一種檢測(cè)磺胺嘧啶的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】一種檢測(cè)磺胺嘧啶的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)磺胺嘧啶的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括磺胺嘧啶特異性抗體及包被的磺胺嘧啶與載體蛋白的偶聯(lián)物和酶標(biāo)二抗，或包被的二抗和酶標(biāo)磺胺嘧啶。本發(fā)明的檢測(cè)磺胺嘧啶的酶聯(lián)免疫試劑盒能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品;主要試劑均以工作液形式提供，檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行；具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，將在動(dòng)物性食品和飼料磺胺嘧啶殘留量的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
【專利說明】一種檢測(cè)磺胺嘧啶的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種磺胺嘧啶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，屬于生物及食品安全檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。。
技術(shù)背景
[0002]磺胺嘧啶，作為磺胺類藥物的一種，其性質(zhì)穩(wěn)定、抑菌譜廣、毒性小、口服易吸收且價(jià)格低廉，是畜牧業(yè)上應(yīng)用最廣泛、應(yīng)用量最大的藥物之一。但是由于它在體內(nèi)的作用時(shí)間和代謝時(shí)間較長(zhǎng)，易殘留在動(dòng)物體內(nèi)，通過任何途徑都可能在人體中蓄積。藥物蓄積濃度超過一定值對(duì)人體機(jī)能是有害的，長(zhǎng)期蓄積則會(huì)導(dǎo)致磺胺藥抗藥性的產(chǎn)生，造成耐藥菌的流行性感染，且有潛在的致癌性。因此，歐盟對(duì)牛奶和肉類食品中的磺胺類藥物制定了最高允許值，即磺胺類藥物總量不得超過100呢/ kg，單個(gè)磺胺類藥物的濃度不得超過25呢/kg。2002年12月我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)文件規(guī)定在所有食品動(dòng)物的肌肉、脂肪、肝和腎中磺胺類最高殘留限量100 I^g / kg，并將磺胺嘧啶列作為重點(diǎn)監(jiān)控的對(duì)象。
[0003]目前，檢測(cè)磺胺嘧啶的方法有微生物法，物理化學(xué)法，如高壓液相色譜(HPLC)、氣-液色譜(GLC)、質(zhì)譜(MS)、薄層色譜法(TLC)等，微生物法檢測(cè)速度較快，但對(duì)磺胺藥缺乏靈敏性和特異性，物理化學(xué)法則存在前處理繁瑣，需要昂貴儀器及其專業(yè)操作等特點(diǎn)，檢測(cè)大批樣本較為困難，不利于大范圍的推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決 的技術(shù)問題是提供一種操作簡(jiǎn)便、快速、適合大批量樣品初篩的磺胺嘧啶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采取的技術(shù)方案:
本發(fā)明所提供的檢測(cè)磺胺嘧啶的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括磺胺嘧啶特異性抗體及包被的磺胺嘧啶與載體蛋白偶聯(lián)物和酶標(biāo)二抗，或包被的二抗和酶標(biāo)磺胺嘧啶。其中，所述磺胺嘧啶特異性抗體可為磺胺嘧啶單克隆抗體或磺胺嘧啶多克隆抗體，所述磺胺嘧啶單克隆抗體優(yōu)選為磺胺嘧啶鼠單克隆抗體，所述磺胺嘧啶多克隆抗體優(yōu)選為磺胺嘧啶兔多克隆抗體，以上抗體均可按常規(guī)方法制備；所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(0VA)、血蘭蛋白(KLH)等常用載體蛋白，所述磺胺嘧啶與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將磺胺嘧啶和載體蛋白用戊二醛法或重氮化法進(jìn)行偶聯(lián)得到；所述標(biāo)記酶可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸醋酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶可通過戊二醛法或過碘酸法交聯(lián)在抗體或磺胺嘧啶上所述二抗優(yōu)選為抗鼠或抗兔抗抗體。
[0006]為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色劑、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液。
[0007]所述濃縮洗滌液為含有0.8%-1.2%吐溫的磷酸鹽緩沖液；所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化氫脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述濃縮復(fù)溶液為含有0.1 %-0.5 %DMF的磷酸鹽緩沖液。[0008]本發(fā)明的檢測(cè)原理為將磺胺嘧啶與載體蛋白的偶聯(lián)物作為包被原吸附于固相載體上或?qū)⒖雇没蚩故蟮目箍贵w吸附于固相載體上，加入樣品和磺胺嘧啶特異性抗體，當(dāng)酶標(biāo)板為磺胺嘧啶與載體蛋白偶聯(lián)物包被的固相載體時(shí)，加入酶標(biāo)二抗，當(dāng)酶標(biāo)板為抗兔或抗鼠的抗抗體包被的固相載體時(shí)，加入酶標(biāo)磺胺嘧啶，待測(cè)樣品中殘留的磺胺嘧啶和固相載體上包被的磺胺嘧啶與載體蛋白偶聯(lián)物或酶標(biāo)磺胺嘧啶競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體，顯色后終止，測(cè)定樣品吸光值，該值與樣品中磺胺嘧啶殘留物含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)比較即可得出磺胺嘧啶的含量。
[0009]本發(fā)明的檢測(cè)磺胺嘧啶的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)動(dòng)物組織、血清、尿樣、蜂蜜、牛奶及飼料等樣品中磺胺嘧啶的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；采用高特異性的磺胺嘧啶單克隆抗體或多克隆抗體，主要試劑均以工作液形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行；高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，將在食品和飼料磺胺嘧啶殘留量的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
