專利名稱：一種檢測(cè)雜色曲霉素的酶電極及其制備與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物傳感器領(lǐng)域，涉及一種酶電極以及由該酶電極組裝的生物傳感器，以及該酶電極與生物傳感器的用途。
背景技術(shù)：
普魯士藍(lán)(Prussian blue, PB)是一種有效的氧化還原媒介體，PB膜修飾電極具有優(yōu)良的電化學(xué)可逆性、極高的穩(wěn)定性及電催化性能，它對(duì)H2A具有高靈敏的電催化作用， 被稱為“人工過氧化物酶”。PB修飾電極能有效降低檢測(cè)H2A的過電位，避免溶液中共存物質(zhì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生的干擾。電流型氧化酶生物傳感器通常是通過檢測(cè)酶反應(yīng)的產(chǎn)物H2O2來達(dá)到檢測(cè)底物的目的，因此，使得基于PB修飾膜組裝的氧化酶生物傳感器在臨床、環(huán)境和食品分析中發(fā)展迅速。但PB修飾電極在中性偏堿性溶液中極不穩(wěn)定、易溶解脫落，限制了它在生物傳感器中的廣泛應(yīng)用。因此制備一種具有耐堿性環(huán)境的PB修飾電極具有重要意義。雜色曲霉素(Sterigmatocystin，ST)是一種致癌致畸的真菌毒素，是黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)的合成前體，二者結(jié)構(gòu)相似，都是由雙呋喃環(huán)與氧雜蒽醌連接組成。ST是國際癌癥研究機(jī)構(gòu)劃分的2B類致癌物質(zhì)，與肺癌、肝癌、胃癌密切相關(guān)。目前， 測(cè)定ST的方法主要有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)、 氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)和偶聯(lián)質(zhì)譜法(Tandem MS)等(Versilovskis, A.，De Saeger, S. Sterigmatocystin Occurrence in foodstuffs and analytical methods—An overview. Molecular Nutrition & Food Research, 2010，54，136-147.)。這些方法各有其特點(diǎn)， 但有的需要使用昂貴的儀器，有的操作繁瑣，有的樣品前處理麻煩，從而難于實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中ST含量的快速檢測(cè)。黃曲霉毒素氧化酶(Aflatoxin-Oxidase，AF0)對(duì)ST具有催化作用，以AFO為分子識(shí)別元件的酶生物傳感器對(duì)ST的檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)迅速，不用繁瑣的樣品前處理等優(yōu)點(diǎn)。在報(bào)道的組裝黃曲霉毒素解毒酶修飾電極對(duì)ST的檢測(cè)中(Yao，DS., Cao, H. , Wen, SM. , et al. A novel biosensor for sterigmatocystin constructed by multi-walled carbon nanotubes (MffNT) modified with aflatoxin-detoxifizyme (ADTZ). Bioelectrochemistry, 2006，68，U6-133·)，其檢測(cè)限為 41. 6 ng/mL，檢測(cè)電位為400mV。但該類酶生物傳感器的檢測(cè)靈敏度有待提高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性有待改善，以及可進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)電位以提高酶電極的選擇性和抗干擾能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)普魯士藍(lán)修飾電極在中性偏堿性溶液中的不穩(wěn)定性，提供一種新型的檢測(cè)雜色曲霉素的酶電極及其制備方法，提高其對(duì)堿性環(huán)境耐受性。