專利名稱：攻擊vegfr1陽(yáng)性細(xì)胞的雜合毒素及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組技術(shù)，具體地說(shuō)是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子突變體與白喉毒素截短體(C區(qū)T區(qū)編碼基因)制成的融合基因(mV8D)和其編碼的雜合蛋白，其為攻擊VEGFR1(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體一)陽(yáng)性細(xì)胞的雜合毒素及其編碼基因。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是血管生長(zhǎng)所必需的生長(zhǎng)因子之一，腫瘤快速生長(zhǎng)時(shí)強(qiáng)烈的代謝形成對(duì)氧氣、養(yǎng)料的大量需求，并在組織局部形成大量代謝廢物的堆積；不完全代謝產(chǎn)物乳酸的堆積，造成pH值下降；乳酸的刺激，缺血、缺氧的刺激使腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)VEGF受體(VEGFR)。VEGFR與VEGF結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，形成新的血管，以滿足腫瘤的生長(zhǎng)需要；有些腫瘤細(xì)胞的表面也表達(dá)VEGFR；當(dāng)有VEGF存在時(shí)，腫瘤細(xì)胞大量增殖(文獻(xiàn)1.Yancopoulos G.D，Dacis S.，Gale N.W，et al Vascular-specific Growth Factorsand Blood Vessel Formation Nature 2000；407(14)242-248)。
白喉毒素(DT)是白喉?xiàng)U菌產(chǎn)生的一種外毒素，可以分成C區(qū)，T區(qū)和R區(qū)三個(gè)區(qū)。R區(qū)可以和細(xì)胞表面的受體相結(jié)合完成毒素對(duì)細(xì)胞的吸附；T區(qū)可以在細(xì)胞膜上形成穿膜孔道，使毒素進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)；C區(qū)可以抑制延長(zhǎng)因子-2的活性，阻斷細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，造成細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)表明將DT的R區(qū)敲掉，DT就使去了和細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合的能力。將DT的R區(qū)換成其它的蛋白配基，DT分子就能和此配基的受體結(jié)合，并殺死具有這一受體的細(xì)胞(文獻(xiàn)2.Choe S.，Bennett M.J.，F(xiàn)ujii G.et al the Crystal Structure ofDiphtheria Toxin Nature1992；357(21)216-222)。
VEGF有兩個(gè)受體，并且能和肝素非特異性結(jié)合。正常情況下，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(VEGFR1)位于血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和腎小球膜細(xì)胞表面。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2)表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞、巨核細(xì)胞、血小板和視網(wǎng)膜前體細(xì)胞表面。而硫酸肝素聚糖位于多種細(xì)胞的表面。在病理情況下，旺盛生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞表面和腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，有大量的VEGFR1和VEGFR2的表達(dá)。
利用VEGF可以與VEGF受體特異性結(jié)合這一特性，可以利用VEGF代替DT的受體結(jié)合區(qū)，把DT毒素引導(dǎo)到VEGF受體陽(yáng)性的細(xì)胞上去，殺死這些細(xì)胞(文獻(xiàn)3.Arora N.Masood R.，Zheng T.et al Vascular EndothelialGrowth Factor Chimeric Toxin is Highly Active Against Endothelial CellsCancer Res.1999 59(1)183-8.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有高選擇性殺傷作用的攻擊VEGFR1陽(yáng)性細(xì)胞的雜合毒素(VEGF-DT雜合蛋白)及其編碼基因。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以人的天然血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因?yàn)榛A(chǔ)，對(duì)其基因上的堿基進(jìn)行突變，再?gòu)陌缀矶舅鼐幋a基因中截取C區(qū)T區(qū)的編碼基因，進(jìn)行基因重組制成兩種融合基因，并在大腸桿菌中表達(dá)成相應(yīng)的有生物活性的蛋白。
