一種同步檢測赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的免疫層析試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于免疫層析分析檢測技術領域，設及食品安全檢測相關的免疫層析檢測技術，具體涉及一種同步檢測赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的免疫層析試紙條。
【背景技術】
[0002]霉菌毒素是糧食或飼料中霉菌生長產生的次級代謝物，在糧食或飼料生產過程中，由于溫度、濕度等環(huán)境因素的影響，可能為霉菌的生長繁殖提供適宜條件，從而引起霉菌毒素的污染。赭曲霉毒素和玉米赤霉稀酮是糧食飼料中常見的霉菌毒素。赭曲霉毒素(Ochratoxins)是一組結構類似的霉菌毒素，有A、B、C、D 4種化合物，主要危及人和動物腎臟，其中毒性最大、與人類健康關系最密切、產毒量最高、對農作物的污染最重、分布最廣的是赭曲霉毒素A (Ochratoxin Α，0ΤΑ)。赭曲霉毒素A已被國際癌癥研宄機構(LARC)確定為II B類致癌物(可能引起人類癌癥的物質)的一種霉菌毒素，它能致癌、致畸、致突變、破壞免疫系統(tǒng)，對肝、腎臟造成損害，還可導致神經中毒。玉米赤霉烯酮(Zearaleaone)是玉米赤霉菌的代謝產物，具有雌激素樣作用，具有較強的生殖毒性和致畸作用，可引起動物發(fā)生雌激素亢進癥，導致動物不孕或流產，對家禽、豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來很大的經濟損失。鑒于這兩種霉菌毒素的危害作用，世界各國對糧食、飼料中這兩種霉菌毒素的含量進行了嚴格限定。
[0003]目前糧食、飼料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量的檢測方法主要采用薄層色譜法，免疫分析法及精密儀器分析法。薄層色譜法作為標準方法雖然被廣泛使用沿用至今，雖不需要特殊的儀器設備，在一般實驗室即可進行，但檢測試劑用量大、操作繁瑣、干擾嚴重、準確性差、靈敏度較低、不能準確定量，對實驗人員和周圍環(huán)境污染危害較大；精密儀器分析法主要有高效液相色譜法、超高效液相色譜法和液質聯(lián)用法，雖然可以精確地進行定性、定量分析，但是由于其設備昂貴、操作復雜和對樣品的純度有較高的要求，需要專業(yè)的操作人員，導致檢測成本高、周期長，無法滿足大批量樣本快速篩查的需要，難以實現(xiàn)快速檢測。免疫分析法主要有酶聯(lián)免疫分析法和膠體金免疫層析法，具有快速、靈敏、操作簡單等優(yōu)點，近年來獲得了快速發(fā)展。然而現(xiàn)有用于霉菌毒素檢測的免疫層析試紙條大都主要只能檢測一種霉菌毒素。而受生產條件影響，我國的同一農產品受多種霉菌毒素污染的可能性大，因此迫切需要能快速、同步檢測多種霉菌毒素的產品。
【實用新型內容】
[0004]本實用新型針對糧食、飼料等樣品中的赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量檢測展開研宄，提供一種具有快速、操作簡單、特異性強、靈敏度高、不需要額外設備等特點，可用于現(xiàn)場快速同步檢測赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量的膠體金免疫檢測試紙條。
[0005]試紙條應用競爭抑制免疫層析原理，通過檢測區(qū)的抗原和金標墊上的金標抗體反應，以檢測區(qū)是否顯色來反應樣品中的赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量是否超標。
[0006]本試紙條由依次黏貼在背襯上的樣品墊、膠體金結合墊、反應膜和吸水墊組成。其中樣品墊、膠體金結合墊、反應膜和吸水墊在相鄰的地方有不同程度的重疊，以保證層析作用從樣品墊到吸水墊的順利進行，使樣品溶液中的有效成分、反應膜上的檢測區(qū)及質控區(qū)與膠體金結合墊上的膠體金單抗偶聯(lián)物順利發(fā)生反應。
[0007]本實用新型試紙條的各組成成分與功能如下:
[0008]背襯:為一面涂有不干膠的不吸水材料，常用PVC板，用于固定試紙條其他組分；
[0009]樣品墊:用玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液，緩沖樣品溶液pH值的作用
[0010]膠體金結合墊:使用聚酯膜或玻璃纖維素膜制成，上有抗赭曲霉毒素A單抗及抗玉米赤霉烯酮單抗與膠體金的偶聯(lián)物，作用為樣品液中的抗原與金標抗體反應的起始場所；
[0011]反應膜:使用硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向依次噴有赭曲霉毒素A—牛血清白蛋白偶聯(lián)物、玉米赤霉烯酮一牛血清白蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠抗體，分別作為檢測線和質控線用于標記檢測線和質控線，將反應結果以肉眼可見的顏色表現(xiàn)出來；