本發(fā)明的另一目的是以耐堿性雜合普魯士藍(lán)修飾電極為基底電極固定黃曲霉毒素氧化酶，實(shí)現(xiàn)對(duì)雜色曲霉素的高靈敏、高選擇性的快速檢測(cè)。本發(fā)明所述的一種檢測(cè)雜色曲霉素的酶電極，包括金電極；以及組裝在金電極上的普魯士藍(lán)雜合層；所述的普魯士藍(lán)是由鐵氰化鉀和氯化鐵溶液電沉積而成；所述的普魯士藍(lán)雜合層是由以下方法組裝在金電極上的提供由L-半胱氨酸單體通過自組裝的方式在金電極表面形成的L-半胱氨酸自組裝膜；提供含有鐵氰化鉀、氯化鐵以及殼聚糖的混合溶液；以及將上述混合溶液中產(chǎn)生的普魯士藍(lán)電沉積在金電極的L-半胱氨酸自組裝膜上， 形成普魯士藍(lán)雜合電極。本發(fā)明所述的自組裝功能膜可以選用硫醇分子、L-半胱氨酸，或其他的一些含有巰基的分子在金電極表面三維組裝過程所形成的一類熱力學(xué)穩(wěn)定、能量最低的有序膜。本發(fā)明優(yōu)選的是L-半胱氨酸自組裝功能膜，它具有促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移作用以及對(duì)某些分子或離子具有高選擇性的識(shí)別功能，使其具有一定抗干擾能力。本發(fā)明所述的一種檢測(cè)雜色曲霉素的酶電極的制備方法，包括以下步驟
A)L-半胱氨酸自組裝修飾金電極的制備將L-半胱氨酸單體通過自組裝的方式組裝在金電極表面，形成L-半胱氨酸自組裝膜，得到L-半胱氨酸自組裝膜功能化修飾的金電極；
B)雜合普魯士藍(lán)電沉積液的制備配制含有鐵氰化鉀、氯化鐵的溶液，與殼聚糖相混合，形成雜合普魯士藍(lán)電沉積液；
C)普魯士藍(lán)雜合電極的制備將L-半胱氨酸修飾的金電極浸入雜合普魯士藍(lán)電沉積液中，采用電化學(xué)恒電位電沉積的方法，將沉積液中的普魯士藍(lán)電沉積在金電極的L-半胱氨酸自組裝膜上，形成普魯士藍(lán)雜合電極。根據(jù)本發(fā)明所述的酶電極的制備方法的進(jìn)一步特征，所述步驟A包括以下具體步驟將金電極清洗干凈；配制0.0廣0.05 mol/L的L-半胱氨酸溶液作為L(zhǎng)-半胱氨酸自組裝液；將處理好的金電極插入到L-半胱氨酸自組裝液中低溫自組裝12-M小時(shí)(時(shí)間需要具體范圍)，制得L-半胱氨酸修飾的金電極。根據(jù)本發(fā)明所述的酶電極的制備方法的進(jìn)一步特征，所述步驟B包括以下具體步驟配制由 2. 5 mmol/L K3Fe(CN)6 + 2. 5 mmol/L FeCl3 + 0. 1 mol/L KCl + 0. 1 mol/L HCl 充分溶解后組成的混合液；加入殼聚糖，使其濃度在0. 019Γ0. 05%之間；將上述溶液混勻后即為雜合普魯士藍(lán)電沉積工作液。根據(jù)本發(fā)明所述的酶電極的制備方法的進(jìn)一步特征，所述步驟C包括以下具體步驟將步驟A中所制得的L-半胱氨酸修飾的金電極插入到步驟B中所制備的雜合普魯士藍(lán)電沉積液中，恒電位下進(jìn)行電沉積，然后轉(zhuǎn)入0. 1 mol/L HCl + 0.1 mol/L KCl混合溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，取出電極用二次蒸餾水小心沖洗后烘干，然后置于0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl緩沖液中進(jìn)行電活化，制得普魯士藍(lán)雜合電極。根據(jù)本發(fā)明所述的普魯士藍(lán)雜合電極可以應(yīng)用于制備生物傳感器。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器，所述生物傳感器包括本發(fā)明所述的酶電極。本發(fā)明所述的一種檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器的制備方法，是以碳納米管為電子傳遞體，均勻分散在殼聚糖溶液中，形成碳納米管-殼聚糖功能膜，將黃曲霉毒素氧化酶包埋在碳納米管-殼聚糖功能膜中，再滴加于本發(fā)明所述的普魯士藍(lán)雜合電極表面，低溫組裝過夜，即制得用于檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器。