的時間(最長為180秒)。如圖15所示，所有的動物都能高效地通過旋轉(zhuǎn)棒測試，直到疾病發(fā)作為止(參見圖15)。表9.在ALS小鼠中的旋轉(zhuǎn)棒分析<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>增大的百分比與各載體對照動物相比*與組1(載體)相比抓力在疾病進行過程中并在GM604存在下，檢查小鼠的抓力。與對照小鼠相比，使用GM604處理的ALS小鼠顯示出在抓力減小方面明顯延遲(參見圖16A和表10)。總之，與對照動物相比，使用1或5mg/kg的GM604處理的小鼠表現(xiàn)更好。表10.ALS小鼠的抓力<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>增大的百分比與各載體對照動物相比*與組1(載體)相比臨床評價在疾病進行過程中并在GM604存在下，檢查小鼠的臨床評分。與對照動物相比，使用GM604處理的ALS小鼠顯示出在臨床評分減小方面明顯延遲(參見圖16B和表11)。總之，與對照動物相比，使用1或5mg/kg的GM604治療的小鼠表現(xiàn)更好。表11.ALS小鼠的臨床評分<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>增大的百分比與各載體對照動物相比*與組1(載體)相比MNTF為這樣的營養(yǎng)因子，其能夠提供保護從而免于神經(jīng)疾病，并且可以使神經(jīng)元組織在損傷或移植后能夠再生。在此所進行的研究證明了MNTF6聚體類似物GM604以有效且高效的方式保護脊髓免于受到ALS的有害作用和的能力。每天靜脈內(nèi)注射施用1和5mg/kg的GM6(M證明了通過增大疾病發(fā)作的年齡、死亡年齡和行為參數(shù)而在ALS小鼠模型中產(chǎn)生呈劑量依賴方式的保護作用。這些研究證明，GM604在ALS方面具有有利的作用。當(dāng)通過靜脈內(nèi)進行施用時，發(fā)現(xiàn)GM604在小鼠中具有對抗ALS的保護作用。實施例5A小鼠帕金森氏疾病模型在帕金森氏疾病(PD)模型中測試GM6(FSRYAR，SEQIDNO:2)(CSBioCo.，MenloPark,CA)的效力。為了測定GM6在PD中的效力，向小鼠注射1-曱基-4-苯基-1，2，3，6-四氬吡咬(MPTP)以誘導(dǎo)PD,然后靜脈內(nèi)注射幾種不同劑量的GM6，從而測定其在減輕PD方面的作用。對5天(每天2次)進行靜脈內(nèi)(i.v.)施用GM6(1'5，10或20mg/kg)的情況進行測試。施用GM6證明了其以劑量依賴方式減輕小鼠的PD,其中20mg/kg顯示出最大的效力。行為、生物化學(xué)和組織學(xué)分析證明了減輕作用，說明了GM6在PD中的獨特作用。這些數(shù)據(jù)表明，在i.v.注射之后GM6在PD小鼠模型中的有效性，并且可以成為用于PD患者的有效治療。用于本實施例的縮寫/術(shù)語。"MNTF，，是指運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子。"GM6"和"6聚體"分別是指MNTF的6個氨基酸的肽類似物。"PD"是帕金森氏疾病。"MPTP"是指1-甲基-4-苯基-l，2，3，6-四氫吡啶。"D0PAC"是指二氫基苯乙酸。"HVA"是指多巴胺。"DA"是指高香草酸。"Genervon，，和"GB，，分另寸是指GenervonBiopharmaceutica1s，LLC。"I.V."是指靜脈內(nèi)。測定運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)的6氨基酸類似物(GM6)的能力，從而測定GM6在帕金森氏疾病(PD)的小鼠模型中的效力。帕金森氏疾病(PD)GM6為合成的6個氨基酸的肽(MNTF)。將GM6以固體形式提供給NTS,并且制劑(儲存在4。C下的溶液)由NTS制備。治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和紊亂的主要障礙是難以將藥物傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。測定藥物的生物利用度和其對各種神經(jīng)紊亂的作用對于潛在的治療發(fā)明而言是重要的。對通過靜脈內(nèi)注射的GM6在PD小鼠模型中的效力進行評估。方法和材料研究設(shè)計。按照下文所述向雄性C57BL/6小鼠注射MPTP，并檢測指示劑量的GM6對PD的保護作用。針對行為表現(xiàn)、生物化學(xué)和組織學(xué)方面的變化來檢測這些動物。MPTP治療。對C57BL/6小鼠進行注射(i.p.，以20mg/kg的量溶于0.lml的水中，以2小時的時間間隔注射4劑量的卜甲基-4-苯基-l，2,3，6-四氫吡啶，MPTP，SigmaM-0896)，并在注射后對這些小鼠進行每周一次的檢測。各組中的對照小鼠接受4次i.p.注射鹽水。在注射后，將小鼠置于加熱毯上24小時。施用MNTF。對于MNTF(GM6)處理，使小鼠每天接受兩次(12hr間隔)靜脈內(nèi)注射溶于鹽水中的各種劑量(1、5、10或20mg/kg)的MNTF,這種注射是在第一次MPTP注射后的30分鐘開始，并在最后一次注射MPTP后再持續(xù)額外的4天；對照小鼠僅接受鹽水。N-10/組。行為測試。將雄性小鼠用于行為測試中。將所有的動物都保持在12小時的光-暗循環(huán)(在7點至19點為光照)中，并允許它們自由進食和進水。為了評價自發(fā)的運動活性，我們使用了由4個Plexiglas氣缸(23cmx30cm，直徑x高)構(gòu)成的活性監(jiān)測器，其中每個氣缸都裝配有三個紅外線光束和自動計數(shù)系統(tǒng)。通過將小鼠放置到氣缸中來開始自發(fā)活性測試。在3min的環(huán)境適應(yīng)之后，通過計數(shù)在每5min內(nèi)穿過光電池裝置中的紅外線光束的次數(shù)來對活性進行評估。為了評98估感覺運動協(xié)調(diào)性，在旋轉(zhuǎn)棒任務(wù)中評價小鼠。使用由旋轉(zhuǎn)軸(直徑為7.3cm)和5個單獨的分隔間構(gòu)成的旋轉(zhuǎn)棒單元，一次對5只小鼠進行測試。在每天訓(xùn)練兩次，并持續(xù)兩天(第一天速度為12rpm,第二天速度為18rpm)之后，在第三天測試期間，將測試的旋轉(zhuǎn)速度增大至25rpm。對每只小鼠都進行3次實驗，每次間隔5分鐘，每次最長的實驗時間長度為60秒，并記錄每只小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上保持的時間。數(shù)據(jù)以三次測試實驗后在旋轉(zhuǎn)棒上的平均時間示出。腦一元胺的定量將切開的腦區(qū)域在0.1M的高氯酸和0.lmM的EDTA中(10mg/100Ml)超聲。然后將提取物離心15分鐘，并收集上清液，然后將其儲存在-20。C下。采用電化學(xué)檢測方法，使用高壓液相色i普(HPLC)測定一元胺(多巴胺，[DA])和代謝物(二氬苯乙酸[DOPAC]，高香草酸[HVA])。免疫組織化學(xué)法。將所有小鼠(1/2腦)滴落固定于4%的PFA中。將所述的腦在4。C的4%的PFA中固定12h,然后儲存在溶解于PBS中的30°/。的蔗糖中。切下50微米切片，并使用1:IOOO稀釋的TH抗體(SigmaT-1299)進行處理用于免疫組織化學(xué)。使用單克隆抗TH的抗體來顯現(xiàn)酪氨酸氫化酶(TH)的免疫反應(yīng)性。采用圖像分析，對黑質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)中的TH免疫陽性細(xì)胞進行初步定量。將切片干燥，并固定于Depex中。使用計算機輔助的立體工具盒來進行細(xì)胞計數(shù)。所有細(xì)胞的計數(shù)都是在對藥物處理為盲的條件下進行的，并且是在100倍放大下進行的。統(tǒng)計分析。將所得的結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)的形式表示。采用t檢驗來分析數(shù)據(jù)中的差異顯著性。所述研究中動物的排除基于以下若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動物在研究結(jié)束前(在任何時間點上)死亡的動物；在施用測試制品后產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥的動物。處理組。所有的組都經(jīng)歷GM6或者作為對照。將栽體或MNTF以所述的劑量經(jīng)尾靜脈對動物(60只動物)給予靜脈內(nèi)推注給藥。對動物每天注射2次，并持續(xù)5天。使用GM6(其為示例性的MNTF6-聚體FSRYARSEQIDNO:2)的小鼠PD模型組別化合物劑量(mg/kg)途徑C57BL/6小鼠1(n=10只小鼠)栽體0IV2(n=10只小鼠)示例性MNTFGM6FSRYAR1mg/kg/天IV3(n=10只小鼠)示例性MNTFGM6FSRYAR5mg/kg/天IV4(n=10只小鼠)示例性MNTFGM6FSRYAR10mg/kg/天IV5(n=10只小鼠)示例性MNTFGM6FSRYAR20mg/kg/天IV6(n=10只小鼠)對照對照NA結(jié)束小鼠中PD的調(diào)節(jié)將所有的測試組都提供給NTS;將GM6以固體材料的形式提供給NTS。測試組中所有的動物都如上文指示給藥。行為測試。對GM6在MS小鼠模型中的效力進行評估。數(shù)據(jù)得自i.v.施用載體或GM6(以指示的劑量)的小鼠。行為分析在使用MPTP誘導(dǎo)PD之后，向小鼠施用上文指示劑量的GM6。從第2天開始并且每天都對動物進行檢測，以測定在給予MPTP和GM6之后動物的行為。在MPTP施用的當(dāng)天開始，向小鼠注射GM6，并持續(xù)5天。在最后一次MPTP注射后的30min開始施用GM6,并再持續(xù)另外的4天。如表12和13所示，與對照動物或經(jīng)處理的動物相比，使用栽體治療的小鼠在行為評分(參見自發(fā)活性和旋轉(zhuǎn)棒測試圖)方面顯示出明顯的增加。使用GM6的處理顯示出在行為方面明顯的改善(減輕)。5、10和20mg/kg的GM6顯示出是明顯有利的，而lmg/kg則沒有顯示出任何改善。