[0012]吸水墊:由吸水紙制成，用于吸收多余的溶液使其不影響最終結果。
[0013]本實用新型試紙條具有如下有益效果:
[0014]( I)特異性好。本實用新型試紙條使用的是分別針對赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的單克隆抗體。
[0015](2)靈敏度高。本實用新型試紙條的最低檢測限赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮分別為5 μ g/kg和10 μ g/kg，滿足國家標準中對糧食、飼料等樣品中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的限量要求。
[0016](3)操作簡單快速。本實用新型試劑板將實驗所需的大部分原料都已整合到試紙條上，不存在試劑配制、洗滌分離等操作，滴加樣品提取液后3-5分鐘即可肉眼讀取結果，且樣品前處理方法簡單。
【附圖說明】
[0017]圖1為試紙條結構示意圖。其中I為樣品墊，2為膠體金結合墊，3為反應膜，4為赭曲霉毒素A檢測線，5為玉米赤霉烯酮檢測線，6為質控線，7為背襯，8為吸水墊。
[0018]圖2為試紙條結果判定示意圖。2-1表示赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮都為陰性；2-2表示赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮都為陽性；2-3表示赭曲霉毒素A為陽性、玉米赤霉烯酮為陰性；2-4表示赭曲霉毒素A為陰性、玉米赤霉烯酮為陽性；2-5、2-6、2-7、2-8表示試紙條無效。
【具體實施方式】
[0019]本實用新型試劑板的制備包括赭曲霉毒素A免疫原的制備、抗赭曲霉毒素A單克隆抗體制備、玉米赤霉稀酮免疫原的制備、抗玉米赤霉稀酮單克隆抗體制備、膠體金溶液制備、膠體金標記抗赭曲霉毒素A單抗的制備，膠體金標記抗玉米赤霉烯酮單抗的制備，試紙條的組裝。
[0020]1、赭曲霉毒素A免疫原(OTA-BSA)制備
[0021]1.1稱取1mg BSA溶解在2ml的20mM pH7.4的PBS溶液中，完全溶解。
[0022]1.2稱取Img赭曲霉毒素A溶于0.2ml四氫呋喃中，加入5 mg DCC和4 mg NHS,室溫下反應2小時。
[0023]1.3將上述反應溶液滴加入BSA溶液中，室溫下反應4小時。
[0024]1.4將上述反應溶液裝入透析袋中，用20mM pH7.4 PBS溶液透析，4°C透析三天，期間每8小時換一次透析液。
[0025]1.5取出透析后的溶液，離心，取上清，_20°C保存。
[0026]2、抗赭曲霉毒素A單克隆抗體制備
[0027]2.1小鼠免疫
[0028]將制備好的赭曲霉毒素A免疫原，按體積比1:1加入佐劑混勻乳化，按蛋白濃度100 μ g/只腹部皮下多點免疫BALB/c小鼠，首免免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，二免及以后以免疫元和弗氏不完全佐劑等體積混勻，首免3周后，以同樣方法進行二次免疫，二免后每兩2周免疫一次，三免后檢測小鼠血清效價，血清效價合格后進行融合，融合前3天再追加免疫一次。
[0029]2.2細胞融合
[0030]按照常規(guī)方法，準備好處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)和提取免疫小鼠的脾細胞，將小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞混合，然后在I分鐘左右時間內(最佳時間為45秒)緩慢加入預熱的融合劑(PEG4000)進行融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細胞，培養(yǎng)十96孔培養(yǎng)板，于37°C 5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后用HT培養(yǎng)基半換液，9天的時候進行全換液。
[0031]2.3雜交瘤細胞的篩選
[0032]細胞融合后，待細胞長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。采用間接非競爭ELISA方法初選，檢測細胞培養(yǎng)上清液，檢測為陽性的孔，立即用有限稀釋法進行亞克隆化。
[0033]2.4雜交瘤細胞的凍存
[0034]將進行了 2-3次亞克隆后的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)后用含25%血清、10% DMSO的基礎細胞培養(yǎng)液凍存，濃度為16-1O7左右/ml。
[0035]2.5單克隆抗體腹水制備
[0036]復蘇凍存的雜交瘤細胞，擴大培養(yǎng)。取8-10周齡BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml/只，7-10日后腹腔注射雜交瘤