具體為首先分別將VEGF165的3-165(制備VEGF突變基因mV8D)和3-114(制備VEGF突變基因smV8D)氨基酸殘基編碼基因中的82位的Arg，84位的Lys和86位的His變成Ala制成mV8；然后制備了DT的1-391氨基酸殘基編碼基因；再把DT基因與VEGF突變基因相連制成融合基因，并更改了其中部分稀有密碼子以利于其在原核生物大腸桿菌中的表達(dá)。利用融合基因mV8D在原核生物--大腸桿菌中表達(dá)出有生物活性的雜合蛋白PmV8D；利用融合基因smV8D在原核生物--大腸桿菌中表達(dá)出有生物活性的雜合蛋白PsmV8D。
一種攻擊VEGFR1陽(yáng)性細(xì)胞的雜合毒素PmV8D，具有序列表SEQ IDNO2中的氨基酸序列。其可由具有序列表SEQ ID NO1中的堿基序列的編碼基因制備而成。
一種攻擊VEGFR1陽(yáng)性細(xì)胞的雜合毒素PsmV8D，具有序列表SEQ IDNO4中的氨基酸序列。其可由具有序列表SEQ ID NO3中的堿基序列的編碼基因制備而成。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.由于本發(fā)明采用白喉毒素做效應(yīng)分子，與人源化單鏈抗體相比，它有更高的殺傷效率?？贵w的Fc段是抗體的細(xì)胞毒作用區(qū)，單鏈抗體與抗體相比有更小的分子量，有更好的穿透活性，生產(chǎn)也更容易；但是由于單鏈抗體不帶抗體的Fc段，所以細(xì)胞殺傷作用弱。本發(fā)明利用白喉毒素作效用分子；白喉毒素可以滅活真核細(xì)胞的廷長(zhǎng)因子-2阻斷蛋白合成；一個(gè)分子即可殺死一個(gè)細(xì)胞，殺傷效率遠(yuǎn)高于單鏈抗體。
2.與免疫毒素相比，本發(fā)明繞過(guò)了制備純抗原，挑取細(xì)胞單克隆，制備單克隆抗體，人源化的技術(shù)障礙，使研制成本大大下降。
3.與國(guó)際上原有的VEGF白喉毒素雜合蛋白相比，本發(fā)明中涉及的蛋白專一性更高，由于改變了VEGF上的受體結(jié)合位點(diǎn)，使其失去了和VEGFR-2相結(jié)合的能力，而只有和受體1相結(jié)合的能力故其專一性比用未突變的VEGF高許多。其細(xì)胞殺傷專一性與單鏈抗體相似，高于未突變的VEGF-DT雜合蛋白。
4.本發(fā)明對(duì)VEGF進(jìn)行突變制成融合基因。其編碼的雜合蛋白PmV8D只與VEGFR1和肝素結(jié)合，PsmV8D只與VEGFR1結(jié)合而且不與肝素結(jié)合，這種VEGF突變體制成的雜合蛋白可以只殺死VEGFR-1陽(yáng)性細(xì)胞，而不殺死VEGFR-2陽(yáng)性細(xì)胞，而smV8D也不會(huì)受到遍布于各種細(xì)胞表面的硫酸肝素聚糖的影響。這樣由VEGF突變體與白喉毒素制成的雜合蛋白可以提高VEGF-DT雜合蛋白的選擇性殺傷作用。


圖1-1為mV8D基因測(cè)序圖之一；圖1-2為mV8D基因測(cè)序圖之二；圖1-3為mV8D基因測(cè)序圖之三；圖1-4為mV8D基因測(cè)序圖之四；圖1-5為mV8D基因測(cè)序圖之五；圖2-1為smV8D基因測(cè)序圖之一；圖2-2為smV8D基因測(cè)序圖之二；圖2-3為smV8D基因測(cè)序圖之三；圖2-4為smV8D基因測(cè)序圖之四；圖3為PmV8D、PsmV8D蛋白電泳圖；圖4為PmV8D、PsmV8D蛋白免疫電泳圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1VEGF突變基因與白喉毒素C區(qū)T區(qū)截短基因的融合基因mV8D的堿基序列(序列表SEQ ID NO1)為ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTCATGCATAAATCTTGATTGGGATGTCATAAGGGATAAAACTAAGACAAAGATAGAGTCTTTGAAAGAGCATGGCCCTATCAAAAATAAAATGAGCGAAAGTCCCAATAAAACAGTATCTGAGGAAAAAGCTAAACAATACCTAGAAGAATTTCATCAAACGGCATTAGAGCATCCTGAATTGTCAGAACTTAAAACCGTTACTGGGACCAATCCTGTATTCGCTGGGGCTAACTATGCGGCGTGGGCAGTAAACGTTGCGCAAGTTATCGATAGCGAAACAGCTGATAATTTGGAAAAGACAACTGCTGCTCTTTCGATACTTCCTGGTATCGGTAGCGTAATGGGCATTGCAGACGGTGCCGTTCACCACAATACAGAAGAGATAGTGGCACAATCAATAGCTTTATCGTCTTTAATGGTTGCTCAAGCTATTCCATTGGTAGGAGAGCTAGTTGATATTGGTTTCGCTGCATATAATTTTGTAGAGAGTATTATCAATTTATTTCAAGTAGTTCATAATTCGTATAATCGTCCCGCGTATTCTCCGGGGCATAAAACGCAACCATTTCTTCATATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATAATGGCTATCGCTCCTGCCCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGTGAATTCTAA(1)SEQ ID NO 1的信息(參見(jiàn)序列表)(a)序列特征*長(zhǎng)度1674堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源人VEGF165和白喉?xiàng)U菌。