根據(jù)本發(fā)明所述的檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器的制備方法的進(jìn)一步特征，所述的碳納米管是采用經(jīng)強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑活化處理后洗至中性烘干的多壁碳納米管或者單壁碳納米管。根據(jù)本發(fā)明所述的檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器的制備方法的進(jìn)一步特征，所述殼聚糖溶液是通過以下方法制備的用乙酸溶解殼聚糖粉末，制備成濃度為0. 19Γ1. 5%的殼聚糖溶液，調(diào)節(jié)殼聚糖溶液的PH值為5. 5，置于低溫保存?zhèn)溆?；所述碳納米管溶于殼聚糖溶液，混勻，制得0. Γ1. 5 mg/mL的碳納米管-殼聚糖溶液。本發(fā)明所述的電子傳遞體可選用有機(jī)分子或高分子電子傳遞體。有機(jī)分子電子傳遞體主要有二茂鐵及其衍生物、有機(jī)染料、醌及其衍生物、離子液體等；高分子電子傳遞體主要有碳納米管、金屬納米顆粒、變價(jià)過渡金屬離子型和有機(jī)氧化還原型等氧化還原聚合物等。本發(fā)明優(yōu)選的電子傳遞體是活化后的碳納米管，可以采用強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑進(jìn)行活化處理。本發(fā)明中將碳納米管分散在殼聚糖溶液中，也可以選用溶膠凝膠(sol-gel)及其復(fù)合物、明礬以及一些其他具有成膜能力的化合物代替殼聚糖。根據(jù)本發(fā)明所述方法制備的生物傳感器可應(yīng)用于檢測(cè)真菌毒素等用途。本發(fā)明所述的酶生物傳感器是以黃曲霉毒素氧化酶為分子識(shí)別元件來檢測(cè)雜色曲霉素的，其原理是黃曲霉毒素氧化酶催化ST反應(yīng)產(chǎn)生了 H2O2，普魯士藍(lán)修飾電極對(duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H2A具有很好的電催化還原作用，碳納米管對(duì)這一反應(yīng)具有促進(jìn)作用，通過檢測(cè)H2O2，就可以達(dá)到檢測(cè)底物雜色曲霉素的作用。由于該電極具有較高的選擇性和靈敏性， 能滿足實(shí)際樣品中雜色曲霉素的定量檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的酶電極與生物傳感器具有如下有益效果
(1)本發(fā)明制備的普魯士藍(lán)雜合電極具有很好的堿性環(huán)境耐受性，克服了傳統(tǒng)普魯士藍(lán)修飾電極在中性和弱堿性不穩(wěn)定，易脫落的缺點(diǎn)。該雜合普魯士藍(lán)修飾電極為組裝一系列酶生物傳感器提供了一個(gè)很好的反應(yīng)平臺(tái)。(2)本發(fā)明制備的酶生物傳感器對(duì)ST具有更靈敏的響應(yīng)，響應(yīng)時(shí)間快，為8s。在 0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0.1 mol/L KCl 的電解緩沖液中，對(duì)ST 的檢測(cè)限為 2 ng/mL ； 線性范圍寬，為10 ng/mL 950 ng/mL。(3)本發(fā)明制備的酶生物傳感器具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性；檢測(cè)電位低，可在 OV檢測(cè)，極大地提高了檢測(cè)的選擇性；同時(shí)由于普魯上藍(lán)雜合膜的引入，極大地提高了酶電極的抗干擾能力；實(shí)際樣品只需經(jīng)過簡(jiǎn)單的預(yù)處理即可用組裝的生物傳感器檢測(cè)，其回收率在91. 49Γ107. 3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2. 1-5. 4%之間，能滿足實(shí)際樣品檢測(cè)需要。(4)本發(fā)明所述的電極制備過程簡(jiǎn)單，性能優(yōu)良；組裝的用于檢測(cè)ST的酶生物傳感器使用簡(jiǎn)單，省時(shí)、省力，檢測(cè)迅速方便，是一種理想的檢測(cè)真菌毒素的替代方法。


