一種用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，其包括，蛋白胨10～25g/L、牛肉浸出粉2～10g/L、NaCl 3～10g/L、細菌瓊脂粉15～20g/L、第一抑制劑0.2～1.0g/L、第二抑制劑0.1～1.0g/L、葡萄糖苷酶顯色底物0.1g/L～0.3g/L、助溶劑1ml～10ml。本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基用于檢測阪崎腸桿菌具有靈敏度高，特異性強，辨識度高、檢測周期短、易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。
【專利說明】
-種用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種微生物檢測用培養(yǎng)基，尤其設(shè)及一種用于檢測阪崎腸桿菌的顯色 培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 阪崎腸桿菌化.sakazakii)，為革蘭氏陰性無芽抱桿菌，是人和動物腸道正常菌叢 中的一種，為條件致病菌。在1980年之前一直被稱為黃色陰溝腸桿菌。直到化rmer提出該菌 是一個新種，屬腸桿菌科腸桿菌屬。2008年Iversen建議將阪崎腸桿菌重新分類命名，成為 腸桿菌科1個新屬。阪崎腸桿菌能引起嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和茵血癥，死亡率 高達50% W上。1961年，F(xiàn)ranklin等首次報道了2例由阪崎腸桿菌引起的腦膜炎病例。W后 相繼在世界范圍內(nèi)報道了一系列新生兒阪崎腸桿菌感染事件。截止2011年，微生物學(xué)家尚 不清楚阪崎腸桿菌的污染來源，但許多病例報告表明嬰兒配方粉是發(fā)現(xiàn)的主要感染渠道。 隨著運一重要條件致病菌頻在嬰兒配方奶粉中檢出，2005年我國出臺《奶粉中阪崎腸桿菌 檢測方法》的行業(yè)標準，填補了國內(nèi)無阪崎腸桿菌檢測標準和方法的空白。隨后，2008年出 臺了關(guān)于阪崎腸桿菌檢驗的國家食品安全標準。雖然目前采用分子生物學(xué)方法檢測致病菌 發(fā)展的如火如茶，但是傳統(tǒng)檢測方法因其成本低、使用面廣，易實現(xiàn)等有點短期內(nèi)還是難W 被完全取代。
[0003] 阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基是利用阪崎腸桿菌自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物反 應(yīng)顯色的原理來檢測阪崎腸桿菌的新型培養(yǎng)基。運些相應(yīng)的顯色底物是由產(chǎn)色基因和微生 物部分可代謝物質(zhì)組成，在特異性酶作用下，游離出產(chǎn)色基因顯示一定顏色，直接觀察菌落 顏色即可對菌種作出鑒定。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)a-葡萄糖巧酶是用來快速區(qū)分阪崎腸桿菌和其它腸 桿菌的可靠方法。
[0004] 目前，2010版國家食品安全標準中檢測阪崎腸桿菌依然沿用的顯色培養(yǎng)基和生化 鑒定的方法。在DFI瓊脂(阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基)上，阪崎腸桿菌產(chǎn)生的a-葡萄糖巧酶和培 養(yǎng)基中顯色底物反應(yīng)后形成無色帶綠色中屯、的菌落，但是由于普通變形桿菌亦能在DFI瓊 脂上形成帶綠色中屯、的菌落，造成干擾;DFI瓊脂平板外觀為棟黃色，顏色差異較小，不易觀 察。國內(nèi)某品牌的阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基低溫放置后會出現(xiàn)點結(jié)晶，疑似染菌現(xiàn)象，影響外 觀。法國科瑪嘉阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基亦由于奇異變形桿菌可產(chǎn)生蔓延的綠色菌落而影響 其特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本部分的目的在于概述本發(fā)明的實施例的一些方面W及簡要介紹一些較佳實施 例。在本部分W及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略W避免使本部 分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而運種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。