融合基因mV8D的具體制備過(guò)程如下以人的VEGF cDNA為模板，運(yùn)用改良的重疊PCR在VEGF上引入六個(gè)突變點(diǎn)。從白喉?xiàng)U菌基因組中運(yùn)用PCR技術(shù)獲得DT截短基因，運(yùn)用基因重組技術(shù)把VEGF突變體基因連接到DT截短基因的3′端。融合基因構(gòu)建到到原核表達(dá)載體中，并在保存菌株中保存。
VEGF基因、DT基因均參照文獻(xiàn)制備(Greenfield L.，Bjorn M.J.，Horn G.，et al Nucletide seqence of the structural gene for diphtheraia toxin carried bycorynebacteriophage β Proc.Natl.Acad Sci.USA 198380(11)；6853-6857Tischer E.，Mitchell R.，Hartman T.et al The human gene for vascularendothelial growth factor J Boil.Chem.1991266(18)；11947-11954)，所用PCR試劑盒和內(nèi)切酶等均購(gòu)自大連寶生物公司。實(shí)驗(yàn)流程參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F奧斯伯等著科學(xué)出版社1998)和各產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下委托上海生工生物工程公司合成如下引物。
引物1(P1)GTT GTA AAA CGA CGA CCA GTG A引物2(P2)AGC AGG AGC GAT AGC CAT TAT CTG CAT GG引物3(P3)GCG ATC GCA CCT GCC CAA GGC CAG CAC，引物4(P4)TAG AAT TCA CAT ATG GCA GAA GGA GGA GG引物5(P5)TAG AAT TCA CGC CTC GGC TTG TCA CAT C以本室制備的VEGF165為模板，以P4，P5為引物通過(guò)PCR法制得VEGF基因。PCR循環(huán)條件為94度30秒，72度30秒，55度30秒，循環(huán)30個(gè)循環(huán)。其余試劑用量均依然試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。制得的VEGF基因克隆入突變載體，以P1，P2，P3為引物，用改良突變法在此基因上引入突變。PCR反應(yīng)基本條件為94度預(yù)變性2分鐘，循環(huán)條件為94度30秒，72度30秒，55度30秒，循環(huán)30個(gè)循環(huán)。
改良突變法詳述如下1突變模板的制備取VEGF的PCR產(chǎn)物與突變載體連接。連接反應(yīng)使用寶生物的T4DNA連接酶，反應(yīng)條件依試劑說(shuō)明進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌株，轉(zhuǎn)化物鋪于IPTG-Xgal-Amp+LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑取八個(gè)白色菌落，懸浮于100ul無(wú)菌milli Q水中。振蕩混均，100℃加熱10min。取10ul混合物加水90ul，做十倍稀釋。此稀釋物命名為混合模板。
突變反應(yīng)依以下條件做PCR反應(yīng)。
第一步VEGF N端編碼基因突變物和C端編碼基因突變物的合成取上一步中制成的混合模板1ul；P1，1ul；P2，1ul；Primix，25ul；ddH2O，22ul。分裝12.5ul/管。做梯度PCR反應(yīng)，退火溫度依次設(shè)定為43℃，48℃，53℃。VEGF C端編碼基因突變物的合成混合模板，1ul；P1，1ul；P3，1ul；Primix，25ul；ddH2O，22ul；分裝12.5ul/管。做梯度PCR反應(yīng)，退火溫度依次設(shè)定為43℃，48℃，53℃。
第二步VEGF突變物的合成VEGF N端編碼基因突變物0.5ul；VEGF C端編碼基因突變物，0.5ul；P1，1ul；Primix，25ul；ddH2O，23ul；做梯度PCR反應(yīng)，退火溫度依次設(shè)定為41.3℃，45.4℃，48.0℃，50.7℃，56℃。
VEGF突變體基因的鑒定PCR產(chǎn)物走1％瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶(700bp)，用引物P4-P5，P1-P2，P1-P3做PCR鑒定。
2白喉毒素截短基因的制備委托上海生工生物工程公司合成如下引物引物6(P6)AGTCCATGGGCGCTGATGATGTTGTTG引物7(P7)ATACATATGAAGAAATGGTTGCGTTTTATG以P6，P7為引物，以白喉毒素全長(zhǎng)基因?yàn)槟０澹訮CR法制備白喉毒素截短基因。PCR反應(yīng)基本條件為94度預(yù)變性2分鐘，循環(huán)條件為94度30秒，72度30秒，50度30秒，循環(huán)35個(gè)循環(huán)。