自發(fā)運動活性100<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>脈內(nèi)施用推注劑量為1、5、10和20mg/kg的GM6證明PD行為、生物化學(xué)和組織學(xué)以劑量依賴方式降低。這表明，GM6通過靜脈內(nèi)施用能夠有效地限定PD在小鼠中的程度，并且有利于治療這些疾病。當(dāng)通過靜脈內(nèi)進行施用時，發(fā)現(xiàn)GM6在PD小鼠模型中是有效的。GM6的效力是劑量依賴方式的，并且表明GM6有利于PD。實施例5B在帕金森氏疾病的細(xì)胞培養(yǎng)物模型中測試MNTF行對MNTF在帕金森氏疾病(PD)的細(xì)胞培養(yǎng)物模型中的效力進行測試。為了測定MNTF在PD細(xì)胞培養(yǎng)物模型中的效力，使SH-SY5Y細(xì)胞在豬毛菜酚(IOO]LiM)中暴露24小時。將細(xì)胞用不同濃度的MNTF處理，以及未經(jīng)MNTF處理，然后針對細(xì)胞的生存能力進行測試。在暴露24小時之后，豬毛菜酚誘導(dǎo)了SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞死亡。將MNTF加入到所述的培養(yǎng)物中顯示了以劑量依賴方式保護對豬毛菜酚的暴露。此外，使用渥曼青霉素(PI3K)進行處理破壞了MNTF的作用。這些數(shù)椐表明，MNTF在施用豬毛菜酚之后的PD細(xì)胞培養(yǎng)物模型中具有神經(jīng)保護作用，并且可以通過PI3K途徑起作用。用于本實施例的縮寫/術(shù)語。"MNTF"是指運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子。"PD"是帕金森氏疾病。"GB，，分另寸是指GenervonBiopharmaceuticals，LLC。"CV"是指細(xì)胞生存能力。"GM，，是指MNTF。"WRT"是指渥曼青霉素。"Sal"是指豬毛菜酚。大量的研究證明了MNTF在大鼠的各種神經(jīng)系統(tǒng)中的效力，其中所述的神經(jīng)系統(tǒng)包括外周坐骨神經(jīng)、外周肌皮神經(jīng)、頭部和面部神經(jīng)、頭部舌下神經(jīng)以及控制頸部、胸腔和上肢中的肌肉的部分脊髓(Wangetal.，1995)。此外，在具有雙隱性基因的wobbler小鼠(NIH)達到16周齡時給予其一劑量的35ng的MNTF，會終止上述品系小鼠的神經(jīng)退行性遺傳疾病。獨立研究組使用其自己建立的檢測和方案來實施以下CNS和PNS實驗l.在GM6血腦屏障滲透的研究中，靜脈內(nèi)施用單次推注劑量為0.2和2mg/kg的GM6證明了在4小時后，腦中GM6的水平以劑量依賴方式增大。2.在中腦動脈阻塞(M0AC)小鼠中風(fēng)模型中，在IV注射GM6處理后，會減小腦中梗塞體積，并以劑量依賴方式減少神經(jīng)缺損。與栽體相比，高劑量的GM6會將腦中梗塞體積減小74%,并顯著減小神經(jīng)缺損(p<0.0001)。3.L-2-羥基戊二酸(LGA)誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。在斑馬魚生物分析中，GM6保護了CNS中由LGA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并將中腦中的細(xì)胞凋亡減少85%。4.在具有8mm間隙的大鼠坐骨神經(jīng)橫切研究中，GM6處理的動物會以劑量依賴方式顯著地改善運動神經(jīng)元的再生(在最佳劑量下P<0.0002)，并促進DRG神經(jīng)元的再生。5.在橫切的股神經(jīng)大鼠模型中，在GM6處理的動物中，正確投射到肌肉中的運動神經(jīng)元的數(shù)量呈現(xiàn)劑量應(yīng)答的方式。在最佳劑量下，正確投射到肌肉中的運動神經(jīng)元的數(shù)量是不正確地投射到皮膚中的運動神經(jīng)元數(shù)量的3倍(p〈0.0001)。6.在斑馬魚生物分析中，GM6保護了PNS中由LGA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并將外周肌神經(jīng)接合點的細(xì)胞凋亡減少49%。7.得自患有CNS紊亂的患者的腦脊液(CSF)含有可溶性因子，這些因子誘導(dǎo)了神經(jīng)突損壞和神經(jīng)元死亡。GM6顯著地增強了患者CSF中細(xì)胞的存活亨廷頓氏疾病(271%)、MS(246%)、中風(fēng)(205°/。)、帕金森氏疾病(198W、阿茲海默氏疾病(191%)和ALS(175%)。這些數(shù)據(jù)表明，MNTF能夠保護神經(jīng)元細(xì)胞對抗由神經(jīng)紊亂患者的CSF所刺激的細(xì)胞死亡，我們在動物實驗中的發(fā)現(xiàn)強烈地證實了這一點。GMP級別的GM6(在本報道中也稱為MNTF)在帕金森氏疾病的細(xì)胞培養(yǎng)物模型中的效力(Shavalietal.，2003)。進行所述的研究以測試MNTF保護SH-SY5Y細(xì)胞免受損害的能力。MNTF以固體的形式提供，并制備制劑(儲存在4。C下的溶液)。方法和材料<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>結(jié)束細(xì)胞數(shù)量將所有的測試組都提供給NTS;將MNTF以固體形式提供給NTS。測試組中所有的培養(yǎng)物都如上文指示給藥。豬毛菜酚和渥曼青霉素得自Sig歸。GM6-示例性MNTF(FSRYAR,SEQIDNO:2)。結(jié)果PD的細(xì)胞培養(yǎng)物模型。PD研究。當(dāng)將SH-SY5Y細(xì)胞與GM6±豬毛菜酚(Sal)—起培養(yǎng)時，對該細(xì)胞生存能力的相對變化進行評估。數(shù)據(jù)得自使用載體或MNTF(GM6)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物。細(xì)胞的生存能力。將細(xì)胞培養(yǎng)物在各種濃度的GM6(0.1至10mg/ml)±豬毛菜酚(IOOnM)、以及渥曼青霉素(WRT，10uM)中溫育，并測定細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，與對照處理細(xì)胞相比，GM6顯示出使細(xì)胞數(shù)量以劑量依賴方式增多。與對照處理細(xì)胞相比，10mg/ml使細(xì)胞數(shù)量增多19.2%。使用1OmM的渥曼青霉素處理細(xì)胞抑制細(xì)胞數(shù)量的增多，表明GM6針對PI3K的作用。使用lOOiaM的豬毛菜酚處理所述的細(xì)胞，證明多巴胺能SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞生存能力降低。在使用豬毛菜酚處理24小時后，細(xì)胞的數(shù)量減少63.7%。向所述的細(xì)胞中加入GM6抑制由Sal誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并顯著地增加細(xì)胞的存活，這可由MTT分析來評估。濃度為lOOiaM的SAL將細(xì)胞的生存能力降至36.5%,并且將濃度為IOOmM的SAL與濃度為0.1，1.0和10.0mg/ml的GM6進行共同處理，分別使細(xì)胞的生存能力增大至66%、85%和95%(參見圖17)。WRT(10yM)阻斷了GM6的神經(jīng)保護作用(參見圖17)。表16.GM6和豬毛菜酚處理后細(xì)胞生存能力變化的百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>*組7-10中細(xì)胞數(shù)量變化的百分比與豬毛菜酚處理的細(xì)胞(組6)相比較。**組2-5中細(xì)胞數(shù)量變化的百分比與載體處理的細(xì)胞(組1)相比較。加入100juM的豬毛菜酚(Sal)，加入IOmM的渥曼青霉素(WRT)。MNTF(GM)為這樣的營養(yǎng)因子，其能夠提供保護從而免于神經(jīng)疾病，并且使神經(jīng)元組織在損傷或移植后再生。在此所進行的研究證明了MNTF以有效且高效的方式保護多巴胺能神經(jīng)元(SH-SY5Y細(xì)胞)免于受到PD(豬毛菜酚)有害作用的能力。24小時施用劑量為0.1、l和10mg/ml的MNTF證明了通過增加細(xì)胞數(shù)量而在SH-SY5Y細(xì)胞中以劑量依賴方式對由豬毛菜酚所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的保護作用。這些研究表明，MNTF在PD中具有有利的作用。當(dāng)進行施用時，發(fā)現(xiàn)MNTF(GM6)具有對抗細(xì)胞死亡(豬毛菜酚誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡)的PD細(xì)胞培養(yǎng)物模型的保護作用。實施例6測試MNTF對抗CSF損傷的保護作用針對GM6在神經(jīng)元損傷模型中的效力進行測試。在原代神經(jīng)元細(xì)胞中，對得自對照組以及8個神經(jīng)紊亂組的每一個組中的5個疾病特異性人患者腦脊液(CSF)樣品進行測試，從而測定對神經(jīng)元細(xì)胞死亡的作用。此外，針對對抗由CSF誘導(dǎo)的損傷的保護作用，對GM6的作用進行檢測。當(dāng)將CSF以10%溶液的形式應(yīng)用時，得自8個不同神經(jīng)疾病的疾病特異性人的CSF誘導(dǎo)了神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。GM6提供了保護從而免于受到該損傷。這些研究表明得自患有神經(jīng)紊亂的人的CSF包含誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的某些因子，并且GM6能夠保護對抗這些作用。這些研究進一步表明GM6在神經(jīng)疾病模型中的效力。用于本實施例的縮寫/術(shù)語。"MNTF"是指運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子。"GM6，'和"6聚體"均是指MNTF的示例性6個氨基酸的肽類似物FSRYAR(SEQIDNO:2)。"CSF"是指腦脊液。"Genervon，，和"GB，，分另'J是指GenervonBiopharmaceuticals，LLC。"