專利名稱：通過抗菌肽抑制劑治療疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子(AML)抑制劑治病的療法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種用抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子(AML)抑制劑治病的療法；用抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子(AML)治病的療法；識(shí)別能降低AMP/AML活性/水平的物質(zhì)的方法。本發(fā)明尤其涉及利用能抑制組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)/beta-防御素(beta-defensin)的復(fù)合物來治療自體免疫疾病如牛皮癬和惡性腫瘤，這兩種疾病都和發(fā)炎，失控的細(xì)胞分裂/分化，血管生長(zhǎng)和/或腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)；同時(shí)，本發(fā)明利用防御素(defensin)來治療上皮損傷，因?yàn)樵摲烙赜写龠M(jìn)上皮增生的藥效；另外，本發(fā)明可以識(shí)別能降低AMP/AML活性/水平的復(fù)合物從而達(dá)到治療自體免疫疾病如牛皮癬和惡性疾病如癌癥的目的，這兩種疾病都和發(fā)炎，失控的細(xì)胞分裂/分化，血管生長(zhǎng)和/或腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。
象自體免疫性的，過敏性的，以及損傷性類的疾病都和以下生物活動(dòng)有關(guān)發(fā)炎，失控的細(xì)胞分裂/分化，失衡的細(xì)胞分裂/分化，血管生長(zhǎng)和/或腫瘤轉(zhuǎn)移；從病理上講該類疾病非常嚴(yán)重甚至可以致死，而且目前尚無(wú)滿意療法，故而經(jīng)濟(jì)影響巨大。
舉例來說，自體免疫疾病就代表了若干有重要臨床及經(jīng)濟(jì)意義的疾病。它們包括牛皮癬，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，1類糖尿病，發(fā)炎性腸道疾病，以及多發(fā)性硬化癥，對(duì)它們也無(wú)令人滿意的療法。類似地，惡性腫瘤如皮膚癌，乳腺癌，直腸癌，頭頸癌，肝癌，肺癌，腎細(xì)胞癌，尿道膀胱癌及類似重癥都可致死，但都無(wú)令人滿意的療法。和上皮損傷有關(guān)的重要疾病，如消化性潰瘍，潰瘍性結(jié)腸炎，損傷缺陷型疾病如和糖尿病有關(guān)的皮膚潰瘍，都有重要的臨床及經(jīng)濟(jì)意義而且都無(wú)令人滿意的療法。過敏性的疾病，如季節(jié)性花粉過敏，豚草過敏，塵螨過敏，寵物皮毛過敏，化妝品過敏，以及各類食物過敏都影響大量群體，重者可以致命，所以過敏藥物市場(chǎng)巨大，經(jīng)濟(jì)意義顯著。因此，尋找和發(fā)炎，失控的細(xì)胞分裂/分化，失衡的細(xì)胞分裂/分化，血管生長(zhǎng)，腫瘤轉(zhuǎn)移和/或上皮損傷有關(guān)的最佳療法一直是緊迫和長(zhǎng)期的需求。
皮膚的上皮襯層，胃腸道和支氣管樹可以產(chǎn)生若干有抗菌效果的被命名為抗菌肽(AMP)的多肽分子，該類分子在宿主的自身防御系統(tǒng)和后天的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起作用。AMP的類分子是陽(yáng)離子多肽，在普通來源的組織及正常的生理濃度下有抗菌作用。AMP的產(chǎn)生和釋放受細(xì)菌信號(hào)，分化，發(fā)育信號(hào)及趨化因子的調(diào)節(jié)，在個(gè)別情況下，也受組織特異性的神經(jīng)內(nèi)分泌特異蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)。雖然AMP的作用原理仍屬未知，但主導(dǎo)理論認(rèn)為，穿透目標(biāo)細(xì)胞膜是AMP的抗菌作用及其細(xì)胞毒害的重要步驟。防御素分為兩大類組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)和防御素。所有的AMP分子的共性是它們能通過非配體受體的途徑來影響細(xì)胞。因?yàn)樗鼈兎浅Ｐ?，高親水性，疏水性或雙性，所以它們可以和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜結(jié)合。它們有能力穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。比如說，GRANULYSIN靠其負(fù)電性穿透并損害細(xì)胞膜(J IMMUNOL。，2001，167350-356)。
組織蛋白酶抑制素(Cathelicidin)類分子有一個(gè)保守的“cathelin”前體功能區(qū)。它們的分子包括一個(gè)由非常保守的前序列組成的N-端信號(hào)肽，和一個(gè)多變區(qū)的C-端陽(yáng)離子多肽。前序列很象cathelin，最早從豬中性粒細(xì)胞中提出的作為組織蛋白酶L(cathepsin L)抑制劑的蛋白質(zhì)。人類組織蛋白酶抑制素是一個(gè)37個(gè)氨基酸的多肽，LL-37/hCAP18是一個(gè)由37個(gè)氨基酸組成的人類組織蛋白酶抑制素，它有一個(gè)疏水的螺旋結(jié)構(gòu)的N-端活性區(qū)，在負(fù)電性的酯類分子存在時(shí)，螺旋結(jié)構(gòu)變得尤為顯著。LL-37活化的重要的一步是其被如中性粒細(xì)胞的彈性酶和蛋白酶3之類的酶從hCAP18的C-端前體被酶切下釋放出來。LL-37和群體AMP分子起功能上的協(xié)同作用來活化宿主細(xì)胞。LL-37之類的組織蛋白酶抑制素所擁有的殺菌能力和調(diào)控免疫反應(yīng)的能力，也是很多AMP分子的特性。這些多肽通過各種細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)來影響宿主的免疫反應(yīng)，例如，有人建議可以以化學(xué)親和劑的形式來和似甲酰多肽受體1(FPRL-1)結(jié)合來影響宿主的免疫反應(yīng)。LL-37可以招募肥大細(xì)胞，肥大細(xì)胞進(jìn)一步又制造更多LL-37來殺菌。
防御素代表一大族的AMP，它們作用體現(xiàn)在粒細(xì)胞的抗菌功能上，小腸，皮膚和其他地方的上皮細(xì)胞的宿主防御能力上(Ganz T.2003 Nat RevImmunol.3710-20)。防御素對(duì)宿主防御能力的貢獻(xiàn)是由其破壞微生物的細(xì)胞膜來實(shí)現(xiàn)的。防御素是由胃腸的，生殖道的，泌尿道的，和支氣管的上皮細(xì)胞，以及角質(zhì)細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞制造的。有些防御素不斷被制造，而另外一些防御素則在發(fā)現(xiàn)有微生物產(chǎn)物和促炎細(xì)胞因子時(shí)才被制造。在先天宿主免疫系統(tǒng)中產(chǎn)生的防御素，起信號(hào)的作用，它調(diào)動(dòng)而且增強(qiáng)適應(yīng)性的宿主免疫系統(tǒng)。這些多肽是陽(yáng)離子性而且有由6-8個(gè)半胱氨酸形成的二硫鍵。哺乳動(dòng)物的防御素分為三亞類，alpha-防御素，beta-防御素，和人體沒有的theta防御素。
alpha-防御素的6個(gè)半胱氨酸形成的3對(duì)二硫鍵，排列成1-6，2-4和3-5的搭配形式。人的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生四種alpha-防御素，alpha-防御素1-4，也被稱作人中性粒細(xì)胞肽(HNP-1到4)。它們被完全加工后約3kDa大小，儲(chǔ)存在中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中。另外兩種alpha-防御素，人體防御素-5和-6是由小腸的濾泡Paneth細(xì)胞，女性的尿道和生殖道的上皮細(xì)胞制造的。不象中性粒細(xì)胞，Paneth細(xì)胞儲(chǔ)存的alpha-防御素是未被加工的多肽前體。就象組織蛋白酶抑制素一樣，alpha-防御素對(duì)微生物和宿主都有作用。比如說，HNP1-3被證明能夠促進(jìn)腫瘤壞死因子(TNF)-alpha和白細(xì)胞介素1(IL-1)在人的被細(xì)菌(Staphylococcus aureus)激活的單核細(xì)胞中產(chǎn)生，或者是在被TNF-alpha活化的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中減少血管粘附分子-1(VCAM-1)的產(chǎn)生。
beta-防御素的特征是6個(gè)半胱氨酸形成的3對(duì)二硫鍵以C1-C5，C2-C4和C3-C6的搭配。在很多種細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)beta-防御素，包括上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。人體中已知的四種beta-防御素被命名為beta-防御素-1，-2，-3和-4?；蚪M分析表明還有更多的beta-防御素有待發(fā)現(xiàn)。beta-防御素有廣泛的抗菌能力和額外的和免疫細(xì)胞有關(guān)的功能。舉例來說，人beta-防御素-2可以和趨化因子受體CCR6結(jié)合，然后趨化樹突狀細(xì)胞和T-細(xì)胞，結(jié)果導(dǎo)致組胺釋放和前列腺素D2在肥大細(xì)胞中產(chǎn)生。因此，有人提出beta-防御素在過敏反應(yīng)中起著作用。通過利用象趨化樹突狀細(xì)胞和T-細(xì)胞中的趨化因子受體CCR6beta之類的受體，beta-防御素可能還會(huì)調(diào)節(jié)適應(yīng)性的抗菌免疫力(Yang D.et al.，1999.Science.286525-8；YangD.et al.，2002.Trends Immunol.23291-6；Oppenheim et al.，2003.Ann RheumDis.62 Suppl 2ii17-21)。
AMP分子可以單獨(dú)或和其他AMP分子協(xié)同作用。比如說許多AMP分子在婦女月經(jīng)周期時(shí)呈現(xiàn)相應(yīng)的周期性的變化(King A.E.et al.，2003.J.Reprod.Immunol.591-16)。具體地說，beta-防御素-2在經(jīng)期的量達(dá)到最高，beta-防御素-4在增生期達(dá)到最高，beta-防御素-3在分泌期的早期達(dá)到最高，beta-1防御素-1在分泌期中期達(dá)到最高，而beta-3則在分泌期晚期達(dá)到最高。有人因而提出維持各種AMP之間的平衡對(duì)發(fā)育有著至關(guān)重要的作用，而這里的月經(jīng)周期就是很好的例證。
抗菌肽或抗菌肽類分子(AML)，如趨化因子，尤其是起趨化因子和細(xì)胞因子雙重作用的AMP分子在發(fā)炎時(shí)指導(dǎo)白細(xì)胞的調(diào)動(dòng)中起著重要的作用。趨化因子的單克隆抗體和拮抗劑，如腫瘤壞死因子，腫干擾素-gamma，白三烯受體拮抗劑，白細(xì)胞介素-8(IL-8)，抗-免疫球蛋白IgE和抗-干擾素受體拮抗劑已經(jīng)擁有專利并已經(jīng)被用于臨床。但是，它們的副作用也同樣明顯，因?yàn)橼吇蜃佣加须p重作用，正常的生長(zhǎng)和代謝也需要趨化因子，因此抑制它們的活性也同時(shí)抑制了正常的生長(zhǎng)和代謝。
不過，除了它們的抗菌和抗病毒的特性以外，AMP分子還有其他促進(jìn)疾病的病理發(fā)生的作用。它們或單獨(dú)作用，或和其他分子協(xié)同作用，如趨化因子，細(xì)胞因子，增生和超增生生物被膜誘導(dǎo)因子，細(xì)菌-細(xì)胞的結(jié)合及粘連促進(jìn)因子，發(fā)炎促進(jìn)因子，單核細(xì)胞鐵質(zhì)保留調(diào)節(jié)因子蛋白酶抑制劑，血管生長(zhǎng)促進(jìn)因子，似皮質(zhì)抑素分子，促進(jìn)胞外基質(zhì)的沉積，控制它們的降解以及其他作用。更重要的是，如下詳述，AMP分子在幾種慢性病中呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，它們不僅影響細(xì)胞的分化和增生而且在慢性發(fā)炎和慢性病的病理發(fā)生中起主要作用。
在現(xiàn)有的抑制趨化因子和細(xì)胞因子的療法中，AMP分子既可以在趨化因子和細(xì)胞因子的上游起作用也可以在它們的下游起作用。它們本身可以激發(fā)炎癥反應(yīng)，但同時(shí)它們也受促炎因子如白細(xì)胞介素-1 alpha(IL-1 alpha)，腫瘤壞死因子alpha(TNF-alpha)及其他因子的刺激進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
由於AMP分子可以在細(xì)胞因子如TNF-alpha和IL-1的上游和下游起作用，被AMP分子引發(fā)的病態(tài)就進(jìn)入了一個(gè)自我維持的對(duì)TNF-alpha和IL-1的制造失控的循環(huán)中，結(jié)果導(dǎo)致破壞性的和長(zhǎng)期性的炎癥。當(dāng)AMP過量產(chǎn)生和同功異源的AMP基因同時(shí)被激活時(shí)，這種現(xiàn)象就變得尤為明顯。利用TNF-alpha拮抗劑，IL-1受體拮抗劑，IL-10抑制劑，和T-細(xì)胞抑制劑可以打破這個(gè)炎癥循環(huán)。不過，由于有最低副作用的要求，抑制這些AMP活力，尤其是抑制她們的次級(jí)趨化因子的活力被證明是更安全更有效的治療發(fā)炎和自體免疫慢性病和某些急性病的更好的方法。
因此，很多和發(fā)炎，失調(diào)的細(xì)胞增生/分化，血管生長(zhǎng)和腫瘤轉(zhuǎn)移，和/或上皮損傷有關(guān)的疾病也和受影響的細(xì)胞/組織內(nèi)失調(diào)的AMP水平有關(guān)(下面文獻(xiàn)有闡述Gallo and Nizet，2003.Curr.Allergy and Asthma Reports 3402；vanWetering et al.，1999.J Allergy Clin Immunol.1041131-8)。
至於牛皮癬和其他的皮膚病，有報(bào)導(dǎo)表明在牛皮癬損傷的組織/細(xì)胞中，LL-37和beta-防御素的量都有所提高，而在異位性皮炎的病人中，LL-37和beta-防御素的量很低或無(wú)，牛皮癬病人的皮膚中含有最少十倍于異位性皮炎病人的AMP量(Ong PY et al.，2002.N Engl J Med.3471151-60)。進(jìn)一步說，作為牛皮癬誘因的表皮損傷可以引發(fā)LL-37和beta-防御素的釋放，而且這類損傷可以發(fā)展成不可逆的牛皮癬損傷。除此以外，其他的幾種皮膚病的也有很高的AMP水平。大部分的痤瘡活檢都顯示出在損傷和損傷周圍的上皮細(xì)胞-尤其是丘疹中beta-防御素-2的免疫活力顯著提高而beta-防御素-1的免疫活力則只不太明顯的提高(Chronnell CMT et al.，2001.J Invest Dermatol 1171120-1125)。
牛皮癬一直被認(rèn)為是由天然免疫力起關(guān)鍵作用的T-細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫性疾病。牛皮癬是由細(xì)菌超抗原(Boehncke，WH.et al.，2001.J.Invest Dermatol.116596-601)促發(fā)激活自身免疫(Gilhar，A.et al.，2002.J.Invest Dermatol.119384-391)造成的表皮缺陷的結(jié)果。牛皮癬的組織學(xué)特征是角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增生和分化的平衡失調(diào)由中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和巨大細(xì)胞引起的外表皮和表皮的異常分化和滲透。自然殺手細(xì)胞(NK)和自然殺手-T細(xì)胞都參與了牛皮癬的病理發(fā)生，而且也存在于皮屑中。AMP是人的T-細(xì)胞和自然殺手細(xì)胞的作用分子，它們從NK細(xì)胞釋放并在疾病發(fā)生中起作用。人AMP分子LL-37和alpha-防御素是在特異的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞群中產(chǎn)生的(Agerberth B.et al.，2000.Blood.963086-93)。
到目前為止，治療牛皮癬的新方法是系統(tǒng)干預(yù)，但不夠理想。該療法包括以T-細(xì)胞為目標(biāo)的療法，腫瘤壞死因子單克隆抗體療法和以細(xì)胞因子為目標(biāo)的療法。
治療牛皮癬的方法包括，外用細(xì)胞增生/分化調(diào)節(jié)劑如維甲類-維生素A-類似物，它可以調(diào)節(jié)或改變上皮層的細(xì)胞分化和增生，因?yàn)樗梢哉T導(dǎo)細(xì)胞凋亡來限制增生數(shù)量(Ocker，M.et al.，2003.Int.J.Cancer 107453-459)，紫外線照射療法也引起細(xì)胞凋亡，從而減少了細(xì)胞增生的可能(Mass，P.et al.，2003.Arch.Dermatol.Res.29571-79)。細(xì)胞凋亡也引起DNA的釋放，因其陰離子性，在陽(yáng)離子性的AMP分子存在時(shí)，DNA分子集結(jié)成束狀從而抑制抗菌能力，或通過配體受體聯(lián)系的聯(lián)系來抑制AMP的下游成分，如皮質(zhì)類甾醇油脂和軟膏和維生素D3。這些外用療法的作用目標(biāo)是發(fā)炎反應(yīng)的最終產(chǎn)物，而沒有阻止發(fā)炎的發(fā)生。
有很多信號(hào)途徑導(dǎo)致病原的增生。牛皮癬中的異常的增生/分化平衡是由於AMP信號(hào)途徑的增強(qiáng)以彌補(bǔ)其他如TGF-beta信號(hào)途徑在牛皮癬中的降低(Doi，H.et al.，2003.J.Dermatol.Sci.337-16)，這導(dǎo)致生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中的功能性的降低。事實(shí)上，AMP分子如LL-37，人類beta-防御素-3，和中性粒細(xì)胞明膠酶有關(guān)的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，以及分泌性的白細(xì)胞蛋白酶抑制劑都在某些生長(zhǎng)因子下游起作用，這些生長(zhǎng)因子在損傷愈合中起重要的作用，如胰島素樣生長(zhǎng)因子1和人角質(zhì)細(xì)胞的TGF-alpha(Sorensen，OE.et al.，2003.J.Immunol.1705583-5589)。
在慢性的發(fā)炎性的肺功能紊亂病人的氣道分泌物中，alpha-防御素大量累積而且被證明對(duì)氣道的上皮細(xì)胞有毒害作用并引發(fā)病原性的趨化因子在其他細(xì)胞中的分泌。特別值得提出的是，在鼻炎組織和受金黃色葡萄球菌S.aureus感染的上呼吸道的發(fā)炎的組織中alpha-防御素大量增加。beta-防御素在鼻竇炎病人中的鼻竇液中大量增加。組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)和beta-防御素在肺炎病人的發(fā)炎的氣管中大量產(chǎn)生。大量的AMP分子總是和可溶性的細(xì)胞炎癥介質(zhì)如IL-8和中性粒細(xì)胞緊密相關(guān)。alpha-和beta-防御素被證明在被分枝桿菌感染的病人的呼吸道中大量增加。同樣，大量的防御素也在以下病癥患者的受損組織中被發(fā)現(xiàn)，如特發(fā)性的發(fā)炎性肺病，彌漫性泛細(xì)支氣管炎，特發(fā)性肺纖維化。體外研究表明，alpha-防御素可以促進(jìn)細(xì)菌和上皮細(xì)胞的粘連，這暗示了這些多肽分子在慢性阻塞性肺疾病和囊性纖維性病的病理發(fā)生中起著作用。中性粒細(xì)胞在哮喘病人的呼吸道中也大量增加，暗示中性粒細(xì)胞對(duì)哮喘的病理發(fā)生也起作用。失控的AMP量和這種病的病理發(fā)生相關(guān)的想法也得到老鼠實(shí)驗(yàn)的支持。舉例來說，氣管內(nèi)滴注防御素可導(dǎo)致急性肺功能障礙，中性粒細(xì)胞的侵入，和支氣管釋放炎癥介質(zhì)，如TNF-alphah和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-2。
對(duì)胃腸而言，有報(bào)道說在胃炎和幽門螺桿菌引起的胃癌病人的發(fā)炎的胃上皮細(xì)胞中，beta-防御素持續(xù)提高。在克隆氏癥或活躍型潰瘍性結(jié)腸炎病人中，alpha-防御素和beta-防御素在發(fā)炎的胃上皮細(xì)胞中大量產(chǎn)生。
對(duì)於泌尿生殖系統(tǒng)疾病，有報(bào)道指出在受感染的泌尿生殖道中的發(fā)炎的組織中AMP的水平也大量提高。有證據(jù)顯示在慢性腎盂腎炎中的發(fā)炎的組織中的小管上皮細(xì)胞中beta-防御素被誘導(dǎo)產(chǎn)生。盆腔炎癥是僅次于陰道毛滴蟲，淋病奈瑟菌和沙眼衣原體的婦科疾病，病患婦女的陰道中有大量的和子宮內(nèi)膜炎關(guān)系緊密的中性粒細(xì)胞防御素。
對(duì)於惡性疾病而言，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)暗示，在惡性腎癌上皮細(xì)胞中，alpha-防御素是多肽組成中最常見的一種，說明alpha-防御素對(duì)腫瘤的增生有直接的影響(Muller，CA.et al.，2002.Am.J.Pathol.1601311-1324)。
AMP過量產(chǎn)生導(dǎo)致病癥的可以是由以下原因造成，基因的拷貝數(shù)的多樣性，啟動(dòng)子在基因組中的位置，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)多樣性引起的過量產(chǎn)生或超?；盍Α?br> 因此，由於AMP/AML分子在和發(fā)炎，失控的細(xì)胞增生/分化，細(xì)胞增生/分化的不平衡，血管增生和細(xì)胞轉(zhuǎn)移，和/或上皮損傷有關(guān)疾病中的明顯作用，本專利發(fā)明人認(rèn)為，治療上述疾病的最佳辦法是通過降低AMP/AML分子的水平和/或活力，和/或通過調(diào)控AMP/AML來達(dá)到。
利用本方法的在先技術(shù)是通過計(jì)算機(jī)基因組DNA序列中查找新的，潛在的，有未知功能的，但和疾病關(guān)系不詳?shù)腁MP類分子，然后嘗試調(diào)節(jié)它們的水平以達(dá)到治病目的(美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0030044907)。
但是，上述在先技術(shù)存在致命缺陷。僅從評(píng)價(jià)的角度來看，在先技術(shù)從來沒有被試過，而且也從來沒有被證明對(duì)任何疾病有療效。更重要的是，在先技術(shù)沒有提出用AMP的抑制劑如beta-防御素或LL-37進(jìn)行疾病治療。
因此，在先技術(shù)沒有夠提出用降低AMP/AMP類分子水平和/或活力來治病的方法。
因此，在先技術(shù)不能治療和發(fā)炎，失控的細(xì)胞增生/分化，細(xì)胞增生/分化的不平衡，血管增生和細(xì)胞轉(zhuǎn)移，和/或上皮損傷有關(guān)疾病。而此普遍認(rèn)為需要尋找一種對(duì)能克服其不足的更好的方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種治療患者疾病的療法，該法提供給病患足夠療效的能降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子(AML)活性和/或水平的某復(fù)合物以達(dá)到治病的目的。
進(jìn)一步講，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案包括給患者有效的用藥方法是給患者身體部位使用含有上述復(fù)合物的載體，而且復(fù)合物濃度范圍在每毫升約50納克到1毫克之間。
更進(jìn)一步講，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括給患者有效的用藥方法給患者使用2到30次的上述復(fù)合物， 兩次用藥間隔約2.4小時(shí)到30天之間。
更進(jìn)一步講，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括用藥方法，即，外用，鼻內(nèi)，穿皮，皮內(nèi)，口服，含服，胃腸外用藥，直腸用藥和吸入式用藥。
更進(jìn)一步講，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還提出，待治疾病和細(xì)胞和/或組織中的生物過程緊密相關(guān)，如生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，細(xì)胞轉(zhuǎn)移和血管生長(zhǎng)。
更進(jìn)一步講，如下詳述的本發(fā)明最佳實(shí)施方案中的患者指人。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)品，該產(chǎn)品含包裝材料及藥物部分，該產(chǎn)品經(jīng)鑒定可用于治療和細(xì)胞和/或/組織的生物活動(dòng)有關(guān)的疾病。該生物活動(dòng)可以是，生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和血管形成；藥物部分包括一合適的藥物載體及作為活性成分的一種能降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子活性和/或水平的復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括上述合適的載體，該藥物載體已經(jīng)過篩選以有助于藥物通過以下的途徑發(fā)揮藥效外用，鼻內(nèi)，經(jīng)皮，皮內(nèi)，口服，含服，皮下或靜脈注射，肛門用藥及吸入式用藥。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括藥物部分的存在形式，如溶液，懸液，乳劑或凝膠。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的藥物部分經(jīng)過調(diào)配使得患者的細(xì)胞和/或組織能接觸到濃度介于每毫升約50納克至約1毫克之間的上述復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括經(jīng)過進(jìn)一步鑒定后得知，其中的藥物部分的總用藥次數(shù)應(yīng)該是在2至30次之間，兩次用藥的間隔時(shí)間為2.4小時(shí)至30天之間。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的細(xì)胞和/或組織可以是上皮細(xì)胞和/或組織，皮膚細(xì)胞和/或組織，角質(zhì)細(xì)胞和/或組織，胃腸細(xì)胞和/或組織或內(nèi)皮細(xì)胞和/或組織。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的疾病可以是腫瘤，自體免疫疾病，上皮疾病，皮膚病，胃腸疾病，內(nèi)皮疾病或一種人類疾病。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的疾病可以是上皮腫瘤，上皮損傷，皮膚腫瘤，皮膚損傷，胃腸腫瘤，胃腸損傷，內(nèi)皮腫瘤，實(shí)體腫瘤，轉(zhuǎn)移瘤，皮膚自體免疫疾病，或惡性腫瘤。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中提到的疾病是牛皮癬或皮膚癌癥。
根據(jù)本發(fā)明的一項(xiàng)內(nèi)容，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或組織生物活動(dòng)的方法，該方法讓細(xì)胞和/或組織接觸一種能夠降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性和/或水平的復(fù)合物從而達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或組織生物活動(dòng)的目的。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的讓細(xì)胞和/或組織接觸所說的的復(fù)合物的效果是通過提供患者上述復(fù)合物來達(dá)到效果的。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中提供患者復(fù)合物是指給患者使用該復(fù)合物/和/或讓該復(fù)合物在患者體內(nèi)通過基因表達(dá)起作用。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中讓細(xì)胞和/或組織接觸上述復(fù)合物的有效方法是指讓它們接觸濃度介于每毫升約50納克至約1毫克之間的該復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括如其中的細(xì)胞和/或組織是惡性和/或角質(zhì)性的，而且其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)，則讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度介于每毫升約0.4至約200微克之間的上述復(fù)合物會(huì)更有效果。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括如其中的細(xì)胞和/或組織是惡性和/或角質(zhì)性的，而且其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是防御素則讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度介于每毫升約0.1至約50微克之間的上述復(fù)合物會(huì)更有效果。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括如其中的細(xì)胞和/或組織是胃腸細(xì)胞和/或組織和/或外皮細(xì)胞和/或組織，而且其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是防御素，則讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度介于每毫升約50納克至約10微克之間的上述復(fù)合物會(huì)更有效果。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括如其中的細(xì)胞和/或組織是內(nèi)皮細(xì)胞和/或組織，而且其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是防御素，則讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度介于每毫升約50納克至約10微克之間的上述復(fù)合物會(huì)更有效果。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括一種鑒定在細(xì)胞和/或組織內(nèi)有調(diào)節(jié)生物活動(dòng)能力的復(fù)合物的方法，該方法包括(a)讓細(xì)胞和/或組織接觸試驗(yàn)用復(fù)合物的方法，該復(fù)合物可以是(i)能夠降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性的分子；和/或(ii)上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子；和(b)評(píng)定該復(fù)合物在細(xì)胞和/或組織內(nèi)調(diào)節(jié)生物活動(dòng)能力的方法，故而可以鑒定出在細(xì)胞和/或組織內(nèi)有調(diào)節(jié)生物活動(dòng)能力的復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的細(xì)胞和/或組織是人工培養(yǎng)的細(xì)胞和/或組織。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的細(xì)胞和/或組織來自人體。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中讓細(xì)胞和/或組織接觸上述試驗(yàn)用復(fù)合物是通過提供患者該復(fù)合物來達(dá)到效果的。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中所說的的讓細(xì)胞和/或組織接觸上述試驗(yàn)用復(fù)合物是通過讓細(xì)胞和/或組織接觸能產(chǎn)生該復(fù)合物的細(xì)胞來達(dá)到效果的。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中能產(chǎn)生上述試驗(yàn)用復(fù)合物的細(xì)胞是B細(xì)胞雜交瘤。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中提供患者試驗(yàn)用復(fù)合物是指給患者使用該復(fù)合物和/或讓該復(fù)合物在患者的體內(nèi)通過基因表達(dá)起作用。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中所說的給患者提供所說的試驗(yàn)用復(fù)合物的有效方式包括外用，鼻內(nèi)，經(jīng)皮，皮內(nèi)，口服，含服，皮下或靜脈注射，肛門用藥及吸入式。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中上述試驗(yàn)用復(fù)合物是從以下材料中選出(a)一種能夠結(jié)合上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的分子；(b)一種能分解上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的酶；(c)一種小型干擾RNA(siRNA)分子，該分子能夠引起編碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)的降解；(d)一種脫氧核糖核酸酶(DNAzyme)，該酶能夠降解編碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核酸(DNA)；(e)一種反義多核苷酸，該反義多核苷酸能夠和編碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)雜交；(f)一種核酶，該核酶能夠降解編碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)；(g)一種類似物，該類似物至少模擬上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的功能片段，但其本身無(wú)功能；(h)一種能夠抑制上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性或配體(ligand)結(jié)合能力的分子或(i)一種能夠和編碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核酸(DNA)雜交的三鏈形成寡核苷酸(triplex forming oligonucleotide)。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中能夠結(jié)合上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的分子是一抗體或一抗體片段。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的抗體片段可以是一單鏈Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，和F(ab’)2。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是防御素(defensin)，組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)，陽(yáng)離子多肽，疏水肽，人抗菌肽(AMP)和/或人抗菌肽類分子。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是beta-防御素。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中所說的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是beta-防御素1，beta-防御素2或LL-37。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中所說細(xì)胞和/或組織是可以是上皮細(xì)胞和/或組織，皮膚細(xì)胞和/或組織，角質(zhì)細(xì)胞和/或組織，胃腸細(xì)胞和/或組織或內(nèi)皮細(xì)胞和/或組織。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和血管形成等生物活動(dòng)。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括一種療法，該療法提供患者足夠療效的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子，從而達(dá)到治療疾病的目的。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中給患者提供上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的是指給患者的身體部位使用帶有濃度在每毫升約2納克至10微克的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的載體來達(dá)到效果的。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中提供患者上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的有效方式包括外用，鼻內(nèi)，經(jīng)皮，皮內(nèi)，口服，含服，皮下或靜脈注射，肛門用藥及吸入式用藥。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的患者是人。