3融合基因的制備制備的白喉毒素截短基因以Nco I和Nde I核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理。VEGF突變體基因以Nde I和EcoR I核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理。同時(shí)用NcoI和EcoR I核酸內(nèi)切酶對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行酶切處理。酶切條件依寶生物公司的產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后，進(jìn)行連接反應(yīng)，連接條件同上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌株，轉(zhuǎn)讓化條件依文獻(xiàn)進(jìn)行(Chung CT，Niemela SL，Miller RH.One-step preparation of competent Escherichia colitransformation and storage of bacterial cells in the same solution.Proc NatlAcad Sci U S A.1989 Apr；86(7)2172-5)。經(jīng)大腸桿菌體內(nèi)擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒，送大連寶生物公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。
mV8D融合基因編碼的雜合蛋白PmV8D的氨基酸序列(序列表SEQ IDNO2)為MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMAIAPAQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRREF.
(1)SEQ ID NO 2的信息(參見(jiàn)序列表)(a)序列特征*長(zhǎng)度557氨基酸殘基*類型蛋白(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)假設(shè)否(e)最初來(lái)源mV8D基因工程菌株。
PmV8D的具體制備過(guò)程為以融合基因mV8D轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)菌株。轉(zhuǎn)化液鋪于Kan+LB固體培養(yǎng)基上，挑取轉(zhuǎn)化的菌落，接種于Kan+LB液體培養(yǎng)基，37度振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，用終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的雜合蛋白命名為PmV8D。培養(yǎng)液置于冰上冷卻十分鐘，5000G離心十分鐘分離菌體后，用生理鹽水重懸菌體。-20度冷凍后融化，反復(fù)三次破碎細(xì)胞，14000G離心十分鐘，分離包含體，包含體溶于6M鹽酸胍溶液中，離心去除沉淀后，透析除鹽，再用SDS-PAGE和WESTEN-BLOT檢測(cè)所表達(dá)蛋白的正確性。
實(shí)施例2VEGF突變基因與白喉毒素C區(qū)T區(qū)截短基因的融合基因smV8D的堿基序列(序列表SEQ ID NO3中)為ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTCATGCATAAATCTTGATTGGGATGTCATAAGGGATAAAACTAAGACAAAGATAGAGTCTTTGAAAGAGCATGGCCCTATCAAAAATAAAATGAGCGAAAGTCCCAATAAAACAGTATCTGAGGAAAAAGCTAAACAATACCTAGAAGAATTTCATCAAACGGCATTAGAGCATCCTGAATTGTCAGAACTTAAAACCGTTACTGGGACCAATCCTGTATTCGCTGGGGCTAACTATGCGGCGTGGGCAGTAAACGTTGCGCAAGTTATCGATAGCGAAACAGCTGATAATTTGGAAAAGACAACTGCTGCTCTTTCGATACTTCCTGGTATCGGTAGCGTAATGGGCATTGCAGACGGTGCCGTTCACCACAATACAGAAGAGATAGTGGCACAATCAATAGCTTTATCGTCTTTAATGGTTGCTCAAGCTATTCCATTGGTAGGAGAGCTAGTTGATATTGGTTTCGCTGCATATAATTTTGTAGAGAGTATTATCAATTTATTTCAAGTAGTTCATAATTCGTATAATCGTCCCGCGTATTCTCCGGGGCATAAAACGCAACCATTTCTTCATATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATAATGGCTATCGCTCCTGCCCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGAC CAAAGAAAGATAGAGCCAGACAAGAGAATGAATTCTAA(1)SEQ ID NO 3的信息(參見(jiàn)序列表)(a)序列特征*長(zhǎng)度1524堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源人VEGF165和白喉?xiàng)U菌。
融合基因smV8D的具體制備過(guò)程如下以人的VEGF cDNA為模板，運(yùn)用改良的重疊PCR在VEGF上引入六個(gè)突變點(diǎn)。從白喉?xiàng)U菌基因組中運(yùn)用PCR技術(shù)獲得DT截短基因，運(yùn)用基因重組技術(shù)把VEGF突變體基因連接到DT截短基因的3′端。融合基因構(gòu)建到到原核表達(dá)載體中，并在保存菌株中保存。
VEGF基因，DT基因參照實(shí)施例一中文獻(xiàn)制備，所用PCR試劑盒和內(nèi)切酶等均購(gòu)自大連寶生物公司。實(shí)驗(yàn)流程參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F奧斯伯等著科學(xué)出版社1998)和各產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下委托上海生工生物工程公司合成如下引物。
