降解黃曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的泉水單胞菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物學(xué)及生物降解領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及一種高效降解黃曲霉毒素 B1和髓曲霉毒素A的泉水單胞菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 曲霉類真菌毒素主要由黃曲霉、寄生曲霉和髓曲霉等曲霉菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn) 物，已分離鑒定了二十多種結(jié)構(gòu)類似物，其中W黃曲霉毒素B1 (AFB1)和髓曲霉毒素A(OTA) 毒性最大，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品工業(yè)中污染最為廣泛。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織 (WHO)癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物，因其具有強(qiáng)烈的致癌、致崎和致突變性，已逐漸成 為公共健康和科研領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。黃曲霉毒素和髓曲霉毒素污染谷物和油料作物已成為 全球性問題，在畜牧業(yè)中，兩類曲霉毒素可通過污染飼料危害動物健康，導(dǎo)致畜牧業(yè)生產(chǎn)率 低下，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并通過直接或間接（動物產(chǎn)品傳播）途徑污染食品，影響人類 的身體健康。動物從飼料中攝入AFB1或AFB2,經(jīng)體內(nèi)轉(zhuǎn)化為AFM1或AFM2,存在于奶、肉 和禽蛋中，污染人類食物鏈。2011年底，我國乳制品行業(yè)發(fā)生的黃曲霉毒素超標(biāo)事件即為 AFB1污染飼料導(dǎo)致奶制品AFM1超標(biāo)的典型案例，已引起我國政府和食品安全部口的高度 重視。隨著人們對真菌毒素危害性認(rèn)識的逐步加深，對于曲霉類真菌毒素檢測、污染防控和 脫毒技術(shù)方面的研究工作也在不斷深入，其與人們生活品質(zhì)、身體健康和經(jīng)濟(jì)利益休戚相 關(guān)。
[0003] 近幾年，發(fā)現(xiàn)了多種微生物對黃曲霉毒素具有顯著的降解或吸附作用。例如，下 酸弧菌屬度utyrivibriosp.)、乳酸桿菌（Xactobacillussp.)、鏈球菌（Str巧tococ州S sp.)、雙歧桿菌度ifidobacteriumsp.)和不動桿菌屬（Acinetobactersp.)等。目前報 道的絕大多數(shù)脫毒菌種在實(shí)際應(yīng)用中存在如下兩方面的共性問題：其一，部分脫毒菌種的 脫毒機(jī)理屬于物理吸附，并非實(shí)質(zhì)性的生物降解，吸附在菌體細(xì)胞壁的毒素，在動物或人體 內(nèi)不同理化環(huán)境下可能發(fā)生解吸附作用，沒有實(shí)質(zhì)性脫毒意義；其二，報道菌種對毒素的脫 毒率多數(shù)在100μg/kgW上較高濃度條件下測定，對于食品原料和飼料等復(fù)雜基質(zhì)中低濃 度曲霉類毒素（低于20yg/kg)的實(shí)際脫毒能力研究鮮見報道。然而，低劑量、復(fù)合污染及 高污染率又是曲霉類真菌毒素污染的普遍特征，而且20μg/kg的低濃度曲霉類真菌毒素 已能夠?qū)θ诵笈K器造成傷害，尤其是被多種毒素復(fù)合污染的農(nóng)產(chǎn)品，其毒性更具有顯著的 增效作用。因此，發(fā)掘具有降解低濃度條件下，多種曲霉類真菌毒素復(fù)合污染的脫毒菌種， 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全領(lǐng)域具有重大的實(shí)踐意義和應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種高效降解黃曲霉毒素B1和髓曲霉毒素A的泉水單胞菌 及其應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明從受多環(huán)芳控嚴(yán)重污染的±壤（煉油廠、汽車修理 廠附近）和受真菌毒素嚴(yán)重污染的霉?fàn)€食品樣品中分離出一株能夠高效降解黃曲霉毒素 B1和髓曲霉毒素A的菌株CW282。