NCC"是指神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物。測試MNTF在對抗CSF損傷中的保護作用使用死后CSF樣品(得自9個研究組的每一個組中的5個疾病特異性患者/供體)以及由UCLAH畫nBrainandSpinalFluidResourceCenter(LosAngeles,CA)提供的鑒定、臨床診斷和神經(jīng)病理學(xué)診斷文件，進行研究以評估MNTF肽在CSF損傷的保護中的能力。在原代神經(jīng)元細(xì)胞中測試CSF樣品，從而測定對神經(jīng)元細(xì)胞死亡的作用。此外，針對對抗由CSF誘導(dǎo)的損傷的保護作用來檢測MNTF6聚體/GM6的作用。GM6在GMP認(rèn)證下化學(xué)合成(CSBioCo.，MenloPark，CA,GMP013,lotC811)。在NeurologicalTestingService,Inc(NTS,Charleston,SC)的合同下進行上述研究。將GM6以固體形式提供給NTS，并且制劑(儲存在4。C下的溶液)由NTS來制備。方法和材料研究的設(shè)計SpragueDawley大鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞由18天大的胚胎胎兒(embryonicfetuses)中分離得到，并在培養(yǎng)物中生長12天。將得自對照和各種神經(jīng)紊亂供體的死后CSF應(yīng)用到培養(yǎng)物中，并檢測神經(jīng)元生存能力。此外，將MNTF加入到所述的培養(yǎng)物中，以保護所述的細(xì)胞免于受到損傷。體外方法由18天大的Sprague-Dawley大鼠胎兒制備神經(jīng)元培養(yǎng)物。將大鼠胎兒中腦切開，并在由21!^/1111胰島素溶于不含0&2+-和1^2+-的Hank平衡鹽溶液(HBSS)中形成的溶液中溫育15分鐘，其中所述的Hank平衡鹽溶液(HBSS)使用了lOmM的HEPES(GIBCOLifeTechnologies,Paisley,Scotland)進行緩沖。然后，將所述的組織在大豆胰島素抑制劑(lmg/mL，溶于HBSS)中暴露2分鐘，并在HBSS中漂洗3次。通過研碎使細(xì)胞分離，然后將這些細(xì)胞分配到96孔或24孔聚-L-賴氨酸涂敷的塑料培養(yǎng)板(Costar，Cambridge,MA)中。最初的涂布密度為大約160-180個細(xì)胞/mm2。在涂布時，每個孔中都包含0.2ml的DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCOLifeTechnologies,NY)，其中所述的培養(yǎng)基補充有100ml/L的胎牛血清(SigmaChemicals,St.Louis,M0)。在24小時之后，用0.15ml的2%v/vB-27神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基替代DMEM/F12培養(yǎng)基，其中所述的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基補充有2mM的GlutaMAX和0.5%w/vD-(+)葡萄糖(GIBC0LifeTechnologies)。每周2次，使用相同組成的新配制培養(yǎng)基取代其中2/3的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在培養(yǎng)12天之后，將培養(yǎng)物用于神經(jīng)毒性實驗。在研究之前、在研究過程中以及當(dāng)將原始數(shù)據(jù)提供給贊助人時，NTS的研究人員并不清楚所述的材料。UCLAHumanBrainandSpinalFluidResourceCenter(LosAngeles，CA)提供了死后CSF樣品(其得自9個研究組的每一個研究組中5個供體)，以及鑒定、臨床診斷和神經(jīng)病理學(xué)診斷文件。在運輸之前，將樣品儲存在-170°C，并使用干冰來運送。所述的研究組為對照(無神經(jīng)紊亂)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、神經(jīng)病(NP)、多發(fā)性硬1<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>化(MS)、阿茲海默氏疾病(AD)、Batten疾病(BD)、亨廷頓氏疾病(HD)、帕金森氏疾病(PD)以及腦缺血(中風(fēng))。為了測試CSF對神經(jīng)元細(xì)胞存活的作用，將CSF加入到處于含有10°/。CSF的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物中。將CSF加入到所述的培養(yǎng)物中，并在48小時后進行檢測。取得培養(yǎng)物的圖像，然后使該培養(yǎng)物經(jīng)歷MTT分析(參見下文)，從而測定細(xì)胞死亡％。將額外的培養(yǎng)物與MNTF(IOOnM)溫育，其中所述的MNTF是在加入CSF之前2小時加入到培養(yǎng)物中的。MTT分析。按照上文所述測定原代神經(jīng)元的生存能力。用使用栽體刺激的細(xì)胞所得到的值作為100%，以一式三份測定存活細(xì)胞的相對數(shù)量。通過MTT分析，在處理的第2天對細(xì)胞的存活進行估測。將MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑)在Hank平衡鹽溶液(Biochrom)中稀釋至200mM，并在37。C下將其在2個小時內(nèi)加入到培養(yǎng)物中。通過加入二甲亞砜由所述的細(xì)胞中釋放出MTT曱臢產(chǎn)物，并在570nm處在introspectIII分光光度計(Pharmacia)中測定上述產(chǎn)物。然后測定與未經(jīng)處理的對照相對比的相對存活情況。統(tǒng)計分析。所得的結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來表示。使用t檢驗來分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。處理組。神經(jīng)元損傷模型<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>MTT分析為了測定在大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中由CSF誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的百分比，釆用MTT分析來分析培養(yǎng)物。如圖18所示，與對照樣品相比，得自對照患者的CSF沒有誘導(dǎo)出任何合適的細(xì)胞死亡。但是，得自各種神經(jīng)紊亂的CSF則誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致不同程度的細(xì)胞損傷(參見表17和圖18)。如所述的圖和表所示，MS誘導(dǎo)了最多的細(xì)胞損失(70%)，而NP則誘導(dǎo)了最少量的細(xì)胞死亡(32W。這些數(shù)據(jù)表明，神經(jīng)紊亂刺激或?qū)е铝四軌蛘T導(dǎo)或加劇神經(jīng)元細(xì)胞損失的化合物的釋放。表17.由CSF誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損失CSF劑量細(xì)胞存活的y。(平均值土sD)p值(降低的y。)對照10%92.00±9.1810(0)ALS10%41.33±13.76<0.0001(55)NP10%62.73±13.42<0.0001(32)MS10%27.40±7.149<0.0001(70)AD10%37.53±12.45<0.0001(59)BD10%57.00±8.443<0.0001(38)HD10%29.40±10.35<0.0001(68)PD10%39.67±11.45<0.0001(57)中風(fēng)10%39.07±11.13<0.0001(57.5)MNTF對神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中的CSF的作用。在神經(jīng)元細(xì)胞損傷的體外模型中，評估MNTF對神經(jīng)元細(xì)胞死亡中的CSF的作用。在加入CSF之前2小時，將MNTF以100nM的量加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中。將CSF以占總體積10。/。加入到原代大鼠神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中。針對細(xì)胞死亡，通過顯微鏡分析和MTT分析對細(xì)胞進行檢測。顯微鏡分析將神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物用100nM的MNTF處理2小時，然后加入得自對照或各種神經(jīng)紊亂的10%的CSF,持續(xù)48小時，再對細(xì)胞損失進行評估。在細(xì)胞經(jīng)歷CSF前處理的條件下，MNTF對細(xì)胞存活具有明顯的作用。112MTT分析為了測定在經(jīng)CSF處理的大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中由MNTF誘導(dǎo)的細(xì)胞保護的百分比，采用MTT分析來分析培養(yǎng)物。如圖2所示，在由得自對照神經(jīng)紊亂患者的CSF所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中，MNTF對神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物提供了一定水平的保護作用(參見表18和圖19)。如圖19和表18所示，MNTF增強細(xì)胞存活，在HD的CSF中最多(271%),在MS(246W、Stroke(205W、Parkinson(198%)、Alzheimer(191%)和ALS(175。/。)的CSF中顯著，而MNTF在BD的CSF中增強細(xì)胞存活最少(114%)。