[0006] 鑒于上述和/或現(xiàn)有用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基中存在的問題，提出了本 發(fā)明。
[0007] 因此，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測阪崎腸桿菌的 顯色培養(yǎng)基，其能夠有效避免培養(yǎng)基平板表面外觀不均一透明W及奇異變形桿菌出現(xiàn)弱陽 性的現(xiàn)象。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種用于檢測阪崎腸桿菌的 顯色培養(yǎng)基，其包括，蛋白腺10~25g/L、牛肉浸出粉2~lOg/L、化C13~lOg/L、細菌瓊脂粉 15~20g/L、第一抑制劑0.2~l.Og/L、第二抑制劑0.1~l.Og/L、葡萄糖巧酶顯色底物O.lg/ L ~0.3g/L、助溶劑 Iml ~10ml。
[0009] 作為本發(fā)明所述用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基的一種優(yōu)選方案，其中：所述 蛋白腺為細菌學(xué)蛋白腺、膜蛋白腺、酪蛋白腺及示蛋白腺的一種或幾種。
[0010] 作為本發(fā)明所述用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基的一種優(yōu)選方案，其中：所述 蛋白腺為膜蛋白腺，且每1000 ml培養(yǎng)基含有膜蛋白腺IOg。
[0011] 作為本發(fā)明所述用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基的一種優(yōu)選方案，其中：所述 第一抑制劑為十二烷基橫酸鋼、脫氧膽酸鋼或=號膽鹽中的一種或幾種。
[0012] 作為本發(fā)明所述用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基的一種優(yōu)選方案，其中：所述 第一抑制劑為脫氧膽酸鋼，且每1000 ml培養(yǎng)基含有脫氧膽酸鋼0.4g。在此，實驗證明：十二 烷基橫酸鋼在滅菌冷卻后的培養(yǎng)基中有結(jié)晶析出，影響外觀。
[0013] 作為本發(fā)明所述用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基的一種優(yōu)選方案，其中：所述 第二抑制劑為巧樣酸鋼、硫代硫酸鋼、結(jié)晶紫或新生霉素中的一種或幾種。
[0014] 作為本發(fā)明所述用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基的一種優(yōu)選方案，其中：所述 第二抑制劑為硫代硫酸鋼，且每1000 ml培養(yǎng)基含有硫代硫酸鋼0.4g。
[0015] 作為本發(fā)明所述用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基的一種優(yōu)選方案，其中：所述 葡萄糖巧酶顯色底物為5-漠-4-氯-3-嗎I噪-a-D-葡萄糖巧，且每1000 ml培養(yǎng)基含有5-漠-4-氯-3-嗎I噪-a-D-葡萄糖巧0.13g。阪崎腸桿菌在a-D-葡萄糖巧酶的作用下水解顯色底物，釋 放出顯色基團，是菌落呈現(xiàn)出特有的顏色
[0016] 作為本發(fā)明所述用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基的一種優(yōu)選方案，其中：所述 助溶劑為水、乙醇、甲醇和N，N-二甲基甲酯胺的一種或幾種。
[0017] 作為本發(fā)明所述用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基的一種優(yōu)選方案，其中：所述 助溶劑為N，N-二甲基甲酯胺，且每1 OOOml培養(yǎng)基含有N，N-二甲基甲酯胺3ml。
