一株陰溝腸桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物根際促生菌及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株促進(jìn)煙草生長(zhǎng)的具 有解憐和產(chǎn)IAA功能的陰溝腸桿菌及其促生特性的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草是茄科（Solanaceae)煙草屬（Nicotiana) -年生草本植物。喜溫、喜光、耐 旱、怕潰、耐瘡、需鐘較多。煙草葉、莖、花專和果都有多細(xì)胞的毛，其中腺毛細(xì)胞中含有葉綠 素，能綜合含有樹(shù)膠和樹(shù)脂的滲出物，與煙草的香氣有一定關(guān)系。煙草葉柄不明顯或成翅狀 柄，其圓錐花序頂生，花專筒狀，花冠漏斗狀，末端粉紅色。葫果，種子黃褐色。煙草原產(chǎn)于南 美洲，因其葉片含煙堿（尼古下），采收后經(jīng)過(guò)調(diào)制、分級(jí)和加工處理，可制卷煙、雪茄煙、旱 煙等，是煙草工業(yè)重要的原料。近年來(lái)我國(guó)煙田施肥出現(xiàn)很大的問(wèn)題，具體表現(xiàn)為：（1)肥 料利用率不高，有資料表明我國(guó)烤煙肥料利用率較低，南方一些省份肥料利用率僅20%左 右。其原因是對(duì)肥料利用率的相關(guān)性技術(shù)缺乏深入研究，特別是對(duì)南方煙區(qū)肥料流失的控 制和北方煙區(qū)的營(yíng)養(yǎng)吸收障礙等沒(méi)有從根本上研究解決；(2)煙田±壤肥力不同程度出現(xiàn) 下降趨勢(shì)，由于缺乏良好的培肥地力措施，加之輪作條件差，煙田常年連作，±壤主要營(yíng)養(yǎng) 元素都不同程度出現(xiàn)下降趨勢(shì)，同時(shí)±壤物理性狀變劣；（3)營(yíng)養(yǎng)不平衡，重氮輕憐缺鐘； (4)對(duì)旱作煙草的施肥技術(shù)缺乏研究。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)植物根際±壤中含有一些可W促進(jìn)植物生長(zhǎng)的微生物，一般有固氮、解 憐、釋鐘、產(chǎn)生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一能力的細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌等。 統(tǒng)稱為植物根際促生菌（PGPR)，其促生作用機(jī)制主要有W下幾大類：提供植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、 產(chǎn)生植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、植物根際生物修復(fù)劑和環(huán)境脅迫調(diào)節(jié)劑等。但篩選出具有多種功 能且高效的微生物菌株一直是本領(lǐng)域追尋的目標(biāo)。
[0004] 煙草吸收大量元素氮、憐、鐘，中量元素巧、儀、硫化及微量元素棚、鋒、銅、儘、鐵等 營(yíng)養(yǎng)元素。吸收規(guī)律是生長(zhǎng)初期（移栽后至團(tuán)棵前）少，中期（團(tuán)棵至打頂前）吸收量最 多，后期（打頂后）吸收量逐漸減少，整個(gè)生長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)吸收呈S型曲線?！廊乐鞋F(xiàn)有的憐并 不能滿足煙草生長(zhǎng)的需要。±壤中含有大量有機(jī)物，可W利用？61^將±壤中的含憐的有 機(jī)物分解，產(chǎn)生可W供給煙草使用的憐。既為煙草補(bǔ)充了營(yíng)養(yǎng)元素又避免了過(guò)多施用化學(xué) 肥料的弊端，比如容易污染環(huán)境，使±壤板結(jié)使煙草田的±質(zhì)受到破壞，損耗±壤中的有機(jī) 物，降低了±壤肥力等。而且目前還未見(jiàn)同時(shí)具有高效解憐和產(chǎn)IAA功能的陰溝腸桿菌及 其促進(jìn)煙草生長(zhǎng)的應(yīng)用報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株陰溝腸桿菌及其促進(jìn)煙草生長(zhǎng)的應(yīng)用，該菌株具有解憐 和產(chǎn)生長(zhǎng)素IAA的作用。
[0006] 一株陰溝腸桿菌巧nterobactercloacae)JP6,該菌株保藏編號(hào)：CGMCCNo. 9615。 保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（CGMCC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期：2014年8月28日。