[0010]抗原的合成:
將磺胺嘧啶和人血清白蛋白(HSA)采用戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。將磺胺嘧啶和卵清蛋白(OVA)采用戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被原。
[0011]磺胺嘧啶鼠單克隆抗體制備:
動(dòng)物免疫程序采用BALB/C小鼠作為免疫動(dòng)物，以磺胺嘧啶與人血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為80-100呢/只，首免時(shí)將抗原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，力口強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
[0012]細(xì)胞融合與克隆化取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞，按5-10:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0013]細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成IX 106_5X IO6個(gè)ML的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
[0014]單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將BALB/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5 mL/只，7-14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5 X IO5 — IO6個(gè)/只，7-10天后采集腹水。經(jīng)辛酸一飽和硫酸按法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20°C保存。
[0015]磺胺嘧啶兔多克隆抗體的制備:
采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以磺胺嘧啶與人血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為I mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3-4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7-10天后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，頸動(dòng)脈放血，經(jīng)硫酸按分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。
[0016]二抗的制備:
以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠或兔IgG為免疫原進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠或羊抗兔抗抗體。
[0017]具體實(shí)施:包被板固相抗原制備:
將磺胺嘧啶抗原用50 mmol/L Na2CO3-NaHCO3 pH9.6緩沖液稀釋至10 mg/L的包被液，96孔微孔板各孔加100 ML，37 °C下避光孵育2 h，棄去包被液，洗滌2次，加入150 ML含有10%小牛血清的封閉液，37 °C下避光孵育1.5 h，棄去封閉液，拍干，晾干，板條密封后置-4
°C保存。
[0018]試劑的配制:
(1)磺胺11密唳標(biāo)準(zhǔn)品:(0ng/mL, 0.5 ng/mL, 1.5 ng/mL, 4.5 ng/mL, 13.5 ng/mL, 40.5ng/mL)，從磺胺嘧啶高標(biāo)中稀釋得到，稀釋液為甲醇:水體積比為4:6 ；
(2)洗滌液:14.5 mmol/L NaCl.0.2 mL/L Tween-80 和 0.2 %NaN3 的 50 mmol/LTris-HCl pH7.8 ；
(3)顯色液A:0.2 M Na2HP04 25.7 mL, 0.1 M 檸檬酸 24.3 mL 和 30% 的 H2O2 50 mL ；
(4)顯色液B:稱取5 mg四甲基聯(lián)苯二胺(TMB)加入2.5 mL無水乙醇中，可加熱至37°C~40 °C直到TMB完全溶解；
(5)終止液:2mol/L 的 H2SO4 ；
(6)樣品復(fù)溶液:用去離子水將2X濃縮樣品復(fù)溶液按1:1體積比進(jìn)行稀釋(1份2X濃縮樣品復(fù)溶液+1份去離子水)用于提取樣本的稀釋；
(7)洗滌工作液:用去離子水將20X濃縮洗滌液按1:19體積比進(jìn)行稀釋(1份20X濃縮洗滌液+19份去離子水) 用于酶標(biāo)板的洗滌；
(8)組織樣本提取液:將乙腈和丙酮按1:1體積比進(jìn)行稀釋(1份乙腈+1份丙酮)，用于組織樣本提??；
(9)蜂蜜樣本緩沖液:稱取20g氯化鈉，用去離子水溶解后定容至500mL。
[0019]實(shí)驗(yàn)室應(yīng)自備的試劑
甲醇、正己烷、乙腈、丙酮、去離子水等。
[0020]測(cè)定之前注意事項(xiàng)
1、使用之前將所有試劑和需用微孔板回升至室溫；
2、使用之后立即將所有試劑放回2l°C；
3、在使用中不要讓微孔干燥；
4、在ELISA分析中的重復(fù)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)；
5、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板；
6、取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-8°C。
[0021]實(shí)施例1檢測(cè)動(dòng)物組織(雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚、蝦)樣品 前處理:
1、稱取2.0±0.05 g勻漿樣品至50 mL離心管中；
2、加入8mL的組織樣本提取液(見配液3)，用渦旋儀振蕩3~5 min ；
3、4000r/min 離心 10 min ；
4、取ImL上層液體于另一離心管中在5(T60°C氮?dú)饬飨麓蹈桑?br> 5、向離心管中加入ImL正己烷，再加入I mL稀釋后的樣品復(fù)溶液并充分振蕩搖勻；6、4000r/min 離心 5 min ；
7、去除上層相，取下層液體50PL用于分析。
[0022]測(cè)定:
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20~25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