[0018] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基用于檢測阪崎腸桿菌具有靈敏度高，特 異性強，辨識度高、檢測周期短、易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0019] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用 的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可W根據(jù)運些附圖獲得其它 的附圖。其中：
[0020] 圖1為蛋白腺種類W及含量對阪崎腸桿菌的影響示意圖；
[0021 ]圖2為不同營養(yǎng)成分對阪崎腸桿菌的影響示意圖；
[0022]圖3為膜蛋白腺濃度對阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基顯色效果的影響示意圖。
【具體實施方式】
[0023] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實施例對 本發(fā)明的【具體實施方式】做詳細的說明。
[0024] 在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)W便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可W 采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的 情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。
[0025] 其次，此處所稱的"一個實施例"或"實施例"是指可包含于本發(fā)明至少一個實現(xiàn)方 式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的"在一個實施例中"并非均指 同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。
[00%] 實施例1
[0027] -種用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，每1000 ml培養(yǎng)基含有膜蛋白腺lOg、牛肉 浸出粉5g、化Cl 5g、細菌瓊脂粉16g、脫氧膽酸鋼0.4g、硫代硫酸鋼0.4g、5-漠-4-氯-3-嗎I 噪-a-D-葡萄糖巧0.13g、N，N-二甲基甲酯胺3ml。
[00%]根據(jù)實施例1，共稱取本品7.35g加入200ml水中完全溶解，煮沸冷卻至50°C左右， 傾入無菌平皿，制備好的平板于2-8°C避光保存。
[00巧]根據(jù)實施例1，共稱取本品7.35g加入200ml水中完全溶解，121°C高壓滅菌15min， 冷卻至50°C左右，傾入無菌平皿，制備好的平板于2-8°C避光保存。
[0030] 將阪崎腸桿菌標準菌株ATCC29544和ATCC51392分別劃線接種于兩種滅菌方式制 得的阪崎腸桿菌顯色平板上，結(jié)果表明差異不顯著，培養(yǎng)基各組分熱穩(wěn)定性較好，故選用 12rC高壓滅菌ISminW保證充分滅菌，延長培養(yǎng)基固體平板使用保質(zhì)期。
[0031] 特異性實驗；
[0032] 將阪崎腸桿菌ATCC29544、阪崎腸桿菌ATCC51392、大腸埃希氏菌ATCC25922、鼠傷 寒沙口氏菌ATCC14028、弗氏巧樣酸桿菌ATCC43864、銅綠假單胞菌ATCC9027、福氏志賀氏菌 CMCC51572、產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048、陰溝腸桿菌CMCC45301、粘質(zhì)沙雷伯菌CMCC41002、普通 變形桿菌CMCC49027、奇異變形桿菌CMCC49005、金黃色葡萄球菌ATCC25923和糞腸球菌 ATCC29212等14種標準菌株和9種收集到的阪崎腸桿菌陽性菌株制成適當濃度的菌懸液(濃 度為IO8-IO 9C即/ml),分別劃線接種到實施例1制成的顯色培養(yǎng)基上(簡稱SWM)、DFI瓊脂(阪 崎顯色培養(yǎng)基）、科瑪嘉阪崎顯色培養(yǎng)基W及國內(nèi)某品牌阪崎顯色培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)2地， 檢測結(jié)果見表1。