[0007] 所述的陰溝腸桿菌的培養(yǎng)條件，采用LB培養(yǎng)基：蛋白腺lOg，酵母浸膏5g，NaCl lOg，蒸饋 1000ml，121°C滅菌 20min，培養(yǎng)溫度 37°C，pH7. 0。
[0008] 所述的陰溝腸桿菌的應(yīng)用，用于解憐和/或產(chǎn)生長(zhǎng)素ΙΑΑ，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。 所述的的植物包括煙草。
[0009] 本發(fā)明菌株培養(yǎng)后得到菌懸液作為液態(tài)菌劑使用，菌懸液的菌數(shù)濃度>l〇Sc化/ mL。菌劑的使用方法：緩苗后灌根，每株煙苗加菌劑ImL。
[0010] 本發(fā)明菌株的菌落及菌體特征為：該菌株在LB培養(yǎng)基（酵母浸膏5g，蛋白腺lOg， 氯化鋼lOg，蒸饋水1000血，瓊脂15~20g，121°C滅菌20min，抑7. 0,37°C)上培養(yǎng)4化后 菌落呈圓形，不透明，表面干燥無(wú)隆起，淡黃色，邊緣整齊。菌體呈球狀，不產(chǎn)芽抱，革蘭氏染 色陰性。
[0011] 該菌株的生理生化特征為：甲基紅試驗(yàn)陰性、V-P試驗(yàn)陰性、淀粉水解試驗(yàn)陽(yáng)性、 硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性、嗎I噪試驗(yàn)陽(yáng)性、硫化氨試驗(yàn)陽(yáng)性、巧樣酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性、葡萄糖發(fā) 酵試驗(yàn)陰性、薦糖發(fā)酵試驗(yàn)陰性、麥芽糖發(fā)酵試驗(yàn)陰性、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性、甘露醇發(fā)酵試 驗(yàn)陰性、葡萄糖碳源利用試驗(yàn)陽(yáng)性、乳糖碳源利用試驗(yàn)陽(yáng)性、甘露醇碳源利用試驗(yàn)陽(yáng)性、薦 糖碳源利用試驗(yàn)陽(yáng)性、麥芽糖碳源利用試驗(yàn)陽(yáng)性、巧樣酸碳源利用試驗(yàn)陰性、2 %NaCl耐鹽 試驗(yàn)陽(yáng)性、5 %化C1耐鹽試驗(yàn)陽(yáng)性、7 %化C1耐鹽試驗(yàn)陽(yáng)性、10%化C1耐鹽試驗(yàn)陰性、產(chǎn)氨 試驗(yàn)陽(yáng)性。
[0012] 該菌株的最適培養(yǎng)條件為：酵母浸膏5g，蛋白腺lOg，氯化鋼lOg，蒸饋水lOOOmL， 瓊脂15~20g，抑7. 0,溫度37°C。
[0013] W上菌株可W用于制備微生物菌劑，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)得菌懸液，作為液態(tài)菌劑。
[0014] 菌懸液的菌數(shù)濃度> 108c化/血。
[0015] 菌劑的使用方法：緩苗后灌根每株煙苗加菌劑ImL。
[0016] 經(jīng)研究表明，對(duì)本發(fā)明的菌株的功能測(cè)定結(jié)果如下：在蒙金娜固體培養(yǎng)基（葡 萄糖lOg，（畑4)25〇4〇. 5g，NaCl0. 3g，Μ拆〇4· 7&0 0. 3g，F(xiàn)eS〇4〇. 03g，MnS〇4· &0 0. 03g; CaC〇35.Og，KCl0. 3g，Ca3(P〇4) 225.Og，卵憐脂 0. 3g，瓊脂 18 ~20g，pH值 7. 2 ~7. 4)上培養(yǎng) 一周后，測(cè)得第一天其菌落直徑d為3. 5mm，溶憐圈直徑D為4. 5mm，D/d為1. 3,第Ξ天其菌 落直徑d為4. 5mm，溶憐圈直徑D為12mm，D/d為2. 7,第屯天其菌落直徑d為5mm，溶憐圈直 徑D為 13mm，D/d為 2.6。在無(wú)機(jī)憐液體培養(yǎng)基（CeHizOelO.Og，（畑4)25〇4〇. 5g，化CIO. 3g，KCl 0. 3g，M拆04·7Η20 0. 3g，F(xiàn)eS〇4*7H2〇 0. 03g，MnS〇4*4H2〇 0. 03g，Ca3(P〇4)225.Og，水 1000血， pH7. 0-7. 5。）培養(yǎng)4天后，用鋼藍(lán)比色法測(cè)定培養(yǎng)液中速效憐的含量變化，從而反應(yīng)細(xì)菌 的解憐能力，測(cè)得JP6培養(yǎng)液中速效憐含量為50.Img/L。在含有k色氨酸（200mg/L)的R2A 液體培養(yǎng)基（酵母粉0. 5g，膜蛋白腺0. 5g，酪蛋白氨基酸0. 5g，葡萄糖0. 5g，可溶性淀粉 0.5g，K2HP〇4〇. 3g，M拆〇4.7&00. 05g，丙酬酸鋼 0. 3g。）