根據(jù)本發(fā)明的一項(xiàng)內(nèi)容，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)品，該產(chǎn)品含包裝材料及藥物部分，該產(chǎn)品經(jīng)鑒定可用于治療和細(xì)胞和/或/組織的生物活動(dòng)有關(guān)的疾病。該生物活動(dòng)可以是，生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和血管形成；藥物部分包括一合適的藥物載體和一活性成分，該活性成分是抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子。
根據(jù)本發(fā)明的一項(xiàng)內(nèi)容，本發(fā)明其中的藥物載體已經(jīng)過篩選以有助于藥物通過以下的途徑發(fā)揮藥效外用，鼻內(nèi)，經(jīng)皮，皮內(nèi)，口服，含服，皮下或靜脈注射，肛門用藥及吸入式用藥。
根據(jù)本發(fā)明的一項(xiàng)內(nèi)容，本發(fā)明其中藥物部分可以存在于以下形式，溶液，懸液，乳劑或凝膠。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的藥物部分經(jīng)過調(diào)配使得患者的細(xì)胞和/或組織能接觸到濃度介于每毫升約2納克至約10微克之間的上述復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的疾病可以是腫瘤，上皮疾病，皮膚病，胃腸疾病和內(nèi)皮疾病。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的疾病可以是上皮腫瘤，上皮損傷，皮膚腫瘤，皮膚傷害，胃腸腫瘤，胃腸損傷，內(nèi)皮腫瘤，實(shí)體腫瘤，轉(zhuǎn)移瘤，皮膚自體免疫疾病或惡性腫瘤。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括一種調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或組織生物活動(dòng)的方法，該方法讓細(xì)胞和/或組織接觸一種抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子從而達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或組織生物活動(dòng)的目的。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的讓細(xì)胞和/或組織接觸所說的的一種抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的效果是通過提供患者上述分子來達(dá)到效果的。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中提供患者抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是指給該患者使用該類物質(zhì)或讓該類物質(zhì)在患者體內(nèi)通過基因表達(dá)起作用。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中讓細(xì)胞和/或組織接觸上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是通過讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度約每毫升2納克到約10微克的該抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子來達(dá)到效果的。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是防御素(defensin)，組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)，陰離子多肽，疏水肽，人抗菌肽(AMP)和人抗菌肽類分子。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是beta-防御素。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是beta-防御素1，beta-防御素2或LL-37。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的細(xì)胞和/或組織可以是上皮細(xì)胞和/或組織，皮膚細(xì)胞和/或組織，角質(zhì)細(xì)胞和/或組織或腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞和/或組織。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括其中的生物活動(dòng)可以是生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎或血管形成。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括如其中的細(xì)胞和/或組織是惡性的，而且其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是防御素，則讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度范圍約每毫升0.1微克到約10微克的上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子會(huì)更有效果。
根據(jù)本發(fā)明的特點(diǎn)，如下詳述的本發(fā)明的最佳實(shí)施方案還包括如其中的細(xì)胞和/或組織是角質(zhì)細(xì)胞和/或組織，而且其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是防御素，則讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度范圍每毫升約2納克到約10微克的上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子會(huì)更有效果。
本發(fā)明成功闡釋了在先技術(shù)的缺陷，因?yàn)楸景l(fā)明具備了以下的優(yōu)勢(shì)(i)一種用某復(fù)合物和/或抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子治療疾病的方法，其中的疾病和細(xì)胞和/或/組織中的生物活動(dòng)有關(guān)，包括生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和/或血管生長(zhǎng)，該復(fù)合物能有效降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子活性和/或水平從而達(dá)到治療疾病的目的。(ii)含有該復(fù)合物并附有治療上述疾病標(biāo)簽的產(chǎn)品；(iii)鑒定該復(fù)合物的方法。
除非特別指明，此處用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的定義都和該專利相應(yīng)領(lǐng)域這些術(shù)語(yǔ)的普遍理解一致。雖然和下述的本專利材料和方法類似的材料和方法在實(shí)踐中用甚至測(cè)試本專利，但最合適的材料和方法應(yīng)以下述的材料和方法為準(zhǔn)。本專利所引述的專利申請(qǐng)，專利和其他文獻(xiàn)都全文列出。如有沖突，專利說明書，包括定義書會(huì)加以控制。除此以外，材料和方法，以及例證都僅是說明性的而非限制性。


本專利在此處以圖形來描述。圖形將提供更多的細(xì)節(jié)描述和專門的條文，從而使本專利的最佳實(shí)施方案內(nèi)最有用的觀念和原理得到最大程度的理解。為此，本專利作者無(wú)意列出超過基本理解范圍之外的結(jié)構(gòu)性細(xì)節(jié)，圖形上的描述對(duì)本領(lǐng)域?qū)嵤┓桨感问绞煜さ膶I(yè)人士則顯而易懂。
在圖形中圖1的一系列微觀照片描述了在用AMP分子人beta-防御素-1和beta-防御素-2處理惡性角質(zhì)細(xì)胞后引起的細(xì)胞增生。培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT，克隆6，A-5，I-5，II-4和RT-3)生長(zhǎng)在24孔的培養(yǎng)盤中，每盤50,000個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞粘附在培養(yǎng)盤上后，加入每毫升1微克的人beta-防御素-1和beta-防御素-2到培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后照相(20倍)。
圖2的柱狀圖顯示惡性的人角質(zhì)細(xì)胞在每毫升1微克的人beta-防御素-2抗體處理后，生長(zhǎng)受到抑制。永生化(immortalized)的，中度或重度惡性的人角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT，克隆6，A-5，I-5，II-4和RT-3)鋪在培養(yǎng)盤中，讓其粘附在培養(yǎng)盤上后，培養(yǎng)在每毫升1微克的人beta-防御素-2抗體的培養(yǎng)液中48小時(shí)，然后用放射性[H3]胸腺嘧啶核苷摻入法測(cè)量細(xì)胞的增生。
圖3的柱狀圖描述了不同濃度的抗LL-37和抗人beta-防御素-2抗體對(duì)原代皮膚角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)的正面和負(fù)面影響。培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞被抗體處理48小時(shí)，其中抗LL-37的抗體(藍(lán)柱)濃度是每毫升4微克(1x)或20微克(5x)或抗人beta-2防御素的抗體(黃柱)的濃度是每毫升1微克(1x)或5微克(5x)。細(xì)胞增生是用放射性[H3]胸腺嘧啶核苷摻入法測(cè)量的，圖中以相對(duì)于未處理細(xì)胞的百分比來顯示。圖中所列是一代表性的實(shí)驗(yàn)，每一柱形是三次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖4a-c三維的體外人造皮膚模型的微觀照片顯示抗AMP(人beta-防御素-2)抗體對(duì)AMP引起的皮膚分化失調(diào)的糾正。圖4a顯示未經(jīng)處理的對(duì)照，圖4b顯示經(jīng)人beta-防御素-2處理的結(jié)果，圖4c顯示經(jīng)抗人beta-防御素-2抗體處理的結(jié)果。把非惡性的HaCaT人角質(zhì)細(xì)胞殖到鼠表皮結(jié)構(gòu)上24小時(shí)后，正如圖中指出的，加入每毫升1微克的抗人beta-防御素-2抗體或每毫升20納克的人beta-防御素-2到培養(yǎng)液中。對(duì)照的培養(yǎng)液中加入0.1％的BSA。經(jīng)每2-3天一次持續(xù)2周的處理后，收集細(xì)胞，用4％的多聚甲醛固定，然后石蠟切片(6微米)。按標(biāo)準(zhǔn)程序切片后，以蘇木素伊紅(H&E)染色。圖中顯示的是奧林巴斯光學(xué)顯微鏡亮視野照片。
圖5a-d照片顯示牛皮癬皮膚損傷經(jīng)過抗LL-37抗體有效處理后的結(jié)果。圖5a和5b相應(yīng)的是未經(jīng)抗LL-37抗體處理的損傷對(duì)照和在第0天的抗LL-37抗體處理之前的損傷。圖5c和5d分別是未經(jīng)處理的損傷對(duì)照和經(jīng)抗LL-37抗體處理后第3天的損傷。請(qǐng)注意在經(jīng)處理的損傷中沒有皮屑，說明皮膚細(xì)胞/組織的增生/分化的失衡已被糾正。
圖6的柱狀圖顯示抗人beta-防御素-2抗體在不同濃度下對(duì)胃腸上皮細(xì)胞增生的顯著影響。給Caco2胃腸上皮細(xì)胞48小時(shí)的濃度為每毫升0.5微克(藍(lán)/淡色柱)或每毫升1.0微克(紅/黑柱)抗人beta-防御素-2抗體處理。細(xì)胞增生是由放射性[H3]胸腺嘧啶核苷摻入法測(cè)量的，然后以相對(duì)于未處理的細(xì)胞的百分比來表示的。圖中所示為一代表性實(shí)驗(yàn)。每一柱形代表三次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖7的柱狀圖顯示抗人beta-防御素-2抗體對(duì)原代內(nèi)皮細(xì)胞增生的顯著抑制。對(duì)牛的原代內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行48小時(shí)的濃度為每毫升0.5微克(藍(lán)/淡色柱)或每毫升1.0微克(紅/黑柱)抗人beta-防御素-2抗體處理。細(xì)胞增生是由放射性[H3]胸腺嘧啶核苷摻入法測(cè)量的，然后以相對(duì)于未處理的細(xì)胞的百分比來表示的。圖中所示為一代表性實(shí)驗(yàn)。每一柱形代表三次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明專利是用抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子和/或一種能夠降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性和/或水平的復(fù)合物來調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或組織生物活動(dòng)的方法，其中的生物活動(dòng)包括生長(zhǎng)，分化，生長(zhǎng)/分化的平衡，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和血管形成；發(fā)明專利也是用上述分子和/或復(fù)合物來治療和上述生物活動(dòng)有關(guān)的疾病的療法，該療法通過調(diào)節(jié)上述生物活動(dòng)達(dá)到治療目的。
該方法讓細(xì)胞和/或組織接觸一種能夠降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性和/或水平的復(fù)合物從而達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或組織生物活動(dòng)的目的。本發(fā)明專利還包括一種產(chǎn)品，該產(chǎn)品含有上述分子并被標(biāo)明用于治療上述疾病，本發(fā)明專利還包括鑒定上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子和/或能夠降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性和/或水平的復(fù)合物的方法。具體地說，本發(fā)明專利可用于治療廣泛的和上述生物活動(dòng)有關(guān)的疾病，包括和細(xì)胞增生/分化失衡有關(guān)的炎癥，如牛皮癬，和損傷有關(guān)的疾病，以及腫瘤，如轉(zhuǎn)移/惡性癌癥。
利用上述的圖形及相關(guān)的描述可以更好地理解本發(fā)明專利的原理及操作。
在詳述本發(fā)明專利的最佳實(shí)施方法之前，有必要指出，本發(fā)明并不局限于下述的專利使用和例證當(dāng)中。本發(fā)明還可以不同方式推廣和實(shí)施在其他方面。同理，此處所用的用語(yǔ)和用詞雖然是以清晰闡釋本發(fā)明為目的，但它們的含義不應(yīng)該被認(rèn)為僅局限于此。
很多和發(fā)炎，失控的細(xì)胞/組織的增生/分化，不平衡的細(xì)胞/組織的增生和分化，血管增生和/或癌癥轉(zhuǎn)移的疾病都沒有令人滿意的療法，因而本發(fā)明具有重大的醫(yī)療的和經(jīng)濟(jì)的意義。在構(gòu)想本專利時(shí)，本專利發(fā)明者認(rèn)為，既然AMP/AML分子涉及上述疾病的病理發(fā)生，那么降低上述分子活力和/或水平抑或使用上述分子就可能達(dá)到治療疾病的目的。
和本方法有關(guān)的在先技術(shù)是通過計(jì)算機(jī)基因組DNA序列中查找新的，潛在的，有未知功能的，和和疾病關(guān)系不明的似AMP類分子，然后在理論上假想調(diào)節(jié)它們的水平來可能會(huì)達(dá)到治病目的(美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0030044907)。
但是，述在先技術(shù)存在致命缺陷。因?yàn)?，那些潛在的似AMP分子在疾病發(fā)生中的功能不明，因此很難想象這些似AMP分子在患者身上會(huì)有治病療效。所以，用這些分子治療疾病也只是局限在理論水平上。另外，在先技術(shù)也沒有提供實(shí)驗(yàn)結(jié)果或找出前人的實(shí)驗(yàn)記錄來證明其想法的可行性。因此在先技術(shù)無(wú)法提出治療任何特別疾病的方法，如發(fā)炎性的疾病，或腫瘤，在先技術(shù)也沒有提供給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易接受的如本發(fā)明所提出的治病方法。而且在先技術(shù)也沒有提出用經(jīng)典的AMP分子如beta-防御素-2或LL-37的抑制劑進(jìn)行疾病治療。
另一個(gè)在先技術(shù)根據(jù)理論提出利用和AMP相應(yīng)的遺傳序列互補(bǔ)的反義多核苷酸來治病。
但該在先技術(shù)也存在嚴(yán)重的不足，包括(i)潛在的AMP在病理發(fā)生中的作用是非常假想性的，(ii)需要使用不可靠的抗體制備方法；(iii)使用潛在的藥物在理論上需要使用食療；(iv)從來沒有用過，因此無(wú)法證明是否有可能治病。
因此，這種在先技術(shù)沒有能夠提出用降低AMP/AML活力和/或水平來治病的方法。
當(dāng)把本發(fā)明落實(shí)到實(shí)踐中時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)抗AMP的抗體可以顯著抑制培養(yǎng)的惡性癌細(xì)胞生長(zhǎng)和它們對(duì)物體表面的黏附性，可以顯著抑制/降低培養(yǎng)的人原代角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，在三維的人造皮膚的模型中可以有效糾正人上皮細(xì)胞/組織的增生/分化失衡，可以有效治療了患者的牛皮癬，可以顯著抑制、降低培養(yǎng)的人胃腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且可以有效抑制人體內(nèi)皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)把本發(fā)明落實(shí)到實(shí)踐中時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)AMP能夠顯著提高或降低培養(yǎng)的人體上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。
因此，和在先技術(shù)成為鮮明對(duì)比的是本專利方法利用復(fù)合物來降低AMP/AML分子水平/活力，和/或利用AMP/AML來調(diào)節(jié)生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和血管增生等生物活動(dòng)，并治療很多疾病，如和發(fā)炎，失控的細(xì)胞增生/分化，血管生長(zhǎng)和腫瘤轉(zhuǎn)移的疾病，包括癌癥如惡性轉(zhuǎn)移性的皮膚癌，和損傷有關(guān)的疾病如潰瘍性疾病，和自身免疫疾病/和失控的細(xì)胞增生、分化有關(guān)的疾病如牛皮癬。
因此，本專利提供了一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞/組織生物活動(dòng)的方法。有效使用該法是讓細(xì)胞和/或組織接觸抗菌肽和/或似抗菌肽的分子和或能降低AMP/AML分子活力/水平的復(fù)合物。該方法能夠用來調(diào)節(jié)以下的生物活動(dòng)，生長(zhǎng)/分化，腫瘤轉(zhuǎn)移和或血管生長(zhǎng)。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞組織的上述生物活動(dòng)，該方法因而可以治療和上述活動(dòng)有關(guān)的疾病，同時(shí)用來鑒定調(diào)節(jié)物，如下祥述。舉例來說，和上述生物活動(dòng)有關(guān)的疾病包括自身免疫疾病，和失衡的細(xì)胞組織生長(zhǎng)增生有關(guān)的疾病，和損傷有關(guān)的疾病，如腫瘤。
在本專利申請(qǐng)中所提到的“調(diào)節(jié)物”是指能降低AMP/AML分子活力/水平的復(fù)合物，和/或用在本專利實(shí)踐中的AMP和/或AML分子。
這里所用的術(shù)語(yǔ)，如“復(fù)合物”，“本發(fā)明中的復(fù)合物”以及“AMP/AML抑制劑”都是指能降低AMP/AML活力/水平的復(fù)合物，它們可以相互轉(zhuǎn)換。
因用途和目的不同，不同的AMP/AML抑制劑可能用在調(diào)節(jié)不同性質(zhì)的生物活動(dòng)中。
這里的術(shù)語(yǔ)AMP可指防御素，蛋白酶抑制素(cathelicidin)，和/或血小板抗菌蛋白(thrombocidin)，它們的變體，包括自然變體制如突變體、多形變體-即等位基因的產(chǎn)物或人工合成的變體分子。
這里的術(shù)語(yǔ)“AML”可指任何有類似防御素，組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)，和/或血小板抗菌蛋白(thrombocidin)生物活性的分子，包括可大幅度促進(jìn)防御素，蛋白酶抑制素(cathelicidin)，和/或血小板抗菌蛋白(thrombocidin)生物活力的分子，包括任何結(jié)構(gòu)上和防御素，蛋白酶抑制素(cathelicidin)，和/或血小板抗菌蛋白(thrombocidin)有顯著相似性的分子。
有效的治療可以通過使用本專利中的一種或多種調(diào)節(jié)物的組合來達(dá)到目的。
AMP/AML抑制劑可以是一種能夠結(jié)合上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的分子；一種能分解上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的酶；一種小型干擾RNA(siRNA)分子，該分子能夠引起編碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)的降解；一種脫氧核糖核酸酶(DNAzyme)，該酶能夠降解編碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核酸(DNA)；一種反義多核苷酸，該反義多核苷酸能夠和編碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)雜交；一種核酶，該核酶能夠降解編碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)；一種類似物，該類似物至少模擬上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的功能片段，但其本身無(wú)功能；一種能夠抑制上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性或配體(ligand)結(jié)合能力的分子或一種能夠和編碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核酸(DNA)雜交的三鏈形成寡核苷酸(triplex forming oligonucleotide)。
以下的敘述以及本領(lǐng)域的其他文獻(xiàn)(如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朜o.20030044907，請(qǐng)參閱文獻(xiàn)部分)為如何取得和利用AMP/AML抑制劑提供詳細(xì)的說明。
AMP/AML抑制劑可以是小分子，AMP/AML顯性失活的突變體，和AMP競(jìng)爭(zhēng)其關(guān)聯(lián)細(xì)胞受體但不致病的多肽。舉例來說，AMP/AML抑制劑可以是其拓?fù)漕愃莆?被設(shè)計(jì)得有抗菌能力但無(wú)趨化能力。如何設(shè)置AMP/AML分子中的二硫鍵來區(qū)分AMP/AML的抗菌能力和趨化能力已在人beta-防御素的研究中有詳盡的描述(Wu Z.et al.，2003.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1008880-5)。
AMP/AML抑制劑可以是合成的模擬抗體，其中的多肽環(huán)附在分子骨架上(美國(guó)專利No.5,770,380)。
這種AMP/AML模擬物可以通過分子印跡的辦法獲得。先將一個(gè)個(gè)的單體分子交聯(lián)在“模板分子”(AMP/AML)上形成聚合物，然后去掉“模板分子”，這時(shí)模板分子尺寸，形狀和化學(xué)功能已被記錄在聚合物上了。去掉了模板分子的空位置被稱作“印記位置”，這些位置可以識(shí)別模板分子或有類似結(jié)構(gòu)的分子。有分子印記的聚合物可模擬天然抗體和模板分子的結(jié)合。
能夠抑制AMP/AML激活或抑制AMP/AML和配體結(jié)合的分子可以有效抑制在細(xì)胞上表達(dá)的受體的結(jié)合。如白細(xì)胞結(jié)合AMP/AML分子后抑制AMP/AML和其受體結(jié)合所調(diào)控的生物活動(dòng)。這類AMP/AML分子及其同源受體被列在表1中表1 AMP/AML分子和它們的同源受體以及和它們的相互作用有關(guān)的疾病。

更多的AMP/AML的受體例子，如趨化因子的受體，可以參見D’Ambrosio et al.，2003.J.Immunol.Methods 273 3-13.這篇文章也有很多的表達(dá)上述受體的細(xì)胞的信息，以及受AMP/AML和受體之間作用影響的疾病的信息。
LL-37(Weiner，DJ.et al.，2003.Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.28738-745)，防御素-3，乳鐵傳送蛋白和IL-88(Perks，B.et al.，2000.Am.J.Respir.Crit Care Med.1621767-1772)的活力都被F-肌動(dòng)蛋白所抑制，因此，該AMP/AML的抑制物可能是F-肌動(dòng)蛋白。F-肌動(dòng)蛋白在多聚陽(yáng)離子白細(xì)胞介素IL-8存在時(shí)集結(jié)成束，因此F-肌動(dòng)蛋白是LL-37和白細(xì)胞介素IL-8配體-受體關(guān)聯(lián)能力的下游因子的抑制物。LL-37和防御素-3被凝膠溶膠素抑制，因此該AMP/AML的抑制物也可能是凝膠溶膠素。絲氨酸蛋白酶抑制物和其類似物或片段可以和AMP分子形成一復(fù)合體使AMP分子失活(Panyutich，AV.et al.，1995.。Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.12351-357；alpha-1 antichymotrypsin，theantimicrobial proteins alpha PI，SLPI and elafin are serpins that formcomplexes with other AMPs)，而降低了某些特別的炎癥(Hiemstra，PS，2002.Biochem.Soc.Trans.30116-120)，因此，該AMP/AML的抑制物也可能是絲氨酸蛋白酶抑制物和其類似物或片段。該AMP/AML的抑制物也可能是SIC，一種從化膿性鏈球菌中分泌出來的能使抗菌肽分子失活得蛋白質(zhì)。
能夠和AMP/AML結(jié)合的分子中，抗體或抗體片段是最佳的選擇。
換一個(gè)角度來說，有很多分子能夠和AMP/AML結(jié)合，包括非免疫球蛋白。
最合適的抗體片段可以是單鏈Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’和F(ab’)2.
用在此處的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指明顯完整的抗體分子。
用在此處的術(shù)語(yǔ)“抗體片段”是指能和AMP/AML結(jié)合的功能性片段。
適合本專利的抗體片段包括一免疫球蛋白輕鏈(稱作“輕鏈”)的決定互補(bǔ)區(qū)(CDR)，一免疫球蛋白重鏈(稱作“重鏈”)的CDR，一輕鏈的可變區(qū)，一重鏈的可變區(qū)，一輕鏈，一重鏈，一Fd片段，以及缺乏整個(gè)可變區(qū)的輕鏈和重鏈的抗體片段，如一Fv，一Fab，一Fab’，和一F(ab’)2。有功能的抗體片段包括整個(gè)或?qū)嵸|(zhì)的輕鏈和重鏈的可變區(qū)，具體定義如下(i)Fv，定義為通過遺傳工程的辦法制造的包含兩條分別表達(dá)的輕鏈和重鏈的可變區(qū)。
(ii)單鏈Fv(“scFv”)，是通過遺傳工程的辦法制造的包含用合適的連接肽連接的輕鏈和重鏈可變區(qū)的單鏈分子。
(iii)Fab，是一個(gè)含有單價(jià)抗原結(jié)合部位的抗體分子片段，F(xiàn)ab可以由木瓜蛋白酶處理完整的抗體分子得到，處理后的分子包括完整的輕鏈，帶有可變區(qū)和CH1區(qū)的重鏈Fd片段。
(iv)Fab’，是一個(gè)含有單價(jià)抗原結(jié)合部位的抗體分子片段，F(xiàn)ab’可以由胃蛋白酶處理完整的抗體分子然后經(jīng)還原處理后獲得，和(v)F(ab’)2，是一個(gè)含有單價(jià)抗原結(jié)合部位的抗體分子片段，F(xiàn)(ab’)2可以由胃蛋白酶處理完整的抗體分子后獲得(比如，由兩個(gè)二硫鍵結(jié)合的Fab’雙體)。
在本專利技術(shù)領(lǐng)域中，抗體(單克隆和多克隆抗體)的制備已是一種普通技術(shù)，利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)中的一種都可以制備抗體，這些方法包括，誘導(dǎo)體內(nèi)抗體產(chǎn)生，篩選免疫球蛋白庫(kù)(Orlandi D.R.et al.，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.863833-3837；Winter G.et al.，1991.Nature 349293-299)或通過連續(xù)的細(xì)胞株培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體。這些技術(shù)包括但并不限於雜交細(xì)胞瘤技術(shù)，人體B-細(xì)胞雜交細(xì)胞瘤技術(shù)，Epstein-Barr病毒(EBV)-雜交細(xì)胞瘤技術(shù)(Kohler G.et al.，1975.Nature 256495-497；Kozbor D.et al.，1985.J.Immunol.Methods 8131-42；Cote RJ.et al.，1983.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802026-2030；Cole SP.et al.，1984.Mol.Cell.Biol.62109-120)。
在制備抗體時(shí)，目標(biāo)病原分子有時(shí)太小以至于不能引起足夠的免疫反應(yīng)。這種情況下，可以把抗原(半抗原(hapten))交聯(lián)在中性免疫載體上，如鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)或血清白蛋白(如牛血清白蛋白(BSA))載體(例證可參見美國(guó)專利號(hào)5,189,178和5,239,078)。把半抗原(hapten)有效交聯(lián)在載體上的技術(shù)在本專利領(lǐng)域已經(jīng)很成熟。舉例來說，有效的直接交聯(lián)可以通過選擇性的還原形成的亞胺(imino)連接來實(shí)現(xiàn)。另一種和載體交聯(lián)的辦法是用壓縮劑二環(huán)己基碳化二亞胺或其他碳化二亞胺脫水劑來完成。連接復(fù)合物也可以有效地幫助交聯(lián)，同性雙功能連接物(linker)和異性雙功能連接物都可以從伊利諾州的Rockford的Pierce Chemical Company購(gòu)買。最后的交聯(lián)產(chǎn)物是一可以引起免疫反應(yīng)的復(fù)合體，它可以被注入老鼠，兔子等哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗體。適宜的方法包括反復(fù)注射免疫抗原，如果輔之以佐劑，則可提高血清中抗體的產(chǎn)量?？贵w血清的效價(jià)可通過本領(lǐng)域熟知的免疫測(cè)試法來測(cè)量。
抗體血清可以直接使用也可用上述提到的方法來取得單克隆抗體?？贵w片段的獲得在本專利領(lǐng)域也是大家所熟知的 [請(qǐng)見Harlow and Lane，″AntibodiesA Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，(1988)]。舉例來說，根據(jù)本專利，抗體片段可以通過蛋白酶水解抗體分子獲得或通過在大腸桿菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)或其他蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng))中基因表達(dá)獲得。
另外，抗體片段也可通過傳統(tǒng)方法來治備，即用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶分解整個(gè)抗體分子來獲得。如上所述，(Fab’)2抗體片段可通過用胃蛋白酶分解抗體分子來獲得5S片段。該片段可以進(jìn)一步被巰基還原劑或是巰基阻斷劑處理造成二硫鍵的斷裂產(chǎn)生一3.5S的Fab’單價(jià)片段。另外一種可能是胃蛋白酶切斷抗體分子也可直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab’片段和一Fc片段。具體的詳盡的操作方法可參見本領(lǐng)域的文獻(xiàn)(如Goldenberg，U.S.Pat.Nos.4,036,945 and 4,331,647；Porter，RR.，1959.Biochem.J.73119-126)。只要產(chǎn)生的抗體片段和完整的抗體一樣能識(shí)別抗原，那么其他的抗體切斷方法也可以用來制備抗體片段，如分離重鏈來形成單價(jià)輕-重鏈片段，片段的再切斷，或其他的酶法，化學(xué)法，或遺傳技術(shù)。