2、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本:加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μ?/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中，然后加入磺胺多殘抗試劑50 μ?7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min；
3、洗板:小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250μ?7孔，充分洗滌4-5次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；
4、加酶標(biāo)物:加入磺胺多殘的酶標(biāo)物100μ?7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min，取出重復(fù)洗板步驟6 ;
5、顯色:加入底物液A液50PL/孔，再加底物液B液50 PL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15~20 min ；
6、測(cè)定:加入終止液50μ?7孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630 nm檢測(cè)，請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測(cè)定每孔OD值。(建議用450/630 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)，在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算動(dòng)物組織(雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚、蝦)樣本中磺胺嘧啶的含量(若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測(cè)法可進(jìn)行判定)。
[0023]實(shí)施例2牛奶樣品的檢測(cè) 前處理:
1、將牛奶室溫4000r/min離心15 min,去除上層脂肪(脫脂奶可省去此步)；
2、將離心后的牛奶用去離子水5倍稀釋(1份牛奶+4份去離子水)并充分振蕩搖勻；
3、取50PL用于分析；
測(cè)定:具體測(cè)定步驟同實(shí)施例1。
[0024]實(shí)施例3蜂蜜樣品的檢測(cè) 前處理:
1、稱取1±0.05 g蜂蜜，加入2 mL蜂蜜樣本緩沖液(見配液4)，渦流振蕩至蜂蜜全部溶
解；
2、加入4mL乙腈,充分振蕩搖勻；
3、室溫4000 r/min 離心 IOmin ；
4、取上層有機(jī)相ImL于5(T60°C氮?dú)饬飨麓蹈桑?br> 5、加入ImL稀釋后的樣品復(fù)溶液溶解干燥的殘留物；
6、取50KL用于分析；
測(cè)定:具體測(cè)定步驟同實(shí)施例1。
[0025]實(shí)施例4尿液樣品的檢測(cè) 前處理
1、(如尿樣渾池須經(jīng)過濾或4000r/min以上，15°C離心10 min直至清亮),暫不使用的樣本需冷凍保存；
2、將尿液用去離子水1:2稀釋(即1份尿液+2份去離子水)；
3、取50PL用于分析； 測(cè)定:具體測(cè)定步驟同實(shí)施例1。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【權(quán)利要求】
1.一種磺胺嘧啶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，有一盒體，其特征在于所述盒體中包括: (1)包被有磺胺嘧啶抗原的酶標(biāo)板(96孔)； (2)磺胺嘧啶特異性抗體； (3)酶標(biāo)記物； (4)磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液； (5)底物A顯色液和底物B顯色液； (6)終止液; (7)濃縮洗滌液； (8)濃縮復(fù)溶液； 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺嘧啶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述磺胺嘧啶抗原由磺胺嘧啶半抗原和載體蛋白通過重氮化法偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清蛋白或鼠血清蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺嘧啶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述磺胺嘧啶特異性抗體為由所述磺胺嘧啶抗原按常規(guī)的免疫方法制備得到單克隆抗體或多克隆抗體，其工作液為PH 7.4的含有0.1-5%脫脂奶粉的磷酸緩沖液，磺胺嘧啶特異性抗體與上述工作液的比為1:2000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺嘧啶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗鼠或抗兔的抗抗體，其工作液為PH 7.4的含有0.1-5%脫脂奶粉的磷酸緩沖液，酶標(biāo)記物與上述工作液的比為1:4000，標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺嘧啶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為0吒/L、0.5 ^g/LU.5吒/L、4.5吒/L、13.5吒/L、40.5呢/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺嘧啶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述底物A為過氧化氫溶液，底物B為四甲基聯(lián)苯二胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺嘧啶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述組織樣本提取液為乙腈和丙酮混合溶液， 所述濃縮復(fù)溶液為含0.1%-0.6%DMSO的磷酸鹽緩沖液，所述濃縮洗滌液為含Tween-80的NaCl溶液，所述終止液為2 mol/L的硫酸溶液。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103808931SQ201210438069
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月6日
【發(fā)明者】杜道林, 張懌韡 申請(qǐng)人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司