中，28°C，180R/min，搖床培養(yǎng) 4d后 取50μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時(shí)加50μLSa化owski比色液巧0血35%肥1〇4+1血 0. 5mol/L化CI3)白色陶瓷板于室溫避光放置30min后觀察，顏色變紅表示能夠分泌IAA， 然后用分光光度法測(cè)定菌懸液的0D600值，然后將菌懸液lOOOOR/min離屯、lOmin，取上清 液加入等體積Sa化owski比色液，避光靜置30min使其顯色，測(cè)定其0D530值，計(jì)算菌濃度 0D600值為1時(shí)，IAA的濃度，測(cè)得JP6發(fā)酵液中IAA含量為128. 9mg/血。盆栽30天時(shí)經(jīng) JP6處理的煙株葉片數(shù)大于對(duì)照，最大葉片表面積也大于對(duì)照，但是沒(méi)有達(dá)到顯著差異，60 天時(shí)經(jīng)JP6處理的煙株株高、莖圍、最大葉片表面積、葉片數(shù)均高于對(duì)照，90天時(shí)經(jīng)JP6處理 的煙株株高、葉片數(shù)與對(duì)照達(dá)到顯著差異，經(jīng)JP6處理的煙草植株的根、莖、葉、植株總鮮重 均好于對(duì)照處理，且均達(dá)到顯著差異，在采收后對(duì)生物量的統(tǒng)計(jì)中可W看出植株的根、莖、 葉干重W及植株總干重均要優(yōu)于對(duì)照，同時(shí)莖干重、植株總干重均在達(dá)到顯著差異。與對(duì)照 相比，根干重增幅為60.8%，莖干重增幅為54. 5%，葉總干重增幅為10. 1%，植株干重增幅 為24. 9 %。W上研究結(jié)果表明，JP6菌株可W很好的促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，在促進(jìn)煙草生長(zhǎng)方面具 有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[0017] 本發(fā)明陰溝腸桿菌巧nterobacter cloacae)JP6。保藏單位：中國(guó)微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（CGMCC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日 期：2014年8月28日，保藏編號(hào)：CGMCCNo.9615。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為60天和90天JP6處理與對(duì)照的煙株株高柱形圖；
[0019] 圖2為60天和90天JP6處理與對(duì)照的煙株莖圍柱形圖；
[0020] 圖3為30天、60天和90天JP6處理與對(duì)照的煙株最大葉表面積柱形圖；
[0021] 圖4為30天、60天和90天JP6處理與對(duì)照的煙株葉片數(shù)柱形圖；
[0022] 圖5為JP6處理與對(duì)照的煙株鮮生物量柱形圖；
[0023] 圖6為JP6處理與對(duì)照的煙株干生物量柱形圖；
[0024] 圖7為JP6解憐效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[00巧]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[00%] 本發(fā)明的陰溝腸桿菌巧nterobacter cloacae)JP6,保藏單位：中國(guó)微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（CGMCC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日 期：2014年8月28日，保藏編號(hào)：CGMCCNo.9615。
[0027] (1)CGMCCNo.9615 的篩選
[0028] 在牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基富集的過(guò)程：稀釋平板培養(yǎng)法分離，稱取采自湖南桑 植官地坪煙田新鮮±壤lOg，置于內(nèi)含玻璃珠和90血無(wú)菌水的250血Ξ角瓶中，170r/min 振蕩30min，然后按105、106、107梯度進(jìn)行稀釋，各取0.1血涂布于賴桿培養(yǎng)基（新鮮的稻 草賴桿300g，瓊脂25g，水lOOOmL12rC高壓蒸汽滅菌25min。）平板和無(wú)機(jī)憐培養(yǎng)基（葡 萄糖 10.Og，（畑4)25〇4〇. 5g，NaCl0. 3g，KC1 0. 3g，Μ拆〇4· 7&0 0. 3g，F(xiàn)eS〇4· 7&0 0. 03邑， MnS〇4· 4&00. 03g，Ca3(P〇4)225.Og，水 1000血抑 7. 0-7.