一種檢測(cè)雜色曲霉毒素的快速檢測(cè)試劑板的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明是一項(xiàng)檢測(cè)雜色曲霉毒素的快速檢測(cè)試劑板的制備方法，主要由上下兩塊塑料卡殼，試紙條組成。其中，試紙條的底層為支撐層。中間層為吸附層，固定在支撐層上；外層為保護(hù)層，固定在吸附層上，吸附層從測(cè)試樣品端依次為纖維層，吸附偶聯(lián)雜色曲霉毒素的金標(biāo)載體蛋白纖維層，纖維素膜層，手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上有用雜色曲霉毒素的載體蛋白溶液劃的檢測(cè)印跡，稱(chēng)T線，用羊抗兔抗抗體溶液劃對(duì)照印跡，稱(chēng)C線。最后的測(cè)試結(jié)果由C線和T線所顯的顏色判斷。本產(chǎn)品具有成本低，方法快速、簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種檢測(cè)雜色曲霉毒素的快速檢測(cè)試劑板的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)糧食作物如大麥、小麥、玉米，餅柏、豆餅、花生餅和常見(jiàn)飼草、麥秸和稻草等是否被雜色曲霉毒素污然。
【背景技術(shù)】
[0002]雜色曲霉素(ST)主要是雜色曲霉和構(gòu)巢曲霉的最終代謝產(chǎn)物，同時(shí)又是黃曲霉和寄生曲霉合成黃血霉毒素過(guò)程后期的中間產(chǎn)物。據(jù)報(bào)道，感染了雜色曲霉的玉米在27°C的環(huán)境下，21天可產(chǎn)生雜色曲霉毒素12 g/kg以上。雜色曲霉毒素在1954年由雜色曲霉培養(yǎng)物中首先分離出的，但并未引起人們的足夠重視，至發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素的強(qiáng)致癌性后，才開(kāi)始注意。用14?標(biāo)記方法已證實(shí)雜色曲霉毒素能轉(zhuǎn)變成黃曲霉毒素馬，而且有人認(rèn)為雜色曲霉毒素可能是非洲某些地區(qū)肝癌的病因。
[0003]能產(chǎn)生ST的菌種主要是雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉和離蠕孢霉。此外，謝瓦曲霉、赤曲霉、焦曲霉、阿姆斯特丹曲霉、黃褐曲霉、四脊曲霉、變色曲霉、爪曲霉、毛殼霉及黃曲霉和寄生曲霉等也可產(chǎn)生ST。上述這些霉菌廣泛存在于自然界，可污染大麥、小麥、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等糧食、食品和飼草，尤其對(duì)小麥、玉米、花生等飼料和飼草污染更為嚴(yán)重。產(chǎn)毒量最高的是雜色曲霉，其次是構(gòu)巢曲霉和離蠕孢霉，前者產(chǎn)生ST的量約為后者的2倍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是一項(xiàng)針對(duì)糧食中的雜色曲霉毒素所開(kāi)展研究，目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性強(qiáng)，靈敏度高，且操作簡(jiǎn)單方便，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩選雜色曲霉毒素陽(yáng)性樣本，只需對(duì)樣品經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理即可檢測(cè)的雜色曲霉毒素快速試紙定量檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明所制作的免疫膠體金檢測(cè)試劑板由本產(chǎn)品主要由上下兩塊塑料卡殼,試紙條組成。試紙條包含樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜、吸水紙。NC膜上劃有檢測(cè)線(T線)，質(zhì)控線(C線)。試劑條上依次緊密粘貼著樣品墊、金標(biāo)墊，NC膜和吸水紙。其中樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水紙相鄰之間有2 mm的重疊。其作用有兩方面:第一是為了使樣品溶液和樣品墊之間有充分的反應(yīng)時(shí)間，樣品墊上的緩沖體系可以中和樣品溶液的酸堿度，保證樣品溶液中的有效成分與金標(biāo)墊上的抗體順利結(jié)合；另一方面是為了讓樣品溶液順利通過(guò)NC膜的孔，一直延展到吸水紙；金標(biāo)墊上包被有抗雜色曲霉毒素抗體與膠體金的結(jié)合物，檢測(cè)線和質(zhì)控線上分別劃有雜色曲霉毒素載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗兔抗抗體。