圖1為普魯士藍(lán)修飾電極在pH8. 0的PBS中的循環(huán)伏安曲線圖；其中，圖中曲線a 為PB-CS/Cys/Au修飾電極；曲線b為PB/Au修飾電極。掃描速度50mV/s。圖 2 為 CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au 修飾電極在含不同濃度 ST 的 pH6. 5 的 PBS 中的循環(huán)伏安曲線圖；其中，圖中曲線從a到c的變化對(duì)應(yīng)ST的濃度分別是0 ng/mL，20 ng/mL, 40 ng/mL。掃描速度50mV/s。圖3為CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修飾電極檢測(cè)ST的電流-時(shí)間曲線。檢測(cè)電位0V ；檢測(cè)體積10mL ；攪拌速度50r/min。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一用于檢測(cè)ST的酶生物傳感器的制備
(一)、儀器與試劑
CHI660C型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)金電極(內(nèi)直徑為2 mm)或修飾電極為工作電極；Ag/AgCl (飽和KCl)電極為參比電極；鉬絲電極為輔助電極。殼聚糖(CS，85-90%的脫乙酰度，平均分子量為1 χ IO6 g/mol，浙江澳興生物科技有限公司)；單壁碳納米管(SWCNTs，直徑<2 nm，長(zhǎng)度5_15>m，純度>95%，深圳納米港公司)，L-半胱氨酸(L-Cys，>99%，北京奇華盛生物技術(shù)發(fā)展中心)，鐵氰化鉀(廣州化學(xué)試劑廠)，三氯化鐵(廣州化學(xué)試劑廠)，磷酸氫二鉀(廣州化學(xué)試劑廠)，磷酸二氫鉀(廣州化學(xué)試劑廠)。所有化學(xué)試劑均為分析純，使用前未經(jīng)過進(jìn)一步處理，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。L-半胱氨酸(L-Cys)自組裝液的配制自組裝液為0. 02 mol/L的L_Cys，用0. 1 mol/L的HCl配制。雜合普魯士藍(lán)電沉積工作液的配制由2. 5 mmol/L K3Fe(CN)6 + 2.5 mmol/L FeCl3 + 0.1 mol/L KCl + 0.1 mol/L HCl混合液充分溶解后組成，然后加入殼聚糖，使其濃度為0. 019Γ0. 05%之間，超聲充分混勻，即為雜合普魯士藍(lán)電沉積工作液，每次使用前新鮮配制。支持電解質(zhì)為PBS 緩沖液(0. 05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl)
(二)、L-Cys自組裝修飾金電極的制備
將待修飾的金電極(Au)在5#金相砂紙(上海辰華儀器公司)上打磨，然后分別用粒徑為1. ΟΜπκΟ. 3Mm和0. 05Mffl的氧化鋁粉末打磨至鏡面，用二次蒸餾水超聲清洗2次，每次 5min。將處理好的電極浸入新鮮配制的Piranha溶液(濃硫酸和雙氧水體積比為7:3)中浸泡IOmin進(jìn)行活化處理；再分別用二次蒸餾水和無水乙醇超聲清洗2次(每次5min)。處理后的電極在0. 5 mol/L的硫酸中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(電位窗口為-0. 2^1. 5V,掃描速度為0. lV/s)直至出現(xiàn)穩(wěn)定的金的特征峰。將活化后的Au電極浸入L-Cys自組裝液中，于 40C自組裝他，取出后用水充分淋洗，除去非特異性吸附的L-Cys分子，便制得L-Cys自組裝修飾的金電極，記為Cys/Au。(三)耐堿性普魯士藍(lán)雜合電極的制備
將步驟二中所制備的Cys/Au自組裝電極插入新鮮配制的雜合普魯士藍(lán)(PB)電沉積工作液中，在恒電位400mV下電沉積40s，用二次蒸餾水小心沖洗后轉(zhuǎn)入0. 1 mol/L HCl + 0. 1 mol/L KCl混合溶液中，以50mV/s掃描速度在-0. 05、. 35V之間掃描至穩(wěn)定，取出電極用二次蒸餾水小心沖洗后于100°C烘烤lh，冷卻至室溫后置于0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl緩沖液中(pH=6. 5)于-0. 05V電活化IOmin后，在支持電解質(zhì)PBS緩沖液于-0. 05、. 35V之間循環(huán)伏安掃描(掃速50mV/s)穩(wěn)定后，便可制得雜合普魯士藍(lán)膜修飾電極，記為 ra-CS/Cys/Au。(四)碳納米管-殼聚糖混合液的制備