引物1(P1)GTT GTA AAA CGA CGA CCA GTG A引物2(P2)AGC AGG AGC GAT AGC CAT TAT CTG CAT GG引物3(P3)GCG ATC GCA CCT GCC CAA GGC CAG CAC，引物4(P4)TAG AAT TCA CAT ATG GCA GAA GGA GGA GG引物5(P5)GCG AAT TCA TTC TCT TGT CTG GCT CTA TC以本室制備的VEGF165為模板，以P4，P5為引物通過(guò)PCR法制得VEGF基因。PCR循環(huán)條件為94度30秒，72度30秒，55度30秒，循環(huán)30個(gè)循環(huán)。其余試劑用量均依然試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。制得的VEGF基因克隆入突變載體，以P1，P2，P3為引物，用改良突變法在此基因上引入突變。PCR反應(yīng)基本條件為94度預(yù)變性2分鐘，循環(huán)條件為94度30秒，72度30秒，55度30秒，循環(huán)30個(gè)循環(huán)。
改良突變法詳述如下1突變模板的制備取VEGF的PCR產(chǎn)物與突變載體連接。連接反應(yīng)使用寶生物的T4DNA連接酶，反應(yīng)條件依試劑說(shuō)明進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌株，轉(zhuǎn)化物鋪于IPTG-Xgal-Amp+LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑取八個(gè)白色菌落，懸浮于100ul無(wú)菌milli Q水中。振蕩混均，100℃加熱10min。取10ul混合物加水90ul，做十倍稀釋。此稀釋物命名為混合模板。
1.1突變反應(yīng)依以下條件做PCR反應(yīng)。
第一步VEGF N端編碼基因突變物和C端編碼基因突變物的合成取上一步中制成的混合模板1ul；P1，1ul；P2，1ul；Primix，25ul；ddH2O，22ul。分裝12.5ul/管。做梯度PCR反應(yīng)，退火溫度依次設(shè)定為43℃，48℃，53℃。VEGF C端編碼基因突變物的合成混合模板，1ul；P1，1ul；P3，1ul；Primix，25ul；ddH2O，22ul；分裝12.5ul/管。做梯度PCR反應(yīng)，退火溫度依次設(shè)定為43℃，48℃，53℃。
第二步VEGF突變物的合成VEGF N端編碼基因突變物0.5ul；VEGF C端編碼基因突變物，0.5ul；P1，1ul；Primix，25ul；ddH2O，23ul；做梯度PCR反應(yīng)，退火溫度依次設(shè)定為41.3℃，45.4℃，48.0℃，50.7℃，56℃。
1.2VEGF突變體基因的鑒定PCR產(chǎn)物走1％瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶(700bp)，用引物P4-P5，P1-P2，P1-P3做PCR鑒定。
2白喉毒素截短基因的制備委托上海生工生物工程公司合成如下引物引物6(P6)AGTCCATGGGCGCTGATGATGTTGTTG引物7(P7)ATACATATGAAGAAATGGTTGCGTTTTATG以P6，P7為引物，以白喉毒素全長(zhǎng)基因?yàn)槟０?，以PCR法制備白喉毒素截短基因。PCR反應(yīng)基本條件為94度預(yù)變性2分鐘，循環(huán)條件為94度30秒，72度30秒，50度30秒，循環(huán)35個(gè)循環(huán)。
3融合基因的制備制備的白喉毒素截短基因以Nco I和Nde I核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理。VEGF突變體基因以Nde I和EcoR I核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理。同時(shí)用NcoI和EcoR I核酸內(nèi)切酶對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行酶切處理。酶切條作依然寶生物公司的產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后，進(jìn)行連接反應(yīng)，連接條作同上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌株，轉(zhuǎn)讓化條件依文獻(xiàn)進(jìn)行(ChungCT，Niemela SL，Miller RH.One-step preparation of competent Escherichia colitransformation and storage of bacterial cells in the same solution.Proc NatlAcad Sci U S A.1989 Apr；86(7)2172-5)。經(jīng)大腸桿菌體內(nèi)擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒，送大連寶生物公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。
smV8D融合基因編碼的雜合蛋白PsmV8D的氨基酸序列(序列表SEQID NO4)為MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALWILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMAIAPAQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENEF.