[0006]本發(fā)明所制備的快速檢測(cè)試劑板應(yīng)用層析式抗體免疫競(jìng)爭(zhēng)原理，通過(guò)抗原和金標(biāo)墊上的抗體反應(yīng)顯色，快速的檢測(cè)糧食中的雜色曲霉毒殘留。若是樣品溶液中含有雜色曲霉毒素，雜色曲霉毒素先和金標(biāo)墊上的抗體先結(jié)合，直至擴(kuò)散到檢測(cè)線。因?yàn)榻饦?biāo)墊上的抗體活性位點(diǎn)因被樣品溶液中的雜色曲霉毒素載體蛋白偶聯(lián)物占據(jù)而無(wú)法與檢測(cè)線上雜色曲霉毒素特異性抗原結(jié)合。當(dāng)樣品中的雜色曲霉毒素含量超過(guò)試劑板檢出限時(shí)，試劑板上的檢測(cè)線顯色比質(zhì)控線顯色淺甚至不顯色，此時(shí)結(jié)果為陽(yáng)性。反之，當(dāng)樣品中雜色曲霉毒素含量在試劑板檢出限以下或無(wú)殘留時(shí)，試劑板上的檢測(cè)線顯色與控制線相近或偏深，判定為陰性。
[0007]本發(fā)明制備的免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板，試劑板的各部分組成成分與功能如下:
1、塑料卡殼:起固定試紙條及標(biāo)示功能區(qū)，顯示加樣孔，標(biāo)示檢測(cè)線、質(zhì)控線；
2、試紙條為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙和其他配件；
3、樣品墊由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液與緩沖樣品溶液的作用；
4、金標(biāo)墊由玻纖制成，其上標(biāo)記有抗雜色曲霉毒素抗體與膠體金的結(jié)合物，是樣品溶液中的有效成分與金標(biāo)抗體發(fā)生反應(yīng)的場(chǎng)所；
5、NC膜部分主要作用是將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見(jiàn)的顏色表征出來(lái)；
6、吸水紙為較厚的濾紙，其作用是將移動(dòng)上來(lái)的多余的溶液吸收。
[0008]本發(fā)明試劑板具有如下有益效果:
(1)特異性好。本發(fā)明試劑板的抗雜色曲霉毒素抗體對(duì)雜色曲霉毒素的交叉反應(yīng)率均為100%，與其他種類(lèi)的抗生素沒(méi)有交叉反應(yīng)；
(2)操作簡(jiǎn)便快速。本發(fā)明試劑板將免疫層析反應(yīng)所需的大部分原料已整合到試劑條中，滴樣后抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，大大縮短了檢樣時(shí)間，滴樣后5-8分鐘內(nèi)即可讀取結(jié)果。本發(fā)明試劑板的操作不需任何專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，普通人員均可操作，只需按說(shuō)明滴樣后用肉眼判讀即可；
(3)不依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)設(shè)備。本發(fā)明試劑板在直接滴樣跑板后，通過(guò)肉眼判斷NC膜上檢測(cè)線和質(zhì)控線的顏色深淺對(duì)比來(lái)判讀結(jié)果，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程無(wú)需用到任何實(shí)驗(yàn)設(shè)備，適合于野外及現(xiàn)場(chǎng)操作，易于推廣；
(4)成本低,效益好。本發(fā)明試劑板生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單,可實(shí)現(xiàn)單個(gè)樣本檢測(cè),生產(chǎn)成本低，大大降低了檢測(cè)費(fèi)用。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]附圖1為本發(fā)明檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖:
圖中I為樣液吸收部分2為膠體金標(biāo)記部分3為檢測(cè)反應(yīng)部分4為檢測(cè)線5為參考線6為吸水部分。
[0010]附圖2為本發(fā)明試紙條的結(jié)果判讀圖。
[0011]【具體實(shí)施方式】
1.膠體金溶液的制備
所需膠體金顆粒的平均大小為30 nm，其制備方法為:制備I L，量取超純水900 mL于錐形燒瓶中，加熱至沸騰。再加入20 mL HAuCl4溶液，加熱至激烈沸騰后又加入20 mL檸檬酸鈉溶液等顏色轉(zhuǎn)成紅色后再繼續(xù)加熱15 min，冷卻至室溫后用超純水定容至I L，放入4 °C冰箱保存。