用1% (體積比)的乙酸溶解殼聚糖粉末，制備成0.5%的殼聚糖(CS)溶液，充分溶解后濾去不溶雜質(zhì)，用濃NaOH調(diào)節(jié)殼聚糖溶液的pH值為5. 5，置于4°C保存?zhèn)溆?。單壁碳納米管(SWCNTs)在使用前先進(jìn)行純化處理，用強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑使其活化，洗至中性烘干后分散于0. 5%的殼聚糖溶液中，超聲分散均勻后，制備成0. 5 mg/mL的單壁碳納米管-殼聚糖溶液(CS-SWCOTs)。(五)黃曲霉毒素氧化酶(AFO)的制備
黃曲霉毒素氧化酶(AFO)的制備可參照文獻(xiàn)1 (Junhua Chen, DalingLiu, etc. Development of an amperometrie enzyme electrode biosensor for sterigmatocystin detection, Enzyme and Microbial Technology 47 (2010) 119 - 126)以及文獻(xiàn) 2 (Shi chuan Li, Jun hua Chen, etc. Amperometric biosensor for aflatoxin Bl based on aflatoxin-oxidase immobilized on multiwalled carbon nanotubesFood Control 22 (2011) 43-49)的報(bào)道。配制成蛋白濃度為5 mg/mL的AFO酶液，備用。(六)酶生物傳感器的制備
取步驟五所制備的AFO酶液5L與步驟四所制備的CS-SWCNTs溶液5L均勻混合，超聲 15min，便制備成了 CS-AF0-SWCNTs混合液。取L CS-AFO-SffCNTs 5混合液滴加于步驟三所制備的PB-CS/Cys/Au修飾電極上，在4°C冰箱中干燥組裝過夜，即制得用于檢測(cè)ST的酶生物傳感器，記為 CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au。實(shí)施例二 雜合普魯士藍(lán)修飾電極堿性環(huán)境穩(wěn)定性研究
采用CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，利用三電極系統(tǒng)(參比電極Ag/ AgCl (飽和KCl)電極；對(duì)電極鉬絲電極；工作電極普魯士藍(lán)修飾電極)，選擇循環(huán)伏安掃描模式，設(shè)置電化學(xué)參數(shù)如下 工作電位-0. 05V +0. 35V 掃描速率50mV/s 靜息時(shí)間2s
設(shè)置好參數(shù)后，在PH8.0的支持電解質(zhì)PBS緩沖液(0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl)中，循環(huán)伏安法檢測(cè)雜合普魯士藍(lán)修飾電極(PB-CS/Cys/Au)的電流響應(yīng)信號(hào)。 為了進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)組裝了純普魯士藍(lán)修飾電極(PB/Au)，組裝過程與雜合普魯士藍(lán)類似， 只是沒有自組裝L-Cys以及加殼聚糖。如圖1所示，PB-CS/Cys/Au修飾電極在pH8. 0的PBS 中有一對(duì)較好的普魯士藍(lán)的氧化還原峰(曲線a)，與PB/Au修飾電極相比(曲線b)，其峰電流明顯變大，峰形變好，電位差變小，這說明雜合普魯士藍(lán)修飾電極的可逆性增加，在堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性和耐受性增加。因此組裝的PB-CS/Cys/Au修飾電極為構(gòu)建酶生物傳感器提供了一個(gè)很好的響應(yīng)平臺(tái)。實(shí)施例三CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修飾電極對(duì)ST的電化學(xué)響應(yīng) (一)循環(huán)伏安法檢測(cè)ST