在顯微鏡或電鏡下觀察，該菌的主要形態(tài)學(xué)特征為：革蘭 氏陰性，無芽抱，短桿狀至桿狀，部分菌體有單根極生鞭毛，能運(yùn)動（圖1A和圖1B)。該菌嚴(yán) 格好氧，最適生長溫度為35-40°C，最適生長抑為7. 5-8. 5,在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天 后，呈現(xiàn)淡黃色半透明菌落，且菌落扁平不凸起，圓形至無規(guī)則形態(tài)。
[0006] 基于菌株CW282的形態(tài)特征和16SrDNA序列（SEQIDNo. 1)，參考《常見細(xì)菌系 統(tǒng)鑒定手冊》，將該菌株鑒定為泉水單胞菌（Silanimonassp.)。該菌株于2015年6月14 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（簡稱CCTCC，地址：中國武漢，武漢大學(xué)，郵編430072)， 保藏編號為CCTCCNO:M2015373。
[0007] 體外試驗(yàn)表明，菌株CW282在短時間具有顯著的髓曲霉毒素（OTA)和黃曲霉毒素 Bl(AFBl)的降解效果。在0TA終濃度為20yg/L的液體培養(yǎng)基中，菌株CW282處理2地， 對0TA的降解率為70. 7%，4化降解率達(dá)到95. 6% ;在AFB1終濃度為20μg/L的液體培養(yǎng) 基中，菌株CW282處理2地，對AFB1的降解率為86. 9 %，4化降解率達(dá)到91. 3 %。用菌株 CW282處理毒素污染的飼料（終濃度20μg/kg)，4化對0TA降解率為53. 2 %，AFB1降解率 為 58. 3%。
[0008] 本發(fā)明還提供含有泉水單胞菌CW282的菌劑及其復(fù)合微生物菌劑。
[0009] 本發(fā)明還提供由泉水單胞菌CW282或所述菌劑制備的黃曲霉毒素B1和髓曲霉毒 素A雙功能生物降解劑。
[0010] 優(yōu)選地，所述生物降解劑中活性成分為由所述菌劑制備的粗酶液。
[0011] 更優(yōu)選地，所述生物降解劑中活性成分為菌株CW282的發(fā)酵液、菌株CW282發(fā)酵液 經(jīng)離屯、所得上清液或菌體裂解液。
[0012] 其中，菌株CW282的發(fā)酵培養(yǎng)基為：膜蛋白腺17.0g/l，大豆腺3.0g/l，葡萄糖 2. 5g/l，rfeCl5.Og/l，K2HP〇42. 5g/L，W水配制。發(fā)酵條件為：37°C，180r/min振蕩培養(yǎng) 4她。
[0013] 本發(fā)明還提供泉水單胞菌CW282、所述菌劑和所述生物降解劑在黃曲霉毒素B1和 髓曲霉毒素A生物降解中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供泉水單胞菌CW282、所述菌劑和所述生物降解劑在霉變食品原料或 飼料脫毒處理中的應(yīng)用。
[0015] 其中，所述霉變食品原料或飼料中黃曲霉毒素B1和髓曲霉毒素A的含量分別為 20μg/kg及W下，但不局限于20μg/kg及W下濃度。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提供泉水單胞菌CW282或所述菌劑在制備黃曲霉毒素B1和髓曲霉 毒素A雙功能高效生物降解劑中的應(yīng)用。 陽017] 與現(xiàn)有的黃曲霉毒素降解菌相比，本發(fā)明的泉水單胞菌CW282能夠在低濃度黃曲 霉毒素B1和髓曲霉毒素A污染條件下達(dá)到極佳的降解效果。根據(jù)國家食品及飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 規(guī)定，谷物類農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉毒素含量必須低于20μg/kg，髓曲霉毒素含量不得超過5μg/ kg，飼料中的髓曲霉毒素A也不得超過100yg/kg(GB2761-2011，GB13078.2-2006)。實(shí) 際上，動物毒理實(shí)驗(yàn)表明，連續(xù)喂養(yǎng)含有20μg/kg毒素的飼料，就可W對大鼠的內(nèi)臟器官 造成嚴(yán)重的傷害（Weietal.，2014D0I10. 1002/jsfa. 6649)。因此，菌株CW282對低濃度 AFB1和0TA具有高效的降解脫毒能力，在食品/飼料生物脫毒應(yīng)用方面具有實(shí)質(zhì)性的應(yīng)用 價值和重大意義。