如上所述，F(xiàn)v包括一對(duì)重鏈的可變區(qū)和輕鏈的可變區(qū)。重鏈的可變區(qū)和輕鏈的可變區(qū)的聯(lián)結(jié)方式可以是單價(jià)共價(jià)鍵(例見Inbar et al.，1972.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.692659-62)，另外，如上所述，F(xiàn)v也可以是一個(gè)包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的分子，其中的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過分子內(nèi)的二硫鍵來聯(lián)結(jié)，或被戊二醛等化學(xué)物質(zhì)交聯(lián)起來。
Fv最好是單鏈Fv。
單鏈Fv是按以下方法制備的，建立一個(gè)編碼重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的結(jié)構(gòu)基因，其中的兩個(gè)可變區(qū)是由一寡核苷酸連接，它會(huì)變成單鏈Fv中上述兩可變區(qū)的連接肽。結(jié)構(gòu)基因然后放入一DNA表達(dá)載體中送入宿主細(xì)胞如大腸桿菌中。重組的宿主細(xì)胞然后合成一單鏈的由連接肽連接上述兩個(gè)可變區(qū)的多肽，具體的詳盡的操作指南可參見本領(lǐng)域的文獻(xiàn)(如Whitlow and Filpula，1991.Methods 297-105；Bird et al.，1988.Science 242423-426；Pack et al.，1993.Bio/Technology 111271-77；and Ladner et al.，U.S.Pat.No.4,946,778)。
分離的互補(bǔ)決定區(qū)多肽可以通過構(gòu)建一編碼目標(biāo)抗體互補(bǔ)決定區(qū)的基因來得到。這個(gè)基因可以由產(chǎn)生抗體細(xì)胞的mRNA的RT-PCR得到。具體的詳盡的操作指南可參見本領(lǐng)域的文獻(xiàn)(如Larrick and Fry，1991.Methods 2106-10)。
在臨床診斷和治療上，人源化的抗體很受歡迎和認(rèn)同。非人的(如鼠)的人源化的抗體是指遺傳工程產(chǎn)生的嵌和抗體或最好含有最小的非人抗體的抗體片段。人源化的抗體是指人抗體(受體抗體)中的互補(bǔ)決定區(qū)部分被動(dòng)物如老鼠，大鼠的抗體(供體抗體)的盡可能小的互補(bǔ)決定區(qū)部分替代的抗體。在某些情況下甚至人抗體的Fv框架的氨基酸也可被動(dòng)物的相應(yīng)部分替代。有時(shí)，人源化的抗體互補(bǔ)決定區(qū)也可含有既非人也非動(dòng)物的氨基酸。一般來講，人源化的抗體含有至少一個(gè)，通常兩個(gè)實(shí)質(zhì)性的可變區(qū)，在可變區(qū)中，整個(gè)或?qū)嵸|(zhì)性的互補(bǔ)決定區(qū)來源于動(dòng)物，而剩余的整個(gè)或?qū)嵸|(zhì)性的框架部分來源于人體。人源化的抗體最好還含有一抗體恒定區(qū)Fc，一般是來自人(例證請(qǐng)參見Jones et al.，1986.Nature321522-525；Riechmann et al.，1988.Nature 332323-329；and Presta，1992.Curr.Op.Struct.Biol.2593-596)。
在本專利領(lǐng)域，如何將抗體人源化已經(jīng)是一成熟的技術(shù)。一般來講，人源化的抗體有一個(gè)到多個(gè)非人源的氨基酸。因?yàn)檫@些氨基酸多來自供體抗體的可變區(qū)，輸入基團(tuán)。抗體人源化的過程實(shí)質(zhì)(詳盡的描述可參見Jones et al.，1986.Nature 321522-525；Riechmann et al.，1988.Nature 332323-327；Verhoeyenet al.，1988.Science 2391534-1536；U.S.Pat.No.4,816,567)上是用嚙齒類動(dòng)物的互補(bǔ)決定區(qū)替換相應(yīng)的人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)。因此，人源化抗體是一抗體嵌和物，即其不太完整的人抗體可變區(qū)已被動(dòng)物的相應(yīng)區(qū)代替。但在實(shí)際操作當(dāng)中，人源化抗體可以指互補(bǔ)決定區(qū)和也許框架區(qū)的個(gè)別氨基酸被相應(yīng)的嚙齒類動(dòng)物抗體的氨基酸所替代。
在本專利領(lǐng)域還有很多制造人抗體的辦法，如顯示信息庫(kù)法(phage-display libraries)[詳見Hoogenboom and Winter，1991.J.Mol.Biol.227381；Marks et al.，1991.J.Mol.Biol.222581；Cole et al.，″Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy″，Alan R.Liss，pp.77(1985)；Boerner et al.，1991.J.Immunol.14786-95)。人源化的抗體也可通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如老鼠注射編碼人免疫球蛋白的基因，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)本身的免疫球蛋白已經(jīng)被部分或全部失活。在接種抗原后，這些動(dòng)物產(chǎn)生在各方面都和人體抗體非常相似的抗體，包括基因重組，輕鏈和重鏈的安裝，及抗體譜。詳盡的實(shí)驗(yàn)方法及指南可參見本領(lǐng)域的文獻(xiàn)(如for example，refer toU.S.Pat.Nos.5,545,807，5,545,806，5,569,825，5,625,126，5,633,425，and 5,661,016；Marks et al.，1992.Bio/Technology 10779-783；Lonberg et al.，1994.Nature368856-859；Morrison，1994.Nature 368812-13；Fishwild et al.，1996.Nature Biotechnology 14845-51；Neuberger，1996.Nature Bioteehnology14826；Lonberg and Huszar，1995.Intern.Rev.Immunol.1365-93；Kellermann，SA.et al.，2002.Curr.Op.Biotechnol.13593-597)。
當(dāng)有了抗體以后，抗體的活性可以用多種辦法來測(cè)試，如ELISA。
很多合適的抗體也可以通過抗體制造商購(gòu)買，如Pharmingen，Dako，Becton-Dickinson，Sigma-Aldrich等。水藻在工業(yè)上可以用來大量制備抗體(ProcNatl Acad Sci USA.2003，100438-42)。
如上所述，AMP/AML的抑制物也可以是一種小型干擾RNA(siRNA)分子。RNA干擾包括兩個(gè)步驟，第一步是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的dsRNA可能被Dicer切成小的21-23核苷酸(nt)的小型干擾RNA(siRNA)分子，Dicer是RNase III家族的對(duì)dsRNA有特異性的核酸酶，在ATP的幫助下它可以處理(切斷)dsRNA(直接轉(zhuǎn)入，轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)入或病毒轉(zhuǎn)入)。RNA被成功地切斷后形成19-21bp的帶有2個(gè)nt的3’突出端(endoverhangs)的雙鏈分子(siRNA)[Hutvagner and Zamore Curr.Opin.Genetics andDevelopment 12225-232(2002)；and Bernstein Nature 409363-366(2001)]。
第二步是發(fā)揮作用，siRNA和一個(gè)核酸酶復(fù)合體形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，or RISC)。激活RISC需要ATP的幫助來解旋siRNA雙鏈分子?；罨腞ISC和同源的轉(zhuǎn)錄分子(mRNA)進(jìn)行鹼基配對(duì)然后將其降解為12核苷酸的片段siRNA[Hutvagner and Zamore Curr.Opin.Genetics andDevelopment 12225-232(2002)；Hammond et al.(2001)Nat.Rev.Gen.2110-119(2001)；and Sharp Genes.Dev.15485-90(2001)]。雖然RNA被降解的原理依舊不詳，但研究指出每一個(gè)RISC都帶有一個(gè)siRNA和一個(gè)RNase[Hutvagner and Zamore Curr.Opin.Genetics and Development 12225-232(2002)]。
因?yàn)閟iRNA的巨大效力，有人認(rèn)為RNAi的作用途徑還包括一步擴(kuò)增。擴(kuò)增可以通過復(fù)制輸入的RNA信息來產(chǎn)生更多的siRNA來完成或復(fù)制剛合成的siRNA分子來完成。另外，擴(kuò)增也可通過RISC的高效率來達(dá)到[Hammond et al.Nat.Rev.Gen.2110-119(2001)，Sharp Genes.Dev.15485-90(2001)；Hutvagner andZamore Curr.Opin.Genetics and Development 12225-232(2002)]。更多的RNA干擾資訊可以在以下綜述得到Tuschl ChemBiochem.2239-245(2001)；Cullen Nat.Immunol.3597-599(2002)；and Brantl Biochem.Biophys.Act.157515-25(2002)。
和本專利相關(guān)合適的RNAi合成技術(shù)詳述如下。首先，從AMP/AML的mRNA的起始密碼AUG開始尋找AA開頭的核苷酸序列。有AA及其3’端的19個(gè)核苷酸構(gòu)成一潛在的siRNA目標(biāo)序列。siRNA目標(biāo)序列最好是在開放閱讀框架(openreading frame)，因?yàn)榉欠g區(qū)(UTRs)有太多的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。和UTR結(jié)合的蛋白質(zhì)及翻譯起始復(fù)合體可能會(huì)干擾siRNA內(nèi)切酶的結(jié)合[Tuschl ChemBiochem.2239-245]。當(dāng)然，非翻譯區(qū)的siRNA也許有效，但不被普遍接受，因?yàn)樵贕APDH的5’UTR區(qū)的siRNA可以造成大約90％mRNA減少和蛋白質(zhì)的喪失(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html).。
在這里所用的“大約”是指上下10％的誤差。
其次，用序列一致性分析(sequence alignment)軟件，如NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)服務(wù)器的BLAST在基因組序列庫(kù)中尋找和潛在的siRNA目標(biāo)序列相似的序列，和不相關(guān)序列有極高相似性的siRNA將被棄置不用。
合格的siRNA序列將被選來進(jìn)行合成。最佳的siRNA序列的G/C含量不應(yīng)太高，因?yàn)橐阎虶/C含量的siRNA比50％以上G/C含量的siRNA對(duì)基因沉默更有效。為了更好評(píng)價(jià)siRNA，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)包括一負(fù)對(duì)照。負(fù)對(duì)照siRNA的組成最好和實(shí)驗(yàn)用siRNA一樣，但和基因組序列無(wú)相似性。因此，最佳的負(fù)對(duì)照siRNA是序列隨意組合的RNA分子，這樣它就不會(huì)和基因組內(nèi)的其他基因有相似性。
如上所述，AMP/AML的抑制物可以是一個(gè)特異地降解AMP/AML的mRNA或DNA的DNA酶(DNAzyme)。DNA酶(DNAzyme)是能夠降解單鏈和雙鏈靶子序列的單鏈多聚核苷酸(Breaker，R.R.and Joyce，G.Chemistry and Biology 1995；2655；Santoro，S.W.&Joyce，G.F.Proc.Natl，Acad.Sci.USA 1997；9434262)。有人提出DNA酶(DNAzyme)作用的模型(″10-23″模型)?！?0-23″DNA酶(DNAzyme)有一由15個(gè)多聚脫氧核糖核苷酸組成的催化區(qū)，該區(qū)位於兩個(gè)底物識(shí)別區(qū)中，每個(gè)識(shí)別區(qū)有7-9個(gè)多聚脫氧核糖核苷酸。該類DNA酶(DNAzyme)可以切割RNA底物的嘌呤嘧碇連接位置(Santoro，S.W.&Joyce，G.F.Proc.Natl，Acad.Sci.USA 199；有關(guān)DNAzyme的綜述，請(qǐng)參閱Khachigian，LM[Curr OpinMol Ther 4119-21(2002)]。
人工設(shè)計(jì)的識(shí)別單鏈和雙鏈靶子序列的DNA酶(DNAzyme)的構(gòu)建和擴(kuò)增的方法可以參見美國(guó)專利號(hào)No.6,326,174 to Joyce et al。
如上所述，AMP/AML的抑制物可以是能特異性地和編碼AMP/AML的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交的反義多核苷酸。
設(shè)計(jì)能有效降低AMP/AML產(chǎn)物的反義多核苷酸需要考慮兩個(gè)重要的方面。首先是如何將反義多核苷酸運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)中，其次是如何使反義多核苷酸在細(xì)胞中特異性地和mRNA結(jié)合起到抑制翻譯的目的。
在先技術(shù)已經(jīng)提供了很多有效運(yùn)送多核苷酸到多種細(xì)胞質(zhì)中的策略[詳見Luft J Mol Med 7675-6(1998)；Kronenwett et al.Blood 91852-62(1998)；Rajur et al.Bioconjug Chem 8935-40(1997)；Lavigne et al.Biochem BiophysRes Commun 237566-71(1997)and Aoki et al.(1997)Biochem Biophys ResCommun 231540-5(1997)]除此以外，用來鑒定和靶子有最高親和力的多核苷酸序列的算法是基于該多核苷酸和其靶子結(jié)構(gòu)變化的的能量學(xué)熱力循環(huán)來進(jìn)行的，細(xì)節(jié)可參照Walton etal.Biotechnol Bioeng 651-9(1999。
這樣的算法一直對(duì)反義多核苷酸試驗(yàn)有效。比如，由Walton等建立的算法曾經(jīng)幫科學(xué)家成功地降低了兔子的beta-血紅蛋白(RBG)和老鼠的腫瘤壞死因子-alpha(TNF alpha)的轉(zhuǎn)錄。同一研究組最近報(bào)道了通過邏輯方法選擇的針對(duì)三個(gè)靶子mRNA(人乳糖脫氫酶A和B以及大鼠gp130)的反義多核苷酸，在培養(yǎng)細(xì)胞中試驗(yàn)后用動(dòng)態(tài)PCR技術(shù)評(píng)估它們的功效，試驗(yàn)三個(gè)靶子，兩種細(xì)胞類別以及有磷酸二酯和硫代磷酸的多核苷酸嵌合體后的結(jié)果證明功效接近百分之百。
另外，其他設(shè)計(jì)和用體外方法測(cè)試特異多核苷酸功效的方法也已發(fā)表(Matveeva et al.，Nature Biotechnology 161374-1375(1998)。
幾個(gè)臨床試驗(yàn)也證明反義多核苷酸的安全性，可行性和有效性。能治療癌癥的反義多核苷酸也已被成功地測(cè)試[Holmund et al.，Curr Opin Mol Ther1372-85(1999)]，而通過抑制c-myc，p53和Bcl-1來治療血液腫瘤的反義多核苷酸也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段而且被證明可以被病人忍受[Gerwitz Curr Opin MolTher 1297-306(1999)]。
最近，有報(bào)導(dǎo)稱在老鼠實(shí)驗(yàn)中反義多核苷酸抑制肝素酶可以阻止癌細(xì)胞胸腔擴(kuò)散[Uno et al.，Cancer Res 617855-60(2001)]。
因此，一般的共識(shí)是反義多核苷酸技術(shù)經(jīng)過最近的如上述的發(fā)展促成了更準(zhǔn)確的反義多核苷酸設(shè)計(jì)算法和多種反義多核苷酸傳送方法，使得普通的技術(shù)工人可以設(shè)計(jì)和執(zhí)行反義多核苷酸實(shí)驗(yàn)，來降低已知序列的基因表達(dá)而不需太多的試錯(cuò)。
如上所述，AMP/AML抑制物可以是能特異性切斷編碼AMP/AML的mRNA的核酶(ribozyme)。因核酶(ribozyme)能特異性地切斷mRNA，所以已越來越多地用在抑制目標(biāo)基因的表達(dá)上[Welch et al.，Curr Opin Biotechnol.9486-96(1998)]。任何mRNA都可以被設(shè)計(jì)的特異核酶(ribozyme)來切斷，這就使核酶(ribozyme)成為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)有的有價(jià)值的工具。在治療領(lǐng)域，核酶(ribozyme)曾被用來對(duì)付傳染病的病毒RNA，癌癥中的強(qiáng)勢(shì)腫瘤基因，以及遺傳病中的特異體細(xì)胞突變[Welch et al.，Clin Diagn Virol.10163-71(1998)]。值得注意的是，在病人中進(jìn)行的幾個(gè)針對(duì)艾滋病的核酶(ribozyme)基因療法已經(jīng)進(jìn)入測(cè)試階段I。最近，核酶(ribozyme)也被用在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中來測(cè)試其目標(biāo)的有效性，及作用途徑的明確性。有幾個(gè)核酶(ribozyme)已經(jīng)進(jìn)入臨床測(cè)試的不同階段。ANGIOZYME是第一個(gè)進(jìn)入人體臨床測(cè)試的化學(xué)合成的核酶(ribozyme)。ANGIOZYME特異性地抑制VEGF-r(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)的形成，VEGF-r是血管增生途徑中的關(guān)鍵成分。Pharmaceuticals，Inc.和其他公司已經(jīng)在動(dòng)物模型中證明抗血管增生療法的重要性。HEPTAZYME是一種選擇性破壞丙型肝炎病毒(HCV)RNA的核酶(ribozyme)，它已被證明在培養(yǎng)細(xì)胞中有消滅HCV的作用(RibozymePharmaceuticals，Incorporated-WEB home page)。
如上所述，AMP/AML的抑制物可以是一種三鏈形成寡核苷酸(triplexforming oligonucleotide，TFO)。TFO可以用來調(diào)節(jié)AMP/AML在細(xì)胞中的基因表達(dá)。最近的研究表明可以設(shè)計(jì)能夠和特異DNA雙螺旋序列的嘌呤嘧啶區(qū)結(jié)合的TFO分子。具體的識(shí)別規(guī)則可見Maher III，L.J.，et al.，Science，1989；245725-730；Moser，H.E.，et al.，Science，1987；238645-630；Beal，P.A.，et al，Science，1992；2511360-1363；Cooney，M.，et al.，Science，1988；241456-459；and Hogan，M.E.，et al.，EP Publication 375408。對(duì)多核苷酸的修飾，如嵌入試劑(intercalators)的引入，主鏈(backbone)的替換及結(jié)合條件的優(yōu)化(如pH和陽(yáng)離子濃度)可以幫助解決TFO內(nèi)在的問題，如電荷相斥和不穩(wěn)定性，最近的研究顯示人工合成的TFO可以和特異性的目標(biāo)序列結(jié)合(最近的綜述可參見Seidman and Glazer，J Clin Invest 2003；112487-94)。
一般來說，TFO有序列對(duì)應(yīng)區(qū)多核苷酸，3’--AGGT；二聚體5’--AGCT；和二聚體3’-TCGA。
不過，有研究者顯示A-AT和G-GC的三合物可以產(chǎn)生最穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)。(Reither and Jeltsch，BMC Biochem，2002，Sept12，Epub)。同一研究小組證明根據(jù)A-AT和G-GC規(guī)則設(shè)計(jì)的TFO不形成非特異三合物，說明三合物的形成確實(shí)是特異性的。
因此，對(duì)每一個(gè)AMP/AAML分子都可以設(shè)計(jì)一個(gè)它的三鏈形成寡核苷酸序列。三鏈形成寡核苷酸至少應(yīng)有15個(gè)鹼基對(duì)，25比較合適，30或更多最好，直到50-100個(gè)鹼基對(duì)。
TFO被轉(zhuǎn)入細(xì)胞(如通過陽(yáng)離子脂質(zhì)體)后，和靶子DNA序列形成三螺旋結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其空間和功能的變化，阻止轉(zhuǎn)錄起始和延長(zhǎng)，引起所要的內(nèi)在的DNA序列變化和基因表達(dá)的降低。用TFO在細(xì)胞中降低基因的表達(dá)的例子包括在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)的染色體外之質(zhì)體(episomal)的supFG1和內(nèi)在基因HPRT表達(dá)的徹底抑制(Vasquez et al.，Nucl Acids Res.1999；271176-81，and Puri，et al，J Biol Chem，2001；27628991-98)，和Ets2轉(zhuǎn)錄因子的目標(biāo)特異性序列的抑制，這對(duì)前列腺癌的病因?qū)W(Carbone，et al，Nucl Acid Res.2003；31833-43)和引致發(fā)炎(pro-inflammatory)ICAM-1基因(Besch et al，J Biol Chem，2002；27732473-79)有重要意義。另外，報(bào)道特異序列的TFO可以和結(jié)合dsRNA抑制依賴于dsRNA的酶的活性，比如依賴于RNA的激酶(Vuyisich and Beal，Nuc.Acids Res 2000；282369-74)。
另外，依據(jù)上述規(guī)則設(shè)計(jì)的TFO分子可以產(chǎn)生強(qiáng)化DNA修復(fù)的突變，因此TFO既可以上調(diào)也可以下調(diào)內(nèi)在基因的表達(dá)。如何設(shè)計(jì)，合成以及使用有效的TFO分子的詳盡描述可以參見美國(guó)專利Nos.2003 017068 and 2003 0096980 toFroehler et al，and 2002 0128218 and 2002 0123476 to Emanuele et al，andU.S.Pat.No.5,721,138 to Lawn。
將上述分子轉(zhuǎn)入細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的技術(shù)已是普通技術(shù)人員的常規(guī)操作，而且本領(lǐng)域的很多文獻(xiàn)也提供了詳盡的使用指南(例如上述文獻(xiàn)和美國(guó)專利No.20030044907，該專利也被上述文獻(xiàn)引用)。
如上所述，用本發(fā)明調(diào)節(jié)生物活動(dòng)的辦法包括讓細(xì)胞/組織接觸調(diào)節(jié)物的若干步驟。
因使用和目的而異，讓細(xì)胞/組織接觸調(diào)節(jié)物的有效方法各不同。如果是人體或動(dòng)物體的細(xì)胞/組織，則最佳的有效接觸方法是給實(shí)驗(yàn)對(duì)象提供上述調(diào)節(jié)物。
為加強(qiáng)接觸效果，給實(shí)驗(yàn)對(duì)象提供上述調(diào)節(jié)物時(shí)應(yīng)考慮合適的使用方法，如外用，鼻內(nèi)，穿皮，皮內(nèi)，口服，含服，胃腸外用，直腸用和吸入式。
治療如關(guān)節(jié)炎類的疾病的最佳用藥方式是皮下和/或局部注射溶于生理鹽水的上述調(diào)節(jié)物。
治療如牛皮癬類的表皮疾病的最佳用藥方式是外用溶于脂類或生理鹽水，或軟膏中的上述調(diào)節(jié)物。
治療如囊性纖維性變病(cystic fibrosis)和哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的最佳用藥方式應(yīng)將調(diào)節(jié)物溶于生理鹽水后采用吸入式給藥。
另外，讓細(xì)胞接觸上述調(diào)節(jié)物的方式可以是讓上述調(diào)節(jié)物在人或動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因表達(dá)。如果細(xì)胞/組織是培養(yǎng)的細(xì)胞/組織，那么最佳的接觸調(diào)節(jié)物的辦法是體外在培養(yǎng)基中加入上述調(diào)節(jié)物。體外提供調(diào)節(jié)物的最佳辦法詳見下面的例證部分。
給實(shí)驗(yàn)對(duì)象使用適合基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物核酸分子可以使該調(diào)節(jié)物在其體內(nèi)表達(dá)。另外，能夠表達(dá)調(diào)節(jié)物的核酸分子也可通過合適的輸送載體/方法(轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)導(dǎo)，同義重組)進(jìn)入合適的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)，如有必要，也可以使用合適的基因表達(dá)系統(tǒng)。被處理的細(xì)胞在組織培養(yǎng)中擴(kuò)增，然后轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)對(duì)象體內(nèi)讓其在那里產(chǎn)生調(diào)節(jié)物。為了提供調(diào)節(jié)物的表達(dá)效率，編碼調(diào)節(jié)物的核酸結(jié)構(gòu)最好帶有一個(gè)順式調(diào)節(jié)元件(cis-acting regulatory elements)，如組織特異性的啟動(dòng)子。該核酸結(jié)構(gòu)還可以在啟動(dòng)子附近裝一增強(qiáng)子以提高轉(zhuǎn)錄的效率。
適合的核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括病毒性的載體，如腺病毒，慢病毒單純皰疹病毒，或腺相關(guān)病毒(AAV)，或非病毒性的轉(zhuǎn)染，如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，聚賴氨酸轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和樹狀聚合物轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。適合于脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的脂類包括，DOTMA，DOPE和DC-Chol[Tonkinson et al.，Cancer Investigation，14(1)54-65(1996)]。在基因療法中的最佳轉(zhuǎn)染手段還是利用病毒性的載體，如腺病毒，AAV，慢病毒，或逆轉(zhuǎn)錄病毒。一個(gè)病毒性的載體包括至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或位置決定因子，或通過其他方式影響基因表達(dá)的因子，如改變RNA剪接，RNA的輸出，信息翻譯后修飾等。這樣的載體還包括裝載信號(hào)，全部或部分的長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)，和適合特定病毒的正鏈和負(fù)鏈引物結(jié)合位點(diǎn)，除非載體已經(jīng)有了這些位點(diǎn)。這樣的載體還包括指導(dǎo)多聚腺苷酸化的信號(hào)，一個(gè)或多個(gè)的限制性位點(diǎn)和翻譯終止序列。舉例來說，典型的這樣的載體包括5’LR，一個(gè)RNA結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)包裝信號(hào)，第二條DNA鏈復(fù)制原點(diǎn)，和一個(gè)3’LTR或其部分。
因用途和目的不同，本發(fā)明的各個(gè)不同的部分對(duì)應(yīng)實(shí)踐中利用不同的AMP/AML，和/或降低不同的AMP/AML的活力/水平。
AMP/AML分子最好是陽(yáng)離子肽和/或親水肽。
此處的“肽”是指含有少于51個(gè)氨基酸的多肽分子，除非上下文中特指抗菌肽或抗菌肽類分子。
AMP/AML分子最好是防御素或組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)。
防御素應(yīng)是beta-防御素，最好是beta-防御素-1或beta-防御素-2。
組織蛋白酶抑制素最好是LL-37。
最好，AMP/AML來源于人。假如不是，則至少是哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明各方面的涉及AMP/AML使用和/或降低其活性/水平的實(shí)際例證將詳細(xì)描述如下。
操作方法可以在本發(fā)明所述的任何細(xì)胞/組織進(jìn)行以調(diào)節(jié)其生物活動(dòng)。
用來調(diào)節(jié)生物活動(dòng)的方法最好是在上皮細(xì)胞/組織，內(nèi)皮細(xì)胞/組織，胃腸組織和/或腫瘤細(xì)胞/組織進(jìn)行。
用來調(diào)節(jié)生物活動(dòng)的方法可以在各種皮膚細(xì)胞/組織中進(jìn)行。
皮膚細(xì)胞/組織最好是角質(zhì)細(xì)胞/組織。
胃腸細(xì)胞/組織最好是胃腸上皮細(xì)胞/組織。
腫瘤細(xì)胞/組織最好是惡性腫瘤細(xì)胞/組織，不過，良性腫瘤細(xì)胞/組織也可以使用。
腫瘤細(xì)胞/組織最好是轉(zhuǎn)移性的。
調(diào)節(jié)生物活動(dòng)的方法可以用在腫瘤細(xì)胞/組織中，此處的腫瘤細(xì)胞/組織可以是各種類型的細(xì)胞/組織。
惡性腫瘤細(xì)胞/組織最好是皮膚細(xì)胞/組織。
有效的使用調(diào)節(jié)物的辦法是讓細(xì)胞/組織接觸因目的和用途不同而定的不同濃度的調(diào)節(jié)物。
當(dāng)用本發(fā)明的AMP/AML抑制物來調(diào)節(jié)生物活動(dòng)時(shí)，有效的方法是讓細(xì)胞/組織接觸約每毫升50納克到1毫克的AMP/AML抑制物。
因目的和用途的不同，讓細(xì)胞/組織接觸的AMP/AML抑制物的有效濃度也不同，可以是約50納克/毫升到約100微克/毫升，或約100微克/毫升到約200微克/毫升，或約200微克/毫升到約300微克/毫升，或約300微克/毫升到約400微克/毫升，或約400微克/毫升到約500微克/毫升，或約500微克/毫升到約600微克/毫升，或約600微克/毫升到約700微克/毫升，或約700微克/毫升到約800微克/毫升，或約800微克/毫升到約900微克/毫升，或約900微克/毫升到約1毫克/毫升。
當(dāng)用本發(fā)明的AMP/AML來調(diào)節(jié)生物活動(dòng)時(shí)，最好是讓細(xì)胞/組織接觸濃度范圍是2納克/毫升到約10微克/毫升的AMP/AML分子。
因目的和用途的不同，讓細(xì)胞/組織接觸的AMP/AML抑制物的有效濃度也不同，可以是約2納克/毫升到約1微克/毫升，或約1微克/毫升到約2微克/毫升，或約2微克/毫升到約3微克/毫升，或約3微克/毫升到約4微克/毫升，或約4微克/毫升到約5微克/毫升，或約5微克/毫升到約6微克/毫升，或約6微克/毫升到約7微克/毫升，或約7微克/毫升到約8微克/毫升，或約8微克/毫升到約9微克/毫升，或約9微克/毫升到約10微克/毫升。
上述方法可以用來調(diào)節(jié)細(xì)胞/組織的生物活動(dòng)如生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和/或血管增生。
如果是為了調(diào)節(jié)上皮的，皮膚的和/或胃腸的細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么調(diào)節(jié)物應(yīng)是本發(fā)明的AMP/AML抑制物，和/或AMP/AML分子。
如果是為了誘導(dǎo)上皮的，皮膚的和/或胃腸的細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么調(diào)節(jié)物最好是本發(fā)明的防御素抑制物，和/或組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)抑制物。
這里的“防御素抑制物”是指本發(fā)明中的能降低防御素分子活性/水平的復(fù)合物。
這里的“組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)抑制物”是指本發(fā)明中的能降低組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)分子活性/水平的復(fù)合物。
如果是為了誘導(dǎo)上皮的和/或皮膚的細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么AMP/AML最好是一防御素。而且用于該目的的防御素的濃度應(yīng)該是0.1微克/毫升到約10微克/毫升，最好是約1微克/毫升。
正如下面的例證部分的例1所示(圖1)，約1微克/毫升的beta-防御素-1或beta-防御素-2可以誘導(dǎo)人皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)。
如果是為了誘導(dǎo)上皮的，皮膚的和/或胃腸的細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么防御素抑制物的濃度最好是約50納克/毫升到約10微克/毫升。這里的防御素抑制物最好是本發(fā)明的beta-防御素-2抑制物。
這里的“beta-防御素-2抑制物”是指本發(fā)明中的能降低beta-防御素-2活性/水平的復(fù)合物。
如果是為了誘導(dǎo)皮膚的和/或角質(zhì)的細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么防御素抑制物的濃度應(yīng)介于約0.1微克/毫升到約10微克/毫升之間，最好是1微克/毫升。正如例證部分的例2所示(圖3)，1微克/毫升的抗beta-防御素-2的抗體可以誘導(dǎo)人原代皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)。
如果是為了誘導(dǎo)皮膚的和/或角質(zhì)的細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)抑制物的濃度應(yīng)介于約0.4微克/毫升到約40微克/毫升之間，最好是4微克/毫升。正如例證部分的例2所示(圖3)，4微克/毫升的抗LL-37的抗體可以誘導(dǎo)人原代皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)。
如果是為了誘導(dǎo)胃腸細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么防御素抑制物的濃度最好是約50納克/毫升到約5微克/毫升，最好是0.5微克/毫升。正如例證部分的例4所示(圖6)，0.5微克/毫升的抗beta-防御素-2的抗體可以誘導(dǎo)胃腸上皮細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)。