采用CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，利用三電極系統(tǒng)(參比電極Ag/ AgCl (飽和KCl)電極，對(duì)電極鉬絲電極，工作電極CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修飾電極)，選擇循環(huán)伏安掃描模式，設(shè)置電化學(xué)參數(shù)如下 工作電位-0. 05V +0. 35V 掃描速率50mV/s 靜息時(shí)間2s
8設(shè)置好參數(shù)后，在PH6. 5的支持電解質(zhì)PBS緩沖液(0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl)中滴加不同濃度的ST，混勻后采用循環(huán)伏安法檢測(cè)。如圖2所示，在沒有ST的 PBS中，CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修飾電極展現(xiàn)出普魯士藍(lán)的一對(duì)氧化還原峰(曲線 a)；隨著ST濃度的增大(曲線b=20ng/mL ST ；曲線c=40ng/mL ST)，修飾電極氧化峰電流變小，還原峰電流增大，表明普魯士藍(lán)雜合修飾電極對(duì)AFO催化ST產(chǎn)生的H2A具有很好的電化學(xué)還原作用。該酶生物傳感器的檢測(cè)機(jī)理是通過檢測(cè)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H2A達(dá)到檢測(cè)ST 的目的。(二)檢測(cè)ST的電流-時(shí)間曲線
采用CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，選擇電流-時(shí)間檢測(cè)模式，采用三電極系統(tǒng)(參比電極Ag/AgCl(飽和KCl)電極；對(duì)電極鉬絲電極；工作電極CS-AF0-SWCNTs/ PB-CS/Cys/Au修飾電極)，設(shè)置電化學(xué)參數(shù)如下 檢測(cè)電位0V 靜息時(shí)間2s 攪拌速度50r/min
待背景電流穩(wěn)定后，往IOmL支持電解質(zhì)PBS緩沖液(0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl)中滴加ST，如圖3所示，隨著ST濃度的變化，響應(yīng)電流呈梯度變化。該酶生物傳感器對(duì)ST響應(yīng)靈敏且迅速，響應(yīng)時(shí)間為8s，檢測(cè)限為2 ng/mL (信噪比為3)。酶修飾電極對(duì)ST檢測(cè)的線性回歸方程為/ (mA) = 0.0791C (ng/ml) -0.8126 (R2=O. 9985)，線性范圍為:10ng/mL 950ng/mL。實(shí)施例四酶電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性
將一支CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修飾電極置于pH8. 0的PBS中連續(xù)循環(huán)伏安掃描100圈，其峰電流仍保持在90%以上，說明本發(fā)明所制備的酶生物傳感具有很好的穩(wěn)定性。該酶電極對(duì)20ng/mL ST重復(fù)測(cè)定9次，其電流響應(yīng)值的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 3. 6%，表明該電極具有較好的檢測(cè)重復(fù)性。另外，同時(shí)制備9根酶修飾電極，相同條件下對(duì) 20ng/mL ST的響應(yīng)電流的RSD為4. 6%。表明該修飾電極具有較好的制作重現(xiàn)性。電極不用時(shí)置于4°C避光干燥保存，隔天測(cè)量，16天后仍保持初始電流響應(yīng)值的90%以上。說明該酶電極具有較好的存儲(chǔ)穩(wěn)定性。實(shí)施例五酶電極的抗干擾性
采用計(jì)時(shí)電流法對(duì)CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修飾電極的抗干擾能力進(jìn)行研究， 測(cè)試條件參數(shù)設(shè)置如實(shí)施例3(二)所示，在IOmL含20ng/mL ST的pH6. 5的PBS緩沖液中， 分別滴加下列不同濃度的可能干擾物，分析其抗干擾能力。分別滴加的干擾物的種類