[0033] 表1幾種顯色培養(yǎng)基特異性檢測結(jié)果
[0034]
[0035]
[0036] 結(jié)果見表1，兩株阪崎腸桿菌標準菌株和9種陽性菌株在SWM上均生長良好，陽性菌 落為藍綠色，顏色鮮亮易區(qū)分，易辨性優(yōu)于DF巧日國內(nèi)某品牌。特異性方面，幾種品牌均能顯 示陽性菌落特有的色澤，SWM與其它品牌相差不大，金黃色葡萄球菌和糞腸球菌等菌落在運 幾種品牌培養(yǎng)基上均受抑制，其它菌株為無色或淡黃色菌落。對阪崎腸桿菌檢測有干擾的 菌株主要有普通變形桿菌和奇異變形桿菌，普通變形桿菌在DFI平板上亦為無色菌落帶綠 色中屯、，不可W與阪崎腸桿菌相區(qū)分，奇異變形桿菌在科瑪嘉顯色平板上為淡綠色且有輕 微蔓延，對阪崎腸桿菌的檢測有一定的干擾。另外DFI顯色平板為襯色，顏色為黃棟色，阪崎 腸桿菌菌落為無色帶綠色中屯、，不易觀察；國內(nèi)某品牌平板經(jīng)冷藏后，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)結(jié) 晶，類似染菌現(xiàn)象，給客戶帶來困擾。SWM阪崎顯色培養(yǎng)基在研制過程中克服W上問題，冷藏 后不結(jié)晶，具有目標菌呈現(xiàn)特有顏色，變形桿菌為無色菌落，平板外觀為白色透明等優(yōu)點。
[0037] 將有代表性及干擾性強的阪崎腸桿菌ATCC29544、普通變形桿菌CMCC49027、大腸 埃希氏菌ATCC25922、奇異變形桿菌CMCC49005,糞腸球菌ATCC29212制成混合菌懸液，取一 環(huán)混合增菌液劃線接種于SWM、DFI和科瑪嘉顯色培養(yǎng)基平板上，結(jié)果見表2。
[003引表2混合菌懸液在各品牌上的分離結(jié)果
[0039]
[0040] 由表2可知，smi和國內(nèi)某品牌對于其它干擾雜菌易分離，平板上只出現(xiàn)兩種顏色 的菌落，無色和特征顏色;DFI中無色帶綠屯、菌落經(jīng)鑒定有普通變形桿菌的干擾;科瑪嘉顯 色平板對于變形桿菌不易區(qū)分，奇異變形對阪崎檢測造成干擾。
[0041 ] 生長率：
[0042] 將上述阪崎腸桿菌標準菌株ATCC29544和ATCC51392制成適宜濃度的菌懸液(濃度 為IO 8-IO9C即/ml)，取稀釋度為1〇-哺1〇-6的菌懸液0.1 ml均勻涂布于SWM、DFI、科瑪嘉、國內(nèi) 某品牌阪崎顯色培養(yǎng)基W及膜蛋白腺大豆瓊脂(TSA)上，36 °C培養(yǎng)2地。取接種水平為20CFU ~200CRJ的平板進行計數(shù)，計算各自的生長率。
[0043] 表3顯色培養(yǎng)基對阪崎腸桿菌靈敏度和菌落形態(tài)的比較 [00441
[0045] 由表3可知，幾種品牌的靈敏度都比較高，生長率方面SWM高于科瑪嘉和國內(nèi)某品 牌，且遠高于GB4789.28-2013中扣>0.5的規(guī)定。DFI生長率雖然高于其它品牌，但由于其培 養(yǎng)基呈棟色，顯色不易觀察等缺點并不就有優(yōu)勢。菌落大小方面，兩株阪崎標準菌株在SWM 上比DFI和國內(nèi)某品牌顯色平板上大。
[0046] 人工污染樣品中阪崎腸桿菌的檢測：
[0047] 1.菌種:將阪崎腸桿菌ATCC29544和ATCC51329等2株標準菌株接種營養(yǎng)肉湯中制 成適標準菌懸液，制備含有目標菌10CFU-100CFU和1-10CFU的菌懸液，備用。
[004引2.前增菌和增菌:稱取乳粉樣品100g，加入900mlBPW增菌液中，混合均勻。將制備 好的菌懸液接種于此樣品懸液中，36°C培養(yǎng)1她。移取Iml轉(zhuǎn)種于IOml mLST-Vm肉湯，44.5°C 培養(yǎng)2地。
[0049] 3.接種培養(yǎng):各區(qū)一環(huán)培養(yǎng)后的增菌液，劃線接種于實施例1(簡稱SWM)顯色培養(yǎng) 基平板上，36°C培養(yǎng)18~2地，根據(jù)在劃線區(qū)域生長情況記錄菌落顏色和形態(tài)，見表4。
[0050] 表4 SWM對人工污染樣品的檢測
[0化1 ]