(1)SEQ ID NO 4的信息(參見(jiàn)序列表)(a)序列特征*長(zhǎng)度507氨基酸殘基*類型蛋白(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)假設(shè)否(e)最初來(lái)源smV8D基因工程菌株。
PsmV8D的具體制備過(guò)程為以融合基因smV8D轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)菌株。轉(zhuǎn)化液鋪于Kan+LB固體培養(yǎng)基上，挑取轉(zhuǎn)化的菌落，接種于Kan+LB液體培養(yǎng)基，37度振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，用終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的雜合蛋白命名為PsmV8D。培養(yǎng)液置于冰上冷卻十分鐘，5000G離心十分鐘分離菌體后，用生理鹽水重懸菌體。-20度冷凍后融化，反復(fù)三次破碎細(xì)胞，14000G離心十分鐘，分離包含體，包含體溶于6M鹽酸胍溶液中，離心去除沉淀后，透析除鹽，再用SDS-PAGE和WESTEN-BLOT檢測(cè)所表達(dá)蛋白的正確性。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所<120>攻擊VEGFR1陽(yáng)性細(xì)胞的雜合毒素及其編碼基因<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1674<212>DNA<213>人VEGF165和白喉?xiàng)U菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1674)<223>
<400>latg ggc gct gat gat gtt gtt gat tct tct aaa tct ttt gtg atg gaa 48Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu1 5 10 15aac ttt tct tcg tac cac ggg act aaa cct ggt tat gta gat tcc att 96Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile20 25 30caa aaa ggt ata caa aag cca aaa tct ggt aca caa gga aat tat gac144Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp35 40 45gat gat tgg aaa ggg ttt tat agt acc gac aat aaa tac gac gct gcg192Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala50 55 60gga tac tct gta gat aat gaa aac ccg ctc tct gga aaa gct gga ggc240Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly65 70 75 80gtg gtc aaa gtg acg tat cca gga ctg acg aag gtt ctc gca cta aaa288Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys85 90 95gtg gat aat gcc gaa act att aag aaa gag tta ggt tta agt ctc act336
Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr100 105 110gaa ccg ttg atg gag caa gtc gga acg gaa gag ttt atc aaa agg ttc384Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe115 120 125ggt gat ggt gct tcg cgt gta gtg ctc agc ctt ccc ttc gct gag ggg432Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly130 135 140agt tct agc gtt gaa tat att aat aac tgg gaa cag gcg aaa gcg tta480Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu145 150 155 160agc gta gaa ctt gag att aat ttt gaa acc cgt gga aaa cgt ggc caa528Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln165 170 175gat gcg atg tat gag tat atg gct caa gcc tgt gca gga aat cgt gtc576Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val180 185 190agg cga tca gta ggt agc tca ttg tca tgc ata aat ctt gat tgg gat624Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp195 200 205gtc ata agg gat aaa act aag aca aag ata gag tct ttg aaa gag cat672Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His210 215 220ggc cct atc aaa aat aaa atg agc gaa agt ccc aat aaa aca gta tct720Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser225 230 235 240gag gaa aaa gct aaa caa tac cta gaa gaa ttt cat caa acg gca tta768Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu245 250 255gag cat cct gaa ttg tca gaa ctt aaa acc gtt act ggg acc aat cct816Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro260 265 270gta ttc gct ggg gct aac tat gcg gcg tgg gca gta aac gtt gcg caa864Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln275 280 285gtt atc gat agc gaa aca gct gat aat ttg gaa aag aca act gct gct912Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala
290 295 300ctt tcg ata ctt cct ggt atc ggt agc gta atg ggc att gca gac ggt 960Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly305 310 315 320gcc gtt cac cac aat aca gaa gag ata gtg gca caa tca ata gct tta 1008Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu325 330 335tcg tct tta atg gtt gct caa gct att cca ttg gta gga gag cta gtt 1056Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val340 345 350gat att ggt ttc gct gca tat aat ttt gta gag agt att atc aat tta 1104Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu355 360 365ttt caa gta gtt cat aat tcg tat aat cgt ccc gcg tat tct ccg ggg 1152Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly370 375 380cat aaa acg caa cca ttt ctt cat atg gca gaa gga gga ggg cag aat 1200His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn385 390 395 400cat cac gaa gtg gtg aag ttc atg gat gtc tat cag cgc agc tac tgc 1248His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys405 410 415cat cca atc gag acc ctg gtg gac atc ttc cag gag tac cct gat gag 1296His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu420 425 430atc gag tac atc ttc aag cca tcc tgt gtg ccc ctg atg cga tgc ggg 1344Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly435 440 445ggc tgc tgc aat gac gag ggc ctg gag tgt gtg ccc act gag gag tcc 1392Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser450 455 460aac atc acc atg cag ata atg gct atc gct cct gcc caa ggc cag cac 1440Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Ala Ile Ala Pro Ala Gln Gly Gln His465 470 475 480ata gga gag atg agc ttc cta cag cac aac aaa tgt gaa tgc aga cca 1488Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro485 490 495