這些數(shù)據(jù)表明，MNTF能夠保護神經(jīng)元細(xì)胞對抗由神經(jīng)紊亂患者的CSF所刺激的細(xì)胞死亡。表18.由MNTF引起的神經(jīng)元細(xì)胞保護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>MNTF為這樣的營養(yǎng)因子，其能夠提供保護從而免于神經(jīng)疾病，并且可以使神經(jīng)元組織在損傷或移植后再生。在此所進行的研究證明了害作用的能力。在多數(shù)情況下，體外應(yīng)用100nM的GM6證明了對神經(jīng)元細(xì)胞的保護作用。這表明，GM6具有對抗多種神經(jīng)紊亂的保護作用。當(dāng)在體外施用至神經(jīng)元細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)GM6具有對抗得自神經(jīng)疾病的CSF的保護作用。實施例7MS模型在小鼠多發(fā)性硬化(MS)模型中測試GM6(CSBioCo.，MenloPark,CA)的效力。為了測定GM6在MS中的效力，向小鼠注射髓鞘蛋白脂蛋白(PLP)以誘導(dǎo)MS,然后靜脈內(nèi)注射若干劑量的GM6以測定對減輕MS的影響。對靜脈內(nèi)(i.v.)施用的7個劑量(每天一次)的GM6(1，5，10或20mg/kg)進行測試。在這些小鼠中，施用GM6證明了呈劑量依賴方式的減輕MS，并且其中20mg/kg的劑量顯示出最大的效力。臨床和組織學(xué)分析都證明了減輕，表明了GM6在MS中的獨特作用。這些數(shù)據(jù)表明，在i.v.注射后的MS小鼠模型中，GM6是有效的，并且可以是MS患者的有效治療方法。用于本實施例的縮寫/術(shù)語。"MNTF"是指運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子。"GM6"和"6聚體"均是指MNTF的示例性6個氨基酸的肽類似物。"MS"是指多發(fā)性硬化。"EAE"是指實驗性自體免疫腦脊髓炎。"PLP"是指髓鞘蛋白脂蛋白。"Genervon，，和"GB，，分另'J是指GenervonBiopharmaceuticals，LLC。"I.V."是指靜脈內(nèi)。本實驗的設(shè)計將對運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)的6氨基酸類似物(GM6)的能力進行評估，以測定GM6在多發(fā)性硬化的小鼠模型中的效力。GB測試制品為合成的6個氨基酸肽(MNTF)(CSBioCo.，MenloPark,CA)。評估通過靜脈內(nèi)注射的GM6在MS小鼠模型中的效力方法和材料研究設(shè)計。按照上文所述向雌性'SJL/J小鼠注射PLP，并檢測指示劑量的GM6對由EAE誘導(dǎo)的MS所產(chǎn)生的保護作用。針對臨床表現(xiàn)和組織學(xué)變化對動物進行檢測。實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)的誘導(dǎo)。在本實驗中，使用雌性S幾/J小鼠(8-10周齡，theJacksonLaboratory)。使用EAE誘導(dǎo)和處理髓鞘蛋白脂蛋白(PLP)(pl39-151，HSLGKWLGHPDKF，SynPepCorporation)用于免疫。在雌性SJL/J小鼠中，通過皮下注射溶解于弗氏完全佐劑中的25pg的PLP來誘導(dǎo)EAE(CFA，DifcoLaboratories)。在免疫的當(dāng)天和48h之后，將溶于磷酸緩沖鹽水(PBS)中的200ng的百日咳毒素(PT，ListBiologicallaboratories,Inc)注射到小鼠的尾靜脈中。MNTF的施用。將小鼠隨機分成以下幾組MNTF處理組(n=10/組)在臨床癥狀發(fā)作(評分$1)的當(dāng)天開始，在連續(xù)7天內(nèi)靜脈內(nèi)施用MNTF,這使得該處理方案具有臨床相關(guān)性。根據(jù)初步研究，MNTF的劑量為1、5、10或20mg/kg。EAE對照組(n=10):使用與實驗組相同體積的鹽水來對EAE小鼠進行處理。臨床觀察。針對EAE的臨床跡象每天觀察小鼠，并且每2天對小鼠稱重。如下確定臨床評分0,未發(fā)現(xiàn)EAE跡象；1，受到影響的尾強直；2,尾癱瘓；3，后肢中度癱瘓；4，后肢重度癱瘓；5，一支后肢癱瘓；6，后肢完全癱瘓；7，后肢完全癱瘓和前肢輕癱；以及8，死亡。就臨床EAE評價而言，使用以下參數(shù)對每只動物而言，發(fā)作當(dāng)天被定義為首次表現(xiàn)出EAE癥狀的那一天。按照以下方法計算EAE持續(xù)時間每只動物被評分為疾病的天數(shù)除以評分的總天數(shù)，并以百分比的形式表示。累積發(fā)病率定義為在實驗期間產(chǎn)生EAE的動物的百分比。就每只動物而言，在實驗期間的平局評分計算為所有單次評分的115總和除以測量的次數(shù)。就每只動物而言，在實驗期間，最大評分被定義為最高的臨床評分。如果在實驗的整個過程中，小鼠死于EAE，則在所有以后的時間點都將這些小鼠指定為8分。如果小鼠在清楚地發(fā)作EAE癥狀之前死亡，則將這些小鼠從實驗中排除。在整個實驗過程中，所有的動物(包括嚴(yán)重EAE影響的動物)都自由進食和進水。組織學(xué)。20天后取出腦和脊髓，并在10。/。的緩沖的福爾馬林(Sigma)中固定。將石蠟包埋切片(6Mm厚)用H&E染色，從而評估腦和脊髓中的病變數(shù)量。對這些進行評分和記錄。統(tǒng)計分析。將結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來表示。采用t檢驗來分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。所述研究中動物的排除?；谝韵氯舾蓸?biāo)準(zhǔn)從研究中排除動物在研究結(jié)束前(在任何時間點上)死亡的動物；在施用測試制品后產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥的動物。處理組。所有的組都經(jīng)歷GM6或者作為對照。將栽體或MNTF以指示的劑量經(jīng)尾靜脈對動物(50只動物)靜脈內(nèi)推注給藥。小鼠MS模型。<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>結(jié)束對小鼠中MS的調(diào)節(jié)將所有的測試組都提供給NTS;將GM6以固體材料的形式提供給NTS。測試組中所有的動物都如上指示給藥。結(jié)果臨床評分。對GM6在MS小鼠模型中的效力進行評估。數(shù)據(jù)得自i.v.施用栽體或GM6(以所述的劑量)的小鼠。臨床分析GM6:在PLP誘導(dǎo)MS后，對小鼠施用指示劑量的GM6(參見圖23)。從第0天開始每隔一天對動物進行一次檢測，以測定動物的臨床評分。在注射PLP的當(dāng)天開始，在7天中，每天都向小鼠注射GM6。如圖23所示，使用載體處理的小鼠顯示臨床評分明顯增大。使用GM6進行治療顯示所述疾病明顯改善(減輕)(參見圖23)。5、10和20mg/kg的GM6顯示是明顯有利的，而lmg/kg的GM6卻沒有顯示出任何復(fù)原。表20示出了在使用GM6處理后產(chǎn)生急性疾病的小鼠的數(shù)量。如表20所示，10和20mg/kg顯示急性疾病小鼠的總數(shù)減少，但是慢性疾病小鼠的總數(shù)則沒有減少。表19.與載體處理動物相比，GM6施用的顯著性<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>表20.具有臨床跡象的小鼠/小鼠的總數(shù)(W—急性疾病<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>表21.具有臨床跡象的小鼠/小鼠的總數(shù)(%)—慢性疾病<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>死亡率本研究中沒有發(fā)生死亡。病變數(shù)量腦和脊髓中的病變數(shù)量通過計數(shù)來測定，并示于圖24A和24B中。隨著GM6劑量的增加，腦和脊髓中的病變數(shù)量減少。這表明，GM6保護腦和脊髓免于受到MS誘導(dǎo)的有害作用。表22.區(qū)域劑量病變#P值差異％(mg/kg)平均值±SD腦069.2010.99NANA162.30±9.2020.1454-10545.00±8.367<0.0001-351024.90±6.871<0.0001-642022.40±6.687<0.0001-68脊髓059.90±9.098NAM155.20±8.8170.2560-8536.90±7.385<0.0001-381024.50±6.671<0.0001-592019.90±8.517<0.0001一67MNTF為這樣的營養(yǎng)因子，其能夠提供保護從而免于神經(jīng)疾病，并且可以使神經(jīng)元組織在損傷或移植后再生。在此所進行的研究證明了MNTF(GM6)的6氨基酸類似物減輕小鼠模型中MS的效力。經(jīng)7天靜脈內(nèi)施用推注劑量為1、5、10或20mg/kg的GM6證明了在MS臨床評分和組織學(xué)中呈劑量依賴方式的減小。這表明，通過靜脈內(nèi)施用，GM6在限定小鼠MS程度方面的有效性，并且可以有利于治療該疾病。當(dāng)進行靜脈內(nèi)施用時，發(fā)現(xiàn)GM6在MS小鼠模型中是有效的。GM6的效力是劑量依賴方式的，這表明GM6有利于治療MS。實施例8在中腦動脈阻塞的小鼠模型中測試GM602(MNTF6聚體)。在中腦動脈阻塞(MCAO)的小鼠模型中測試GenervonBiopharmaceuticals，LLC測試制品GM602的效力。為了測定GM602在MCAO小鼠模型中的效力，使小鼠經(jīng)歷1小時的缺血和14天的再灌注。在再灌注開始后的0、3、6、12和24小時，經(jīng)尾靜脈推注向小鼠靜脈內(nèi)注射GM602,并檢測在腦血流量(CBF)、心率(HR)、血壓(BP)、p02、pC02，pH、神經(jīng)缺損(ND)和梗塞體積(IFV)方面的變化。檢測在缺血后的指定時間以及在3天中的每一天都靜脈內(nèi)(i.v.)施用GM602(5mg/kg)的神經(jīng)保護作用。施用GM602證明在CBF、HR、BP、p02、pC02、或pH方面沒有發(fā)生變化。