如果是為了抑制腫瘤，上皮，皮膚和/或胃腸細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么調(diào)節(jié)物應(yīng)是本發(fā)明的防御素抑制物，和/或組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)抑制物，最好是本發(fā)明的beta-防御素-2的抑制物。
如果是為了抑制腫瘤細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么防御素抑制物的濃度應(yīng)介于約0.1微克/毫升到約10微克/毫升之間，最好是1微克/毫升。正如例證部分的例1所示(圖2)，1微克/毫升的抗beta-防御素-2的抗體可以抑制惡性皮膚癌細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)。
如果是為了抑制皮膚和/或角質(zhì)細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么防御素抑制物的濃度應(yīng)介于約50納克/毫升到約50微克/毫升之間，最好是5微克/毫升。正如例證部分的例2所示(圖3)，5微克/毫升的抗beta-防御素-2的抗體可以抑制人原代皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)。
如果是為了抑制皮膚和/或角質(zhì)細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)抑制物的濃度應(yīng)介于約2微克/毫升到約200微克/毫升之間，最好是20微克/毫升。正如例證部分的例2所示(圖3)，20微克/毫升的抗組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)抑制物的抗體可以抑制人原代皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)。
如果是為了抑制胃腸細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么防御素抑制物的濃度應(yīng)介于約0.1微克/毫升到約10微克/毫升之間，最好是1微克/毫升。正如例證部分的例4所示(圖6)，1微克/毫升的抗beta-防御素-2的抗體可以抑制人胃腸上皮細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)。
如果是為了抑制血管增生/內(nèi)皮細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，那么調(diào)節(jié)物最好使用防御素抑制物。而且防御素抑制物最好是本發(fā)明的beta-防御素-2的抑制物。防御素抑制物的濃度應(yīng)介于約50納克/毫升到約10微克/毫升之間，如果是介于約50納克/毫升到約15微克/毫升之間則更好，最好是0.5微克/毫升。正如例證部分的例5所示(圖7)，0.5或1微克/毫升(尤其是0.5微克/毫升)的抗beta-防御素-2的抗體可以抑制血管增生/人內(nèi)皮細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)。
如果是為了抑制腫瘤細(xì)胞/組織的轉(zhuǎn)移，那么調(diào)節(jié)物最好使用本發(fā)明的防御素抑制物。而且防御素抑制物最好是本發(fā)明的beta-防御素-2的抑制物。防御素抑制物的濃度應(yīng)介于約0.1微克/毫升到約10微克/毫升之間，最好是1微克/毫升。
正如例證部分的例1所示，1微克/毫升的抗beta-防御素-2的抗體可以抑制人惡性皮膚癌細(xì)胞/組織對(duì)物體脫離接觸。
如果是為了糾正上皮/皮膚細(xì)胞/組織失調(diào)的增生/分化平衡，那么調(diào)節(jié)物最好使用防御素抑制物。而且防御素抑制物最好是本發(fā)明的beta-防御素-2的抑制物。防御素抑制物的濃度應(yīng)介于約0.1微克/毫升到約1毫克/毫升之間，最好是大約1微克/毫升，或大約100微克/毫升。
正如例證部分的例3所示(圖4a-c)，1微克/毫升的抗beta-防御素-2的抗體可以在一很真實(shí)的人皮膚體外生長(zhǎng)模型上糾正增生/分化的失衡。在例證部分的例3所示(圖5a-d)，100微克/毫升的抗beta-防御素-2的抗體可以抑制人牛皮癬損傷的皮屑形成，表明細(xì)胞/組織失調(diào)的增生/分化平衡已得到糾正。
如果是為了抑制細(xì)胞/組織的發(fā)炎，那么調(diào)節(jié)物最好使用本發(fā)明的防御素抑制物。而且防御素抑制物最好是本發(fā)明的beta-防御素-2的抑制物。防御素抑制物的濃度應(yīng)介于約50納克/毫升到約1毫克/毫升之間，最好是0.5微克/毫升，或者是100微克/毫升。
正如例證部分的例3所示(圖5a-d)，1微克/毫升的抗beta-防御素-2的抗體可以抑制人體組織的自發(fā)免疫性的發(fā)炎。如例證部分的例5所示(圖7)，0.5微克/毫升的抗beta-防御素-2的抗體可以抑制人體內(nèi)皮細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)，說明調(diào)節(jié)物有抑制血管增生的能力。
如果能抑制人體組織的發(fā)炎和血管增生，那么本專利所描述的潛在的可以強(qiáng)烈抑制發(fā)炎的方法將會(huì)得到廣泛的認(rèn)同和接受。
正如此處所述，本發(fā)明可以用來調(diào)節(jié)生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和血管增生等生物活動(dòng)。因?yàn)檫@些活動(dòng)和許多疾病有關(guān)，因此，本發(fā)明證明了可以通過調(diào)節(jié)和這些活動(dòng)來治療和這些活動(dòng)有關(guān)的疾病的可能性，因此將會(huì)得到廣泛的認(rèn)同和接受。
因此，根據(jù)本發(fā)明的特性，患者可以得到一種療法。該療法提供給患者足夠療效的能降低AMP/AML活力/水平的復(fù)合物來治病。
如此處所述，這里的“(疾)病”是指醫(yī)學(xué)病癥，失調(diào)，綜合癥，或是不適的，異常的生理，形態(tài)，外觀和/或體態(tài)和/或狀態(tài)。
因此，“治療”或“治病”是指消除，明顯抑制，減慢或逆轉(zhuǎn)病癥的進(jìn)程，明顯改善臨床癥狀或者顯著防止臨床癥狀的出現(xiàn)。
該療法可以治療多種疾病。
特別是，該療法可以治療和(i)腫瘤；(ii)發(fā)炎；(iii)外皮損傷；(iv)失調(diào)的細(xì)胞/組織生長(zhǎng)/分化；(v)失去平衡的細(xì)胞/組織生長(zhǎng)/分化和(vi)和血管增生有關(guān)的各類疾病。
可以接受本發(fā)明療法的各類疾病將舉例如下。
根據(jù)本發(fā)明，一個(gè)普通技術(shù)人員，如內(nèi)科醫(yī)生，最好是某種疾病的?？漆t(yī)生，只需要一些必要的技能訓(xùn)練就可以治療疾病。
這里的“患者”是指攜帶疾病的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
實(shí)驗(yàn)對(duì)象是指哺乳動(dòng)物，大部分時(shí)候是指人。
因?yàn)樯掀?，皮膚和/或胃腸細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)已被證明可被誘導(dǎo)，所以上述的誘導(dǎo)這些細(xì)胞/組織生長(zhǎng)的方法對(duì)治療缺乏細(xì)胞/組織生長(zhǎng)的疾病尤為適宜。這類疾病包括和上皮，皮膚和/或胃腸損傷有關(guān)的疾病。
因?yàn)閻盒缘?，上皮的，皮膚的和/或胃腸細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)已被證明可被抑制，所以上述的抑制這些細(xì)胞生長(zhǎng)的方法對(duì)治療和失調(diào)的/過度的細(xì)胞/組織生長(zhǎng)有關(guān)的疾病尤為適宜，失調(diào)的/過度的細(xì)胞/組織包括惡性的，上皮的，皮膚的和/或胃腸的細(xì)胞/組織。這類疾病包括一般的腫瘤，胃腸腫瘤，特別是惡性皮膚癌。
因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)已被證明可被抑制，所以上述的抑制這些細(xì)胞生長(zhǎng)的方法對(duì)治療和失調(diào)的/過度的內(nèi)皮細(xì)胞/組織生長(zhǎng)有關(guān)的，以及和血管增生有關(guān)的疾病尤為適宜。這類疾病包括實(shí)體腫瘤(solid tumors)，內(nèi)皮腫瘤和炎性疾病，包括自身免疫疾病如牛皮癬。
因?yàn)樵隗w外的三維人造皮膚生長(zhǎng)模型中，以及體外的和炎癥損傷有關(guān)的上皮和/或皮膚組織的生長(zhǎng)/分化平衡紊亂中，這些平衡紊亂已被證明可糾正，所以上述的糾正生長(zhǎng)/分化平衡紊亂的方法對(duì)治療和上述平衡紊亂有關(guān)的疾病尤為適宜。這類疾病包括牛皮癬和頭皮屑。
因?yàn)槿梭w組織中，自身免疫性的發(fā)炎已被證明可被抑制，所以上述的抑制發(fā)炎的方法對(duì)治療和發(fā)炎有關(guān)的疾病尤為適宜。這類疾病包括自身免疫性性疾病，如牛皮癬和胃腸自身免疫疾病。
抑制人惡性皮膚癌細(xì)胞/組織對(duì)物體脫離接觸因?yàn)樵谌四[瘤和/或皮膚細(xì)胞/組織中，對(duì)物體的脫離接觸已被證明可被抑制，所以上述的抑制對(duì)物體脫離接觸方法對(duì)治療物體脫離接觸有關(guān)的疾病尤為適宜。這類疾病包括轉(zhuǎn)移性腫瘤，尤其是轉(zhuǎn)移性的惡性皮膚腫瘤。
為治療疾病，上述調(diào)節(jié)物的使用可以是任何一種適宜的方法。
對(duì)患者使用上述復(fù)合物的有效方法最好是給患者使用AMP/AML抑制物大約2到30個(gè)次，兩次間隔時(shí)間是大約2.4小時(shí)到30天。
因目的和應(yīng)有的不同，使用次數(shù)也應(yīng)隨之變化，可以是大約2到5次，大約5到10次，大約10到15次，大約15到20次，大約20到25次，大約25到30次，或大約30到35次。
給患者使用上述調(diào)節(jié)物的有效方法是最好給患者使用3次AMP/AML的抑制物。
因目的和應(yīng)有的不同，使用調(diào)節(jié)物的間隔時(shí)間也應(yīng)隨之變化，可以是大約2.4小時(shí)到3天，大約3天到6天，大約6天到9天，大約9天到12天，大約12天到15天，大約15天到18天，大約18天到21天，大約21天到24天，大約24天到27天，或大約27天到30天。
最佳間隔時(shí)間是大約一天。
如下例證部分的例3所述，根據(jù)本發(fā)明，給患者使用3次調(diào)節(jié)物，間隔時(shí)間一天可有效治療人牛皮癬。
在給患者使用上述調(diào)節(jié)物時(shí)，同時(shí)使用其他療法可以增進(jìn)療效。比如同時(shí)使用象蛋白酶抑制物的多肽抑制物，絲氨酸蛋白酶抑制劑的抑制成分(alpha-1 PI)和alpha-1抗胰糜蛋白酶(Panyutich，AV.et al.，1995.Am.J.Respir.CellMol.Biol.1235-357)，BAPTA-AM(一種細(xì)胞內(nèi)Ca(2+)螯合劑)，百日咳毒素和U-73122(一種磷脂酶C的抑制物Niyonsaba，F(xiàn).et al.，2001.Eur.J.Immunol.311066-1075)，T-細(xì)胞療法，對(duì)趨化因子如腫瘤壞死因子的單克隆抗體以及細(xì)胞因子療法，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抑制物等。比如，外用藥物可以包括，細(xì)胞增生調(diào)節(jié)物如維甲類物質(zhì)-維生素A-調(diào)節(jié)或改變上皮炎細(xì)胞分化的類似物。如果同時(shí)使用抗發(fā)炎藥物/療法來防止牛皮癬和其他自身免疫疾病的復(fù)發(fā)，那么上述的綜合療法會(huì)更有效果。這類藥物/療法包括tazarotene，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿維A酸(Acitretin).視黃醛(bexarotene)，ploralem，依曲替酯(etretinate)，皮質(zhì)類甾醇膏或涂油，合成的維生素D3，IL-10，IL-4和IL-1RA(受體拮抗劑)。
為了治療疾病，上述調(diào)節(jié)物應(yīng)作為藥物組成的一部分，除此以外，藥物組成還包括合適的藥物載體，而且藥物也需要適當(dāng)?shù)陌b及治病標(biāo)志。
根據(jù)本發(fā)明，給病人使用的調(diào)節(jié)物包含有上述調(diào)節(jié)物和生理學(xué)上合適的藥物載體或賦形劑。
這里的“藥物組成”是指一種或多種這里描述的活性成分以及其他如合適的藥物載體或賦形劑等化學(xué)成分。使用藥物組成的目的是促進(jìn)活性成分進(jìn)入患者。
這里的“活性成分”是本發(fā)明中能對(duì)上述生物活動(dòng)起作用的調(diào)節(jié)物。
這里“生理學(xué)上合適的藥物載體”和“合適的藥物載體”可以互換，因?yàn)樗鼈兌际侵笇?duì)藥效成分的活力和作用沒有影響的載體或稀釋劑，另外它們本身對(duì)試驗(yàn)個(gè)體也沒有刺激作用。它們也都含有佐劑。
這里“賦形劑”是指一種加入到藥物組成中的能進(jìn)一步利於藥物活性成分使用的物質(zhì)。對(duì)於賦形劑的種類，沒有限制，它可以是碳酸鈣，磷酸鈣，各種糖類和淀粉，纖維素衍生物，明膠，植物油和聚乙二醇。
對(duì)藥物成分和使用的技術(shù)可以參見本文參考文獻(xiàn)″Remington’sPharmaceuticai Sciences，″Mack Publishing Co.，Easton，PA，的最新版本。
合適的用藥方法包括，例如口服，直腸用藥，經(jīng)黏膜用藥，經(jīng)鼻用藥，腸部用藥或非腸部用藥，包括肌肉內(nèi)的，皮下的和髓內(nèi)的照射，鞘內(nèi)的注射，以及心室內(nèi)的，靜脈內(nèi)的，腹膜內(nèi)的，鼻內(nèi)的，或眼內(nèi)的注射。
另外，用藥也可采取局部性的而不是全身性的，如把藥物直接注射如病人的組織中。
本發(fā)明的藥物成分也可以用本領(lǐng)域的很多常用的方法加工，如傳統(tǒng)的混合，溶解，顆?；?，加糖衣，加液研磨法，乳化，加膠囊，陷入或冷凍干燥。
用傳統(tǒng)的方式可將本專利的藥物成分和一種或多種無(wú)生理作用的藥物載體組合成產(chǎn)品，藥物載體包括賦形劑和能幫助活性成分包裝和吸收的輔助成分。合適的組合因用藥方式而定。
如果是注射，藥物組成的活性成分可以在水溶液中，最好是生理溶液，如Hank’s溶液，Ringer’s溶液，或生理鹽緩沖液。如果用藥方式經(jīng)過粘膜，那么穿透物是需要的。這樣的穿透物在本領(lǐng)域中很常見。
如果是口服，活性成分則應(yīng)和本領(lǐng)域中很常見的載體合用。這些載體可將藥物成分組裝成，藥片，藥粒，糖衣，膠囊，液體，膠體，糖漿，粘漿，懸浮液，和類似物以方便病人入口?？梢岳霉腆w賦形劑制備口服藥物，磨碎的混合物加工成顆粒，如有必要，則加入適當(dāng)添加劑使之成為藥?；虼b糖衣的藥核。合適的賦形劑包括，糖類如乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇，纖維素類，如玉米淀粉，小麥淀粉，水稻淀粉，馬鈴薯淀粉，明膠，黃蓍膠粉，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素和/或其他無(wú)生理作用的藥物載體藥物多聚物，如聚乙烯比咯烷酮(PVP)。如有必要，也可加入潰散劑，如交聯(lián)的PVP，瓊脂，或藻酸，鹽類，如藻鹽。
待裝糖衣的藥核需要加上糖衣。濃縮蔗糖溶液可以用來作糖衣，它還可以包括其他成分如，阿拉伯樹膠，云母，聚乙烯比咯烷酮，卡伯漢樹脂膠，聚乙二醇，二氧化鈦，漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。染料或色素也可加入藥片或糖衣中以便識(shí)別或區(qū)分不同活性成分的組合。
如果是用于口服的藥物，則還需要明膠制成的套筒膠囊，或是軟的密封的膠粒，以及增塑劑，如甘油或山梨醇。如是套筒膠囊，則除活性藥物成分以外還需填充成分，如乳糖，結(jié)合成分如淀粉，潤(rùn)滑成分如云母或硬脂酸，和穩(wěn)定成分，如有必要的話。如是軟的密封的膠粒，則活性藥物成分可以溶在合適的液體中，如油脂，液體石蠟，或液體聚乙二醇。除此以外，可能還需要穩(wěn)定成分。所有的口服藥物都應(yīng)包裝成合適的劑量以備不同的用藥方式。
如果服藥方式是含服，那么藥物成分可以是傳統(tǒng)的藥片的形式或糖錠形式。
如果用藥方式是鼻吸式，那么本發(fā)明建議的方式是通過壓力罐或是通過霧化器進(jìn)行噴霧，如用霧化器，則需要合適的推動(dòng)劑，如氟里昂12，氟里昂11，氟里昂114或二氧化碳.如用壓力罐，那么藥物劑量則由壓力閥門來控制。明膠作的藥物膠粒和藥夾包括由活性成分藥粉及合適的填充物如乳糖或淀粉。
如果用藥方式是不經(jīng)胃腸的，如大劑量注射或連續(xù)輸液，那么藥物組成也應(yīng)作出適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。如果是用于注射，藥物成分的量應(yīng)以注射劑量單位來調(diào)整，如安瓿量或多劑量容器量等，如有必要，可能還需加入防腐劑。藥物成分可以是懸浮液，溶液或是在油性或水性載基里的乳濁液，也可能含有其他成分以達(dá)到懸浮，穩(wěn)定和/或分散的作用。
如果用藥方式是不經(jīng)胃腸的，那么藥物成分可以是溶于水溶液的活性成分。另外，活性成分也可以是水基或油基的注射用懸浮液。這種情況下，有必要使用合適的親脂類溶劑或載基包括油脂，如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯，甘油三酯或脂質(zhì)體。注射用的水基懸浮液可能還含有增加懸浮液粘稠度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素，山梨醇，葡聚糖。如有必要，還需加入合適的穩(wěn)定劑和能提高活性成分濃度的物質(zhì)。油膏溶液會(huì)含有脂或有機(jī)醇或有機(jī)物，例如，苯甲醇，聚乙二醇，2-甲基-2，4-戊二醇，卡波姆，抗壞血酸，butylhydroxyainisole，丁基羥基苯甲醚，依地酸二鈉，水，氨丁三醇，poxoamer。
另外，在使用前，粉末狀的活性成分也可存在于可溶性的載基，如無(wú)菌的不含致熱原的水溶液中。
本發(fā)明的藥物成分也可用灌腸或傳統(tǒng)的栓劑和如椰子乳或其他甘油三酯通過直腸給藥。
可以使用的本發(fā)明的有效藥效成分是指包裝在合適的容器中的能達(dá)到一定預(yù)期效果的藥量的藥效成分。更具體地說，一定量的藥效成分是指能夠預(yù)防，減輕或減緩病癥(如牛皮癬或癌癥)或延長(zhǎng)患者存活時(shí)間的活性成分(本發(fā)明的調(diào)節(jié)物)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都能夠決定藥效成分的定量，尤其是下面又提供了翔實(shí)的細(xì)節(jié)。
在本發(fā)明的用法中，有效藥量或劑量是通過體外試驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果估計(jì)出來的。舉例來說，一劑的藥物是從動(dòng)物模型中所期望達(dá)到的濃度或滴度來決定的。這些信息可以幫助決定在人體中使用的劑量。
利用體外實(shí)驗(yàn)，和細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物等手段，標(biāo)準(zhǔn)的藥理程序可以測(cè)量上述活性成分的毒性和藥效。所得到的資料可以幫助決定在人體中使用的劑量范圍。用藥的劑量形式和用藥方式?jīng)Q定了用藥劑量。具體的配方，用藥方式和劑量可由醫(yī)生視病人的實(shí)際情況而定(參見Fingl，et al.，1975，in″ThePharmacological Basis of Therapeutics″，Ch.1 p.1)。
具體的劑量和間隔時(shí)間要因人而異地進(jìn)行調(diào)節(jié)，目的是使大腦和血漿中的活性成分達(dá)到期望的療效(最低藥效濃度，MEC)。MEC會(huì)有浮動(dòng)，但可以從體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果中估計(jì)出來。能達(dá)到MEC的劑量也因個(gè)人特點(diǎn)和用藥方式而變。因此有必要使用測(cè)量來測(cè)定血漿中的濃度。
因病情的嚴(yán)重程度和對(duì)藥物的反應(yīng)的不同，用藥可以是一次或多次，療程可以是幾日到幾周或直到痊愈或病情的減低。
用藥量當(dāng)然決定于被治對(duì)象，病情嚴(yán)重程度，用藥方式，開藥醫(yī)生的判斷等等。
本發(fā)明的藥效成分可以是各種包裝，比如成套的形式，或使用供藥裝置，如FDA許可的試劑盒，它可以有一或多劑量的活性成分。如是成套包裝則可以用金屬箔紙或塑料薄膜，如吸塑包裝等。如使用供藥裝置，那么還要提供使用說明書。不管是成套的形式的包裝，還是使用供藥裝置的包裝，都可以附上一份政府機(jī)構(gòu)簽發(fā)的，對(duì)該產(chǎn)品的使用，銷售的規(guī)定說明，該說明也同時(shí)是允許上述產(chǎn)品在人或動(dòng)物上使用的許可證明。舉例來說，這種說明可以是標(biāo)有美國(guó)食品和藥物管理局的許可的處方藥物或其他產(chǎn)品。本發(fā)明調(diào)節(jié)物和與其相配的藥物載體所組成的藥物也可以如上所述進(jìn)行制備，包裝到合適的容器中，標(biāo)明用途，用法及療效等。
因此，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)品，該產(chǎn)品包括被鑒定對(duì)疾病有療效的包裝材料，和一種藥物成分，該藥物成分包括一合適的藥物載體和作為活性成分的一種調(diào)節(jié)物。
藥物成分最好是以下形式，溶液，懸浮液，乳液或膠質(zhì)。
藥物載體的目的是幫助藥物的使用及吸收，因此藥物載體的選擇最好是考慮到下述的用藥方式，外用，鼻內(nèi)，穿皮，皮內(nèi)，口服，含服，胃腸外用，直腸用和吸入式。
藥物成分的搭配最好是考慮到讓患者的帶病細(xì)胞/組織接觸合適的濃度的調(diào)節(jié)物來達(dá)到治病目的。
如上所述，根據(jù)適當(dāng)?shù)捏w系，上述藥物成分經(jīng)進(jìn)一步鑒定可在患者上使用。
因此，本發(fā)明提供了一種鑒定能調(diào)節(jié)細(xì)胞/組織生物活動(dòng)的復(fù)合物的方法。該方法的第一步是將細(xì)胞/組織接觸能降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子(AML)分子活性/水平的試驗(yàn)復(fù)合物，和/或接觸AMP/AML。第二步是評(píng)估復(fù)合物調(diào)節(jié)細(xì)胞/組織生物活動(dòng)的能力。
如果上述方法能夠篩選多種復(fù)合物并找出期望的能能調(diào)節(jié)細(xì)胞/組織生物活動(dòng)的復(fù)合物，那么它將贏得普遍的認(rèn)同。
本發(fā)明的所謂調(diào)節(jié)生物活動(dòng)的方法，最好是指用來鑒定能調(diào)節(jié)生物活動(dòng)的復(fù)合物的方法。
本發(fā)明的所謂調(diào)節(jié)生物活動(dòng)的方法，是指試驗(yàn)復(fù)合物最好是一調(diào)節(jié)物。
本發(fā)明的所謂調(diào)節(jié)生物活動(dòng)的方法，正如下述例證區(qū)所描述，是指鑒定最好能調(diào)節(jié)細(xì)胞/組織生物活動(dòng)的復(fù)合物的方法。另外，本發(fā)明的所謂調(diào)節(jié)生物活動(dòng)的方法，加上下述例證區(qū)所描述，最好是用來鑒定能誘導(dǎo)腫瘤，上皮的，皮膚的，角質(zhì)的，和/或胃腸的細(xì)胞/組織生長(zhǎng)的復(fù)合物的方法；和最好是用來鑒定能抑制血管增生/內(nèi)皮細(xì)胞/組織生長(zhǎng)的方法；和抑制腫瘤細(xì)胞/組織轉(zhuǎn)移的方法；和糾正紊亂的上皮的，角質(zhì)的和/或皮膚細(xì)胞/組織的增生/分化的平衡的方法，和/或抑制上皮的，角質(zhì)的和/或皮膚的細(xì)胞/組織的發(fā)炎的方法。
鑒定手段最好是用高通量方法，高通量方法的操作可以在本領(lǐng)域的很多指南性文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)(如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朜o.20030044907)。
試驗(yàn)復(fù)合物可以通過很多方法和細(xì)胞/組織接觸。如例證區(qū)所描述，最好的接觸方法是體外接觸。如有可能，可以讓復(fù)合物和培養(yǎng)的細(xì)胞/組織接觸。
產(chǎn)生試驗(yàn)復(fù)合物的細(xì)胞最好是B-細(xì)胞雜交瘤。如有可能，產(chǎn)生試驗(yàn)復(fù)合物的細(xì)胞也可因用途和目的不同而是其他細(xì)胞。
因?yàn)锽-細(xì)胞雜交瘤可以產(chǎn)生抗體，因此讓細(xì)胞/組織接觸B-細(xì)胞雜交瘤可以用來鑒定能夠產(chǎn)生調(diào)節(jié)生物活動(dòng)抗體的B-細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，這種方法將會(huì)得到認(rèn)同和接受。
讓細(xì)胞/組織有效地接觸試驗(yàn)復(fù)合物是指給試驗(yàn)對(duì)象，包括細(xì)胞/組織(體外模型)提供試驗(yàn)復(fù)合物。給試驗(yàn)對(duì)象提供試驗(yàn)復(fù)合物最好是參照前述的辦法。
鑒定復(fù)合物的有效方法是讓試驗(yàn)復(fù)合物接觸牛皮癬損傷及和上皮傷有關(guān)的疾病的損傷，如，牛皮癬動(dòng)物模型的牛皮癬損傷，或有牛皮癬的病人的牛皮癬損傷，正常的或帶病變的保存在含有血漿和淋巴細(xì)胞的人造皮膚培養(yǎng)液中人的活體組織，正常的或帶病變的組織是指有或者沒有AMP或其基因和啟動(dòng)子多型性的人體組織，和/或一帶病的細(xì)胞/組織，其中的疾病誘導(dǎo)型是ApoE4而非誘導(dǎo)型是ApoE3。
有效的鑒定方法是讓試驗(yàn)復(fù)合物接觸移植到動(dòng)物身上的人牛皮癬損傷移植物(異種植皮模型)?；铙w組織取樣應(yīng)經(jīng)當(dāng)事人同意?；铙w組織然后可以移植到免疫缺陷的老鼠身上(如NIHS-bg-nu-xid or BNX)。為建立異種植皮模型，需要從組織的供體的血液中提取并激活PBMC(例如，使用超抗原)，然后把激活的PBMC注射入受體動(dòng)物中。用這種動(dòng)物模型作鑒定方法的操作細(xì)節(jié)及指南可以參見例證區(qū)的例6-8或者本領(lǐng)域的相關(guān)文獻(xiàn)(如美國(guó)專利No.20030044907)受牛皮癬影響最大的組織除了被激活的免疫系統(tǒng)外，就是皮膚。組成皮膚的細(xì)胞主要是上皮角質(zhì)細(xì)胞和皮成纖維細(xì)胞。其他細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞，黑色細(xì)胞，毛囊細(xì)胞，汗腺細(xì)胞，及免疫系統(tǒng)細(xì)胞。這些細(xì)胞都很合適用作上述鑒定方法。
包括鑒定方法的評(píng)估生物活動(dòng)調(diào)節(jié)能力的方法有很多種，而且都很合適，且被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟悉。但這樣的評(píng)估最好是按下述例證區(qū)的描述進(jìn)行。
當(dāng)用體內(nèi)模型，細(xì)胞計(jì)數(shù)或組織學(xué)評(píng)定時(shí)，生物活動(dòng)調(diào)節(jié)能力的有效評(píng)估可以通過定量測(cè)定上皮組織的厚度來完成。
測(cè)量結(jié)果可以通過統(tǒng)計(jì)分析和ANOVA來獲得最大信息性。
根據(jù)一項(xiàng)實(shí)施方案，鑒定方法是把試驗(yàn)復(fù)合物加到培養(yǎng)的微生物/細(xì)菌中，然后測(cè)量微生物/細(xì)菌的存活率來有效評(píng)估復(fù)合物的生物活動(dòng)調(diào)節(jié)能力。微生物/細(xì)菌的存活率是以計(jì)算它們形成的菌落來進(jìn)行的，如金黃色葡萄球菌(來自臨床樣本)，GAS(NZ131)，和侵襲性大腸桿菌029(Porter et al，1997)。在分析之前，要先接種系列稀釋的細(xì)菌來測(cè)量細(xì)菌濃度。具體可以按如下操作方法進(jìn)行。用10mM磷酸鈉緩沖液(20mM NaH2PO4廈20，20mM Na2HPO4□H2O)洗細(xì)胞兩次，用上述磷酸鈉緩沖液稀釋細(xì)胞到2,000,000個(gè)/毫升(金黃色葡萄球菌，GAS)或200,000個(gè)/毫升(大腸桿菌)。如果是金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，它們就在攝氏37度和不同濃度的AMP/AML培養(yǎng)4小時(shí)，在要測(cè)試的不同濃度的調(diào)節(jié)物存在下，用96孔的圓底培養(yǎng)皿(Costar 3799，Corning inc.，NY)，每一孔加50微升的緩沖液。GAS培養(yǎng)1小時(shí)，因?yàn)樗谶@種緩沖液中生長(zhǎng)不好。培養(yǎng)結(jié)束后，細(xì)胞被稀釋10倍到100,000倍，然后每20毫升這樣的溶液以三個(gè)重復(fù)的形式鋪在胰蛋白酶大豆培養(yǎng)基(如果是金黃色葡萄球菌)和todd-hewitt broth(THB)培養(yǎng)基中(如果是GAS和大腸桿菌)，然后計(jì)算菌落的平均值。然后按下面方法計(jì)算每毫升的cfu，以及AMP/AML的殺菌能力(經(jīng)AMP/AML處理的培養(yǎng)后的細(xì)菌存活數(shù))/(未經(jīng)AMP/AML處理的培養(yǎng)后的細(xì)菌存活數(shù))×100，這代表了相比未存活下來的細(xì)菌，存活下來的細(xì)菌百分比(AMP/AML+試驗(yàn)復(fù)合物培養(yǎng)后的細(xì)胞存活數(shù))/(經(jīng)試驗(yàn)復(fù)合物培養(yǎng)后的細(xì)胞存活數(shù))×100。
所有的被鑒定的復(fù)合物都要經(jīng)過篩選確定它們是否具有以下的一或多種效果是否能夠抑制AMP的抗菌能力，是否能夠影響細(xì)胞增殖或分化或其他上述受帶病組織的細(xì)胞活動(dòng)，這些組織是從病患或正常(試驗(yàn)對(duì)照)或模型中分離出來用以篩選牛皮癬，免疫系統(tǒng)激活抑制物的效果的，例如HaCaT，人原代或鼠原代角質(zhì)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞等等。
經(jīng)過鑒定的復(fù)合物可能要經(jīng)過篩選確定它們是否對(duì)人造皮膚培養(yǎng)物和動(dòng)物模型有效果以鑒定對(duì)期望的某種或某幾種綜合的生物活動(dòng)有效果的抑制物。這包括鑒定能抑制AMP/AML在增生/分化平衡上的作用但不影響其抗菌/抗微生物活力的抑制物。
試驗(yàn)復(fù)合物或調(diào)節(jié)物可以是小的合成的/多肽分子或其他類型的分子。
試驗(yàn)復(fù)合物或調(diào)節(jié)物最好是多肽分子，蛋白質(zhì)，糖基化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的各類試驗(yàn)復(fù)合物和調(diào)節(jié)物能從商業(yè)性的化學(xué)藥劑倉(cāng)庫(kù)買到，比如，被一些大公司如Merck，Glaxo Welcome，Bristol Meyers Squib，Monsanto/Searle，Eli Lilly，Novartis，Pharmacia UpJohn等所擁有的化學(xué)藥劑倉(cāng)庫(kù)。本發(fā)明的各類試驗(yàn)復(fù)合物和調(diào)節(jié)物也能從網(wǎng)上的公司購(gòu)買，如Chemcyclopedia(http//www.mediabrains.com/client/chemcyclop/BGl/search.asp)。另外，本發(fā)明的各類試驗(yàn)復(fù)合物和調(diào)節(jié)物也可以用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)和/或生物學(xué)合成技術(shù)來從頭合成。合成適合本發(fā)明的復(fù)合物和調(diào)節(jié)物的詳盡的技術(shù)指南在本領(lǐng)域的相關(guān)文獻(xiàn)中可以查到。如果需要生物合成多肽和核酸，可參見，如Sambrook et al.，infra；和下面例證區(qū)的相關(guān)的文獻(xiàn)。
如果需要化學(xué)合成，則可以參見，例如由美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)(http//www.chemistry.org/portal/Chemistry)提供的詳盡指南。對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，如普通的化學(xué)家，則仍然需要接受化學(xué)合成方面的培訓(xùn)方可合成試驗(yàn)復(fù)合物。
在合成能和AMP/AML分子結(jié)合的小分子時(shí)，需要考慮以下若干因素，抗體結(jié)構(gòu)，受體，配體，以及有關(guān)的生化和生物學(xué)的特性。也許還需要用最低能量和分子動(dòng)力學(xué)或者在最低能量和分子動(dòng)力學(xué)之后的比較模型來計(jì)算從頭折疊。這兩種方法的區(qū)別僅在於它們使用不同的起始結(jié)構(gòu)和不同的試錯(cuò)方法。折疊樣式是用最低能量和分子動(dòng)力學(xué)的方法來研究的。
這里的“多肽”包括自然多肽(降解產(chǎn)物，人工合成的多肽或重組多肽)和peptidomimetics(一般是人工合成的模擬多肽)，如peptoids和多肽模擬物semipeptoid。semipeptoid可以有基團(tuán)的修飾從而使其在身體中更穩(wěn)定或更易進(jìn)入靶子細(xì)胞。修飾包括但不限於CH2-NH，CH2-S，CH2-S＝O，O＝C-NH，CH2-O，CH2-CH2，S＝C-NH，CH＝CH or CF＝CH等主鏈的修飾和基團(tuán)修飾。制備peptidomimetics復(fù)合物的方法在本領(lǐng)域很常見和具體，例如Quantitative Drug Design，C.A.RamsdenGd.，Chapter 17.2，F(xiàn).Choplin Pergamon Press(1992)所描述。
多肽分子中的肽鍵(-CO-NH-)可以被N-甲基鍵(-N(CH3)-CO-)，酯鍵(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)，ketomethylen鍵(-CO-CH2-)，硫唑嘌呤鍵(a-azabonds)(-NH-N(R)-CO-)，其中的R是烷基，如甲基，卡巴鍵(-CH2-NH-)，hydroxyethylene鍵(-CH(OH)-CH2-)，硫代酰胺鍵(-CS-NH-)，烯烴雙鍵(-CH＝CH-)，反酰胺鍵(-NH-CO-)，衍生肽鍵(peptide derivatives)(-N(R)-CH2-CO-)，其中的R是正常支鏈，存在于天然的碳原子上。
這些修飾可以是多肽鏈的任何位置甚至一條多肽鏈的多個(gè)(2-3)位置。
天然的芳香氨基酸，如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)，苯丙氨酸(Phe)可以被合成的非天然氨基酸所取代，如TIC，naphthylelanine(Nol)，苯丙氨酸的環(huán)甲基的衍生物，苯丙氨酸或環(huán)甲基酪氨酸的鹵化衍生物。
除以上所列，本發(fā)明的多肽還可以包括一個(gè)或多個(gè)修飾的氨基酸和一個(gè)或多個(gè)非氨基酸單體(如脂肪酸，綜合碳水化合物等)。
在此處的規(guī)范部分和下面的聲明部分，“氨基酸”是指20種天然氨基酸，體內(nèi)的翻譯后修飾的氨基酸，如羥脯氨酸，磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸，以及不常見氨基酸，包括但不限於2-氨基脂肪酸，羥賴氨酸，別-異亮氨酸，正纈氨酸，正亮氨酸和鳥氨酸。更進(jìn)一步說，“氨基酸”包括D-型和L-型氨基酸。
下面的表2和表3列了可以用在本發(fā)明中的天然氨基酸(表2)和非常規(guī)氨基酸(表3)表2.天然氨基酸.