1000倍于ST濃度的葡萄糖，檸檬酸，PO43-, NO3", L-色氨酸，蔗糖，甘氨酸，D-山梨醇； 500倍于ST濃度的抗壞血酸，尿素，甲醇，草酸，CIO4"； 100倍于ST濃度的油酸，酒石酸鈉，苯酚，乙酸銨，EDTA ； 10倍于ST濃度的對(duì)苯二酚，CuCl2, 3，5- 二硝基水楊酸。測(cè)試效果當(dāng)控制相對(duì)誤差不超過檢測(cè)20ng/mL ST的電流響應(yīng)值的5% 的情況下，1000倍的葡萄糖，檸檬酸，PO43-, NO3-, L-色氨酸，蔗糖，甘氨酸，D-山梨醇；500倍的抗壞血酸，尿素，甲醇，草酸，C104_ ；100倍的油酸，酒石酸鈉，苯酚，乙酸銨，EDTA ；10倍的對(duì)苯二酚，CuCl2, 3，5- 二硝基水楊酸等對(duì)測(cè)定不產(chǎn)生干擾。實(shí)施例六實(shí)際樣品檢測(cè)
將本發(fā)明所述的酶生物傳感器用于實(shí)際樣品測(cè)定以及檢測(cè)其回收率，所述的實(shí)際樣品可以是玉米、花生、大米、小麥等一系列農(nóng)副產(chǎn)品和糧食作物，也可以是飼料、飲料、醬油、橄欖油、花生油等一系列可能含ST的產(chǎn)品。本實(shí)施例中選用玉米樣品進(jìn)行檢測(cè)。玉米樣品的處理取Ig優(yōu)質(zhì)玉米粉，加入不同濃度的ST，于5 ml 80%的甲醇溶液中振蕩萃取 45 min，離心(5000 r/min, 10 min)，上清用 0. lmol/L ρΗ7· 0 的 PBS 按 1 :5(V/ V)稀釋后檢測(cè)。其他樣品按照類似的方法，經(jīng)過簡(jiǎn)單的預(yù)處理后即可檢測(cè)。計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)檢測(cè)參數(shù)設(shè)置如實(shí)施例3 (二)所示，對(duì)分別含10 ng/nL,50 ng/ nL, 100 ng/nL, 150ng/nL, 200ng/nL ST的玉米樣品進(jìn)行計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)，每個(gè)濃度的玉米樣品均測(cè)量4次。測(cè)試結(jié)果如表1所示，所測(cè)得樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2. 19Γ5. 4%之間，加標(biāo)回收率在91.49Γ107. 3%之間，用于實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果令人滿意。表1 玉米樣品中ST含量的測(cè)定
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)雜色曲霉素的酶電極，其特征在于包括金電極；以及組裝在金電極上的普魯士藍(lán)雜合層；所述的普魯士藍(lán)是由鐵氰化鉀和氯化鐵溶液電沉積而成；所述的普魯士藍(lán)雜合層是由以下方法組裝在金電極上的提供由L-半胱氨酸單體通過自組裝的方式在金電極表面形成的L-半胱氨酸自組裝膜；提供含有鐵氰化鉀、氯化鐵以及殼聚糖的混合溶液；以及將上述混合溶液中產(chǎn)生的普魯士藍(lán)電沉積在金電極的L-半胱氨酸自組裝膜上，形成普魯士藍(lán)雜合電極。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)雜色曲霉素的酶電極的制備方法，其特征在于，包括以下步驟A)L-半胱氨酸自組裝修飾金電極的制備將L-半胱氨酸單體通過自組裝的方式組裝在金電極表面，形成L-半胱氨酸自組裝膜，得到L-半胱氨酸自組裝膜功能化修飾的金電極；B)雜合普魯士藍(lán)電沉積液的制備配制含有鐵氰化鉀、氯化鐵的溶液，與殼聚糖相混合，形成雜合普魯士藍(lán)電沉積液；C)普魯士藍(lán)雜合電極的制備將L-半胱氨酸修飾的金電極浸入雜合普魯士藍(lán)電沉積液中，采用電化學(xué)恒電位電沉積的方法，將沉積液中的普魯士藍(lán)電沉積在金電極的L-半胱氨酸自組裝膜上，形成普魯士藍(lán)雜合電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶電極的制備方法，其特征在于，所述步驟A包括以下具體步驟將金電極清洗干凈；配制0. 0Γ0. 05 mol/L的L-半胱氨酸溶液作為L(zhǎng)-半胱氨酸自組裝液；將處理好的金電極插入到L-半胱氨酸自組裝液中低溫自組裝12-M小時(shí)，制得L-半胱氨酸修飾的金電極。