在ND和IFV中檢測變化，其是時間依賴性的。在0、3、6和12小時，5mg/kg的GM602顯示出顯著保護作用免于梗塞損害，這解釋了對神經(jīng)缺損的保護作用。這些數(shù)據(jù)表明，在MCAO小鼠模型中，在i.v.注射后GM602對腦具有神經(jīng)保護作用?？s寫/術(shù)語縮寫/術(shù)語定義證F運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子MNTF6聚體MNTF的6氨基酸肽類似物GM602用于中風(fēng)的MNTF的6氨基酸肽類似物MCAO中腦動脈阻塞GBGenervonBiopharmaceuticalsLLCI.V.靜脈內(nèi)CBF腦血流量HR心率BP血壓ND神經(jīng)缺損IFV梗塞體積對GB測試制品GM602(其為運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子的6氨基酸肽類似物(MNTF6聚體；FSRYAR))保護腦免于受到急性缺血和再灌注損傷的能力進行測試。GM602在P認(rèn)證下化學(xué)合成(CSBioCo.，MenloParkCA，GMP013，1otC811)。將GM602以固體的形式提供，并由此制備制劑(其為儲存在4'C下的溶液)。方法和材料動物在實驗前，使重量為22-25克的C57BL/6小鼠(Jackson119Laboratory,BarHarbor,ME)均自由進食和進水。使用氟烷來麻醉動物(70%/30%卯2/02中1%的氟烷，通過面罩麻醉)。通過尾套裝置監(jiān)測平均動脈血壓(MABP)，并收集血液樣品，從而測定動脈pH水平、以及PaC。2和Pa02。使用VisitechSystem血壓監(jiān)測儀記錄MABP和心率。使用插入到顳肌肌肉中的直腸溫度計和熱敏探針來監(jiān)測腦的溫度。通過使用帶有水套的加熱墊，將動物的體溫保持在37°C。在缺血前的1小時至缺血后的6小時監(jiān)測腦的溫度，并每隔30分鐘記錄一次。實驗組所有的動物都經(jīng)歷了1.0h的缺血及24h的再灌注，并將動物隨機分成栽體組(n-10)，或靜脈內(nèi)注射了劑量為5mg/kg的GM602的處理組(n-lO)。NTS通過使用儲存在4。C下的(100%)鹽水溶液重構(gòu)GM602來配制GM6(CSBioCo.，MenloPark,CA，CS1507,GMP013，lotC811)作為原液。載體對照接受鹽水溶液。在再灌注開始后的0、3、6、12和24小時、以及損失后的三天中的每一天(損傷后)都通過尾進行IV推注GM602。研究者對處理組是盲的。缺血的誘導(dǎo)本研究涉及缺血的瞬時模型。對每只小鼠都進行麻醉，并分離出頸外動脈(ECA)和頸總動脈(CCA)。將熱敏探針插入到直腸和顳肌肌肉中，從而監(jiān)測肌體和腦的溫度，其中通過外部加熱，將所述的溫度保持在36-37°C。通過頸部正中切口使左側(cè)頸總動脈(CCA)暴露出來。對甲狀腺上動脈和枕動脈進行電凝集并分開。將顯微手術(shù)夾放置在頸外動脈(ECA)起源的周圍。將ECA的遠端用6-0絲綁結(jié)，并橫切。將6-0絲松散地系在ECA殘端的周圍。移開所述的手術(shù)夾，并將5-0尼龍縫合線(涂有有機硅)的經(jīng)燒邊的尖端溫和地插入到ECA殘端中。將環(huán)狀的6-0絲系緊在所述殘端的周圍，并且使尼龍縫合線進入并通過頸外動脈(ICA)中大約13mm(根據(jù)體重進行調(diào)節(jié))，直至所述的縫合線停留在前大腦動脈(ACA)中，由此阻塞了前交通動脈和中腦動脈。在將尼龍縫合線放置l小時后，其被拉回到ECA中，并封閉切口。組織學(xué)檢測關(guān)于組織學(xué)檢測，在誘導(dǎo)缺血之后的14天，采用腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)來麻醉動物。釆用穿心灌注的方式，使用4。C的10%的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)對腦進行灌注。取出所述的腦，并將其在-20。C下冷凍15分鐘，然后再放置到嚙齒動物腦矩陣中。制備冠狀切片(lmm厚)，并將其在37。C下用2%的氯化三苯基四氮唑(TTC)染色。由各腦獲得由梗塞的前緣直至尾部范圍的7個連續(xù)的lmm厚冠狀切片，其中所述的梗塞距額極2mm開始。將經(jīng)TTC染色的切片放置在10%中性的緩沖福爾馬林中，并在黑暗狀態(tài)下，在4'C下保持至少24小時。使用計算機輔助的圖像分析系統(tǒng)測定各切片中的梗塞的面積，其中所述的計算機輔助圖像分析系統(tǒng)由裝配有QuickCapture圖像采集卡的PowerMacintosh計算機、安裝在Olympus顯微鏡上的HitachiCCD照相機、以及照相機支架構(gòu)成。使用NIHImageAnalysisSoftware,v.1.55。獲取圖像，并在7個切片上測定損害的總面積。由對治療狀態(tài)為盲的單個操作者進行所有的測量。通過對切片的梗塞體積求和來計算梗塞體積。通過采用以下能夠消除水胂影響的公式來計算梗塞的尺寸00:(對側(cè)體積-同側(cè)未損傷的體積)X100/對側(cè)體積。腦血流量的測量通過使用激光多普勒血流儀監(jiān)測腦血流量(CBF)。CBF值以百分比的形式測定，這是因為由激光多普勒血流儀顯示的值并非為絕對值。如上文所述，使用氟烷來麻醉動物(70%/30%^2/02中的1%氟烷，通過面罩麻醉)。在與MCA阻塞同側(cè)的腦半球中，坐標(biāo)如下點A,前囪點后0.5mm、中線側(cè)部2mm;點B,前囪點后lmm、中線側(cè)部1.2mm;點D，前囪點后lmm、中線側(cè)部1.7mm;點C，在對側(cè)半球中，前囪點后lmm、距中線2mm。在缺血發(fā)作前測定CBF,并在灌注結(jié)束后的2小時持續(xù)測量。在注射化合物之前和注射之后進行測定(在缺血前15分鐘、至注射結(jié)束后30分鐘內(nèi)進行連續(xù)的測量，并且每30分鐘記錄一次)。將MCA阻塞后且在施用前的平均值作為基線值，此后的數(shù)據(jù)以基線值的百分比表示。行為評估121后的小鼠中測定行為分析(神經(jīng)缺損)情況。神經(jīng)學(xué)評分如下0,正常的運動功能；1,當(dāng)通過尾巴將動物提起來時，軀干和對側(cè)前肢彎曲；2，當(dāng)通過尾巴將動物按在平面上時，會發(fā)生對側(cè)偏轉(zhuǎn)，但在休息時保持正常的姿態(tài)；3，在休息時發(fā)生對側(cè)傾斜；4，沒有自發(fā)運動活性。所述研究中動物的排除基于以下若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動物在研究結(jié)束前(在任何時間點上)死亡的動物。將至死亡時收集的數(shù)據(jù)提供給GB;在阻塞后腦血流量沒有降低至基線值的20土5%(即，被認(rèn)為為非缺血)，或者是血流量沒有恢復(fù)至基線值的90±10%的動物；在缺血損傷后發(fā)展出癲癇狀行為的動物；在缺血過程中或缺血后片刻，檢測到過量出血的動物。統(tǒng)計分析將結(jié)果表示成平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。采用單因素協(xié)方差分析(A麗A)、再通過Fisher精確檢驗(Fisher'sposthoctest)來分析生理學(xué)和組織學(xué)數(shù)據(jù)中的差異顯著性。在監(jiān)測數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上計算重復(fù)測量的AN0VA，再通過Fisher精確檢驗評價多組中的差異顯著性。處理組。所有的組都經(jīng)歷GM602或者作為對照。以IV給藥方式給予動物(30只動物)以指示劑量的載體或GM602。小鼠中風(fēng)模型<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>結(jié)束MNTF對缺血和再灌注損傷的神經(jīng)保護作用。針對腦血流量(CBF)、心率(HR)、血壓(BP)、p02、pC02、pH、神經(jīng)缺損(ND)和梗塞體積(IFV)來評價動物。將所有的測試組都提供給NTS;將GM602以固體材料的形式提供給NTS。測試組中所有的動物都如上文指示給藥。結(jié)果小鼠中缺血的研究。對這些研究中的缺血的相對嚴(yán)重性進行評估。數(shù)據(jù)得自患有缺血損傷的小鼠，其中所述的小鼠靜脈內(nèi)注射載體或GM602。梗塞體積與載體注射組相比，在GM602組(0、3、6和12小時)中，腦中梗塞體積明顯減小。GM602顯示出在缺血后的0至12小時使梗塞體積呈劑量依賴性地減小(參見表l)。梗塞體積示于圖26中。在腦中梗塞體積減小的百分比示于表23中。如表所示，在0、3、6和12小時的GM602顯示出使梗塞尺寸減小70%、68%、58%和36%。24小時梗塞體積雖然減小，但是與載體處理動物相比沒有顯示出顯著性差異。表23.腦中梗塞減小的百分比組別劑量(mg/kg)梗塞體積(mm3)梗塞體積減小的百分比*P值,1074.26±12.090NA2522.05±7.29270.3%0.0013524.15±8.11067.5%0.0014531.03±9.25558.2%0.0015547.72±9.11835.7°/。0.0016564.13±12.5113.4。/00.0821減小的百分比與各自栽體對照動物相比。*與組1(栽體)相比。死亡率在本研究中未發(fā)生死亡。生理學(xué)參數(shù)。在缺血期間或者再灌注之后，栽體小鼠和經(jīng)治療的小鼠之間，生理學(xué)參數(shù)(腦血流量、平均動脈血壓、血液p02、pC02和pH)不具有顯著性差異，均為基線值(參見圖27-31)。123行為測定。基于0至4的分值，針對神經(jīng)缺損對動物進行評估。使用GM602處理的動物顯示出神經(jīng)缺損呈劑量依賴方式的減小(數(shù)據(jù)同樣示于圖32中)。表24<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>在美國，中風(fēng)是死亡的第三大常見原因，并且是造成殘疾的主要原因。局灶性腦缺血造成的結(jié)果和所形成的梗塞的尺寸可以通過"壞死性"(細(xì)胞凋亡)細(xì)胞死亡情況以及通過在缺血邊緣帶中延遲的神經(jīng)元細(xì)胞損失(程序性細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡)情況來測定。