表3.不常用的或經(jīng)修飾的氨基酸.




本發(fā)明的多肽可以線狀的或者環(huán)形的形式被使用。
多肽可以被合成為環(huán)形或者適宜情況下讓其形成環(huán)形的結(jié)構(gòu)。
例如，一根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，多肽能可以含有至少兩個(gè)包夾多肽核心的半胱氨酸基團(tuán)組成，在這種情況中，環(huán)化能由半胱氨酸基間的S-S鍵組成。支鏈和支鏈間的環(huán)化也可以由(--CH2)n-S-CH-2-C-鍵的相互作用來形成，其中的n＝1或者2，舉例來說，通過將半胱氨酸或者高胱氨酸SH基團(tuán)和溴乙?；馁嚢彼?，鳥氨酸，二氨基丁酸或者二氨基丙酸起反應(yīng)來完成。此外，環(huán)化還能通過谷氨酸，天冬氨酸，賴氨酸，鳥氨酸，二氨基丁酸(Dab)，二氨基丙酸等在主鏈上各個(gè)位置酰胺鍵形成-CO-NH或者-NH-CO鍵來完成。主鏈和主鏈之間的環(huán)化也可以通過結(jié)合H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-COOH或者H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-NH2格式的修飾氨基酸來完成。
因使用和目的不同，不同的AMP/AMLs分子都可用于本發(fā)明的不同試驗(yàn)方案中。適宜于在本發(fā)明中使用的AMP/AMLs分子的許多例子被列在因特網(wǎng)上http//www.bbcm.units.it/~tossi/pagl.htm，并在下文中有介紹。
AMP/AMLs分子的例子包括alpha-防御素，組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)和thrombocidins(或叫“血小板殺菌蛋白[PMPs]”)。
防御素的例子包括alpha-防御素，beta-防御素和中性粒細(xì)胞防御素。
alpha-防御素的例子包括從alpha-防御素1到-6(Mol Immunol。2003Nov；40(7)463-7；J Clin Invest.1985 Oct；76(4)1427-35)。
beta-防御素的例子包括beta-防御素-1(Genomics.1997 Aug1；43(3)316-20；Biochem Biophys Res Commun.2002 Feb 15；291(1)17-22；FEBSLett.1995 Jul 17；368(2)331-5；Paulsen F et al.，J Pathol.2002Nov；198(3)369-77)，beta-defensin-2(Biochemistry.2001 Apr3；40(13)3810-6；Gene.1998 Nov 19；222(2)237-44；Paulsen F et al.，JPathol.2002 Nov；198(3)369-77)，beta-防御素3(Cell Tissue Res.2001Nov；306(2)257-64；J Biol Chem.2002 Mar 8；277(10)8279-89.Epub 2001 Dec11；J Biol Chem.2001 Feb 23；276(8)5707-13；Paulsen F et al.，J Pathol.2002 Nov；198(3)369-77)，beta-防御素4(J Immunol.2002 Sep1；169(5)2516-23)，beta-防御素5(Am J Pathol.1998 May；152(5)1247-58；JBiol Chem.1992 Nov 15；267(32)23216-25)，和beta-防御-6(FEBS Lett.1993Jan 4；315(2)187-92；Crit Care Med.2002 Feb；30(2)428-34)。
beta-防御素包括由五個(gè)保守的beta-防御素基因串編碼的基因產(chǎn)物，這五個(gè)保守的beta-防御素基因串是由計(jì)算機(jī)搜索找出的。
嗜中性粒細(xì)胞防御素的例子包括嗜中性粒細(xì)胞alpha-防御素和嗜中性粒細(xì)胞beta-防御素。
嗜中性粒細(xì)胞alpha-防御素的例子包括嗜中性粒細(xì)胞alpha-防御素-1//人嗜中性粒細(xì)胞多肽(HNP)-1(J Clin Invest.1985 Oct；76(4)1436-9；Paulsen Fet al.，J Pathol.2002 Nov；198(3)369-77)，嗜中性粒細(xì)胞alpha防御素-2/HNP-2(J Clin Invest.1985 Oct；76(4)1436-9；Paulsen F et al.，J Pathol.2002 Nov；198(3)369-77)，嗜中性粒細(xì)胞alpha防御-3/HNP-3(J Clin Invest.1985 Oct；76(4)1436-9；Paulsen F et al.，J Pathol.2002 Nov；198(3)369-77)，嗜中性粒細(xì)胞alpha防御素4/HNP-4(Mol Immunol.2003 Nov；40(7)463-7)，人防御素5(HD-5；D.E.Jones and C.L.Bevins，J.Biol.Chem.267(1992)，pp.23216-23225；J Biol Chem.1992 Nov 15；267(32)23216-25；Mol Immunol.2003Nov；40(7)469-75；Quayle AJ et al.，Am.J.Pathol.1998，1521247-1258；FEBS Lett.1993 Jan 4；315(2)187-92；D.E.Jones and C.L.Bevins，F(xiàn)EBS Lett.315(1993)；Paulsen F et al.，J Pathol.2002 Nov；198(3)369-77)，和人防御素6(HD-6；Mol Immunol.2003 Nov；40(7)463-7)，人防御素5(HD-5；D.E.Jones and C.L.Bevins，J.Biol.Chem.267(1992)，pp.23216-23225；J BiolChem.1992 Nov 15；267(32)23216-25；Mol Immunol.2003 Nov；40(7)469-75；Quayle AJ et al.，Am.J.Pathol.1998，1521247-1258；FEBS Lett.1993 Jan4；315(2)187-92；D.E.Jones and C.L.Bevins，F(xiàn)EBS Lett.315(1993)；PaulsenF et al.，J Pathol.2002 Nov；198(3)369-77)。
組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)的例子包括人LL-37/hCAP18(LL37)(Curr Drug Targets Inflamm Allergy.2003 Sep；2(3)224-31；Eur JBiochem.1996 Jun 1；238(2)325-32；Paulsen F et al.，J Pathol.2002Nov；198(3)369-77).LL-37是一37氨基酸基團(tuán)的多肽蛋白質(zhì)，它的37個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)它的前體hCAP18/人組織蛋白酶抑制素的第134-170氨基(GenBankACCESSION NP_004336；VERSION NP_004336.2 GI39753970；REFSEQaccessionNM_004345.3).LL-37調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖和血管增生途徑可以被百日咳毒素抑制，一種G蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體的抑制物(Koczulla，R.et al.，2003.J.Clin.Invest1111665-1672).類似AMP/AML已在下列專利中被列出美國(guó)專利2003120037，美國(guó)專利200309626，美國(guó)專20020141620，美國(guó)專利20020507，CA 2383172，美國(guó)專利20020072495和被參考資料引用的文獻(xiàn).人抗菌組織蛋白酶抑制素前體hCAP 18在骨髓細(xì)胞和過渡骨髓細(xì)胞中被合成然后運(yùn)到嗜中性粒細(xì)胞中特別的小粒中(Blood.1997 Oct 1；90(7)2796-803)。
抗菌肽類分子(AML)的例子包括趨化因子或者其片斷。
這樣的趨化因子包括CC趨化因子和CXC趨化因子。趨化因子和AMP的功能被證明有相當(dāng)大的重疊(Cole et al.，2001.J.Immunol.167623)，某些趨化因子和防御素被證明能結(jié)合同樣的趨化因子受體CCR6。防御素和某些趨化因子擁有驚人的相似特徵，包括大小，二硫鍵，干擾素(IFN)誘導(dǎo)能力，陽(yáng)離子性和其他特征。相關(guān)的趨化因子和AMP之間的相似性在許多文獻(xiàn)中都有所介紹(如Durrand Peschel，2002.Infection and Immunity 706515)。因此，各種各樣的趨化因子和其相應(yīng)的抗體都可以用在本發(fā)明的各種用途中。
上述CC趨化因子包括CCL1，CCL5/RANTES(Infect Immun.2002Dec；70(12)6524-33；Eur J Biochem 1996 Apr 1；237(1)86-92)，CCL8，CCL11，CCL17，CCL18，CCL19，CCL20/活化調(diào)節(jié)的趨化因子/(LARC)/巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)3-alpha(MIP-3alpha)/Exodus-1/Scya20(Yang D et al.，Journal ofLeukocyte Biology Volume 74，September 2003；74(3)448-55)，CCL21，CCL22，CCL25，CCL27/CTACK和CCL28(J Biol Chem.2000 Jul21；275(29)22313-23；J Immunol.2003 Feb 1；170(3)1452-61).CCL趨化因子在Yang D et al.，Journal of Leukocyte Biology Volume 74，September2003；74(3)448-55中有描述。
上述CXC趨化因子的例子包括CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL4(PF4)，CXCL7/NAP-2，CXCL8/IL-8，CXCL9(MIG；Yang D et al.，Journal of LeukocyteBiology Volume 74，September 2003；74(3)448-55)，CXCL10/IP-10(The Journalof Immunology，2001，167623-627)，CXCL11/IP9/I-TAC(The Journal ofImmunology，2001，167623-627)，CXCL12/SDF-1(Yang D et al.，Journal ofLeukocyte Biology Volume 74，September 2003；74(3)448-55)，CXCL13，CXCL14，結(jié)締組織活化多肽3(CTAP-3；Infect Immun.2002 Dec；70(12)6524-33；Eur JBiochem 1996 Apr 1；237(1)86-92)，和CTAP-3前體血小板鹼性蛋白質(zhì)。CXC趨化因子在Yang D et al.，Journal of Leukocyte Biology Volume 74，September2003；74(3)448-55中有描述。
纖維蛋白肽的例子包括纖維蛋白多肽-A感染(Infect Immun.2002Dec；70(12)6524-33；Eur J Biochem 1996 Apr 1；237(1)86-92)，纖維蛋白多肽-B(Infect Immun.2002 Dec；70(12)6524-33；Eur J Biochem 1996 Apr1；237(1)86-92)。
AMP/AML的例子進(jìn)一步包括XCL1(Yang D et al.，Journal of LeukocyteBiology Volume 74，September 2003；74(3)448-55)，MIP-1beta (Yang D et al.，Journal of Leukocyte Biology Volume 74，September 2003；74(3)448-55).
更多的AMP/AML例子包括腎上腺髓質(zhì)素(Regul Pept.2003 Apr15；112(1-3)147-52；J Biol Chem 1998 Jul 3；273(27)16730-8)，alpha黑素細(xì)胞刺激激素(Cutuli M et al.，J Leukoc Biol.2000 Feb；67(2)233-9；Neuroimmunomodulation-2002-2003；10(4)208-16)，血管生成素(NatureImmunology，March 2003)，血管生成素4(Nature Immunology，March 2003)，抗菌劑多肽B/enkelytin(Neuroimmunol 2000 Sep 22；109(2)228-35)抗白細(xì)胞酶(ALP；Biochem Biophys Res Commun.1998 Jul 30；248(3)904-9；Am J RespirCrit Care Med 1999 Jul；160(1)283-90)，淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞衍生的抗微生物多肽，血小板衍生的抗微生物的多肽，抗微生物的多肽PR39，一載脂蛋白載脂蛋白，載脂蛋白C，載脂蛋白C2(Hypertens Pregnancy2002；21(3)199-204；Peptides.2000 Mar；21(3)327-30)，載脂蛋白C3(Hypertens Pregnancy 2002；21(3)199-204；Peptides.2000Mar；21(3)327-30)，載脂蛋白E(Hypertens Pregnancy 2002；21(3)199-204；Peptides.2000 Mar；21(3)327-30)，載脂蛋白E2(Brain Res 1997 Feb21；749(1)135-8；Biochemistry 2002 Oct 1；41(39)11820-3；Eur J Clin ChemClin Biochem 1997 Aug；35(8)581-9)，殺菌的/能增加滲透性的蛋白質(zhì)(Paulsen Fet al.，J Pathol.2002 Nov；198(3)369-77；Mol Microbiol 1995 Aug 17523-31；J Biol Chem 1987 Nov 5；262(31)14891-4)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)，BMP 2/4，BMP-5，buforin，calcitermincalcitermin(FEBS Lett.2001 Aug24；504(1-2)5-10)，組織蛋白酶，組織蛋白酶B，組織蛋白酶G，組織蛋白酶K，溶酶體的組織蛋白酶，嗜鉻素(Blood 2002 Jul 15；100(2)553-9)，嗜鉻素A(Blood 2002 Jul 15；100(2)553-9)，嗜鉻素B(Blood 2002 Jul15；100(2)553-9)，糜酶(Immunology 2002 Apr；105(4)375-90)，結(jié)締組織激活多肽-3光抑素(APMIS.2003 Nov；111(11)1004-1010；Biol Chem Hoppe Seyler1988 May；369 Suppl191-7)，DCD-1(J Immunol Methods.2002 Dec1；270(1)53-62)，dermicidin(Nat Immunol.2001 Dec；2(12)1133-7)，彈性蛋白酶特異性抑制物/SKALP(來自皮膚的antileucoproteinase)/elafin(BiochemSoc Trans.2002 Apr；30(2)111-5；J Invest Dermatol 2002 Jul；119(1)50-5)，eNAP-1，嗜曙紅陽(yáng)離子蛋白質(zhì)多肽(Peptides.2003 Apr；24(4)523-30；JImmunol 2002 Mar 1682356-64；Eur J Biochem 1996 Apr 1；237(1)86-92；Peptides.2003 Apr；24(4)523-30；J Exp Med 1989 Jul 1；170(1)163-76)，ESC42，ESkine，F(xiàn)ALL-39(Proc Natl Acad Sci USA.1995 Jan 3；92(1)195-9)，F(xiàn)as配體(FasL；Berthou C et al.，J Immunol.1997 Dec 1；159(11)5293-300)，fractalkine，粘多糖，granulysin(Reprod Biol Endocrinol.2003 Nov 28；JImmunol.2003 Mar 15；170(6)3154-61；Cancer Immunol Immunother.2002Jan；50(11)604-14.Epub 2001 Nov；Expert Opin Investig Drugs.2001Feb；10(2)321-9)，granzyme B(Berthou C et al.，J Immunol.1997 Dec1；159(11)5293-300)，HAX 1，肝素結(jié)合蛋白/CAP37(Paulsen F et al.，J Pathol.2002 Nov；198(3)369-77；J Clin Invest 1990 May；85(5)1468-76)，hepcidin(JBiol Chem.2001 Mar 16；276(11)7806-10.Epub 2000 Dec 11；Eur J Biochem2002 Apr 2692232-7)，HE2，HE2alpha(Biol Reprod.2002 Sep；67(3)804-13)，HE2alpha C-端片段(Biol Reprod.2002 Sep；67(3)804-13)，HE2betal(BiolReprod.2002 Sep；67(3)804-13)，來源于HE2基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，histatin(Antimicrob Agents Chemother 2001 Dec 453437-44；Biochem Cell Biol.1998；76(2-3)247-56)，組蛋白，組蛋白H2A，組蛋白H-2b(Peptides.2003Apr；24(4)523-30；J Immunol 2002 Mar 1682356-64；Eur J Biochem 1996 Apr1；237(1)86-92)，HMG 17，HtpG，HtpG同源物，HSl結(jié)合蛋白質(zhì)，白細(xì)胞介素-8，乳鐵傳遞蛋白(Eur J Nucl Med.2000 Mar；27(3)292-301；Paulsen F etal.，J Pathol.2002 Nov；198(3)369-77；J Mammary Gland Biol Neoplasia 1996Jul；1(3)285-95)，淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞AMP(Hua Xi Yi Ke Da Xue XueBao 2002 Jan；33(1)87-90)，溶菌酶(Paulsen F et al.，J Pathol.2002Nov；198(3)369-77；Anat Embryol(Berl)2002 Jul；205(4)315-23)，巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)(MIP)，MIP-1alpha，MIP-1beta，MIP-3alpha，肥大細(xì)胞小粒絲氨酸蛋白酶(Immunology 2002 Apr；105(4)375-90)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，MMP-2，MMP-7(Paulsen F et al.，J Pathol.2002 Nov；198(3)369-77)，遷移抑制因子(J Immunol.1998 Sep 1；161(5)2383-90；Scand J Infect Dis.2003；35(9)573-6)，，MMP 9，MRP8(Behring Inst Mitt.1992 Apr；(91)126-37)，MRP14(Behring Inst Mitt.1992 Apr；(91)126-37)，嗜中性粒細(xì)胞明膠酶關(guān)聯(lián)的lipocalin NGAL(NGAL；Exp Dermatol.2002 Dec；11(6)584-91；Mol Cell.2002 Nov；10(5)1033-43)，嗜中性粒細(xì)胞溶菌酶(Int J Antimicrob Agents.1999Sep；13(1)47-51)，類鴉片活性多肽，perforin(Berthou C et al.，J Immunol.1997 Dec 1；159(11)5293-300)，，磷脂酶A(2)(PLA 2)，Peptides.2003Apr；24(4)523-30；J Exp Med 1989 Jul 1；170(1)163-76)，血小板鹼性(InfectImmun.2002 Dec；70(12)6524-33；Eur J Biochem 1996 Apr 1；237(1)86-92)，血小板因子-4，銀屑素(psoriasin)(J Histochem Cytochem.2003May；51(5)675-85；G1酲er R et al.，J Invest Dermatol 117768(abstr 015))，retrocyclin(Proc Natl Acad Sci USA 2002 Feb 19；99(4)1813-8)，分泌性的白細(xì)胞蛋白酶抑制□SLPI；Shugars DC et al.，Gerontology.2001Sep-Oct；47(5)246-53；Biochem Soc Trans.2002 Apr；30(2)111-5；J InvestDermatol 2002 Jul；119(1)50-5)，分泌的磷脂酶A(2)(Peptides.2003Apr；24(4)523-30；J Immunol 2002 Mar 1682356-64；Eur J Biochem 1996 Apr1；237(1)86-92；Paulsen F et al.，J Pathol.2002 Nov；198(3)369-77)，P物質(zhì)，S100鈣結(jié)合蛋白，S100A7，S100A8，S100A9，胸腺素，胸腺素beta-4(Infect Immun.2002 Dec；70(12)6524-33；Eur J Biochem 1996 Apr1；237(1)86-92；Infect Immun.2002 Dec；70(12)6524-33；Eur J Biochem 1996Apr 1；237(1)86-92)，胸腺的和活性調(diào)節(jié)的趨化因子(TARC)，TL1A，tryptase(Immunology 2002 Apr；105(4)375-90)，ubiquicidin(Eur J Nucl Med.2000 Mar；27(3)292-301；Hiemstra PS，van den Barselaar MT et al.，JLeukocyte Biol 1999；66423-428；J Nucl Med 2001 May 42788-94)，和尿激酶類型的血纖維蛋白溶酶原活化物。
AMP/AML可以是計(jì)算機(jī)發(fā)現(xiàn)的28個(gè)潛在的似防御素的多肽分子中的任何一個(gè)(Am J Respir Cell Mol Biol.2003 Jul；29(1)71-80).
如同在上文描繪那樣，本發(fā)明能被用作治療各種和以下有關(guān)的疾病(i)腫瘤，(ii)發(fā)炎，(iii)上皮損傷；(iv)細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)/分化的失調(diào)；(v)細(xì)胞/組織的生長(zhǎng)/分化平衡的紊亂；(vi)和/或血管增生。
本發(fā)明所能治療的疾病的例子列舉在美國(guó)專利No.@@@中本發(fā)明所能治療的疾病的例子也列舉如下。
腫瘤，包括皮膚腫瘤，角質(zhì)細(xì)胞腫瘤，胃腸的腫瘤，癌，黑素瘤，鱗狀細(xì)胞腫瘤，口腔鱗狀細(xì)胞癌，淋巴瘤，惡性腫瘤，良性腫瘤，實(shí)體瘤，轉(zhuǎn)移性的腫瘤和非實(shí)體瘤。
人beta-防御素-2的在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的濃度比正常口腔上皮膚細(xì)胞高得多(Sawaki，K.et al.，2002.Anticancer Res.222103-2107)。細(xì)胞增殖和癌之間有遺傳學(xué)的內(nèi)在聯(lián)系。細(xì)胞的增殖和分化的調(diào)節(jié)受削弱抑制時(shí)導(dǎo)致癌。成長(zhǎng)中的腫瘤需要鄰近細(xì)胞的幫助才能癌變。細(xì)胞因子的過度表達(dá)或者過於活躍加速癌變進(jìn)程。長(zhǎng)期發(fā)炎對(duì)細(xì)胞的刺激也導(dǎo)致細(xì)胞改變。血管增生是癌變中一重要過程fAMP是血管增生的引導(dǎo)因子(Koczulla，R.et al.，2003.J.Clin.Invest1111665-1672)。因此使用AMP和細(xì)胞因子的拮抗劑來抑制細(xì)胞分化和增殖以及血管增生可以用來治療癌癥。尿激酶類型血纖維蛋白溶酶原活化劑(uPA)有抗微生物的特性(Gyetko，MR.et al.，2002.J.Immunol.168801-809)而且參與惡性的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)展。在體內(nèi)和體外的研究表明alpha防御素是腎臟細(xì)胞癌中的惡性的上皮膚細(xì)胞多肽成分中的常見成分，暗示了其可能對(duì)腫瘤增殖的直接影響(Muller，CA.et al.，2002.Am.J.Pathol.16011311-1324)。在體內(nèi)試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)某些抗血管增生復(fù)合物有強(qiáng)烈的抗癌效果。因此抑制有血管增生作用的AMP如LL-37可以作為治療癌的一種形式?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)因在腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移的過程中的細(xì)胞外基質(zhì)中起重要的作用而被人所熟知。在很大的比例ESCC腫瘤的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間基質(zhì)可以看到MMP-2(細(xì)胞質(zhì))和MMP-9(基質(zhì))蛋白的過度的表達(dá)(J Cancer Res Clin Oncol.2003 Oct 16)。
BMP-2/4和BMP-5但不是BMPR IA可能也參與口腔癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(0verexpression of BMP-2/4，-5 and BMPR-IA associated with malignancy oforal epithelium Oral Oncol.2001，37225-33.)。
和上皮損傷有聯(lián)系的疾病例子包括愈合缺陷，潰瘍，皮膚潰瘍，褥瘡，胃潰瘍，消化性潰瘍，頰的潰瘍，鼻咽的潰瘍，食管的潰瘍，十二指腸潰瘍和與糖尿病相關(guān)的愈合缺陷。
疾病的例子包括自發(fā)的/炎性疾病，慢性炎性疾病，急性/炎性疾病，炎性的/皮膚疾病，炎性的/胃腸的疾病，和發(fā)炎有關(guān)的腫瘤，過敏性的疾病，自身免疫病，傳染性疾病，惡性疾病，和移植有關(guān)的疾病，炎性的/退化性疾病，和發(fā)炎有關(guān)的損傷，和過敏有關(guān)的疾病，炎性的/心血管的疾病，炎性的/腺體疾病，炎性的/肝病，炎性的/神經(jīng)病學(xué)的疾病，炎性的/肌肉骨骼的疾病，炎性的/腎臟的疾病，炎性的/生殖系統(tǒng)的疾病，炎性的/系統(tǒng)性的疾病，炎性的/結(jié)締組織疾病，炎性疾病/神經(jīng)壞死疾病，組織壞死，和器官移植有關(guān)的疾病，炎性的/血液學(xué)的疾病，炎性的/眼病，炎性的/呼吸疾病。
皮膚的/炎性的疾病例子包括牛皮癬，頭皮屑，尋常性天皰瘡，扁平苔蘚，異位性皮炎，硬皮病，皮肌炎，脫發(fā)，瞼炎，皮膚癌，黑素瘤，鱗狀細(xì)胞癌，尋常痤瘡，新生兒中毒性紅斑，毛囊炎，皮皺紋，自身免疫的大皰的皮膚病，大皰的類天皰瘡，落葉型天皰瘡，炎和藥疹。
頭皮屑可被當(dāng)作是炎性的，不正常細(xì)胞增生或者不正常分化的疾病而造成頭皮的皮屑化皮伸出。類似地，牛皮癬也是由於LL-37等AMP分子的過度活躍而引起的增殖/分化平衡紊亂所引起。瑞典的人口中統(tǒng)計(jì)調(diào)查顯示了頭皮屑和牛皮癬之間的相關(guān)。有得牛皮癬遺傳風(fēng)險(xiǎn)(家族內(nèi))的人也有很大可能得頭皮屑。因此被本發(fā)明所描繪的適用于治療牛皮癬的方法也適合于頭皮屑。
胃腸的/炎性疾病的例子包括克隆氏癥，慢性自身免疫性胃炎，自身免疫性萎縮性胃炎，原發(fā)性硬化性膽管炎，自身免疫的achlorhydra，結(jié)腸炎，回腸炎，慢性炎性的腸的疾病，炎性腸綜合癥，慢性炎性腸道疾病，乳糜瀉，吃飯混亂，膽石和一胃腸的潰瘍。
克隆氏癥是一炎性腸道疾病。因?yàn)槟c接觸對(duì)外環(huán)境，所以AMP分子在對(duì)外防御和調(diào)節(jié)正常的生理功能中起重要的雙重作用，類似地在皮膚中，AMP分子也起生理上和病理上的雙重重要作用。這些組織中AMP分子的異常的表達(dá)和/或活力將引起病理學(xué)的后果。Paneth細(xì)胞(腸中的一種特別細(xì)胞)在和細(xì)菌共同作用時(shí)幫助血管形成缺乏Paneth細(xì)胞的老鼠無(wú)法形成正常的血管。值得注意的是，一種特別的細(xì)菌Bacteroides thetaiotaomicron或者B.thetaiotaomicron在正常的人和鼠的腸內(nèi)形成的菌落可以刺激血管的形成，其效果和接種完整的微生物群體是一樣的。在自身免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中，AMP能象趨化因子一樣對(duì)胃腸道的慢性炎癥的維持起重要的作用(Cunliffe，RN，Mahida，YR.，2003.JLeukoc Biol.Oct 2[Epub ahead of print])。AMP LL-37，beta-防御素，人alpha-防御素，beta-防御素(包括HD5)，HN-6，溶菌酶和分泌的PLA2，TL1A在腸內(nèi)，Paneth細(xì)胞，小腸的分泌性上皮膚細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(Ghosh，D.et al.，2002.Nat.Immunol.3583-590；Fellermann，K.et al.，2003.Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.15627-634)。過度表達(dá)alpha-防御素的細(xì)胞是T-細(xì)胞和不成熟樹突細(xì)胞，樹突細(xì)胞，以及單核細(xì)胞(Yang，D.et al.，2000.J.Leukoc.Biol.689-14；Risso，A.，2000.J.Leukoc.Biol.68785-792；Territo，MC.et al.，1989.J.Clin.Invest 842017-2020)。人alpha-防御素以及其它AMP對(duì)宿主天然免疫系統(tǒng)在腸的局部防御中起著重要的作用，這些作用和微生物感染以及慢性腸道炎有很大的關(guān)系(Wehkamp，J.et al.，2002.Dig.Dis.Sci.471349-1355)。alpha-防御素通過降低人中性粒細(xì)胞的趨化性使急性炎癥轉(zhuǎn)化為慢性炎癥，例如，alpha-防御素-1/人嗜中性粒細(xì)胞蛋白質(zhì)-1在人中性粒細(xì)胞中起抗趨化性的作用。已知慢性炎癥的特點(diǎn)是結(jié)締組織中的細(xì)胞增生而不是淋巴細(xì)胞，漿細(xì)胞或中性粒細(xì)胞的滲出。因此，合適的調(diào)節(jié)AMP/AML分子的方法也可以用來治療如炎性腸道疾病，克隆氏癥和潰瘍性結(jié)腸炎等疾病。
胃炎是指胃處在的發(fā)炎的狀態(tài)。胃炎主要有A和B兩類。A類胃炎被認(rèn)為是在自身免疫過程中形成的。但兩類胃炎的發(fā)生都和傳染物幽門螺桿菌有關(guān)系。AMP分子也參與到兩類胃炎的發(fā)生。防御素也參與到胃炎的發(fā)病機(jī)理中(Bajaj-Elliott，M.et al.，2002.Gut 51356-361)。因此，合適的調(diào)節(jié)AMP/AML分子的方法可以用來治療胃炎類的疾病。
過敏性的/炎性疾病的例子包括氣喘，蕁麻疹，蕁麻疹，花粉過敏癥，灰塵螨過敏癥，惡毒過敏癥，化妝品過敏癥，乳汁過敏癥，化學(xué)過敏癥，藥物過敏癥，昆蟲叮咬過敏癥，動(dòng)物皮屑過敏癥，帶刺植物過敏癥，毒常青藤過敏癥，過敏性休克，過敏性，特應(yīng)性的過敏癥和食物過敏癥。
超敏反應(yīng)的例子包括I類超敏反應(yīng)，II類超敏反應(yīng)，III類超敏反應(yīng)，IV類超敏反應(yīng)，速發(fā)型超敏反應(yīng)反應(yīng)，抗體介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，免疫復(fù)合物介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，遲發(fā)型超敏反應(yīng)，T輔助細(xì)胞介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，T-細(xì)胞超敏反應(yīng)，細(xì)胞毒性T-細(xì)胞介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，TH1細(xì)胞介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，和TH2細(xì)胞介導(dǎo)的超敏反應(yīng)。
心血管的炎性和/或炎性的/血液學(xué)的疾病的例子包括動(dòng)脈粥樣硬化，高安動(dòng)脈炎，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，雷諾氏病，顳動(dòng)脈炎顳動(dòng)脈炎，炎性貧血，炎性淋巴細(xì)胞減少，惡性貧血，閉塞性疾病，心肌梗死，血栓形成，韋格內(nèi)肉芽腫，淋巴瘤，白血病，川崎綜合癥，第八因子單株抗體自身免疫性疾病，壞死性小血管炎，顯微鏡下多血管炎，嗜酸性肉芽腫性血管炎，免疫缺乏壞死性腎乳頭炎，新月體性腎小球腎炎，抗磷脂綜合征，抗體引起的心衰竭，血小板減少性紫癜，自身免疫性溶血性貧血，心臟的自身免疫，南美錐蟲病，鐵缺陷貧血和抗T輔助細(xì)胞的自身免疫。