[0052] 由表4可知，阪崎腸桿菌接種量越多，劃線生長區(qū)域越大，接種量> IOOCFU時，4區(qū) 全部有目標菌生長，菌落為典型藍綠色;接種量為10-100CFU時在第一區(qū)和第二區(qū)生長，菌 落為典型藍綠色;接種量在1-10CFU時，亦能檢出，可達到IOCFU的檢出限。藍綠色典型菌落 經(jīng)鑒定后即為阪崎腸桿菌，樣品對照中的無色雜菌經(jīng)鑒定為其他腸桿菌，非阪崎腸桿菌。
[0053] 實際樣品中阪崎腸桿菌的檢測：
[0化4] 1.采集樣品
[0055]從超市W及原料供應(yīng)商處采集奶粉和乳粉共50份 [0化6] 2.增菌培養(yǎng)
[0化7] 稱取乳粉樣品lOOg，加入900mlBPW增菌液中，混合均勻，36。(：培養(yǎng)1她。移取Iml轉(zhuǎn) 種于IOml mLSlM%肉湯，44.5°C培養(yǎng)2地。
[0化引3.接種培養(yǎng)
[0059] 取一環(huán)培養(yǎng)后的增菌液，劃線接種于實施例1制成的阪崎顯色培養(yǎng)基平板上，37°C 培養(yǎng)18-2地，觀察菌落顏色和形態(tài)。
[0060] 4.結(jié)果觀察和分析
[0061 ] 50份樣品中有3份樣品檢出阪崎腸桿菌，同時使用GB4789.40-2010和API20E生化 鑒定系統(tǒng)檢測比對樣品，與顯色培養(yǎng)基結(jié)果一致，兩種方法檢測結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果一致。
[0062] 實施例2
[0063] -種用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，每1000 ml培養(yǎng)基含有膜蛋白腺15g、牛肉 浸出粉7g、化Cl 5g、細菌瓊脂粉18g、脫氧膽酸鋼0.6g、硫代硫酸鋼1.0g、5-漠-4-氯-3-嗎I 噪-曰-D-葡萄糖巧0.1g、N，N-二甲基甲酯胺1ml。
[0064] 根據(jù)實施例2,共稱取本品7.35g加入200ml水中完全溶解，煮沸冷卻至50°C左右， 傾入無菌平皿，制備好的平板于2-8°C避光保存。
[0(?日]根據(jù)實施例2,共稱取本品7.35g加入200ml水中完全溶解，121°C高壓滅菌15min， 冷卻至50°C左右，傾入無菌平皿，制備好的平板于2-8°C避光保存。
[0066] 將阪崎腸桿菌標準菌株ATCC29544和ATCC51392分別劃線接種于兩種滅菌方式制 得的阪崎腸桿菌顯色平板上，結(jié)果表明差異不顯著，培養(yǎng)基各組分熱穩(wěn)定性較好，故選用 12rC高壓滅菌ISminW保證充分滅菌，延長培養(yǎng)基固體平板使用保質(zhì)期。
[0067] 特異性實驗；
[0068] 將阪崎腸桿菌ATCC29544、阪崎腸桿菌ATCC51392、大腸埃希氏菌ATCC25922、鼠傷 寒沙口氏菌ATCC14028、弗氏巧樣酸桿菌ATCC43864、銅綠假單胞菌ATCC9027、福氏志賀氏菌 CMCC51572、產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048、陰溝腸桿菌CMCC45301、粘質(zhì)沙雷伯菌CMCC41002、普通 變形桿菌CMCC49027、奇異變形桿菌CMCC49005、金黃色葡萄球菌ATCC25923和糞腸球菌 ATCC29212等14種標準菌株和9種收集到的阪崎腸桿菌陽性菌株制成適當濃度的菌懸液(濃 度為IO8-IO 9C即/ml),分別劃線接種到實施例2制成的顯色培養(yǎng)基上(簡稱SWM)、DFI瓊脂(阪 崎顯色培養(yǎng)基）、科瑪嘉阪崎顯色培養(yǎng)基W及國內(nèi)某品牌阪崎顯色培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)2地， 檢測結(jié)果見表5。
[0069] 表5幾種顯色培養(yǎng)基特異性檢測結(jié)果 [00701
[
[0072]結(jié)果見表5,兩株阪崎腸桿菌標準菌株和巧巾陽性菌株在SWM上陽性菌落為藍綠色， 而3號和8號陽性菌株在SWM上陽性菌落為深藍綠色，易辨性優(yōu)于DFI和國內(nèi)某品牌。特異性 方面，幾種品牌均能顯示陽性菌落特有的色澤，SWM與其它品牌相差不大，金黃色葡萄球菌 和糞腸球菌等菌落在運幾種品牌培養(yǎng)基上均受抑制，其它菌株為無色或淡黃色菌落。對阪 崎腸桿菌檢測有干擾的菌株主要有普通變形桿菌和奇異變形桿菌，普通變形桿菌在DFI平 板上亦為無色菌落帶綠色中屯、，不可W與阪崎腸桿菌相區(qū)分，奇異變形桿菌在科瑪嘉顯色 平板上為淡綠色且有輕微蔓延，對阪崎腸桿菌的檢測有一定的干擾。