[0012]2.金標(biāo)墊的制備
取已制備好的膠體金溶液100 mL，用0.1 moL/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8.0。邊攪拌邊加入2 mg抗雜色曲霉毒素單抗,攪拌20 min, 20000 r/m離心15 min,棄上清液,加入10 mLP H 7.4的PBS緩沖液清洗2次。將沉淀用10 mL含2 % BSA的PBS緩沖液(pH 7.4)溶解,用0.22 Mm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0013]3.雜色曲霉毒素-BSA偶聯(lián)物的制備，雜色曲霉毒素抗體的制備
(1)雜色曲霉毒素與載體蛋白的偶聯(lián)
采用碳二亞胺(EDC-HCl)法將雜色曲霉毒素與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫抗原及包被抗原。稱(chēng)取20 mgBSA,加入I mL蒸懼水。另外用I mL蒸懼水溶解20 mg EDC-HCl和20 mg雜色曲霉毒素，加入到上述溶液中。將溶液混勻后，置于4°C下避光反應(yīng)12 h(期間可顛倒混勻)。之后用PBS緩沖液透析4天，期間每間隔8小時(shí)換液I次。再將溶液離心，收集上清液，-20°C下凍存?zhèn)溆茫?br> (2)雜色曲霉毒素抗體的制備
取6-8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的雜色曲霉毒素-BSA偶聯(lián)物與等體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 ug/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強(qiáng)免疫I次，用不完全佐劑腹腔注射。融合前3d強(qiáng)化免疫I次，不用佐劑，劑量加倍。
[0014]細(xì)胞融合按常規(guī)方法進(jìn)行:
將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1:10的比例混合，在50 % PEG作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初篩選擇10 mg/L雜色曲霉毒素載體蛋白(BSA)偶聯(lián)物包被酶聯(lián)板，被測(cè)孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠人工IgG-1RP (1:1000)，OPD顯色。篩選出的陽(yáng)性孔再用雜色曲霉毒素-BSA包被的酶聯(lián)板進(jìn)行阻斷間接ELISA。將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2X 10_3 moL/L雜色曲霉毒素溶液等量混合，37°C感作I h，加入已包被的酶標(biāo)板中。另外用PBS (0.01 moL/L，pH7.4)替代雜色曲霉毒素溶液作對(duì)照，其余步驟同上。若雜色曲霉毒素阻斷后的OD值降至對(duì)照孔的50%以下，則判為陽(yáng)性孔。經(jīng)2-3次檢測(cè)都呈陽(yáng)性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。
[0015]體外培養(yǎng):將克隆化的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)5 X IO5 mL時(shí)停止換液，細(xì)胞全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內(nèi)誘生腹水:給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細(xì)胞株10個(gè)細(xì)胞，7天后抽取腹水。
[0016]4.雜色曲霉毒素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的組裝
用劃膜機(jī)把適當(dāng)濃度的雜色曲霉毒素載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗兔抗抗體在NC膜上，分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，37°C烘箱干燥8 h。檢測(cè)試劑組成為一個(gè)PVC試紙條，在其上按順序粘上樣品墊、金標(biāo)墊、N C膜和吸水紙。用切割機(jī)將貼好的試紙板切割成4 mm寬的條，裝入塑料卡殼中制成檢測(cè)試劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲(chǔ)存。
[0017]5.雜色曲霉毒素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板檢測(cè)實(shí)施操作方法