發(fā)炎是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展的病理學(xué)過程的一部分。肺炎衣原體以及其它各種各樣微生物都是把發(fā)炎轉(zhuǎn)化為動(dòng)脈粥樣硬化的潛在病源因素。發(fā)炎是幾個(gè)CNS病理發(fā)病的誘因也是結(jié)果。發(fā)炎是缺血性中風(fēng)后腦缺血開始的病理生理學(xué)的一個(gè)過程，也是頭部傷害和蛛網(wǎng)膜下出血等其它CNS病理學(xué)的一部分。此外，在CNS中或者其周圍的發(fā)炎也是引發(fā)腦局部缺血的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素。內(nèi)皮膚細(xì)胞表達(dá)并分泌AMP。肝素是37kDa(CAP37)的陽(yáng)離子的抗微生物的蛋白質(zhì)，最早是從人嗜中性粒細(xì)胞提取出來，是一重要的多功能炎性調(diào)解物，它在血管的內(nèi)皮和動(dòng)脈粥樣硬化的病斑的血管的內(nèi)皮中表達(dá)。(Lee，TD.et al.，2002.Am.J.Pathol.160841-848)。人beta-防御素-2在星形細(xì)胞中表達(dá)，它的表達(dá)在細(xì)胞因子和LPS的出現(xiàn)時(shí)大量增加(Hao，HN.et al.，2001.J.Neurochem.771027-1035)。因此，抑制AMP可以用來防治這些情況的發(fā)生。
和發(fā)炎/慢性病有關(guān)的貧血是身體通過減少病原物從細(xì)胞間鐵的吸收來打擊病原的手段。鐵被嗜中性粒細(xì)胞吸收。在沒有沒有病原體的情況下，慢性炎癥有時(shí)也會(huì)發(fā)生。在慢性炎癥中，趨化因子誘導(dǎo)一序列鐵的轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致缺鐵癥。如慢性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎，骨髓炎，青年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕熱，克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸炎和慢性病病人腎衰竭。鐵傳遞蛋白攜帶的鐵運(yùn)輸?shù)絾魏思?xì)胞造成貧血。這個(gè)“運(yùn)輸”被認(rèn)為和AMP活力有關(guān)。細(xì)胞因子IL-1，IL-6和TNF-beta啟動(dòng)防御素的生產(chǎn)，而后防御素啟動(dòng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，結(jié)果造成單核細(xì)胞對(duì)鐵的過量吸收。調(diào)節(jié)細(xì)胞因子對(duì)鐵的運(yùn)輸在慢性病和貧血的發(fā)病機(jī)理中是一重要機(jī)制(Ludwiczek，S.et al.，2003.Blood 1014148-4154)。因此，調(diào)解AMP可以用來控制鐵的體內(nèi)平衡。已知肝素AMP可以控制鐵的吸收，因此抑制肝素能夠增加鐵吸收(Nicolas，G.et al.，2002.Blood Cells Mol.Dis.29327-335)。但是，其他的AMP分子間接參與鐵的調(diào)節(jié)，如防御素和LL-37。因?yàn)镠NP-1是一嗜中性粒細(xì)胞中的非特異性的防御性多肽，它在抵御疾病中起著重要作用，如口腔扁平苔蘚，粘膜白斑病以及和和鐵缺陷有關(guān)的舌炎(Mizukawa，N.et al.，1999.Oral Dis.5139-142)。同樣，所有的陽(yáng)離子性的嗜中性粒細(xì)胞來源的AMP在超量表達(dá)的時(shí)候也引起缺鐵癥(hypoferremia)。因此抑制這些AMP分子可用來治療這類疾病。
白細(xì)胞的SLPI(分泌的白細(xì)胞蛋白酶抑制物(SLPI))在活躍的韋格內(nèi)肉芽腫中的表達(dá)看來好像是提高的，因此，抑制SLPI的活性可以用來治療韋格內(nèi)肉芽和其他類型的血管炎。
腺體的/炎性的疾病包括甲型糖尿病，乙型糖尿病，B型胰島素抵抗，Schmidt綜合癥，Cushing’s綜合癥，甲狀腺毒癥，良性前列腺增生癥，胰臟疾病，橋本甲狀腺炎，特發(fā)性腎上腺萎縮，甲狀腺功能亢進(jìn)(Graves’disease)，雄激素性脫發(fā)，甲狀腺疾病，甲狀腺炎，自發(fā)性自身免疫甲狀腺炎，特發(fā)性的黏液水腫，卵巢的自身免疫，自身免疫性的抗精液不孕，自身免疫的前列腺炎，阿狄森氏病/安迪生氏病(促腎上腺激素增多癥)和甲型多腺體自體免疫綜合征。
糖尿病是一系統(tǒng)性的疾病，伴隨多種嚴(yán)重的并發(fā)癥既影響生活品質(zhì)也影響壽命。這些并發(fā)癥之一是牙周病(牙周炎)。牙周炎不僅僅是口腔的局部感染(Iacopino，AM.，2001.Ann.Periodontol.6125-137)。當(dāng)糖尿病得到控制的時(shí)候，根尖周病和其它損傷就像在非糖尿病患者身上一樣立即痊愈(Bender，IB，Bender，AB.et al.，2003. J.Endod.29383-389)。在最近在對(duì)胰島素不敏感疾病(例如肥胖，乙型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化)的研究中發(fā)現(xiàn)它們同樣有高含量的細(xì)胞因子和發(fā)炎的跡象。目前的證據(jù)傾向于支持慢性炎癥促發(fā)慢性胰島素不敏感的觀點(diǎn)而不是相反的觀點(diǎn)(Grimble，RF.，2002.Curr.Opin.Clin.Nutr.MetabCare 5551-559)。最近的人體研究已證明高血脂和牙周炎之間存在著聯(lián)系?？赡艿脑蚴歉咂咸烟?例如糖尿病患者的高血糖)和高LDL水平(在如高糖尿病患者的身上)容易引起低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯(LDL/TRG)的升高，即使血糖水平得到很好的控制，仍會(huì)導(dǎo)致LPS-類分子的結(jié)合從而引起AMP的過量產(chǎn)生。因此，本發(fā)明可以用來治療糖尿病，和糖尿病有關(guān)的疾病如牙周，以及和糖尿病有關(guān)的愈合缺陷。
增殖性視網(wǎng)膜病是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一。發(fā)病過程包括異常血管發(fā)育而引起的可能的視網(wǎng)膜脫落和失明。LL-37和其它AMP都參與了血管增生的調(diào)控(Koczulla，R.et al.，2003.J.Clin.Invest 1111665-1672)，因此LL-37抗體和抗拮劑都可以用來阻止新形成血管的發(fā)育從而預(yù)防了和糖尿病有關(guān)的眼疾的發(fā)生。
肝的/炎性的疾病的例子包括原發(fā)性膽汁性肝硬化，慢性活動(dòng)型肝炎，狼瘡樣肝炎，自身免疫性肝炎和肝硬化。
神經(jīng)學(xué)的/炎性疾病的例子包括神經(jīng)退化性疾病，多發(fā)性硬化，老年癡呆癥，帕金森氏癥，重癥肌無(wú)力，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病，Guillain-Barre綜合征，自身免疫性神經(jīng)性病變，自身免疫的神經(jīng)病，Lambert-Eaton二氏肌無(wú)力綜合征，副腫瘤神經(jīng)病，副腫瘤小腦萎縮，非副腫瘤僵人綜合征，漸進(jìn)性小腦萎縮，Rasmussen’s氏腦炎，肌萎縮性側(cè)索硬化，Sydeham氏舞蹈病，Gilles Tourette綜合癥，自身免疫性多發(fā)性內(nèi)分泌病，dysimmune神經(jīng)性病變，獲得性神經(jīng)肌炎，多發(fā)性關(guān)節(jié)硬化癥，視神經(jīng)炎，海綿狀腦病，偏頭痛，頭疼，集束性頭痛和僵人綜合征。
在多發(fā)性硬化(MS)的情況下，防御素和乳鐵傳遞蛋白存在于腦脊液(CSF)中。這些多肽在肺炎和腦膜炎中有抗微生物的作用，并可能促發(fā)信號(hào)途徑。MS信號(hào)途徑和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的信號(hào)途徑有相似的地方，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的信號(hào)途徑中AMP存在於關(guān)節(jié)周圍的滑液中。其他參與的多肽包括IP 10，防御素和乳鐵傳遞蛋白和CAP37。
載脂蛋白E2Apo(a)基因的多態(tài)形和老年癡呆癥有直接的關(guān)系(AD；Barbier，A.et al.，1997.Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.35581-589；Compton，D.etal.，2002.Neurosci.Lett.33160-62)，而且ApoE有抗微生物的能力，因此對(duì)該分子的調(diào)節(jié)可以用于治療老年癡呆癥。雖然該多肽的其他多態(tài)形或多或少地參與老年癡呆癥的發(fā)生，但是e4卻是最活躍的。雖然e4/e4基因型的人得病風(fēng)險(xiǎn)最高，但是e2/e4或者e3/e4基因型的人物也有得病的可能。雖然攜帶APOE e4等位基因表示有得病的風(fēng)險(xiǎn)，但單單因?yàn)閿y帶e4并不能預(yù)測(cè)老年癡呆癥發(fā)生的可能性--只有40％的老年癡呆癥患者帶有e4等位基因。e4等位基因和高膽固醇吸收也有關(guān)系，而高膽固醇吸收提高血液內(nèi)的膽固醇水平。e4/e4基因型僅占西方人口的百分之1-3。西方人中e4/e4基因型的婦女得老年癡呆癥的風(fēng)險(xiǎn)比男人高60％。食用高膽固醇食物的人，如果同時(shí)是有e4等位基因的攜帶者，得冠狀動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)提高。ApoE復(fù)合體的形成可以提高可溶解的Abeta的吸收。在ApoE轉(zhuǎn)基因老鼠中LPS-引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生是由ApoE3而不是ApoE4異構(gòu)體來調(diào)控的，暗示在老年癡呆癥和在其它神經(jīng)衰退性疾病中有類似的ApoE4基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。因此本發(fā)明中對(duì)這種蛋白質(zhì)多態(tài)形的抑制物能防止或者推遲老年癡呆癥的發(fā)生(Rebeck，GW.et al.，2002.J.Alzheimers.Dis.4145-154)。ApoE4因此是一種不好的同功物/同功酶/多態(tài)形，其導(dǎo)致老年癡呆癥的位點(diǎn)可以由其多態(tài)形ApoE2和E3的類似位點(diǎn)來取代，而且ApoE2和E3不會(huì)被身體拒絕，這種辦法(把ApoE2和E3注射或用其他方法轉(zhuǎn)入體內(nèi))如果和單克隆抗體/拮抗物拮抗物一道使用，療效會(huì)更顯著。(Baum，L.et al.，2000.Microsc.Res.Tech.50278-281)。在老年癡呆癥病人而不是對(duì)照組中，腦的微循環(huán)表達(dá)肝素結(jié)合蛋白AMP CAP37，一種炎性調(diào)解物(Grammas，P.，2000.Neurobiol.Aging 21199-205)。CAP37的抗體和拮抗物因此也可用于治療老年癡呆癥(Pereira，HA.et al.，1996.Neurobiol.Aging 17753-759；Neurobiol Aging，2002，23531-6)。FPRL1是一個(gè)LL-37的受體，因此可以作為治療老年癡呆癥的藥理學(xué)上的分子靶子(Cui，Y.et al.，2002.J.Leukoc.Biol.72628-635)。LL-37在和A(beta-)多肽協(xié)同作用激活同一個(gè)G蛋白偶聯(lián)趨化物類受體-1(Le，Y.et al.，2001.J.Neurosci.21RC123)。
結(jié)締組織/炎性疾病的例子包括關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，化膿性關(guān)節(jié)炎，混合結(jié)締組織病，膽脂瘤，復(fù)發(fā)性多軟骨炎，自身免疫性肌炎，原發(fā)性Sjogren’s綜合癥，平滑肌自身免疫性疾病，肌炎，腱炎，韌帶發(fā)炎，軟骨炎，關(guān)節(jié)發(fā)炎，滑液發(fā)炎，腕管綜合癥，骨關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)直性脊柱炎，骨骼發(fā)炎，自身免疫的耳朵疾病，骨質(zhì)疏松，纖維肌痛綜合癥纖維肌痛綜合癥，牙周炎和自身免疫的內(nèi)耳疾病。
對(duì)關(guān)節(jié)炎一類的疾病，AMP分子的表達(dá)和產(chǎn)生都在健康人或發(fā)炎病人的滑膜中。沉積AMP分子，溶菌酶，乳鐵傳遞蛋白，分泌性磷脂酶A(2)(sPA2))，基質(zhì)裂解素(MMP7)人嗜中性粒細(xì)胞alpha-防御素-1，-2和-3，人beta-防御素-1和人beta-防御素-2可以通過組織免疫化學(xué)法來決定。AMP殺菌通透性增加蛋白(BPI)，肝素結(jié)合蛋白，LL37，人alpha-防御素-5，人alpha-防御素-6和人beta-防御素-1，-2，和-3的mRNA表達(dá)可以通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法進(jìn)行分析。用RT-PCR發(fā)現(xiàn)在鍵康滑膜的樣本中有CAP37和人beta-防御素-1的mRNA。而人beta-防御素-3和/或LL37 mRNA則在以下病人的滑膜樣本中被檢測(cè)出來，化膿性關(guān)節(jié)炎(PA)，骨關(guān)節(jié)炎(OA)或者類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。用組織化學(xué)免疫法已在所有的A類滑膜細(xì)胞樣品中檢測(cè)出溶菌酶，乳鐵傳遞蛋白，sPA(2)和MMP7。人beta-防御素-1僅在B類滑膜細(xì)胞的某些樣品中被檢測(cè)出來。人beta-防御素-2多肽則只在一些發(fā)炎的樣本中有免疫反應(yīng)活性。HNP1-3則在鍵康和發(fā)炎的滑膜中都被檢測(cè)出。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明人的滑膜能產(chǎn)生眾多的AMP分子。在發(fā)炎的情況下，AMP表達(dá)模式相應(yīng)變化，人beta-防御素-3在PA中(LL-37在RA中，人beta-防御素-3在OA中)被誘導(dǎo)表達(dá)，而beta-防御素-1的表達(dá)則降低(Paulsen，F(xiàn).et al.，2002.J.Pathol.198369-377；Cunliffe，RN，Mahida，YR.，2003.J Leukoc Biol.Oct 2[Epub ahead of print])。因此抑制一種或多種這些蛋白的活性將能抑制關(guān)節(jié)炎類的疾病發(fā)生。
在膽脂瘤中，混有微生物的角質(zhì)生物被膜是由AMP的過量產(chǎn)生造成的(Jung，HH.et al.，2003.Laryngoscope 113432-435；Chole，RA，F(xiàn)addis，BT.，2002Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.1281129-1133)，參與的AMP分子包括LL-37AMP或者其他防御素或者其它AMP。因此，合適的調(diào)節(jié)AMP的方法可以用來治療膽脂瘤類疾病。
炎性的/腎臟疾病的例子包括糖尿病型腎病。
高葡萄糖(例如尿病患者的高血糖癥)和高LDL水平在如高糖尿病患者的身上容易引起低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯(LDL/TRG)的升高，即使血糖水平得到很好的控制，仍會(huì)導(dǎo)致LPS-類分子的結(jié)合從而引起AMP的過量產(chǎn)生。beta-防御素-1mRNA的過量產(chǎn)生在糖尿病型的腎病中其著重要的作用(Page，RA，Malik，AN.etal.，2003.Biochem.Biophys.Res.Commun.310513-521)。防御素的細(xì)胞毒性和腎中發(fā)炎的位置有聯(lián)系，在該位置，防御素在對(duì)慢性腎小球性腎炎和腎盂腎炎的的病理發(fā)生起作用(Rebenok，AZ.et al.，1999.Ter.Arkh.7162-67)。因此抑制這類AMP可用于治療糖尿病型腎病。
炎性的/生殖系統(tǒng)的疾病的例子包括習(xí)慣性流產(chǎn)，卵巢的囊胞，或者和月經(jīng)有關(guān)的疾病。
炎性的/系統(tǒng)性的疾病的例子包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡，系統(tǒng)性硬皮病，敗血癥性休克，中毒性休克綜合癥，Reiter’s綜合癥和惡病質(zhì)。
炎性的/有傳染性疾病的例子包括獲得念珠菌病，真菌的傳染，蕈樣肉芽腫，慢性傳染性疾病，亞急性傳染性疾病，急性傳染性疾病，病毒性疾病，細(xì)菌性疾病，原生動(dòng)物引起的疾病，寄生蟲病，支原體疾病，壞疽，膿毒病，朊病毒病，流行性感冒，結(jié)核病，細(xì)菌的肺炎，瘧疾，免疫缺陷綜合癥，慢性疲憊綜合癥和嚴(yán)重急性呼吸綜合癥。
LL-37和真菌或細(xì)菌的表面蛋白LPS結(jié)合。LL-37在生理鹽水中對(duì)真菌無(wú)害(Turner，J.et al.，1998.Antimicrob.Agents Chemother.422206-2214)。同樣，并非所有AMP對(duì)假絲酵母有害。因此抑制LL-37和其他對(duì)真菌無(wú)害的AMP能用來阻礙真菌對(duì)細(xì)胞的粘附從而治療真菌性疾病。
和移植/炎性的疾病的有關(guān)的例子包括移植排斥，慢性移植排斥，亞急性移植排斥，急性移植排斥，超急性移植排斥，排斥植入物和移植物等。
植入物的例子包括，彌補(bǔ)性的/假的的植入物，隆乳，硅膠植入物，牙齒植入物，陰莖植入物，心臟植入物，人造關(guān)節(jié)，骨折修復(fù)裝置，骨頭替代植入物，藥物釋放植入物，導(dǎo)管，起搏器，顆人造心，人造心瓣膜，藥物釋放植入物，電極和呼吸器管子。
傷害/發(fā)炎的例子包括皮外傷，擦傷，撞傷，割傷，傷刺，撕裂傷，沖擊傷，震蕩，挫傷，燙傷，凍瘡，化學(xué)制品傷，曬黑，脫水，輻射傷，放射性傷，吸入煙霧，肌肉撕裂，肌肉拉傷，肌腱撕裂，肌腱拉傷，韌帶拉傷，韌帶撕裂，過度伸長(zhǎng)，軟骨拉傷，，骨折，神經(jīng)壓迫，和槍傷。
炎性的/呼吸的疾病的例子包括氣喘，過敏性的氣喘，彌漫性全細(xì)支氣管炎，氣腫，自發(fā)的肺纖維變化，囊性纖維化，流行性感冒，鼻竇炎，鼻竇炎和慢性起阻礙作用的肺的疾病。
一些文獻(xiàn)提供的證據(jù)支持本發(fā)明能用于治療例如氣喘，慢性阻礙性肺病，囊性纖維化和鼻竇炎疾病等疾病的觀點(diǎn)。發(fā)炎受AMP刺激(呼吸系統(tǒng)的上皮細(xì)胞，內(nèi)皮的細(xì)胞，支氣管，喉，腎，成纖維細(xì)胞和其它內(nèi)皮膚細(xì)胞)。此外，流感嗜血桿菌對(duì)支氣管的上皮膚細(xì)胞的粘附性受嗜中性粒細(xì)胞的防御素的刺激而增強(qiáng)。嗜中性粒細(xì)胞防御素是從被發(fā)炎所激活的嗜中性粒細(xì)胞中排出(Gorter，AD.et al.，1998.J.Infect.Dis.1781067-1074)。流感嗜血桿菌對(duì)各種上皮的，似成纖維細(xì)胞的，和內(nèi)皮的細(xì)胞類型的粘附被防御素促進(jìn)。防御素也增強(qiáng)其他病菌的粘附性，如Moraxella catarrhalis，Neisseria meningitidis和nonencapsulatedpneumonsae(Gorter，AD.et al.，2000.FEMS Immunol.Med.Microbiol.28105-111)。H.influenzae，M.catarrhalis，N.meningitidis和nonencapsulated S.pneumoniae。在囊性纖維化(CF)病人中的慢性發(fā)炎和呼吸系統(tǒng)分泌物內(nèi)的AMP水平增加有關(guān)。但是，CF氣體通路的表面液體殺菌能力被減弱。這種缺陷反映在慢性的，大量的細(xì)菌菌落的出現(xiàn)和反復(fù)被P.aeruginosa感染的肺炎上。當(dāng)CF通路表面液體的鹽濃度低于正常時(shí)，其殺菌能力得到恢復(fù)，說明有缺陷的CF跨膜的電傳導(dǎo)調(diào)節(jié)物造成異常高鹽濃度。上皮的AMP分子如人beta-防御素和組織蛋白酶抑制素的殺菌能力被高鹽濃度所抑制說明在這個(gè)天然免疫防御中的這一缺陷是造成CF病人的慢性肺部傳染的原因。在念珠菌病中，在高鹽的濃度下，AMP促進(jìn)病原體緊貼細(xì)胞表面膜從而間接提高了病原體感染力。在慢性阻礙性肺病，囊性纖維化和彌漫性泛細(xì)支氣管炎的病人膿分泌物中，防御素的濃度非常高，這也增加了傳染機(jī)會(huì)和疾病的加劇?？狗烙?1到-6的抗體因此能減少傳染和發(fā)炎。M.pneumoniae的傳染在小通氣管道中誘導(dǎo)趨化因子RANTES在通氣管道的不同水平影響慢性氣喘的發(fā)病。因此有必要抑制RANTES。這樣，抑制這些和其它AMP的表達(dá)將遏制疾病的發(fā)展并達(dá)到治愈的目的。防御素的氣管內(nèi)滴注造成急性肺發(fā)炎和肺功能障礙，這暗示在炎性肺疾病的發(fā)病機(jī)理中大量的防御素在通氣管道中扮演重要的角色(Zhang，H.et al.，2001.Am.J.Physiol Lung CellMol.Physiol 280L947-L954)。它們?cè)谀倚岳w維化，彌漫性泛支氣管炎，特異性肺纖維變化和急性呼吸衰竭綜合癥中和傳染性疾病中過量表達(dá)(Aarbiou，J.etal.，2002.Ann.Med.3496-101)。此外，除了他們的抗微生物作用以外，人嗜中性粒細(xì)胞防御素還通過調(diào)動(dòng)T細(xì)胞和樹突細(xì)胞來影響適應(yīng)性免疫力(Yang，D.et al.，2000.J.Leukoc.Biol.689-14)。
人bets-防御素-2在鼻頂部粘膜中表達(dá)，而在慢性鼻竇炎時(shí)其表達(dá)量提高(Chen，PH，F(xiàn)ang，SY.，2003.Eur.Arch.Otorhinolaryngol.Sep 18[Epub aheadof print])。因此降低人beta-防御素-2的表達(dá)量能被用來治療鼻竇炎等疾病。
炎性的/眼睛疾病包括眼睛干燥疾病，phacogenic葡萄膜炎，瞼炎和交感性眼炎。
干眼癥是一慢性炎性眼睛疾病，在絕經(jīng)期的婦女，老年人和有以下全身性疾病的病人中尤為明顯，如Sjogren’s綜合癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，狼瘡和糖尿病(37％的糖尿患者和28％帶病成年人)。防御素對(duì)T-細(xì)胞的作用和趨化因子類似(Stern，ME，et al.，2002.Invest Ophthalmol.Vis.Sci.432609-2614)。干眼癥的一個(gè)特徵是包括人beta-防御素-2在內(nèi)的AMP的表達(dá)量提高。在中度干眼病人中beta-防御素-2在結(jié)膜上皮中表達(dá)(Narayanan，S.et al.，2003.InvestOphthalmol.Vis.Sci.443795-3801)。因此抑制AMP/AML(特別人beta-防御素-2)產(chǎn)量和活動(dòng)能被用來治療例如干眼癥之類的疾病。
新生兒中毒性紅斑是健康新生皮膚發(fā)炎的常見反應(yīng)，其特點(diǎn)是傷口處聚集大量的活化的免疫細(xì)胞。它的病因和生理學(xué)重要性仍然不清楚。最近的研究表明，通過對(duì)整個(gè)表皮層的組織染色發(fā)現(xiàn)很強(qiáng)的銀屑素(psoriasin)信號(hào)(Marchini，G.et al.，2003.Pediatric Dermatology 20377-384)。因此，遏制這種蛋白質(zhì)可以達(dá)到治病目的。
大部分痤瘡活組織切片在損傷的和損傷周圍的的上皮，尤其是膿皰部位都顯示了高的防御素-2的免疫活性和不顯著的高防御素-1免疫活性(Chronnell，CMT.et al.，2001.Journal of Investigative Dermatology 1171120-1125)。
毛囊炎是一種常見皮膚疾病，臨床特征是丘疹和膿皰。近來組織免疫化學(xué)研究顯示人嗜中性粒細(xì)胞多肽(HNPs)和人betas防御素-2大量地存在於毛囊炎損傷的最表面。滲入PMN白細(xì)胞和毛囊間的膿皰中的HNPs都有免疫活性。比較起來，在受影響的毛囊的損傷周圍也有人beta-防御素-2免疫活性。人beta-防御素-2在這里的分布形式和在尋常痤瘡損傷中的分布類似(Oono，T.et al.，2003.British Journal of Dermatology 148188-191)。
AMP表達(dá)水平的提高和例如扁平苔蘚和肉樣瘤病等疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，在扁平苔蘚中，beta-防御素的水平提高，而在肉樣瘤病中，LL-37的水平提高。在新生兒中毒性紅斑的發(fā)炎的皮膚損傷中，組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)大量增加，這種增加和炎性的/有活力的嗜中性粒細(xì)胞，嗜曙紅細(xì)胞和樹突細(xì)胞有明顯聯(lián)系。
在尋常疣或者尖銳濕疣的發(fā)病過程中LL-37也大量產(chǎn)生。
疾病的例子還包括老化及和老化相關(guān)的疾病。下面的例子部分顯示了不同抗微生物多肽濃度對(duì)角質(zhì)細(xì)胞增殖/分化平衡的影響。在三維人造皮膚培養(yǎng)的模型中，人beta-防御素-2的過度表達(dá)會(huì)造成角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的無(wú)序增生。造成皮膚和其他軀體組織的衰老的原因有很多。造成皺紋和衰老的一個(gè)重要因素是膠原蛋白質(zhì)的不一致和無(wú)序的加強(qiáng)。因?yàn)槌衫w維細(xì)胞的可以在細(xì)胞間質(zhì)中產(chǎn)生膠原蛋白以增加成纖維細(xì)胞的密度，所以增加膠原蛋白的輸出可以使皮膚年輕。。如同在下面例子部分中描繪得那樣，在三維的人造皮膚培養(yǎng)中使用抗人beta-防御素-2的抗體可以降低角質(zhì)細(xì)胞的增生但增加其分化，同時(shí)提高成纖維細(xì)胞的增殖，結(jié)果產(chǎn)生一比未經(jīng)抗體處理的皮膚(正常皮膚)更緊密的和更有序的皮膚。角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞也比未經(jīng)處理的皮膚更加有序，而且其有正常上皮厚度的皮膚面積也得到擴(kuò)大。下面結(jié)果數(shù)據(jù)顯示AMP控制分化/增殖平衡，并在控制分化/增殖平衡時(shí)，它們的濃度的水平?jīng)Q定細(xì)胞的有序程度。這個(gè)結(jié)果證明了AMP以及AMP抑制物對(duì)成纖維細(xì)胞和膠原的重要性，進(jìn)而決定角質(zhì)細(xì)胞組織的有序性，從而為皮膚的抗衰老和抗皺紋提供了療法。這一療法也應(yīng)該對(duì)很多表達(dá)AMP分子的組織有效。
和小纖維及原始小纖維結(jié)合的AMP分子也參與和年齡相關(guān)疾病的發(fā)病。就象在其他慢性炎性疾病中一樣，AMP抑制物可以防止因發(fā)炎和組織變形導(dǎo)致的糖尿病，老年癡呆癥，帕金森氏病和瘋牛病。糖尿病發(fā)生的第一時(shí)期是高胰島素水平導(dǎo)致的AMP的過量產(chǎn)生，然后是胰組織發(fā)生形態(tài)改變。這個(gè)結(jié)果導(dǎo)致胰島素全身性的降低。此外，AMP和原始小纖維的結(jié)合體和年齡有關(guān)的疾病像II型糖尿病，老年癡呆癥，帕金森氏病，瘋牛病和其它prion疾病有關(guān)系。錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚合在一起被稱作淀粉小纖維可以殺死有這樣疾病的細(xì)胞。形成成熟小纖維的更小結(jié)構(gòu)(原始小纖維)比成熟小纖維更容易穿過細(xì)胞膜，因此比小纖維更具毒性。治療的目的在於拆散這些小纖維的積累。在老年癡呆癥中，這些小纖維被稱作淀粉斑；在帕金森氏病中它們被稱作Lewy小體；在II類糖尿病中它們被稱作胰島淀粉沉積物，它們存在于胰腺中產(chǎn)生和調(diào)節(jié)胰島素的“蘭氏小島”中。II類糖尿病是最普通的和上述淀粉聚集相關(guān)的疾病之一。抑制原始小纖維的形成對(duì)預(yù)防老年疾病極為重要。有證據(jù)顯示在例如老年癡呆癥等慢性炎性疾病中AMP和淀粉斑在一起(Pereira，HA.et al.，1996.Neurobiol.Aging 17753-759)。有人假定AMP和原始小纖維形成復(fù)合體。復(fù)合體的形成需要對(duì)憎水性和靜電性的精細(xì)平衡進(jìn)行調(diào)控，因?yàn)檫@兩種平衡作用之間的任何一種都不足以大到使復(fù)合物形成。支持上述的假想的證據(jù)來自于高度陽(yáng)離子性的小蛋白質(zhì)防御素可以從小纖維中提取出來時(shí)，其中包括淀粉的A蛋白(Liepnieks，JJ.et al.，1995.Biochim.Biophys.Acta 127081-86)。同樣地，抗微生物的蛋白質(zhì)ApoE4的異構(gòu)體和老年癡呆癥的高風(fēng)險(xiǎn)有很大的關(guān)系，它是所有ApoE異構(gòu)體中陽(yáng)離子性最高的，和從ApoE2差二個(gè)電位，和ApoE3差一個(gè)電位(Mahley，RW，Rall，SC，Jr.，2000.Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.1507-537；Castano，EM.et al.，1995.J.Biol.Chem.27017610-17615)。本發(fā)明作者假設(shè)AMP(在其它特性之外高度陽(yáng)離子性和小分子多肽)作為催化劑或者是交聯(lián)劑使蛋白多糖和AA型淀粉的小纖維起作用，因?yàn)樗鼈兂⒔Y(jié)構(gòu)下之間的密切關(guān)系(Snow AD.et al.，1987.Lab Invest.57687-98)。本發(fā)明者進(jìn)一步假設(shè)復(fù)合體在發(fā)炎過程中直接或間接地形成原始小纖維，然后AMP幫助原始小纖維粘附在細(xì)胞膜上。同樣小陰離子的分子也將促進(jìn)小纖維的形成。就象小陽(yáng)離子多肽一樣，肝素和其他的氨基葡聚糖可以促成alpha-觸核蛋白(alpha-synuclein)在試管中形成淀粉的小纖維(Cohlberg JA.et al.，2002.Biochemistry 411502-11)。因此減少AMP可用于預(yù)防和年齡相關(guān)的疾病。防御素在和發(fā)炎有關(guān)的老年癡呆癥中過量表達(dá)(Hsiao-Nan et al.，Journal ofEurochemistry，2001，77，1027-1035)。在高濃度情況下，防御素，特別是alpha-防御素對(duì)人細(xì)胞是有毒性的，在老年癡呆癥，多發(fā)性硬化和糖尿病中可以導(dǎo)致細(xì)胞死。在老年癡呆癥患者中，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia)被激活，然后釋放CAP37AMP。化膿性鏈球菌分泌的蛋白質(zhì)可以抑制抗菌鏈球菌多肽因而可以使AMP失活(SIC；Inga-Maria Frick et al.，2003.J.Biol.Chem.27816561-16566)，所以能被用作治療老年癡呆癥和/其它炎性疾病。防御素粘附于補(bǔ)充蛋白(特別是C1補(bǔ)充蛋白)。這個(gè)補(bǔ)充蛋白AMP的復(fù)合體在老年癡呆癥病斑中存在(McGeer，EG.et al.，1994.FEBS Lett.356169-73)。
如上所述，阻止AMP/AML和其同源受體的結(jié)合可以被用來抑制由AMP/AML和受體結(jié)合所調(diào)控的生物過程。超過50種AMP/AMLs分子和超過20種的受體被證明參與雜疾病的發(fā)生，因此禁止正確的配體和受體結(jié)合疾病的治療極為重要。這樣的AMP/AML和其同源的受體的例子以及相應(yīng)的可被治愈的疾病列在表1中。
使用本發(fā)明的技術(shù)和方法的詳盡的指南，以及所需材料的取得可參見本領(lǐng)域的相關(guān)文獻(xiàn)(例如美國(guó)專利號(hào)20030044907)。
因此，相對(duì)于在先技術(shù)，本發(fā)明第一個(gè)提出AMP/AML和/或它們的抑制物來治療各種疾病的方法，例如牛皮癬和腫瘤，這些疾病都和細(xì)胞/組織的失調(diào)的生長(zhǎng)/分化，生長(zhǎng)/分化平衡的紊亂，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移，血管增生等生物活動(dòng)有關(guān)。
可以預(yù)料在本專利的有效期間很多有關(guān)藥物篩選技術(shù)將被研發(fā)出來，因此本專利中“鑒定復(fù)合物的方法”也涵蓋所有這些新技術(shù)。
當(dāng)本領(lǐng)域的一般的技術(shù)人員詳細(xì)審核了下述例證部分之后，他會(huì)很容易懂得本發(fā)明的目標(biāo)，優(yōu)勢(shì)及新意。另外，下面的例證也為上文所描繪的實(shí)施方案和細(xì)節(jié)，以及在下面的專利權(quán)限部分提供了實(shí)驗(yàn)的支持及指導(dǎo)。
例證以下是例證部分，這些例證和上述的描述一起以一種不受限制的形式共同闡述本發(fā)明。