近期出現(xiàn)的療法用于治療缺血性中風(fēng)，但是，一旦神經(jīng)元細(xì)胞死亡循環(huán)被引發(fā)，這些治療方法通常涉及溶解血液凝塊，但不會發(fā)揮神經(jīng)保護、或者減小行為缺損或腦梗塞體積的作用。理解影響細(xì)胞損失的基礎(chǔ)機制將有助于減小與缺血性損傷有關(guān)的細(xì)胞死亡的藥物的設(shè)計和應(yīng)用。MNTF為這樣的營養(yǎng)因子，其能夠提供保護從而免于神經(jīng)疾病，并可以在發(fā)生損傷或缺血性中風(fēng)后使神經(jīng)元組織再生。本發(fā)明所進行的研究在此證明了GM602(匪TF的6氨基酸類似物)能夠以有效且高效的方式保護腦免于受到由腦缺血和再灌注損傷而造成的有害作用的能力。在缺血損傷后在各時間靜脈內(nèi)施用5mg/kg的GM602證明了通過減小梗塞體積和行為性質(zhì)而在腦中產(chǎn)生對抗缺血/再灌注損傷的、呈時間依賴性的保護作用。這些研究表明，GM602在中風(fēng)中具有有利的作用。當(dāng)靜脈內(nèi)施用時，發(fā)現(xiàn)GM602在小鼠中具有對抗缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護作用。實施例9在永久性中腦動脈阻塞的大鼠模型中測試GM602(MNTF6聚體)。在永久性中腦動脈阻塞(MCA0)的大鼠模型(Kindy，Study#2CStroke)中、測《GenervonBiopharmaceuticais,LLC觀'J《希寸品GM602的效力。為了測定GM602在MCAO大鼠模型中的效力，使大鼠經(jīng)歷28天的永久性缺血。在缺血開始后的3小時，經(jīng)尾靜脈向大鼠靜脈內(nèi)推注GM602。針對在腦血流量(CBF)、心率(HR)、血壓(BP)、p02、pC02、pH、神經(jīng)缺損(ND)和梗塞體積(IFV)方面的變化對大鼠進行檢測。雖然施用GM602證明在HR、BP、p02、pC02或pH方面沒有發(fā)生變化，但是在缺血后3小時施用GM602證明CBF增大。更重要的是，在施用GM602之后，觀察到ND、IFV、TNF(發(fā)炎的生物標(biāo)志物)和Fluoro-Jade(神經(jīng)元退行性病變的生物標(biāo)志物)以劑量依賴方式顯著降低。當(dāng)進行施用時，IV注射2.5、IO或20mg/kg的GM602會顯示出明顯的保護作用從而免于受到梗塞損害，這解釋了對神經(jīng)缺損的保護作用。這些數(shù)據(jù)表明，在MCAO的永久性大鼠模型中，在缺血過程中IV注射GM602對腦具有神經(jīng)保護作用。在缺血發(fā)作后的3小時用GM602進行處理證明了保護作用，并且有利于臨床試驗。<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)，決定在永久性中腦動脈阻塞(MCAO)大鼠模型中，對GB測試制品GM602(其為運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子的6氨基酸肽類似物(MNTF6聚體))保護腦免于受到慢性缺血損傷的能力進行測試。GM602在GMP認(rèn)證下化學(xué)合成(CSBioCo.,MenloPark,CA，lotD294)。方法和材料動物在試驗前，使重量為225-250克的Sprague-Dawley大鼠(Harlan)均自由進食和進水。使用氟烷來麻醉動物(70%/30%N02/02中的1%氟烷，通過面罩麻醉)。收集血液樣品，從而測定動脈pH水平以及PaC02和Pa02。<吏用VisitechSystem血壓監(jiān)觀'M義i己錄MABP和'G率。使用插入到顳肌肌肉中的直腸溫度計和熱敏探針來監(jiān)測腦的溫度。通過使用帶有水套的加熱墊，將動物的體溫保持在37°C。在缺血前的1小時至缺血后的6小時監(jiān)測腦的溫度，并每隔30分鐘記錄一次。實驗組所有的大鼠都經(jīng)歷了永久性缺血。將動物隨機分成載體組(n-10)，或靜脈內(nèi)注射了劑量為2.5、10或20mg/kg的GM602的三個處理組(n=10)中的任一組中。在缺血發(fā)作后的3小時經(jīng)尾靜脈給予IV推注。研究者對處理組是盲的。由NTS配制GM6，其使用儲存在4。C下的標(biāo)準(zhǔn)鹽水溶液重構(gòu)GM6來作為原液。載體對照接受鹽水溶液。缺血的誘導(dǎo)本研究涉及缺血的永久性模型。對每只大鼠都進行麻醉，并分離出頸外動脈(ECA)和頸總動脈(CCA)。將熱敏探針插入到直腸和顳肌肌肉中，從而監(jiān)測肌體和腦的溫度，其中通過外部加熱，^f吏大鼠保持在36-37。C。通過頸部正中切口使左側(cè)頸總動脈(CCA)暴露出來。對甲狀腺上動脈和枕動脈進行電凝集并分開。將顯微手術(shù)夾放置在頸外動脈源(ECA)的周圍。將ECA的遠端用6-0絲綁結(jié)，并橫切。將6-0絲松散地系在ECA殘端的周圍。移開所述的手術(shù)夾，并將5-0尼龍縫合線(涂有有機硅)的經(jīng)燒邊的尖端溫和地插入到ECA殘端中。將環(huán)狀的6-0絲系緊在所述殘端的周圍，并且使尼龍縫合線進入并通過頸外動脈(ICA)中大約17mm(根據(jù)體重進行調(diào)節(jié))，直至所述的縫合線停留在前大腦動脈(ACA)中，由此阻塞了前交通動脈和中腦動脈。在使用手術(shù)126吻合器插入尼龍縫合線后即刻封閉傷口。使所述的縫合線保持放置28天。組織學(xué)檢測關(guān)于組織學(xué)檢測，在誘導(dǎo)缺血之后的28天，釆用腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)來麻醉動物。采用穿心灌注的方式，-使用4'C的10。/。的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、然后4y。的多聚曱醛(4。C)對腦進行灌注。取出腦，將其在4%的多聚甲醛中過夜固定，然后再在4匸下30%的蔗糖中固定24小時。將所述的組織包埋到OCT培養(yǎng)基中，并在干冰上冷凍(儲存在-8(TC)。這些組織用于組織和免疫細(xì)胞化學(xué)分析。在缺血發(fā)作后28天收集腦，將其冷凍，然后切成16mhi的切片。使用蘇木精和曙紅對冠狀切片進行染色，從而清晰地描繪出缺血損傷的程度。通過對在16-Mm染色的冠狀切片(由各腦的前自點點+2.46、+1.66、+0.86、+0.06、0.74、1.54、2.34和3.14mm收集得到)上的損傷面積進行積分，來計算梗塞體積。使用計算機輔助的圖像分析系統(tǒng)(NIHIMAGE,Version1.6)，對腦皮層、紋狀體(striatal)和海馬3止梗塞總體積進行定量。由對治療狀態(tài)為盲的單個操作者進行所有的測量。通過對切片中梗塞體積求和來計算梗塞體積。通過采用以下能夠消除水腫影響的公式來計算梗塞的尺寸(％):(對側(cè)體積-同側(cè)未損傷的體積)X100/對側(cè)體積。腦血流量的測量通過使用激光多普勒血流儀監(jiān)測腦血流量(CBF)。CBF值以百分比的形式測定，這是因為由激光多普勒血流儀顯示的值并非為絕對值。如上文所述，使用氟烷來麻醉動物(70%/30%N02/02中的1%氟烷，通過面罩麻醉)。在與MCA阻塞同側(cè)的腦半球中，坐標(biāo)如下點A,前囪點后0.5mm、中線側(cè)部2mm;點B，前囪點后lmm、中線側(cè)部1.2mm;點D,前囪點后lmm、中線側(cè)部1.7mm;點C，在對側(cè)半球中，前自點后lmm、距中線2mm。在缺血發(fā)作前、在誘導(dǎo)缺血后3小時但在施用測試制品之前、以及在施用測試制品之后1小時，測定CBF。將MCA阻塞前的平均值作為基線值，此后的數(shù)據(jù)以基線值的百分比表示。行為評估在缺血損傷之前，每天都對動物處理10min,持續(xù)3天。在損傷之前的當(dāng)天，針對行為變化對動物進行檢測。所有的行為測試都是在中風(fēng)手術(shù)片刻之前、以及在施用測試制品之后的28天進行。在測試開始之前，在各階段都使動物在測試房間里適應(yīng)30min。前肢放置測試一一針對各個前肢得到單獨的評分。就視覺放置的子測試而言，測試者將動物垂直把握，并使其接近桌面。正常放置在桌子上的一肢得O分；延遲放置(<2s)的得l分；而沒有放置或非常延遲放置(>2s)的得2分。首先，當(dāng)將所述的動物向桌子的前方拉拽、接著將所述的動物向桌子的一側(cè)拉拽時，從而得到單獨的評分(每一肢的最大評分，4;分?jǐn)?shù)越高表示缺陷越重)。就觸覺放置的子測試而言，把握住動物，使其不能看見或者用其胡須接觸到桌面上。當(dāng)將所述的動物向桌子的前方拉拽、接著向桌子的一側(cè)拉拽時，都使前爪輕輕地接觸桌面。按照上文的標(biāo)準(zhǔn)(每一肢的最大評分，4)，對每一次放置評分。就本體放置的子測試而言，僅將動物向前方拉拽，并向前爪施加更大的壓力；按照上文對放置評分(每一肢的最大評分，2)。將這些子評分加起來，從而得到每一肢前肢放置的總評分(范圍為O-IO)。后肢放置測試——按照與上述前肢相同的方式實施后肢放置測試，但是僅包括觸覺和本體的子測試(最大評分分別為4和2;總分范圍為0-6)。改進的平衡木測試——改進的平衡木測試檢測了前庭運動反射(vestibulomoterreflex)活性，其為使動物在狹窄的平衡木(30x1.3cm)上保持60秒鐘。在平衡木上的平衡能力按照如下標(biāo)準(zhǔn)評分動物以所有四只爪子都保持在平衡木的頂部的方式達到平衡，1;動物將爪子放置在平衡木的一側(cè)或者在平衡木上晃動，2;有一肢或兩肢從平衡木上滑落，3;有三肢從平衡木上滑落，4;動物試圖用爪子在平衡木上保持平衡，但是跌落，5;動物伸出了平衡木，然后跌落，1286;動物未嘗試平衡而由平衡木上跌落，7。在手術(shù)前，動物接受了三個訓(xùn)練試驗；將這些分值中最后的評分作為基線評分。自發(fā)運動活性一一在手術(shù)前的當(dāng)天、以及手術(shù)后的一周時，將動物放置在狹窄的玻璃筒(16.5X25cm)中，并錄像10min。對動物的自發(fā)運動評分。如下評分0，沒有運動；1,幾乎沒有或者沒有進行探測(有限的運動)；2，一定程度的探測(有限程度的運動)；3，自由運動(對照，進行正常的探測)。