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶電極的制備方法，其特征在于，所述步驟B包括以下具體步驟配制由 2. 5 mmol/L K3Fe(CN)6 + 2. 5 mmol/L FeCl3 + 0. 1 mol/L KCl + 0. 1 mol/L HCl充分溶解后組成的混合液；加入殼聚糖，使其濃度在0. 019Γ0. 05%之間；將上述溶液混勻后即為雜合普魯士藍(lán)電沉積工作液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶電極的制備方法，其特征在于，所述步驟C包括以下具體步驟將步驟A中所制得的L-半胱氨酸修飾的金電極插入到步驟B中所制備的雜合普魯士藍(lán)電沉積液中，恒電位下進(jìn)行電沉積，然后轉(zhuǎn)入0. 1 mol/L HCl + 0.1 mol/L KCl混合溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，取出電極用二次蒸餾水小心沖洗后烘干，然后置于0. 05 mol/L KH2PO4-K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl緩沖液中進(jìn)行電活化，制得普魯士藍(lán)雜合電極。
6.一種檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器，其特征在于，所述生物傳感器包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶電極。
7.如權(quán)利要求6所述的生物傳感器的制備方法，其特征在于以碳納米管為電子傳遞體，均勻分散在殼聚糖溶液中，形成碳納米管-殼聚糖功能膜，將黃曲霉毒素氧化酶包埋在碳納米管-殼聚糖功能膜中，再滴加于權(quán)利要求1所述的普魯士藍(lán)雜合電極表面，低溫組裝過夜，即制得用于檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述的碳納米管是采用經(jīng)強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑活化處理后洗至中性烘干的多壁碳納米管或者單壁碳納米管。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖溶液是通過以下方法制備的用乙酸溶解殼聚糖粉末，制備成濃度為0. 19Γ1. 5%的殼聚糖溶液，調(diào)節(jié)殼聚糖溶液的PH值為5. 5，置于低溫保存?zhèn)溆茫凰鎏技{米管溶于殼聚糖溶液，混勻，制得 0. Γ1. 5 mg/mL的碳納米管-殼聚糖溶液。
10.如權(quán)利要求6所述的生物傳感器在檢測(cè)雜色曲霉素方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)雜色曲霉素的酶電極及其制備方法，以及以其為基底電極固定黃曲霉毒素氧化酶組裝的用于檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器。在金電極表面先自組裝上L-半胱氨酸功能膜，再插入到雜合普魯士藍(lán)電沉積工作液中，采用恒電位法即可制備普魯士藍(lán)雜合電極。采用碳納米管作為電子傳遞體，將其均勻分散在殼聚糖溶液中，作為包埋黃曲霉毒素氧化酶的載體，再將殼聚糖-黃曲霉毒素氧化酶-碳納米管混合膜組裝到雜合普魯士藍(lán)修飾電極表面，就制成了用于檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器。本發(fā)明所述的酶電極與生物傳感器具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，對(duì)雜色曲霉素響應(yīng)迅速靈敏，響應(yīng)時(shí)間快，檢測(cè)電位低，抗干擾能力強(qiáng)，具有很好的選擇性。
文檔編號(hào)G01N27/403GK102175736SQ20111002255
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日
發(fā)明者劉大嶺, 姚冬生, 謝春芳, 陳俊華 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)