aag aaa gat aga gca aga caa gaa aat ccc tgt ggg cct tgc tca gag1536Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu500 505 510cgg aga aag cat ttg ttt gta caa gat ccg cag acg tgt aaa tgt tcc1584Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser515 520 525tgc aaa aac aca gac tcg cgt tgc aag gcg agg cag ctt gag tta aac1632Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn530 535 540gaa cgt act tgc aga tgt gac aag ccg agg cgt gaa ttc taa1674Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg Glu Phe545 550 555<210>2<211>557<212>PRT<213>人VEGF165和白喉?xiàng)U菌<400>2Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu1 5 10 15Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile20 25 30Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp35 40 45Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala50 55 60Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly65 70 75 80Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys85 90 95
Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr100 105 110Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe115 120 125Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly130 135 140Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu145 150 155 160Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln165 170 175Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val180 185 190Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp195 200 205Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His210 215 220Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser225 230 235 240Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu245 250 255Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro260 265 270Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln275 280 285Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala
290 295 300Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly305 310 315 320Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu325 330 335Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val340 345 350Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu355 360 365Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly370 375 380His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn385 390 395 400His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys405 410 415His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu420 425 430Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly435 440 445Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser450 455 460Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Ala IIe Ala Pro Ala Gln Gly Gln His465 470 475 480Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro485 490 495
Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu500 505 510Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser515 520 525Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn530 535 540Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg Glu Phe545 550 555<210>3<211>1524<212>DNA<213>人VEGF165和白喉?xiàng)U菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1524)<223>
<400>3atg ggc gct gat gat gtt gtt gat tct tct aaa tct ttt gtg atg gaa 48Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu1 5 10 15aac ttt tct tcg tac cac ggg act aaa cct ggt tat gta gat tcc att 96Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile20 25 30caa aaa ggt ata caa aag cca aaa tct ggt aca caa gga aat tat gac144Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp35 40 45gat gat tgg aaa ggg ttt tat agt acc gac aat aaa tac gac gct gcg192Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala50 55 60gga tac tct gta gat aat gaa aac ccg ctc tct gga aaa gct gga ggc240Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly65 70 75 80
gtg gtc aaa gtg acg tat cca gga ctg acg aag gtt ctc gca cta aaa288Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys85 90 95gtg gat aat gcc gaa act att aag aaa gag tta ggt tta agt ctc act336Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr100 105 110gaa ccg ttg atg gag caa gtc gga acg gaa gag ttt atc aaa agg ttc384Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe115 120 125ggt gat ggt gct tcg cgt gta gtg ctc agc ctt ccc ttc gct gag ggg432Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly130 135 140agt tct agc gtt gaa tat att aat aac tgg gaa cag gcg aaa gcg tta480Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu145 150 155 160agc gta gaa ctt gag att aat ttt gaa acc cgt gga aaa cgt ggc caa528Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln165 170 175gat gcg atg tat gag tat atg gct caa gcc tgt gca gga aat cgt gtc576Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val180 185 190agg cga tca gta ggt agc tca ttg tca tgc ata aat ctt gat tgg gat624Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp195 200 205gtc ata agg gat aaa act aag aca aag ata gag tct ttg aaa gag cat672Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His210 215220ggc cct atc aaa aat aaa atg agc gaa agt ccc aat aaa aca gta tct720Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser225 230 235 240gag gaa aaa gct aaa caa tac cta gaa gaa ttt cat caa acg gca tta768Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu245 250 255gag cat cct gaa ttg tca gaa ctt aaa acc gtt act ggg acc aat cct816Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro260 265 270