[0073] 將有代表性及干擾性強的阪崎腸桿菌ATCC29544、普通變形桿菌CMCC49027、大腸 埃希氏菌ATCC25922、奇異變形桿菌CMCC49005,糞腸球菌ATCC29212制成混合菌懸液，取一 環(huán)混合增菌液劃線接種于SWM、DFI和科瑪嘉顯色培養(yǎng)基平板上，結(jié)果見表6。
[0074] 表的昆合菌懸液在各品牌上的分離結(jié)果
[0075]
[0076] 由表6可知，smi和國內(nèi)某品牌對于其它干擾雜菌較易分離，平板上出現(xiàn)=種顏色 的菌落:無色和兩種特征顏色;DFI中無色帶綠屯、菌落經(jīng)鑒定有普通變形桿菌的干擾;科瑪 嘉顯色平板對于變形桿菌不易區(qū)分，奇異變形對阪崎檢測造成干擾。
[0077] 生長率；
[0078] 將上述阪崎腸桿菌標準菌株ATCC29544和ATCC51392制成適宜濃度的菌懸液(濃度 為IO 8-IO9C即/ml)，取稀釋度為1〇-哺1〇-6的菌懸液0.1 ml均勻涂布于SWM、DFI、科瑪嘉、國內(nèi) 某品牌阪崎顯色培養(yǎng)基W及膜蛋白腺大豆瓊脂(TSA)上，36 °C培養(yǎng)2地。取接種水平為20CFU ~200CRJ的平板進行計數(shù)，計算各自的生長率。
[0079] 表7顯色培養(yǎng)基對阪崎腸桿菌靈敏度和菌落形態(tài)的比較
[0080]
[0081] 由表7可知，幾種品牌的靈敏度都比較高，生長率方面SWM低于科瑪嘉，而高于國內(nèi) 某品牌。DFI生長率最高。
[0082] 實施例3
[0083] -種用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，每1000 ml培養(yǎng)基含有膜蛋白腺20g、牛肉 浸出粉lOg、化Cl 5g、細菌瓊脂粉20g、脫氧膽酸鋼0.2g、硫代硫酸鋼0.2g、5-漠-4-氯-3-嗎I 噪-a-D-葡萄糖巧0.08g、N，N-二甲基甲酯胺10ml。
[0084] 根據(jù)實施例3,共稱取本品7.35g加入200ml水中完全溶解，煮沸冷卻至50°C左右， 傾入無菌平皿，制備好的平板于2-8°C避光保存。
[00化]根據(jù)實施例3,共稱取本品7.35g加入200ml水中完全溶解，121°C高壓滅菌15min， 冷卻至50°C左右，傾入無菌平皿，制備好的平板于2-8°C避光保存。
[0086] 將阪崎腸桿菌標準菌株ATCC29544和ATCC51392分別劃線接種于兩種滅菌方式制 得的阪崎腸桿菌顯色平板上，結(jié)果表明差異不顯著，培養(yǎng)基各組分熱穩(wěn)定性較好，故選用 12rC高壓滅菌ISminW保證充分滅菌，延長培養(yǎng)基固體平板使用保質(zhì)期。
[0087] 特異性實驗；
[0088] 將阪崎腸桿菌ATCC29544、阪崎腸桿菌ATCC51392、大腸埃希氏菌ATCC25922、鼠傷 寒沙口氏菌ATCC14028、弗氏巧樣酸桿菌ATCC43864、銅綠假單胞菌ATCC9027、福氏志賀氏菌 CMCC51572、產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048、陰溝腸桿菌CMCC45301、粘質(zhì)沙雷伯菌CMCC41002、普通 變形桿菌CMCC49027、奇異變形桿菌CMCC49005、金黃色葡萄球菌ATCC25923和糞腸球菌 ATCC29212等14種標準菌株和9種收集到的阪崎腸桿菌陽性菌株制成適當濃度的菌懸液(濃 度為IO8-IO 9C即/ml),分別劃線接種到實施例3制成的顯色培養(yǎng)基上(簡稱SWM)、DFI瓊脂(阪 崎顯色培養(yǎng)基）、科瑪嘉阪崎顯色培養(yǎng)基W及國內(nèi)某品牌阪崎顯色培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)2地， 檢測結(jié)果見表8。
[0089] 表8幾種顯色培養(yǎng)基特異性檢測結(jié)果
[0090]
[0091]