通常，這里使用的以及本發(fā)明中的實(shí)驗(yàn)過程中使用的名稱包括分子的，生化的，微生物學(xué)的，和重組DNA技術(shù)。相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)這些技術(shù)有詳盡的解釋。例如Molecular CloningA laboratory Manual”Sambrook et al.，(1989)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”Volumes I-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel et al.，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley andSons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to MolecularCloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson et al.，“RecombinantDNA”，Scientific American Books，New York；Birren et al.(eds)“GenomeAnalysisA Laboratory Manual Series”，Vols.1-4，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1998)；下述文獻(xiàn)和專利也列出很多方法U.S.Pat.Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659 and 5,272,057；“CellBiologyA Laboratory Handbook”，Volumes I-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；“Current Protocols in Immunology”Volumes I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites et al.(eds)，“Basic and Clinical Immunology”(8th Edition)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds)，“SelectedMethods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；下述文獻(xiàn)和專利詳盡地描述了免疫學(xué)技術(shù)U.S.Pat.Nos.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771 and 5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait,M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.，and HigginsS.J.，eds.(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.，andHiggins S.J.，eds.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.，ed.(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A PracticalGuide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)and“Methods in Enzymology”Vol.1-317，Academic Press；“PCR ProtocolsA Guide To Methods AndApplications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak et al.，“Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；；這里詳細(xì)列出所有的參考資料，其它普通參考資料在這文件的其他地方已有提及。雖然實(shí)驗(yàn)過程是本領(lǐng)域常用的，但為方便讀者仍然列在下方。
除非另外定義，這里使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的定義和本領(lǐng)域一般技術(shù)人員普遍理解的定義一致。雖然和其中描繪相仿的方法和材料也能用在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，但最適宜的方法和材料應(yīng)以下述為最佳。
例1使用抗AMP抗體來抑制癌細(xì)胞的增殖和對(duì)物體沾附性的喪失對(duì)轉(zhuǎn)移性的惡性的皮膚癌等癌的最適的治療方法背景對(duì)轉(zhuǎn)移性的惡性癌癥，如轉(zhuǎn)移性的惡性皮膚癌尚無(wú)最好的治療辦法。最好的策略是鑒定出誘發(fā)癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)和造成對(duì)物體沾附性喪失的因子，然后找出能抑制這些因子的復(fù)合物從而達(dá)到抑制生長(zhǎng)和物體沾附性喪失的目的。在實(shí)踐中，本專利已鑒定出來操縱癌癥增生和對(duì)物體沾附性喪失的AMP分子，并證明抗AMP的抗體可以抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和對(duì)癌細(xì)胞物體沾附性喪失的抑制，所以可治愈包括惡性轉(zhuǎn)移皮膚癌在內(nèi)的癌癥，因此本發(fā)明克服了在先技術(shù)的局限性。
材料和方法抗微生物的多肽(AMP)抗微生物的多肽人beta-防御素-1和人beta-防御素-2購(gòu)自Sigma(商品號(hào)分別是D9565和D9690)。
抗體所用的人beta-防御素-2抗體是來自于山羊，使用超過98％純的重組人beta-防御素-2(GenBankACCESSION AAC33549；VERSION AAC33549.1GI3510600；DBSOURCEaccession AF040153.1)接種山羊得到多克隆抗體。然后用beta-防御素-2固定的親和層析純化抗血清。
胸苷摻入測(cè)量細(xì)胞增殖法細(xì)胞增殖通過測(cè)量[3(H)]胸苷摻入到脫氧核糖核酸來評(píng)定。在攝氏37度下細(xì)胞被[3(H)]胸苷(1微居里/mL，ICN，Irvine，CA)處理1小時(shí)。在組織培養(yǎng)以后，細(xì)胞用PBS沖洗3次，在5％三氯乙酸中室溫培養(yǎng)15分鐘后溶解在1％的tritonX-100。摻入細(xì)胞的放射性在一個(gè)Tricarb液態(tài)閃爍計(jì)數(shù)器的[3(H)]放射范圍內(nèi)被測(cè)量。每一實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)為同一試驗(yàn)條件下三個(gè)重復(fù)樣品的均值。胸苷的摻入量由每分鐘(DPM)每毫克蛋白質(zhì)的蛻變數(shù)目決定。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果惡性皮膚癌受AMP刺激而顯著增生為了調(diào)查AMP對(duì)惡性的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，表皮的人角質(zhì)細(xì)胞株被AMP長(zhǎng)期處理，然后監(jiān)測(cè)它們的增殖。這些細(xì)胞株包括永生性的(細(xì)胞株HaCaT和無(wú)性系6)，輕度惡性細(xì)胞(細(xì)胞株A-5和I-5)和高度惡性的細(xì)胞(細(xì)胞株II-4和RT-3)。如圖1所示，上皮膚細(xì)胞接觸AMP后導(dǎo)致細(xì)胞明顯增殖，和明顯的對(duì)物體沾附性的降低。這一數(shù)據(jù)清楚證明AMP可能參與皮膚癌等癌癥的發(fā)病機(jī)理中的細(xì)胞過度增生和腫瘤轉(zhuǎn)移。使用抗AMP抗體抑制皮膚癌細(xì)胞生長(zhǎng)和對(duì)物體沾附性的喪失培養(yǎng)的永生性的，中度惡性的或者高度惡性的人角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT，A-5和RT-3)在接種后，允許其沾附在培養(yǎng)皿的表面，然后用含有1.0微克/毫升的抗人beta-防御素-2抗體的培養(yǎng)基培養(yǎng)48個(gè)小時(shí)，細(xì)胞增殖由[3H])胸苷摻入測(cè)量細(xì)胞增殖法來估計(jì)。如圖2所示，惡性角質(zhì)細(xì)胞的成長(zhǎng)的被1.0微克/毫升的抗人beta-防御素-2抗體顯著抑制。抗體處理也被觀察到能顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)物體的粘附能力。這些結(jié)果因此證明抗AMP抗體處理細(xì)胞能用來治療如惡性的轉(zhuǎn)移性的皮膚癌等癌癥。
結(jié)論上面描繪的結(jié)果清楚證明AMP，如人beta-防御素-1和人beta-防御素-2參與促進(jìn)癌細(xì)胞病理性的增殖，例如惡性的轉(zhuǎn)移性的皮膚癌，而且第一個(gè)證明了能抑制AMP活性的復(fù)合物，如抗AMP抗體可以是最合適的治療如惡性轉(zhuǎn)移性的皮膚癌等癌癥的方法，。
例2使用抗AMP抗體來調(diào)節(jié)皮膚細(xì)胞增殖治療例如皮膚損傷，燒傷，和皮膚腫瘤等需要藥理性調(diào)節(jié)皮膚生長(zhǎng)的疾病的最佳療法背景對(duì)很多疾病仍然沒有最好的療法，如需要藥理性調(diào)節(jié)皮膚生長(zhǎng)的皮膚損傷和燒傷等疾病。最佳的治療策略應(yīng)該是抑制能妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的因子。如把本專利落實(shí)到實(shí)踐中，特別濃度的抗AMP抗體可以促進(jìn)和降低皮膚的生長(zhǎng)以對(duì)疾病(皮膚損傷和燒傷)達(dá)到最好的治療的能力已被證明，本發(fā)明正如下所述克服了在先技術(shù)的局限性。
材料和方法抗體所用的人beta-防御素-2抗體是來自于山羊，使用超過98％純的重組人beta-防御素-2(GenBankACCESSION AAC33549；VERSION AAC33549.1GI3510600；DBSOURCEaccession AF040153.1)接種山羊得到多克隆抗體。然后用beta-防御素-2固定的親和層析層析純化抗血清。使用的抗LL-37抗體蛋白質(zhì)是通過向兔子接種免疫37氨基酸基團(tuán)長(zhǎng)的LL-37多肽得到多克隆抗體，然后通過蛋白質(zhì)-A來純化多克隆抗體，作為抗原的LL-37多肽[其氨基酸對(duì)應(yīng)抗微生物的多肽前體蛋白質(zhì)hCAP18/人組織蛋白酶抑制素的氨基酸基團(tuán)134-170(GenBankACCESSION NP_004336；VERSION NP_004336.2 GI39753970；REFSEQaccessionNM_004345.3)]。(GenBankACCESSION NP_004336；VERSION NP_004336.2GI39753970；REFSEQaccession NM_004345.3)]胸苷摻入測(cè)量細(xì)胞增殖法細(xì)胞增殖通過測(cè)量[3(H)]胸苷摻入到脫氧核糖核酸來評(píng)定。在攝氏37度下細(xì)胞被[3(H)]胸苷(1微居里/mL，ICN，Irvine，CA)處理1小時(shí)。在組織培養(yǎng)以后，細(xì)胞用PBS沖洗3次，在5％三氯乙酸中室溫培養(yǎng)15分鐘后溶解在1％的tritonX-100。摻入細(xì)胞的放射性在一個(gè)Tricarb液態(tài)閃爍計(jì)數(shù)器的[3(H)]放射范圍內(nèi)被測(cè)量。每一實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)為同一試驗(yàn)條件下三個(gè)重復(fù)樣品的均值。胸苷的摻入量由每分鐘(DPM)每毫克蛋白質(zhì)的蛻變數(shù)目決定。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
不同濃度的抗AMP抗體促進(jìn)或降低原代角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)為了調(diào)查抗AMP抗體對(duì)原代角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，培養(yǎng)的原代角質(zhì)細(xì)胞被不同濃度的LL-37抗體處理48小時(shí)(藍(lán)柱)，濃度分別是在4(“1x”)或者20(“5x”)微克/毫升，或者用抗人beta-防御素-2抗體(黃色柱形)在1(“1x”)或者5(“5x”)微克/毫升的濃度下測(cè)量細(xì)胞增生。如圖3中所顯示，用4或者1微克/毫升的LL-37抗體或者人beta-防御素-2抗體的處理顯著誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞的增殖，然而出人意料的是，用5倍或更高濃度地處理細(xì)胞，如20或者5微克/毫升卻會(huì)導(dǎo)致角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的顯著抑制。
結(jié)論上面的結(jié)果第一次清楚證明特異性AMP抗體如抗人beta-防御素-2抗體和LL-37抗體可用于促進(jìn)或抑制皮膚生長(zhǎng)，因此可以是治療需要皮膚生長(zhǎng)的那些疾病，如皮膚損傷，燒傷等的最佳療法。
例3使用抗AMP抗體的作為治療下述疾病的最佳療法，例如和發(fā)炎，自身免疫和/或皮膚細(xì)胞/組織增殖/分化平衡紊亂有關(guān)的疾病如牛皮癬。
背景和發(fā)炎，自身免疫和/或皮膚細(xì)胞/組織增殖/分化平衡紊亂有關(guān)的疾病有很多，如牛皮癬和頭皮屑等迄今沒有合適的療法。血管增生和上皮形成在牛皮癬的皮膚中非常普遍，而且被AMP分子如LL-37所促進(jìn)(Koczulla，R.et al.，2003.J.Clin.Invest 1111665-1672；Heilborn，JD.et al.，2003.J InvestDermatol 120379-389)。最和適的治療策略應(yīng)是鑒定出造成皮膚細(xì)胞/組織增殖/分化失調(diào)的因子，然后使用能抑制該因子活力的復(fù)合物來治療疾病。但是這樣的復(fù)合物但尚待發(fā)現(xiàn)。造成牛皮癬的AMP/AML分子包括銀屑素(psoriasin)，防御素，LL-37。TACK/CCL27，CCL28，fractalkine，嗜中性粒細(xì)胞白明膠酶結(jié)合的lipocalin(NGAL)(Exp Dermatol.2002，11584-91)。因此本發(fā)明者假設(shè)抑制這些AMP/AMLs分子可以用于治療牛皮癬。在實(shí)踐上，正如下所述，本專利第一個(gè)證明了可以用AMP抗體來治療和發(fā)炎，自身免疫和/或皮膚細(xì)胞/組織增殖/分化平衡紊亂有關(guān)的疾病如牛皮癬并達(dá)到最佳治療效果，因此本發(fā)明已經(jīng)克服了在先技術(shù)的局限。
材料和方法抗微生物的多肽(AMP)抗微生物的多肽人beta-防御素-2購(gòu)自Sigma(SigmaCat.No.D9690)。
抗體所用的人beta-防御素-2抗體是來自于山羊，使用超過98％純的重組人beta-防御素-2(GenBankACCESSION AAC33549；VERSION AAC33549.1GI3510600；DBSOURCEaccession AF040153.1)接種山羊得到多克隆抗體。然后用beta-防御素-2固定的親和層析層析純化抗血清。使用的抗LL-37抗體蛋白質(zhì)是通過向兔子接種免疫37氨基酸基團(tuán)長(zhǎng)的LL-37多肽得到多克隆抗體，然后通過蛋白質(zhì)-A來純化多克隆抗體，作為抗原的LL-37多肽[其氨基酸對(duì)應(yīng)抗微生物的多肽前體蛋白質(zhì)hCAP18/人組織蛋白酶抑制素的氨基酸基團(tuán)134-170(GenBankACCESSION NP_004336；VERSION NP_004336.2GI39753970；REFSEQaccessionNM_004345.3)]。(GenBankACCESSION NP_004336；VERSION NP_004336.2GI39753970；REFSEQaccession NM_004345.3)]。
三維的人造皮膚培養(yǎng)用0.1％乙酸從大鼠尾巴的肌腱中提取天然甲類(TYPE1)膠原，然后用膠原制備類似皮層的人造皮膚培養(yǎng)。將冷凍干燥制備的膠原用0.1％乙酸再溶解成4毫克/毫升的溶液。用1倍體積的10X Hank’s鹽緩沖液混合八倍體積的冰冷的膠原溶液，然后用2M的NaOH來中和。懸浮的老鼠成纖維細(xì)胞(傳代5-8)和一倍體積的小牛胎血清(FCS)混合，然后和上述的溶液混合制成終濃度為每毫升有100,000個(gè)細(xì)胞和3.2毫克膠原的溶液。從這混合物溶液中取出2.5毫升倒進(jìn)聚碳酸酯膜濾器中(Falcon no.3501，Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)然后倒入深的6孔培養(yǎng)盤中(Becton Dickinson)，讓其在攝氏37度凝固。放置玻璃環(huán)(24毫米外徑，20毫米內(nèi)徑)到凝膠上，達(dá)到壓緊膠和向角質(zhì)細(xì)胞提供一個(gè)可供生長(zhǎng)的平的中心區(qū)域的目的。用添加了10％FCS和50毫克/毫升L-抗壞血酸(Sigma)的DMEM(Biological Industries，Israel)平衡上述凝膠。第二天，接種1,000,000個(gè)HaCaT培養(yǎng)的非惡性的人角質(zhì)細(xì)胞(2.5-3.5□105persquare centimeter)到上述的DMEM膠原培養(yǎng)基質(zhì)上。在培養(yǎng)基中浸沒以后，過夜培養(yǎng)后，培養(yǎng)物被提高到空氣培養(yǎng)液界面繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)液。
人牛皮癬損傷的體外處理用含有0.1％BSA的PBS稀釋LL-37抗體(100微克/毫升)，在一盲法試驗(yàn)中給負(fù)對(duì)照使用無(wú)抗體的緩沖液。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果抗AMP(人beta-防御素-2)抗體糾正皮膚的增殖/分化平衡紊亂一個(gè)獨(dú)一無(wú)二的三維人造皮膚共培養(yǎng)的模型被建立起來研究AMP對(duì)皮膚增殖/分化平衡紊亂的影響，并檢測(cè)抑制AMP活力對(duì)平衡紊亂糾正的可能性。原代人角質(zhì)細(xì)胞被接種在含有膠原的鼠成纖維細(xì)胞構(gòu)成的膠質(zhì)模擬皮層上。幾星期之內(nèi)，在上述生長(zhǎng)情況下，三維人造皮膚共培養(yǎng)物變得有序，和體內(nèi)皮膚組織的組織化學(xué)結(jié)構(gòu)極其相似，其中包括皮表皮層和角質(zhì)的形成。因此角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖/分化平衡是形成有序的人造皮膚共培養(yǎng)物的先決條件。任何不平衡將阻止表皮膚細(xì)胞形成成熟的完全發(fā)育的皮膚模擬物。
為了研究AMP對(duì)皮膚細(xì)胞/皮膚的生長(zhǎng)/分化平衡的影響，讓培養(yǎng)的皮膚接觸20納克/毫升的人beta-防御素-2。如圖4b所示，和未經(jīng)處理的對(duì)照(圖4a)比較，接觸beta-防御素-2的角質(zhì)細(xì)胞形成正常表皮層的能力降低。但是，用1微克/毫升的抗人beta-防御素-2抗體的處理后，出人意料的是，增殖/分化平衡紊亂得到顯著恢復(fù)，培養(yǎng)的皮膚(圖4c)顯示了正常的組織學(xué)的分化結(jié)構(gòu)。
這些清楚地暗示了可以用抗AMP抗體治療例如牛皮癬和頭皮屑等疾病，因?yàn)樗鼈兊牟∫蚝推つw細(xì)胞/組織的增殖/分化不平衡有關(guān)。同理，本發(fā)明也假定癌癥是由於外膜防御素-1((表達(dá)量降低)和防御素-2((表達(dá)量提高)的不平衡造成的永久性的細(xì)胞增殖/分化之間的平衡紊亂，因此，上述療法也適用于治療癌癥。
用抗AMP(LL-37)抗體在體內(nèi)人有效治療牛皮癬的皮膚損傷為了研究使用抗AMP抗體治療和發(fā)炎，自身免疫和/或細(xì)胞/組織生長(zhǎng)/分化不平衡有關(guān)的疾病(如牛皮癬類)的可能性，在體內(nèi)用抗AMP(LL-37)抗體處理人牛皮癬的損傷。使用盲法試驗(yàn)連續(xù)3天給牛皮癬損傷100微克/毫升的LL-37抗體，處理10小時(shí)以后開始檢測(cè)損傷的外表，持續(xù)14天。作為對(duì)照，在同樣的試驗(yàn)對(duì)象的鄰近的損傷處使用一非特異性的抗體。使用盲法試驗(yàn)10小時(shí)后，抗體溶液被收集鑒定(不顯示數(shù)據(jù))。在僅10小時(shí)以后，AMP抗體處理出人意料地造成損傷的顯著愈合。如圖5a-d所見，抗AMP抗體處理?yè)p傷三天后，發(fā)炎顯著減弱，皮屑明顯減少?？贵w處理后，療效維持(不顯示數(shù)據(jù))至少兩星期。在4個(gè)不同損傷上重復(fù)試驗(yàn)，每次都給出同樣的結(jié)果。結(jié)論和在先技術(shù)相比，上述結(jié)果第一個(gè)證明了使用抗AMP抗體來治療疾病。特別是，上述結(jié)果第一個(gè)證明了使用抗AMP抗體治療牛皮癬之類的和發(fā)炎和/或皮膚細(xì)胞/組織生長(zhǎng)/分化平衡紊亂有關(guān)疾病的最合適療法。
例4使用抗AMP抗體調(diào)節(jié)胃腸上皮膚細(xì)胞增生治療炎性腸道疾病，和幽門螺桿菌有關(guān)的和胃腸疾病，胃腸癌等和胃腸細(xì)胞過度增生有關(guān)的疾病最合適的療法。
背景炎性腸道疾病，和幽門螺桿菌有關(guān)的和胃腸疾病，胃腸癌等和失調(diào)的胃腸細(xì)胞過度增生有關(guān)的疾病，尚無(wú)最好的治療辦法。如把本發(fā)明落實(shí)到實(shí)踐中，因?yàn)榭笰MP抗體有調(diào)節(jié)胃腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，所以抗AMP抗體提供了一個(gè)治療炎性腸道疾病，和幽門螺桿菌有關(guān)的和胃腸疾病，胃腸癌等和失調(diào)的胃腸細(xì)胞過度增生有關(guān)疾病的最好的治療辦法。抗AMP抗體的上述能力被下面的實(shí)驗(yàn)所證明，因此本發(fā)明克服了在先技術(shù)的局限性。
材料和方法抗體所用的人beta-防御素-2抗體是來自于山羊，使用超過98％純的重組人beta-防御素-2(GenBankACCESSION AAC33549；VERSION AAC33549.1GI3510600；DBSOURCEaccession AF040153.1)接種山羊得到多克隆抗體。然后用beta-防御素-2固定的親和層析層析純化抗血清胸苷摻入量細(xì)胞增殖法細(xì)胞增殖通過測(cè)量[3(H)]胸苷摻入到脫氧核糖核酸來評(píng)定。在攝氏37度下細(xì)胞被[3(H)]胸苷(1微居里/mL，ICN，Irvine，CA)處理1小時(shí)。在組織培養(yǎng)以后，細(xì)胞用PBS沖洗3次，在5％三氯乙酸中室溫培養(yǎng)15分鐘后溶解在1％的tritonX-100。摻入細(xì)胞的放射性在一個(gè)Tricarb液態(tài)閃爍計(jì)數(shù)器的[3(H)]放射范圍內(nèi)被測(cè)量。每一實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)為同一試驗(yàn)條件下三個(gè)重復(fù)樣品的均值。胸苷的摻入量由每分鐘(DPM)每毫克蛋白質(zhì)的蛻變數(shù)目決定。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果胃腸上皮膚細(xì)胞增生的正或負(fù)調(diào)節(jié)明顯受抗AMP(人beta-防御素-2)抗體濃度決定為研究抗AMP抗體對(duì)胃腸上皮膚細(xì)胞增生的影響，用0.5或者1.0微克/毫升濃度的抗人beta-防御素-2抗體處理培養(yǎng)的Caco2人胃腸上皮膚細(xì)胞48個(gè)小時(shí)，細(xì)胞增生由[3(H)]胸苷摻入法來測(cè)量。出人意料的是抗體被發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)有重要影響，而且這種影響依抗體濃度而變。如圖6所示，1微克/毫升濃度的抗體對(duì)胃腸上皮膚細(xì)胞增生有抑制作用，然而0.5微克/毫升的低濃度抗體卻可以刺激細(xì)胞增生。
結(jié)論和在先技術(shù)相比，上述結(jié)果第一個(gè)清楚證明抗AMP抗體能提高或降低胃腸上皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，上述的結(jié)果為治療炎性腸道疾病，幽門螺桿菌傳染相關(guān)的疾病和胃腸癌等和胃腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)失控有關(guān)的疾病提供了合適的療法。
例5使用抗AMP抗體抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生治療固體瘤，牛皮癬，自身免疫病和內(nèi)皮的腫瘤等和內(nèi)皮的過度增生/血管生長(zhǎng)有關(guān)疾病的最佳療法。
背景對(duì)固體瘤，牛皮癬，自身免疫病和內(nèi)皮的腫瘤等和內(nèi)皮的過度增生/血管生長(zhǎng)有關(guān)疾病尚無(wú)最好的治療辦法。如把本專利落實(shí)到實(shí)踐中，因?yàn)榭笰MP抗體有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生/血管生長(zhǎng)的能力，所以抗AMP抗體提供了一個(gè)治療固體瘤，牛皮癬，自身免疫病和內(nèi)皮的腫瘤等和內(nèi)皮的過度增生/血管生長(zhǎng)和/或發(fā)炎有關(guān)疾病的最好的治療辦法?？笰MP抗體的上述能力被下面的實(shí)驗(yàn)所證明，因此本發(fā)明克服了在先技術(shù)的局限性。
材料和方法
抗體所用的人beta-防御素-2抗體是來自于山羊，使用超過98％純的重組人beta-防御素-2(GenBankACCESSION AAC33549；VERSION AAC33549.1GI3510600；DBSOURCEaccession AF040153.1)接種山羊得到多克隆抗體。然后用beta-防御素-2固定的親和層析層析純化抗血清胸苷摻入測(cè)量細(xì)胞增殖法細(xì)胞增殖通過測(cè)量[3(H)]胸苷摻入到脫氧核糖核酸來評(píng)定。在攝氏37度下細(xì)胞被[3(H)]胸苷(1微居里/mL，ICN，Irvine，CA)處理1小時(shí)。在組織培養(yǎng)以后，細(xì)胞用PBS沖洗3次，在5％三氯乙酸中室溫培養(yǎng)15分鐘后溶解在1％的tritonX-100。摻入細(xì)胞的放射性在一個(gè)Tricarb液態(tài)閃爍計(jì)數(shù)器的[3(H)]放射范圍內(nèi)被測(cè)量。每一實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)為同一試驗(yàn)條件下三個(gè)重復(fù)樣品的均值。胸苷的摻入量由每分鐘(DPM)每毫克蛋白質(zhì)的蛻變數(shù)目決定。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果抗AMP(人beta-防御素-2)抗體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增生的顯著抑制為了查明抗AMP抗體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增生的影響。0.5或者1.0微克/毫升濃度的抗人beta-防御素-2抗體被用于處理培養(yǎng)的牛原代內(nèi)皮細(xì)胞48個(gè)小時(shí)，細(xì)胞增生由[3(H)]胸苷摻入法來測(cè)量。該抗體被發(fā)現(xiàn)顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，尤其是濃度為0.5微克/毫升時(shí)，如圖7所示。
結(jié)論和在先技術(shù)相比，上述結(jié)果第一個(gè)清楚證明抗AMP抗體，如抗人beta-防御素-2抗體能顯著抑制內(nèi)皮膚細(xì)胞增生/血管生長(zhǎng)和/或發(fā)炎，因此，上述的結(jié)果為治療固體瘤，牛皮癬，自身免疫病和內(nèi)皮的腫瘤等和內(nèi)皮的過度增生/血管生長(zhǎng)和/或發(fā)炎有關(guān)疾病的最佳療法。
例子6細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白質(zhì)溶解產(chǎn)物制備細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白質(zhì)溶解產(chǎn)物制備原代人和鼠的角質(zhì)細(xì)胞或者細(xì)胞株以及人和鼠的成纖維細(xì)胞的制備和保持如同以前描繪那樣(Wertheimer，E.et al.，1993.Nat.Genet.571-73；Spravchikov，N.et al.，2001.Diabetes501627-1635)角質(zhì)細(xì)胞簡(jiǎn)單地說，新鮮提取的角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在Eagle’s培養(yǎng)基(Biological Industries，Beit Haemek，Israel)附加10％chelex處理的小牛胎血清(Biological Industries，Beit Haemek，Israel)，1％抗生素，0.05mM Ca2。在培養(yǎng)中5天以后，為了引起分化，培養(yǎng)基換成指定的Ca2+濃度(0.05mM為細(xì)胞增生階段；0.12mM為誘導(dǎo)分化，1.0mM 48個(gè)小時(shí)終端分化)處理48小時(shí)以后。48小時(shí)后，除非特別指出，細(xì)胞被刮入到裂解液中[磷酸緩沖液(PBS)含有TritonX-100，1％；乙二胺四乙酸，1mM；氟化鈉，10mM；鈉200微摩爾的原釩酸，蛋白酶抑制物混合]。以最大速度離心裂解產(chǎn)物，溶解在Triton的上層的物質(zhì)進(jìn)一步被SDS-PAGE和免疫印跡試驗(yàn)分析。如同下面描繪那樣，不溶于Triton的下層沉淀可用于細(xì)胞骨架蛋白的分析。蛋白質(zhì)濃度是通過使用一修正過的Lowry測(cè)試法(Bio-Rad DC Protein Assay Kit)來測(cè)量。
用于角分析蛋白表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備如上所述，收集不溶于Triton的下層(沉淀)放入含有beta-巰基乙醇(20％)和SDS(5％)的特別裂解液中處理30分鐘。樣品以最大的速度在一microcentrifuge中被離心30分鐘，上層溶解產(chǎn)物進(jìn)一步被SDS-PAGE和西方免疫印跡試驗(yàn)分析。
例7
趨化性測(cè)試法。
趨化性測(cè)試法。細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，T細(xì)胞，HEK293；25微升，細(xì)胞密度1.0-3.0×106細(xì)胞/毫升)RPMI培養(yǎng)基(Beit Haemek)含有0.5％BSA(SigmaAldrich)，接種96孔的ChemoTx一次性的趨化性裝置上使用5微米毛孔大小(Neuroprobe)。把被測(cè)試的試劑按十倍稀釋順序用含有或不含有0.5％BSA的RPMI稀釋放入小室的最底下的孔內(nèi)。裝置在37C和5％二氧化碳的環(huán)境下培養(yǎng)60-600分鐘，不同趨化物濃度下的細(xì)胞遷移由一倒置顯微鏡計(jì)數(shù)。
細(xì)胞(1×107/mL)懸浮在含有0.25％BSA，145mM NaCl，5mM KCl，10mMNa/MOPS，1mM CaC12，1mM MgC12，10mM葡萄糖，10mM HEPES(都來自于SigmaAldrich)pH值7.4，用2微摩爾的Fura-2-AM(Molecular Probes，Eugene，OR)在室溫下培養(yǎng)40分鐘。用含有0.25％BSA的緩沖液清洗細(xì)胞一次，然后保留在室溫。使用之前，一部分細(xì)胞(4×105)被清洗然后懸浮在2毫升含有0.05％BSA的緩沖液中，容器是一個(gè)透明攪拌小容器，溫度是37C。然后可以測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度和趨化性，操作方法可以參見(Maghazachi，AA.et al.，1997.FASEB J.11765-774)例子8牛皮癬動(dòng)物模型人牛皮癬的皮膚-SCID老鼠移植模型移植人皮膚到免疫缺損的老鼠上面(或天生地?zé)o胸腺的[裸]老鼠或者嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷[SCID]老鼠)提供了一種研究牛皮癬的方法。
SCID老鼠(CB 17系；Taconic Farms Inc.，Germantown，New York)將被用作組織受體。經(jīng)Keratom處理的組織樣品和20毫升血液從正?；蛘吲Ｆぐ_的志愿者身上得到然后切成1×1厘米的小片。涉及的主要血液成分是自然殺手細(xì)胞。二到四個(gè)老鼠的兩個(gè)側(cè)面將被移植人皮膚樣品，取決于組織的數(shù)量。將老鼠麻醉之后(鈉戊巴比妥；1.825毫每25克體重，i.p)。每一老鼠的背的兩個(gè)側(cè)面的毛被刮除。手術(shù)切除老鼠的皮，其大小將和待移植的人組織一樣。移植過來的皮膚被縫合(4-0 Dexon″S″；Davis-Geck，Manati，Puerto Rico)在老鼠的背上，并進(jìn)一步用Xeroform礦脂敷料包扎繃帶5天。在準(zhǔn)備和藥物處理的過程中，動(dòng)物都停留在一個(gè)無(wú)菌環(huán)境中。PBMC是從血液中提取的。給移植物注射供體活化的PBMC(超級(jí)抗原)可以在一些動(dòng)物中促進(jìn)或保留牛皮癬(Smith，T，Nickoloff，BJ.，1996.J.Clin.Invest 981878-1887)。
抗體篩選將在移植3到5星期之后開始。
皮屑化皮膚(fsn)老鼠模型另一個(gè)將被測(cè)驗(yàn)的模型是一個(gè)有牛皮癬表現(xiàn)型的鼠的模型，皮屑化皮膚(fsn)突變。一對(duì)有生殖力的CBy.A fsn/J老鼠從TheJackson Laboratory，Bar Harbor，ME購(gòu)得。因?yàn)閷?dǎo)致皮屑化皮膚表現(xiàn)型的遺傳缺陷仍屬未知，而且純合體突變老鼠不育，所以CBY(FSN/fsn)老鼠的后代將被用在所有實(shí)驗(yàn)中。在CBy.A背景中，5-6星期大的老鼠身上已經(jīng)可以看見紅色鱗狀皮膚損傷，這就幫助從野生型或者雜合的同窩幼崽中區(qū)分fsn/fsn老鼠。對(duì)於抗體處理研究，年齡(在絕大部分情況中同窩幼崽)在12和16星期之間的老鼠將被使用，因?yàn)橐呀?jīng)被證明表現(xiàn)型在這段時(shí)間比較穩(wěn)定。
動(dòng)物處理方法動(dòng)物將被把分成處理組(載體加檢驗(yàn)試劑)和一對(duì)照組(僅有載體)。單克隆抗體或者抑制物的使用方法可以是外用，皮內(nèi)的或者腹膜內(nèi)使用(溶于100微升PBS中)(起始濃度6毫克試劑/千克體重，依實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作相應(yīng)調(diào)整)。對(duì)照老鼠只用PBS處理。每天進(jìn)行處理，持續(xù)處理14天。