gta ttc gct ggg gct aac tat gcg gcg tgg gca gta aac gtt gcg caa 864Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln275 280 285gtt atc gat agc gaa aca gct gat aat ttg gaa aag aca act gct gct 912Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala290 295 300ctt tcg ata ctt cct ggt atc ggt agc gta atg ggc att gca gac ggt 960Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly305 310 315 320gcc gtt cac cac aat aca gaa gag ata gtg gca caa tca ata gct tta1008Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu325 330 335tcg tct tta atg gtt gct caa gct att cca ttg gta gga gag cta gtt1056Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val340 345 350gat att ggt ttc gct gca tat aat ttt gta gag agt att atc aat tta1104Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu355 360 365ttt caa gta gtt cat aat tcg tat aat cgt ccc gcg tat tct ccg ggg1152Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly370 375 380cat aaa acg caa cca ttt ctt cat atg gca gaa gga gga ggg cag aat1200His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn385 390 395 400cat cac gaa gtg gtg aag ttc atg gat gtc tat cag cgc agc tac tgc1248His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys405 410 415cat cca atc gag acc ctg gtg gac atc ttc cag gag tac cct gat gag1296His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu420 425 430atc gag tac atc ttc aag cca tcc tgt gtg ccc ctg atg cga tgc ggg1344Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly435 440 445ggc tgc tgc aat gac gag ggc ctg gag tgt gtg ccc act gag gag tcc1392Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser450 455 460aac atc acc atg cag ata atg gct atc gct cct gcc caa ggc cag cac1440
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Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly130 135 140Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu145 150 155 160Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln165 170 175Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val180 185 190Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp195 200 205Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His210 215 220Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser225 230 235 240Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu245 250 255Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro260 265 270Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln275 280 285Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala290 295 300Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly305 310 315 320
Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu325 330 335Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val340 345 350Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu355 360 365Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly370 375 380His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn385 390 395 400His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys405 410 415His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu420 425 430Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly435 440 445Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser450 455 460Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Ala Ile Ala Pro Ala Gln Gly Gln His465 470 475 480Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro485 490 495Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Glu Phe500 50權(quán)利要求
1.一種攻擊VEGFR1陽(yáng)性細(xì)胞的雜合毒素，其特征在于具有序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
2.一種權(quán)利要求1所述攻擊VEGFR1陽(yáng)性細(xì)胞雜合毒素的編碼基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO1中的堿基序列。
3.一種攻擊VEGFR1陽(yáng)性細(xì)胞的雜合毒素，其特征在于具有序列表SEQ ID NO4中的氨基酸序列。
4.一種權(quán)利要求1所述攻擊VEGFR1陽(yáng)性細(xì)胞雜合毒素的編碼基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO3中的堿基序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因重組技術(shù)，具體地說(shuō)是兩種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子突變基因與白喉毒素C區(qū)T區(qū)的融合基因和其編碼的雜合蛋白，其為VEGFR1陽(yáng)性細(xì)胞的雜合毒素及其編碼基因。融合基因mV8D具有序列表SEQ ID NO1中的堿基序列；融合基因smV8D具有序列表SEQ ID NO3中的堿基序列；雜合蛋白PmV8D具有序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列；雜合蛋白PsmV8D具有序列表SEQ ID NO4中的氨基酸基序列。它們是以人的天然血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因?yàn)榛A(chǔ)，對(duì)其基因上的堿基進(jìn)行突變，再?gòu)陌缀矶舅鼐幋a基因中截取C區(qū)T區(qū)的編碼基因，進(jìn)行基因重組制成兩種融合基因，并在大腸桿菌中表達(dá)成相應(yīng)的有生物活性的蛋白。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1690080SQ200410020438
公開(kāi)日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2004年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月21日
發(fā)明者呂安國(guó), 白向陽(yáng), 吳文芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所