(I)樣品處理
(a)直接提取法
將飼料、谷物、麥芽樣品進(jìn)行粉碎以使75%的樣品可以通過(guò)20目篩，樣品的大小顆粒與速溶咖啡相當(dāng)。稱(chēng)取3.0 g粉碎好的樣品，加入9 mL樣品提取液(提取液配制:50 mL甲醇+50 mL水，加4 g氯化鈉混勻即得樣品提取液，可按需配置)，充分?jǐn)嚢杌旌?10 min)，靜置20 min后輕輕吸取上清液，按1:1比例與樣本稀釋液混合均勻后進(jìn)行樣品檢測(cè)；
(b)烘干/吹干處理法 將飼料、谷物、麥芽樣品進(jìn)行粉碎以使75%的樣品可以通過(guò)20目篩，樣品的大小顆粒與速溶咖啡相當(dāng)。稱(chēng)取3.0 g粉碎好的樣品，加入9 mL樣品提取液(提取液配制:先用20 mL水將加4 g氯化鈉溶解，再加入80 mL甲醇，即得樣品提取液，可按需配置)，充分?jǐn)嚢杌旌?3分鐘)，靜置20分鐘，輕輕吸取上清液I mL，放于110°C烘箱中烘干(約I h)，用0.5 mL10%甲醇充分溶解后即可進(jìn)行樣品檢測(cè)。
[0018](2)檢測(cè)步驟
用一次性吸管緩慢垂直滴加2滴樣本(約50 ML)于加樣孔，加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)。加樣后切勿移動(dòng)檢測(cè)板，5- 8分鐘判讀結(jié)果。
[0019](3)結(jié)果判斷
陰性(一):T線(檢測(cè)線，靠近加樣孔一端)顯色，表明樣品中雜色曲霉毒素濃度過(guò)低或不含雜色曲霉毒素；陽(yáng)性(+ )T線無(wú)顯色，則表明樣品中雜色曲霉毒素濃度過(guò)高；無(wú)效結(jié)果:未出現(xiàn)C線(對(duì)照線)，可能是操作不當(dāng)或檢測(cè)板已失效，用新的檢測(cè)板重新測(cè)試。
【權(quán)利要求】
1.這是一項(xiàng)檢測(cè)大麥、小麥、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等糧食、食品和飼草等中雜色曲霉毒素的快速檢測(cè)卡快速檢測(cè)試劑板的制備方法，其特征是NC膜上貼有包被了抗雜色曲霉毒素抗體的膠體金金標(biāo)墊，從樣品墊到吸水紙方向依次的檢測(cè)線和質(zhì)控線，上面劃的是雜色曲霉毒素載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗兔抗抗體。
2.如權(quán)利要求書(shū)第一條所述的試劑板制備方法，其特征在于將膠體金與抗雜色曲霉毒素抗體按一定比例混合標(biāo)記，使其形成穩(wěn)定的金顆粒，制作成金標(biāo)墊。
3.如權(quán)利要求書(shū)第一條所述的試劑板制備方法，本實(shí)用新型發(fā)明中檢測(cè)用抗原是雜色曲霉毒素與載體物質(zhì)形成的偶合物，其中載體物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成多肽、半合成多肽、多糖，如血清白蛋白、球蛋白、脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖，示例性的載體物質(zhì)包括牛血清白蛋白、卵清白蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白、甲狀腺球蛋白、L-多聚賴(lài)氨酸等；另外，載體物質(zhì)也可以是具有活性基團(tuán)的其他合成或天然聚合物，如白喉毒素、破傷風(fēng)毒素、酵母、尼龍、右旋葡聚糖、纖維素等，同樣也可以用來(lái)制備檢測(cè)用抗原，第二種屬動(dòng)物蛋白指非抗體來(lái)源屬動(dòng)物的蛋白，例如，抗體為鼠源性，則第二種屬動(dòng)物蛋白可以是卵清白蛋白、兔血清白蛋白等雞、兔或其他非鼠源性動(dòng)物蛋白。
4.如權(quán)利要求書(shū)第一條所述的試劑板制備方法，其特征在于樣品中雜色曲霉毒素的多少和檢測(cè)板上的檢測(cè)線顯色深淺有關(guān)，如果檢測(cè)線顯色較淺或不顯色，斷定為陽(yáng)性，反之為陰性。
5.如權(quán)利要求書(shū)第一條所述的試劑板制備方法，其特征在于工藝流程包括制備抗雜色曲霉毒素抗體,制備膠體金溶液,制備膠體金標(biāo)記抗雜色曲霉毒素抗體和組裝雜色曲霉毒素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK103808925SQ201210438057
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月6日
【發(fā)明者】杜道林, 祝文珍 申請(qǐng)人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司