生物標(biāo)志物分析將16mai厚的冠狀切片固定在顯微載玻片上，并干燥。將所述的栽玻片在包含溶于80%乙醇的1%氫氧化鈉(將20mL5%的NaOH加入到80mL的無水乙醇中)的溶液中浸漬5分鐘。然后，在70%的乙醇中浸漬2分鐘，再在蒸餾水中浸漬2分鐘。將所述的載玻片轉(zhuǎn)移到0.06%的高錳酸鉀溶液中，持續(xù)IO分鐘。然后，將所述的栽玻片在蒸餾水中沖洗2分鐘。由0.01%的原液制備成染色液，以用于Fluoro-JadeB。在所述的栽玻片于染色液中保持20分鐘之后，將其在3次蒸餾水洗滌，每次沖洗1分鐘。通過簡單地將載玻片垂直在紙巾上(15秒)排水來除去過量的水。然后將所述的載玻片放置在被設(shè)定在大約50。C的切片加熱器上，直到完全干燥(例如5-10分鐘)。通過在二曱苯中浸漬至少1分鐘來清潔千燥的栽玻片，然后用DPX(Fluka，MilwaukeeWI，orSigmaChem.Co.,St.Louis,M0)(其為非水性非焚光的塑料周定介質(zhì))蓋片。就細(xì)胞因子(TNF)分析而言，將組織切片在pH7.4的Tris緩沖鹽水(TBS)中洗滌，并在合適的血清(山羊)中封閉。將切片在4。C下封閉過夜，然后在4。C下經(jīng)歷第一抗體過夜。將切片在TBS中洗滌，然后加入笫二抗體，并在室溫下溫育1小時。在洗滌后，將切片按照說明書在VectorABCElite試劑盒中溫育，然后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。在水中終止反應(yīng)，并在經(jīng)歷二甲苯處理后蓋片。所述研究中動物的排除基于以下若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動物在研究結(jié)束前(在任何時間點上)死亡的動物。將至死亡時收集的數(shù)據(jù)提供給GB;在阻塞后腦血流量沒有降低至基線值的20±5%(即，被認(rèn)為為非缺血情況)的動物；在缺血損傷后產(chǎn)生癩癇狀行為的動物；在缺血過程中或缺血后片刻，檢測到過量出血的動物。處理組。所有的組都經(jīng)歷GM602或者作為對照。在誘導(dǎo)缺血后的3小時，動物接受IV給藥的載體或GM602。大鼠中風(fēng)模型組別化合物劑量(mg/kg)途徑1(n=10只大鼠)載體0IV2(n=10只大鼠)GM6022.5mg/kgIV3(n=10只大鼠)GM602lOmg/kgIV4(n=10只大鼠)GM60220mg/kgIV結(jié)束GM602對缺血和再灌注損傷中的神經(jīng)保護作用。針對腦血流量(CBF)、心率(HR)、血壓(BP)、p02、pC02、pH、神經(jīng)缺損(ND)、梗塞體積(IFV)、發(fā)炎生物標(biāo)志物和神經(jīng)元退行性生物標(biāo)志物來評價動物。將所有的測試組都提供給NTS;將GM602以固體材料的形式提供給NTS。測試組中所有的動物都如上文指示給藥。統(tǒng)計分析將結(jié)果表示成平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。采用單因素協(xié)方差分析(ANOVA)、再通過Fisher精確檢驗來分析生理學(xué)和組織學(xué)數(shù)據(jù)中的差異顯著性。在監(jiān)測數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上計算重復(fù)測量的ANOVA，再通過Fisher精確檢驗評價多組中的差異顯著性。結(jié)果大鼠中缺血的研究。對這些研究中缺血的相對嚴(yán)重性進行評估。數(shù)據(jù)得自患有缺血損傷的大鼠，其中所述的大鼠靜脈內(nèi)注射栽體或GM602。梗塞體積所有研究組中梗塞體積繪制于圖33中。在永久性缺血130后3小時，IV施用GM602減小動物腦中的梗塞體積。梗塞體積減小的百分比示于表25中。表25.腦中梗塞減小的百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>減小的百分比與各種載體對照動物相比。*與組1相比(栽體)。死亡率在本研究中未發(fā)生死亡。生理學(xué)參數(shù)。在缺血期間或者在施用測試藥物之后，栽體小鼠和治療的小鼠之間，生理學(xué)參數(shù)(平均動脈血壓、血液p02、pC02和pH)不具有顯著性差異(參見圖35-38)，均為基線值。但是，在使用GM602處理的組中，觀察到由GM602介導(dǎo)的腦血流量顯著增大(參見圖34)。表26—施用GM602之后CBF增加<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>行為測試?；诙鄠€不同的參數(shù)(如下文所指示)，針對神經(jīng)缺損對動物進行評估。使用GM602治療的動物顯示出神經(jīng)缺陷呈劑量依賴方式的減小(數(shù)據(jù)同樣示于圖39中)。表27—施用GM602后的前肢放置測定<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>表28—施用GM602后的后肢放置測定化合物(組)測試評分與栽體相比的p值l-栽體5.1±0.74NA2-GM602(2.5mg/kg)3.9±1,20P<0.023-GM602(10mg/kg)2.7±0.95P<0.00014-GM602(20mg/kg)2.0±0.82P<0.0001表29—施用GM602后的平衡木測定化合物(組)測試評分與栽體相比的p值l-栽體5.300±1.059NA2-GM602(2.5mg/kg)4.100±0.9944P<0.01773-GM602(10mg/kg)3.200±0.7888P<0.00014-GM602(20mg/kg)2.700±0.4930P<0.0001表30—施用GM602后的自發(fā)活性化合物(組)測試評分與栽體相比的p值l-栽體0.2±0.42NA2-GM602(2.5mg/kg)0.9±0.74P<0.023-GM602(10mg/kg)1.6±0.52P<0.00014-GM602(20mg/kg)1.9±0.74P<0.0001生物標(biāo)志物分析。收集組織切片以用于生物標(biāo)志物分析(Fluoro-Jade和TNF)。在GM602施用組中，在第28天，在所述組織部分中所見的TNF染色明顯減少，并且這種減少呈現(xiàn)出劑量依賴性(參見表31和圖8)。在永久性缺血損傷后，在施用GM602之后的第28天所見的針對Fluoro-Jade的染色明顯減少(參見表32和圖41)。表31—施用GM602后TNF水平的減少情況化合物(組)TNF水平(對照的W與栽體相比的p值l-栽體89.07±17.96NA2-GM602(2.5mg/kg)64.24±16.18P<0.0053-GM602(10mg/kg)49.03±12.60P<0.00014-GM602(20nig/kg)32.72±11.15P<0.0001132表32—在施用GM602后Fluoro-jade水平的減少情況化合物(組)Fluoro-jade(細(xì)胞的#)與載體相比的p值1-載體7007±1054NA2-GM602(2.5mg/kg)4899±1248P=0.00073-GM602(10mg/kg)3504±959.4P<0.00014-GM602(20mg/kg)2889±719.6P<0.0001在美國，中風(fēng)是死亡的第三大常見原因，并且是造成殘疾的主要原因。局灶性腦缺血造成的結(jié)果和所形成的梗塞的尺寸可以通過"壞死性"(細(xì)胞凋亡)細(xì)胞死亡情況以及通過在缺血邊緣帶中延遲的神經(jīng)元細(xì)胞損失(程序性細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡)情況來測定。近期出現(xiàn)的療法用于治療缺血性中風(fēng)。但是，一旦神經(jīng)元細(xì)胞死亡循環(huán)被引發(fā)，這些治療方法通常涉及溶解血液凝塊，但不會發(fā)揮神經(jīng)保護、或者減小行為缺損或腦梗塞體積的作用。理解影響細(xì)胞損失的基礎(chǔ)機制將有助于減小缺血性損傷有關(guān)的細(xì)胞死亡的藥物的設(shè)計和應(yīng)用。MNTF為這樣的營養(yǎng)因子，其能夠提供保護從而免于神經(jīng)疾病，并可以在發(fā)生損傷或缺血性中風(fēng)后使神經(jīng)元組織再生。本發(fā)明所進行的研究在此證明了GM602(MNTF的6氨基酸類似物)能夠以有效且高效的方式保護大鼠的腦免于受到由永久性腦缺血損傷而造成的有害作用的能力。在缺血損傷后3小時靜脈內(nèi)施用2.5、10或20mg/kg的GM602證明了通過減小梗塞體積、改善行為性質(zhì)、增加腦血流量、降低炎癥和神經(jīng)元退化而在腦中產(chǎn)生對抗缺血損傷的、呈劑量依賴方式的保護作用。這些研究表明，GM602在永久性中風(fēng)中具有有利的作用。當(dāng)將GM602進行靜脈內(nèi)施用時，發(fā)現(xiàn)其在大鼠中具有對抗缺血損傷的神經(jīng)保護作用。本文參考或提及的所有專利、出版物、科學(xué)論文、網(wǎng)站以及其他文件和材料指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平，并且每個此類參考的文件和材料在此引入作為參考，其程度與其已單獨地整體引入作為參考或整體在本文中闡述相同。申請人保留將來自任何此類專利、出版物、科學(xué)論文、網(wǎng)站、可電子獲得的信息、以及其他參考的材料或文件在形體上引入本說明書內(nèi)的權(quán)利。本文描述的具體方法和組合物是優(yōu)選實施方案的代表，并且是示例性的而不意欲作為對本發(fā)明范圍的限制?？紤]本說明書后，其他目.的、方面和實施方案將被本領(lǐng)域技術(shù)人員想到，并且包含在如由權(quán)利要求范圍限定的本發(fā)明的精神內(nèi)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，無需背離本發(fā)明的范圍和精神，可以進行本文公開的本發(fā)明的各種替具體公開為必需的任何一種或多種元件，或一種或多種限制的情況下進行實踐。因此，例如，在本文的每種情況下，在本發(fā)明的實施方案或?qū)嵤├校g(shù)語"包含"、"基本上由……組成"和"由……組成"中的任何一個在說明書中都可以替換為其他2個術(shù)語中的任一。