【附圖說明】 陽0化]圖1A和圖1B為本發(fā)明菌株CW282的電子顯微鏡照片。
[0019] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中菌株CW282發(fā)酵液及粗酶液對曲霉毒素的動態(tài)降解曲 線。
[0020] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中菌株CW282發(fā)酵液對飼料中曲霉毒素的降解效率。
【具體實(shí)施方式】
[0021] W下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0022] 實(shí)施例1黃曲霉毒素B1和髓曲霉毒素A降解菌的篩選、鑒定和培養(yǎng)
[0023] 1、菌株的篩選
[0024] 樣品采集自受多環(huán)芳控嚴(yán)重污染的±壤（煉油廠、汽車修理廠附近）和受真菌毒 素嚴(yán)重污染的霉?fàn)€食品。取采集樣品〇.5g加入150mL富集培養(yǎng)基中（0TA和AFB1含量各為 20μg/L左右），在30°C恒溫培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)7天。第一次富集培養(yǎng)結(jié)束后，取5mL富集培 養(yǎng)液接種到150mL新鮮的0TA和AFB1富集培養(yǎng)基中，將0TA和AFB1的濃度提高到30μg/ L在相同條件下繼續(xù)富集培養(yǎng)7天。W相同的富集方法完成第Ξ次富集培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，提高OTA 和AFB1的濃度至50μg/L。富集培養(yǎng)結(jié)束后，用無菌水將富集培養(yǎng)液作梯度稀釋，將梯度 稀釋液分別涂布于0TA或AFB1固體分離培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，挑取 培養(yǎng)皿單菌落接種于含有0TA和AFB1各20μg/L的富集培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行降解測試培養(yǎng)4她， 同時設(shè)置不接菌的陰性對照。降解培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液經(jīng)二氯甲燒提取，按照國家標(biāo)準(zhǔn)高效 液相色譜巧光檢測法（HPLC-FLD，參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T25220-2010和GB/T 18979-2003進(jìn)行）檢測培養(yǎng)液中兩類毒素殘留濃度，與對照相比計(jì)算降解率。最終，分離獲 得一株在低濃度0TA和AFB1條件下（0TA和AFB1含量《20μg/L)仍保持高效降解率的菌 株CW282。 陽0巧]其中，富集培養(yǎng)基為：葡萄糖5.Og/l，蛋白腺5.Og/l，酵母粉2. 5g/l，巧樣酸錠 1.Og/L，NaAc·抓2〇 2. 5g/L，MnS〇4· 4&0 0. 05g/L，K2HPO4I.Og/L，Μ拆〇4· 7&0 0. 2g/L，吐 溫-800. 5血，0TA添加濃度 20-50μg/L，AFB1 添加濃度 20-50μg/L，調(diào)抑至6. 2-6. 5。 [00%] 分離培養(yǎng)基為：葡萄糖10.Og/l，蛋白腺10.Og/l，酵母粉5.Og/l，巧樣酸錠2.Og/ L，Μ拆O4· 7&0 0. 58g/L，NaAc·抓2〇 5.Og/L，MnS〇4· 4&0 0. 28g/L，吐溫-801. 0血，調(diào)抑 至6. 2-6. 5。
[0027] 上述培養(yǎng)基在120°C條件下高壓滅菌15min，使用前添加無菌0TA和AFB1毒素標(biāo) 準(zhǔn)溶液至規(guī)定濃度，固體培養(yǎng)基按W上配方加2. 0%的瓊脂粉。
[0028] 2、菌株CW282的鑒定
[0029] 菌株CW282的主要形態(tài)學(xué)特征為：革蘭氏陰性，無芽抱，短桿狀至桿狀，部分菌體 有單根極生鞭毛，能運(yùn)動（圖1A和圖1B)。該菌嚴(yán)格好氧，最適