表皮厚度的鑒定在藥物處理以后，殺死老鼠，移植的人組織被摘除并固定在3％甲醛溶液中。用石蠟包埋以后，切成1到5微米厚的切片，放到顯微鏡載玻片上用蘇木和曙紅染色。使用NIH圖像軟件(National Institutes of Health，Bethesda，Maryland)測(cè)量單位厚度表皮來表示其大小。具體地說，在10X放大視野下觀察隨機(jī)選擇的切片視野。在同等放大倍數(shù)下，每一視野內(nèi)的表皮組織切片將包括相等的片段(一典型切片有三到四個(gè)片段)，然后對(duì)每一片段用NIH圖像軟件進(jìn)行定量。用這種方法對(duì)每一供體的處理組內(nèi)二到四只老鼠的兩個(gè)側(cè)面移植的多個(gè)切片進(jìn)行測(cè)量，總計(jì)100或更多個(gè)測(cè)量。外表皮區(qū)的平均值將從這些測(cè)量數(shù)據(jù)中算出。對(duì)於人牛皮癬的皮膚SCID老鼠移植模型還需要設(shè)定一個(gè)附加的對(duì)照。在移植以前，從每一供體的身上取出一小片組織，固定在3％甲醛溶液中作為零時(shí)間的樣本以備將來測(cè)量。
組織學(xué)和組織免疫化學(xué)的評(píng)定牛皮癬的其它幾項(xiàng)組織學(xué)的特徵將被測(cè)量以評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)處理的效果。這包括表皮的增生和皮層的和/或內(nèi)表皮層及淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的穿入。為了達(dá)到這目的，每一組織的5微米厚的切片用蘇木和曙紅染色后用顯微鏡觀察然后做出評(píng)定。
統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)顯著性將被二尾的學(xué)生t-檢驗(yàn)估計(jì)，當(dāng)P＜0.05時(shí)將被認(rèn)為是顯著的。此外，每一組表皮厚度的測(cè)量結(jié)果還被ANOVA以及兩組之間的比較分析。使用一混合的模型方法來分析每一組織在處理前和處理后的之間是否存在相關(guān)(或差異)。
正如廣泛認(rèn)可的那樣，本發(fā)明為了清晰起見而在不同的方案內(nèi)出現(xiàn)的術(shù)語(yǔ)，也可以組合在同一方案內(nèi)。反之亦然，為了簡(jiǎn)潔起見，同一實(shí)施方案內(nèi)的各種不同術(shù)語(yǔ)也可以放置在文中其他地方或再組合。
雖然本發(fā)明和其具體實(shí)施方案已被詳細(xì)地介紹，但很顯然對(duì)熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言可能還有更多的選擇，修改和變化。因此，本文的目的是盡量涵蓋和本專利的內(nèi)涵和范圍相關(guān)的所有可能性，各種修改和變化。此處特別說明文中所有的標(biāo)有登錄號(hào)的發(fā)表的文章，專利，專利申請(qǐng)和序列是都以完整的參考資料形式列出地，這和單獨(dú)地，特異性地列出標(biāo)有登錄號(hào)的發(fā)表的文章，專利，專利申請(qǐng)和序列沒有區(qū)別。此外，本發(fā)明中引用了參考資料不應(yīng)該被認(rèn)為是承認(rèn)這些參考資料就是相對(duì)本專利而言的在先技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種療法，該療法提供患者一種能有效降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子活性和/或水平的復(fù)合物，從而達(dá)到治療疾病的目的。
2.權(quán)利要求1中所說的療法，其中提供患者復(fù)合物是指給患者使用該復(fù)合物和/或讓該復(fù)合物在患者體內(nèi)通過基因表達(dá)起作用。
3.權(quán)利要求1中的方法，其中所說的復(fù)合物可以是(a)一種能夠結(jié)合上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的分子；(b)一種能分解上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的酶；(c)一種小型干擾RNA(siRNA)分子，該分子能夠引起上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)的降解；(d)一種脫氧核糖核酸酶(DNAzyme)，該酶能夠降解解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核酸(DNA)；(e)一種反義多核苷酸，該反義多核苷酸能夠和解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)混交；(f)一種核酶，該核酶能夠降解解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)；(g)一種類似物，該類似物具有模擬上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的功能片段，但其本身無(wú)功能；(h)一種能夠抑制上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性或配體(ligand)結(jié)合能力的分子或(i)一種能夠與解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核酸(DNA)混交的三鏈形成寡核苷酸(triplex formingoligonucleotide)。
4.權(quán)利要求3中的方法，其中所說的能夠結(jié)合上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的分子是一抗體或一抗體片段。
5.權(quán)利要求4中的方法，其中所說的抗體片段可以是一單鏈Fv，一Fab，一Fab’，或一F(ab’)2。
6.權(quán)利要求2中的方法，其中給患者使用上述復(fù)合物的有效方式是給患者的身體部位使用載有濃度為每毫升約50納克至1毫克之間的復(fù)合物的載體。
7.權(quán)利要求2中的方法，其中給患者使用上述復(fù)合物的次數(shù)應(yīng)該是2到30次，兩次用藥的間隔時(shí)間為2.4小時(shí)至30天之間，這樣會(huì)更有效。
8.權(quán)利要求2中的方法，其中給患者使用上述復(fù)合物的有效方式包括外用，鼻內(nèi)，經(jīng)皮，皮內(nèi)，口服，含服，皮下或靜脈注射，肛門用藥及吸入式用藥。
9.權(quán)利要求1中的療法，其中上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的分子可以是防御素(defensin)，組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)，陰離子多肽，疏水肽，人抗菌肽(AMP)和/或人抗菌肽類分子。
10.權(quán)利要求1中的療法，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是beta-防御素(beta-defensin)。
11.權(quán)利要求1中的療法，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是beta-防御素1，beta-防御素2或LL-37。
12.權(quán)利要求1中的療法，其中的疾病和細(xì)胞和/或/組織中的生物活動(dòng)有關(guān)，包括生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生長(zhǎng)。
13.權(quán)利要求12中的療法，其中的細(xì)胞和/或組織可以是上皮細(xì)胞和/或組織，皮膚細(xì)胞和/或組織，角質(zhì)細(xì)胞和/或組織，一胃腸細(xì)胞和/或組織或一內(nèi)皮細(xì)胞和/或組織。
14.權(quán)利要求1中的療法，其中的患者是人。
15.權(quán)利要求1中的療法，其中的疾病是可以是腫瘤，自體免疫疾病，上皮疾病，皮膚病，胃腸疾病或內(nèi)皮疾病。
16.權(quán)利要求1中的療法，其中的疾病可以是上皮腫瘤，上皮損傷，皮膚腫瘤，皮膚傷害，胃腸腫瘤，胃腸損傷，內(nèi)皮腫瘤，實(shí)體腫瘤，轉(zhuǎn)移瘤，皮膚自體免疫疾病，或惡性腫瘤。
17.權(quán)利要求1中的療法，其中的疾病是牛皮癬或皮膚癌。
18.一件產(chǎn)品，該產(chǎn)品含包裝材料及藥物部分，該產(chǎn)品經(jīng)鑒定可用于治療和細(xì)胞和/或/組織的生物活動(dòng)有關(guān)的疾??；該生物活動(dòng)可以是，生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和血管形成；藥物部分包括一合適的藥物載體和一活性成分，該活性成分是能夠降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性和/或水平的一種復(fù)合物。
19.權(quán)利要求18中的產(chǎn)品，其中的復(fù)合物可以是(a)一種能夠結(jié)合上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的分子；(b)一種能分解上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的酶；(c)一種小型干擾RNA(siRNA)分子，該分子能夠引起解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)的降解；(d)一種脫氧核糖核酸酶(DNAzyme)，該酶能夠降解解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核酸(DNA)；(e)一種反義多核苷酸，該反義多核苷酸能夠和解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)雜交；(f)一種核酶，該核酶能夠降解解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)；(g)一種類似物，該類似物至少模擬上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的功能片段，但其本身無(wú)功能；(h)一種能夠抑制上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性或配體(ligand)結(jié)合能力的分子或(i)一種能夠和解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核酸(DNA)雜交的三鏈形成寡核苷酸(triplex formingoligonucleotide)。
20.權(quán)利要求19中的產(chǎn)品，其中能夠結(jié)合上述抗菌肽分子的分子是一抗體或一抗體片段。
21.權(quán)利要求20中的產(chǎn)品，其中的抗體片段可以是一單鏈Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，和F(ab’)2。
22.權(quán)利要求18中的產(chǎn)品，其中的藥物載體已經(jīng)過篩選以有助于藥物通過以下的途徑發(fā)揮藥效外用，鼻內(nèi)，經(jīng)皮，皮內(nèi)，口服，含服，皮下或靜脈注射，肛門用藥及吸入式用藥。
23.權(quán)利要求18中的產(chǎn)品，其中藥物部分可以存在于以下形式，溶液，懸液，乳劑或凝膠。
24.權(quán)利要求18中的產(chǎn)品，其中的藥物部分經(jīng)過調(diào)配使得患者的細(xì)胞和/或組織能接觸到濃度介于每毫升約50納克至約1毫克之間的上述復(fù)合物。
25.權(quán)利要求18中的產(chǎn)品，經(jīng)過進(jìn)一步鑒定后得知，其中的藥物部分的總用藥次數(shù)應(yīng)該是在2至30次之間，兩次用藥的間隔時(shí)間為2.4小時(shí)至30天之間。
26.權(quán)利要求18中的產(chǎn)品，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是防御素(defensin)，組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)，陰離子多肽，疏水肽，人抗菌肽(AMP)和/或人抗菌肽類分子。
27.權(quán)利要求18中的產(chǎn)品，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是beta-防御素。
28.權(quán)利要求18中的產(chǎn)品，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是beta-防御素1，beta-防御素2或LL-37。
29.權(quán)利要求18中的產(chǎn)品，其中的細(xì)胞和/或組織可以是上皮細(xì)胞和/或組織，皮膚細(xì)胞和/或組織，角質(zhì)細(xì)胞和/或組織，胃腸細(xì)胞和/或組織或內(nèi)皮細(xì)胞和/或組織。
30.權(quán)利要求18中的產(chǎn)品，其中的疾病可以是腫瘤，自體免疫疾病，上皮疾病，皮膚病，胃腸疾病，內(nèi)皮疾病或一種人類疾病。
31.權(quán)利要求18中的產(chǎn)品，其中的疾病可以是上皮腫瘤，上皮損傷，皮膚腫瘤，皮膚傷害，胃腸腫瘤，胃腸損傷，內(nèi)皮腫瘤，實(shí)體腫瘤，轉(zhuǎn)移瘤，皮膚自體免疫疾病，或惡性腫瘤。
32.權(quán)利要求18，其中提到的疾病是牛皮癬或皮膚癌癥。
33.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或組織生物活動(dòng)的方法，該方法讓細(xì)胞和/或組織接觸一種能夠降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性和/或水平的復(fù)合物從而達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或組織生物活動(dòng)的目的。
34.權(quán)利要求33中的方法，其中的讓細(xì)胞和/或組織接觸所說的復(fù)合物的效果是通過提供患者上述復(fù)合物來達(dá)到效果的。
35.權(quán)利要求34中的方法，其中提供患者復(fù)合物是指給患者使用該復(fù)合物/和/或讓該復(fù)合物在患者體內(nèi)通過基因表達(dá)起作用。
36.權(quán)利要求33中的方法，其中的復(fù)合物可以是(a)一種能夠結(jié)合上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的分子；(b)一種能分解上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的酶；(c)一種小型干擾RNA(siRNA)分子，該分子能夠引起解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)的降解；(d)一種脫氧核糖核酸酶(DNAzyme)，該酶能夠降解解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核酸(DNA)；(e)一種反義多核苷酸，該反義多核苷酸能夠和解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)雜交；(f)一種核酶，該核酶能夠降解解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)；(g)一種類似物，該類似物至少模擬上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的功能片段，但其本身無(wú)功能；(h)一種能夠抑制上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性或配體(ligand)結(jié)合能力的分子或(i)一種能夠和解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核酸(DNA)雜交的三鏈形成寡核苷酸(triplex formingoligonucleotide)。
37.權(quán)利要求36中的方法，其中能夠結(jié)合上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是一抗體或一抗體片段。
38.權(quán)利要求37中的方法，其中的抗體片段可以是一單鏈Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，和F(ab’)2。
39.權(quán)利要求33的方法，其中，讓細(xì)胞和/或組織接觸上述復(fù)合物是指讓它們接觸濃度介于每毫升約50納克至約1毫克之間的該復(fù)合物。
40.權(quán)利要求33中的方法，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是防御素(defensin)，組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)，陰離子多肽，疏水肽，人抗菌肽(AMP)和/或人抗菌肽類分子。
41.權(quán)利要求33中的方法，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是beta-防御素。
42.權(quán)利要求33中的方法，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是beta-防御素1，beta-防御素2或LL-37。
43.權(quán)利要求33中的方法，其中的生物活動(dòng)可以是，生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和血管形成。
44.權(quán)利要求33中的方法，其中的細(xì)胞和/或組織可以是上皮細(xì)胞和/或組織，一皮膚細(xì)胞和/或組織，一角質(zhì)細(xì)胞和/或組織，一胃腸細(xì)胞和/或組織或一內(nèi)皮細(xì)胞和/或組織。
45.權(quán)利要求33中的方法，如其中的細(xì)胞和/或組織是惡性和/或角質(zhì)性的，而且其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)，則讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度介于每毫升約0.4至約200微克之間的上述復(fù)合物會(huì)更有效果。
46.權(quán)利要求33中的方法，如其中的細(xì)胞和/或組織是惡性和/或角質(zhì)性的，而且其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是防御素則讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度介于每毫升約0.1至約50微克微克之間的上述復(fù)合物會(huì)更有效果。
47.權(quán)利要求33中的方法，如其中的細(xì)胞和/或組織是胃腸細(xì)胞和/或組織和/或內(nèi)皮細(xì)胞和/或組織，而且其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是防御素，則讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度介于每毫升約50納克至約10微克之間的上述復(fù)合物會(huì)更有效果。
48.權(quán)利要求33中的方法，如其中的細(xì)胞和/或組織是內(nèi)皮細(xì)胞和/或組織，而且其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是防御素，則讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度介于每毫升約50納克至約10微克之間的上述復(fù)合物會(huì)更有效果。
49.權(quán)利要求33中的方法，其中的細(xì)胞和/或組織來自人體。
50.一種鑒定在細(xì)胞和/或組織內(nèi)有調(diào)節(jié)生物活動(dòng)能力的復(fù)合物的方法，該方法包括(a)讓細(xì)胞和/或組織接觸試驗(yàn)用復(fù)合物的方法，該復(fù)合物可以是(i)能夠降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性的分子；和/或(ii)上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子；和(b)評(píng)定該復(fù)合物在細(xì)胞和/或組織內(nèi)調(diào)節(jié)生物活動(dòng)能力的方法，故而可以鑒定出在細(xì)胞和/或組織內(nèi)有調(diào)節(jié)生物活動(dòng)能力的復(fù)合物。
51.權(quán)利要求50中的方法，其中的細(xì)胞和/或組織是人工培養(yǎng)的細(xì)胞和/或組織。
52.權(quán)利要求50中的方法，其中的細(xì)胞和/或組織來自人體。
53.權(quán)利要求50中的方法，其中讓細(xì)胞和/或組織接觸上述試驗(yàn)用復(fù)合物是通過提供患者該復(fù)合物來達(dá)到效果的。
54.權(quán)利要求50中的方法，其中所說的讓細(xì)胞和/或組織接觸上述試驗(yàn)用復(fù)合物是通過讓細(xì)胞和/或組織接觸能產(chǎn)生該復(fù)合物的細(xì)胞來達(dá)到效果的。
55.權(quán)利要求50中的方法，其中能產(chǎn)生上述試驗(yàn)用復(fù)合物的細(xì)胞是B細(xì)胞雜交瘤。
56.權(quán)利要求53中的方法，其中提供患者試驗(yàn)用復(fù)合物是指給患者使用該復(fù)合物和/或讓該復(fù)合物在患者的體內(nèi)通過基因表達(dá)起作用。
57.權(quán)利要求56中的方法，其中所說的給患者提供所說的試驗(yàn)用復(fù)合物的有效方式包括外用，鼻內(nèi)，經(jīng)皮，皮內(nèi)，口服，含服，皮下或靜脈注射，肛門用藥及吸入式。
58.權(quán)利要求50中的方法，其中上述試驗(yàn)用復(fù)合物是從以下材料中選出(a)一種能夠結(jié)合上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的分子；(b)一種能分解上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的酶；(c)一種小型干擾RNA(siRNA)分子，該分子能夠引起解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)的降解；(d)一種脫氧核糖核酸酶(DNAzyme)，該酶能夠降解解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核酸(DNA)；(e)一種反義多核苷酸，該反義多核苷酸能夠和解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)雜交；(f)一種核酶，該核酶能夠降解解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)；(g)一種類似物，該類似物至少模擬上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的功能片段，但其本身無(wú)功能；(h)一種能夠抑制上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的活性或配體(ligand)結(jié)合能力的分子或(i)一種能夠和解碼上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核酸(DNA)雜交的三鏈形成寡核苷酸(triplex formingoligonucleotide)。
59.權(quán)利要求58中的方法，其中能夠結(jié)合上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的分子是一抗體或一抗體片段。
60.權(quán)利要求59中的方法，其中的抗體片段可以是一單鏈Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，和F(ab’)2。
61.權(quán)利要求50中的方法，其中上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是防御素(defensin)，組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)，陰離子多肽，疏水肽，人抗菌肽(AMP)和/或人抗菌肽類分子。
62.權(quán)利要求50中的方法，其中上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是beta-防御素。
63.權(quán)利要求50中的方法，其中所說的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是beta-防御素1，beta-防御素2或LL-37。
64.權(quán)利要求50中的方法，其中所說細(xì)胞和/或組織是可以是上皮細(xì)胞和/或組織，皮膚細(xì)胞和/或組織，角質(zhì)細(xì)胞和/或組織，胃腸細(xì)胞和/或組織或內(nèi)皮細(xì)胞和/或組織。
65.權(quán)利要求50中的方法，其中的生物活動(dòng)可以是，生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移或血管形成。
66.一種治療患者的療法，該法提供患者足夠療效的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子，從而達(dá)到治療的目的。
67.權(quán)利要求66中的方法，其中提供患者抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是指給患者使用該類物質(zhì)和/或讓該類物質(zhì)在患者體內(nèi)通過基因表達(dá)起作用。
68.權(quán)利要求67中的方法，其中給患者提供上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的是指給患者的身體部位使用帶有濃度在每毫升約2納克至10微克的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的載體來達(dá)到效果的。
69.權(quán)利要求66中的方法，其中提供患者上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子的有效方式包括外用，鼻內(nèi)，經(jīng)皮，皮內(nèi)，口服，含服，皮下或靜脈注射，肛門用藥及吸入式用藥。
70.權(quán)利要求66中的方法，其中抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是防御素(defensin)，組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)，陰離子多肽，疏水肽，人抗菌肽(AMP)和/或人抗菌肽類分子。
71.權(quán)利要求66中的方法，其中抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是beta-防御素。
72.權(quán)利要求66中的方法，其中抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是beta-防御素1，beta-防御素2或LL-37。
73.權(quán)利要求66中的方法，其中的患者是人。
74.權(quán)利要求66中的方法，其中的疾病和細(xì)胞和/或/組織中的生物活動(dòng)有關(guān)，比如生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生長(zhǎng)。
75.權(quán)利要求74中的方法，其中的細(xì)胞和/或組織可以是上皮細(xì)胞和/或組織，皮膚細(xì)胞和/或組織，角質(zhì)細(xì)胞和/或組織，胃腸細(xì)胞和/或組織或腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞和/或組織。
76.權(quán)利要求66中的方法，其中的疾病可以是腫瘤，上皮疾病，皮膚病，胃腸疾病和內(nèi)皮疾病。
77.權(quán)利要求66中的方法，其中的疾病是可以是上皮腫瘤，上皮損傷，皮膚腫瘤，皮膚傷害，胃腸腫瘤，胃腸損傷，內(nèi)皮腫瘤，實(shí)體腫瘤，轉(zhuǎn)移瘤，皮膚自體免疫疾病及惡性腫瘤。
78.一件產(chǎn)品，該產(chǎn)品含包裝材料及藥物部分，該產(chǎn)品經(jīng)鑒定可用于治療和細(xì)胞和/或/組織的生物活動(dòng)有關(guān)的疾病；該生物活動(dòng)可以是，生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎，腫瘤轉(zhuǎn)移和血管形成；藥物部分包括一合適的藥物載體及作為活性成分的一種抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子。
79.權(quán)利要求78中的產(chǎn)品，其中的藥物載體已經(jīng)過篩選以有助于藥物通過以下的途徑發(fā)揮藥效外用，鼻內(nèi)，經(jīng)皮，皮內(nèi)，口服，含服，皮下或靜脈注射，肛門用藥及吸入式用藥。
80.權(quán)利要求78中的產(chǎn)品，其中藥物部分可以存在于以下形式，溶液，懸液，乳劑或凝膠。
81.權(quán)利要求78中的產(chǎn)品，其中的藥物部分經(jīng)過調(diào)配從而使患者的細(xì)胞和/或組織能接觸到濃度介于每毫升約2納克至約1微克之間的上述復(fù)合物。
82.權(quán)利要求78中的產(chǎn)品，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是防御素(defensin)，組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)，陰離子多肽，疏水肽，人抗菌肽(AMP)和/或人抗菌肽類分子。
83.權(quán)利要求78中的產(chǎn)品，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是beta-防御素。
84.權(quán)利要求78中的產(chǎn)品，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是beta-防御素1，beta-防御素2或LL-37。
85.權(quán)利要求78中的產(chǎn)品，其中的細(xì)胞和/或組織可以是上皮細(xì)胞和/或組織，皮膚細(xì)胞和/或組織，角質(zhì)細(xì)胞和/或組織，胃腸細(xì)胞和/或組織或腫瘤細(xì)胞和/或組織。
86.權(quán)利要求78中的產(chǎn)品，其中的疾病可以是腫瘤，上皮疾病，皮膚病，胃腸疾病或內(nèi)皮疾病。
87.權(quán)利要求78中的產(chǎn)品，其中的疾病是可以是上皮腫瘤，上皮損傷，皮膚腫瘤，皮膚傷害，胃腸腫瘤，胃腸損傷及惡性腫瘤。
88.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或組織生物活動(dòng)的方法，該方法讓細(xì)胞和/或組織接觸一種抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子，以達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或組織生物活動(dòng)的目的。
89.權(quán)利要求88中的方法，其中讓細(xì)胞和/或組織接觸上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是指提供患者該抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子。
90.權(quán)利要求89中的方法，其中提供患者抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是指給該患者使用該類物質(zhì)或讓該類物質(zhì)在患者體內(nèi)通過基因表達(dá)起作用。
91.權(quán)利要求88中的方法，其中讓細(xì)胞和/或組織接觸上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是通過讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度約每毫升2納克到約10微克的該抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子來達(dá)到效果的。
92.權(quán)利要求88中的方法，其中抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是防御素(defensin)，組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)，陰離子多肽，疏水肽，人抗菌肽(AMP)和/或人抗菌肽類分子。
93.權(quán)利要求88中的方法，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是beta-防御素。
94.權(quán)利要求88中的方法，其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子可以是beta-防御素1，beta-防御素2或LL-37。
95.權(quán)利要求88中的方法，其中的細(xì)胞和/或組織可以是上皮細(xì)胞和/或組織，皮膚細(xì)胞和/或組織，角質(zhì)細(xì)胞和/或組織或腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞和/或組織。
96.權(quán)利要求88中的方法，其中的生物活動(dòng)可以是生長(zhǎng)，分化，發(fā)炎或血管形成。
97.權(quán)利要求88中的方法，如其中的細(xì)胞和/或組織是惡性的，而且其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是防御素，則讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度范圍約每毫升0.1微克到約10微克的上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子會(huì)更有效果。
98.權(quán)利要求88中的方法，如其中的細(xì)胞和/或組織是角質(zhì)細(xì)胞和/或組織，而且其中的抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子是防御素，則讓細(xì)胞和/或組織接觸濃度范圍每毫升約2納克到約10微克的上述抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子會(huì)更有效果。
99.權(quán)利要求88中的方法，其中的細(xì)胞和/或組織來自人體。
全文摘要
一種用抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子抑制劑治病的方法。該法提供患者足夠療效的一種能夠降低抗菌肽(AMP)和/或抗菌肽類分子活性和/或水平的復(fù)合物，從而達(dá)到治療疾病的目的。
文檔編號(hào)A01N43/02GK1729014SQ200380105021
公開日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2003年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者希爾曼·伊茲查克 申請(qǐng)人:希爾曼·伊茲查克