同樣地，術(shù)語"包含"、"包括"、"含有"等應(yīng)被廣泛而且沒有限制地序進行實踐，'并且它們不必限制于本文或:利要求_中指出的e步驟順序。同樣如本文和附加權(quán)利要求中所使用的，除非上下文另有明確說明，單數(shù)形式"一種"、"一個"和"所述"等包括復(fù)數(shù)參考。該專利決不能被解釋為限制于本文具體公開的具體實施例或?qū)嵤┓桨富蚍椒?。該專利決不能被解釋為受由專利商標(biāo)局的任何審查者或任何其他官員或雇員進行的任何陳述限制，除非此類陳述由申請人以回答的書面形式特別地而沒有限定或保留明確地采用。已使用的術(shù)語和表達作為描述性而非選擇性的術(shù)語使用，并且在其部分，但應(yīng)認(rèn)識到在如要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)的各種修改是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選實施方案和任選特征具體且此類修改和變化被視為在如由附加權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明已在本文中得到廣泛和一般地描述。屬于一般公開內(nèi)容的更窄的種類和亞一般分類中的每一種也可形成本發(fā)明的部分。這包括本發(fā)明的一般描述，條件或負(fù)面限制是從種類中去除任何主題，不管刪除的材料是否在本文中具體引用。其他實施方案在下述權(quán)利要求內(nèi)。此外，當(dāng)本發(fā)明的特征或方面按照Markush組進行描述時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到本發(fā)明因此也按照Markush組的任何個別成員或成員亞組進行描述。權(quán)利要求1.一種減輕遭受神經(jīng)元紊亂的動物中的神經(jīng)元紊亂的方法，該方法包括以足以減輕所述紊亂的量，向所述的動物施用運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物。2.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂選自脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、腦缺血、亨廷頓氏疾病、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化(MS)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變。3.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為脊髓損傷。4.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為神經(jīng)退行性疾病。5.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為腦缺血。6.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為亨廷頓氏疾病。7.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為帕金森氏疾病。8.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為MS。9.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為ALS。10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的紊亂為阿茲海默氏疾病。11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的紊亂為糖尿病神經(jīng)病變。12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的MNTF類似物是具有選自SEQIDNO:1-142的氨基酸序列的多肽、或該多肽的鹽。13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的MNTF類似物是具有選自SEQIDNO:1-7的氨基酸序列的多肽、或該多肽的鹽。14.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的MNTF類似物是具有SEQIDNO:1的6至33連續(xù)殘基的氨基酸序列的多肽、或該多肽的鹽。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的多肽具有包含SEQIDNO:4的至少6個連續(xù)殘基的氨基酸序列。16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多肽的序列包含SEQIDNO:2。17.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多肽的序列包含SEQIDNO:3。18.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多肽的序列是SEQIDNO:l-7中的一個。19.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的MNTF類似物是具有選自SEQIDNO:1-142的氨基酸序列的多肽的類似物，或該類似物的鹽，其中所述的類似物表現(xiàn)出MNTF活性。20.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的MNTF類似物是具有選自SEQIDNO:1-7的氨基酸序列的多肽的類似物，或該類似物的鹽，其中所述的類似物表現(xiàn)出MNTF活性。21.權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的MNTF類似物以非經(jīng)口途徑施用至所述的動物。22.權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的MNTF類似物以靜脈內(nèi)的方式施用至所述的動物。23.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的MNTF類似物是具有SEQIDNO:1的6至33連續(xù)殘基的氨基酸序列的多肽或該多肽的鹽的類似物。24.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的動物是哺乳動物。25.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的動物是人。26.—種修復(fù)動物中被損害的神經(jīng)通路的方法，該方法包括以足以至少部分修復(fù)所述通路的量，向所述的動物施用MNTF類似物。27.—種改善具有被損害的神經(jīng)通路的動物中的運動功能的方法，該方法包括以足以改善所述動物中的運動功能的量，向所述的動物施用MNTF類似物。28.—種再生具有被損害的神經(jīng)通路的動物中的神經(jīng)通路的方法，該方法包括以足以再生所述動物中的所述通路的量，向所述的動物施用MNTF類似物。29.—種減輕動物中神經(jīng)元缺陷的方法，該方法包括以足以減輕所述所迷神經(jīng)元缺陷的量，向所述的動物施用MNTF類似物。30.—種包含MNTF類似物和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物，其中所述的MNTF類似物是具有選自SEQIDNO:1-142的氨基酸序列的多肽、或該多肽的鹽。31.權(quán)利要求30所述的組合物，其中多肽具有選自SEQIDN0:l-7的氨基酸序列。32.權(quán)利要求30所述的組合物，其中多肽具有選自SEQIDNO:2-142的氨基酸序列。33.權(quán)利要求30所述的組合物，其中多肽具有選自SEQIDNO:2-7的氨基酸序列。34.—種包含MNTF類似物和藥學(xué)上可接受栽體的藥物組合物，其中所述的MNTF類似物是具有SEQIDNO:1的6至32連續(xù)殘基的氨基酸序列的多肽、或該多肽的鹽。35.權(quán)利要求34所述的組合物，其中所述的多肽具有包含SEQIDNO:4的至少6個連續(xù)殘基的氨基酸序列。36.權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述多肽的序列包含SEQIDNO:2。37.權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述多肽的序列包含SEQIDNO:3。38.—種包含MNTF類似物和藥學(xué)上可接受栽體的藥物組合物，其中所述的MNTF類似物是具有選自SEQIDNO:1-142的氨基酸序列的多肽的類似物、或該類似物的鹽，其中所述的類似物表現(xiàn)出MNTF活性。39.—種包含MNTF類似物和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物，其中所述的MNTF類似物是具有SEQIDNO:l的6至32連續(xù)殘基的氨基酸序列的多肽或該多肽的鹽的類似物。全文摘要本發(fā)明公開涉及使用運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)或其肽類似物來治療神經(jīng)元紊亂的方法。本發(fā)明公開進一步涉及通過施用運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)或其肽類似物來治療受試者中脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)和腦缺血、亨廷頓氏疾病、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變的方法。文檔編號A01N61/00GK101534648SQ200780041924公開日2009年9月16日申請日期2007年11月13日優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日發(fā)明者M·S·金迪,P-Y·D·寇申請人:健能萬生物制藥公司