[0092] 結(jié)果見表8,兩株阪崎腸桿菌標準菌株和5種陽性菌株在SWM上陽性菌落為藍綠色， 而3號和6~8號陽性菌株在SWM上陽性菌落為深藍綠色，易辨性優(yōu)于DFI和國內(nèi)某品牌。特異 性方面，幾種品牌均能顯示陽性菌落特有的色澤，smi與其它品牌相差不大，金黃色葡萄球 菌和糞腸球菌等菌落在運幾種品牌培養(yǎng)基上均受抑制，其它菌株為無色或淡黃色菌落。對 阪崎腸桿菌檢測有干擾的菌株主要有普通變形桿菌和奇異變形桿菌，普通變形桿菌在DFI 平板上亦為無色菌落帶綠色中屯、，不可W與阪崎腸桿菌相區(qū)分，奇異變形桿菌在實施例3和 科瑪嘉顯色平板上為淡綠色且有輕微蔓延，對阪崎腸桿菌的檢測有一定的干擾。
[0093] 將有代表性及干擾性強的阪崎腸桿菌ATCC29544、普通變形桿菌CMCC49027、大腸 埃希氏菌ATCC25922、奇異變形桿菌CMCC49005,糞腸球菌ATCC29212制成混合菌懸液，取一 環(huán)混合增菌液劃線接種于SWM、DFI和科瑪嘉顯色培養(yǎng)基平板上，結(jié)果見表9。
[0094] 表9混合菌懸液在各品牌上的分離結(jié)果
[0095]
[0096] 由表9可知，smi和科瑪嘉顯色平板對于變形桿菌不易區(qū)分，奇異變形對阪崎檢測 造成干擾。
[0097] 生長率：
[0098] 將上述阪崎腸桿菌標準菌株ATCC29544和ATCC51392制成適宜濃度的菌懸液(濃度 為IO 8-IO9C即/ml)，取稀釋度為1〇-哺1〇-6的菌懸液0.1 ml均勻涂布于SWM、DFI、科瑪嘉、國內(nèi) 某品牌阪崎顯色培養(yǎng)基W及膜蛋白腺大豆瓊脂(TSA)上，36 °C培養(yǎng)24h。取接種水平為20CFU ~200CRJ的平板進行計數(shù)，計算各自的生長率。
[0099] 表10顯色培養(yǎng)基對阪崎腸桿菌靈敏度和菌落形態(tài)的比較
[0100]
[0101] 由表10可知，幾種品牌的靈敏度都比較高，生長率方面SWM高于DFI、科瑪嘉和國內(nèi) 某品牌。
[0102] 由此可見，
[0103] (1)蛋白腺種類W及含量對阪崎腸桿菌的影響
[0104] 培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方：蛋白腺類lOg/1、牛肉浸粉5g/L、氯化鋼5g/L、瓊脂1.6g/L、水 1000ml，其中蛋白腺類包括(膜蛋白腺、細菌學(xué)蛋白腺、酪蛋白腺W及示蛋白腺），將標準菌 株ATCC29544制成適當濃度菌懸液，測其在含有不同氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)上的生長率，如圖1所示。
[0105] 結(jié)果顯示，W膜蛋白腺為氮源的培養(yǎng)基平板為無色透明，生長率最高，而且菌落生 長良好，菌落較大，另外W細菌學(xué)蛋白腺和示蛋白腺為原料的培養(yǎng)基平板為淡黃色，不利于 后期觀察菌落顏色；W酪蛋白腺為原料的培養(yǎng)基平板為綠色，且有不可容顆粒，故不采用。 所W氮源W膜蛋白腺最佳。
[0106] (2)不同營養(yǎng)成分對阪崎腸桿菌的影響
[0107] 培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方:膜蛋白腺lOg/1、某營養(yǎng)成分5g/L、氯化鋼5g/L、瓊脂1.6g/L、水 1 OOOml，其中某營養(yǎng)成分類包括(酵母粉、牛肉浸粉、牛屯、浸粉），將標準菌株ATCC29544制成 適當濃度菌懸液，測其在含有不同碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)上的生長率，如圖2所示。
[0108] 由圖2可知，阪崎腸桿菌在W牛肉浸粉和酵母粉為原料制成的培養(yǎng)基上的生長率 較高要比牛屯、浸粉高，但是，阪崎腸桿菌在牛肉浸粉為原料的培養(yǎng)基上易生成黃色素，推測 牛肉浸粉可W促進阪崎腸桿菌分泌代謝產(chǎn)物，故W牛肉浸粉為最優(yōu)營養(yǎng)成分。
[0109] (3)膜蛋白腺濃度對阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基顯色效果的影響
[0110] 其它成分不變，底物添加量為O.lg/L，膜蛋白腺濃度分別為10g/L、15g/L、20g/L和 25g/L，觀察其上菌落的顏色，W及各培養(yǎng)基的生長率，如圖3所示。
[0111] 由圖3可知，膜蛋白腺含量不同時阪崎腸桿菌菌落大小差異很小，但膜蛋白腺含量 為lOg/L時生長率最高，且此時阪崎腸桿菌顯色最明顯，隨著蛋白腺含量的增加，顏色并沒 有加深反倒減弱，推測蛋白腺含量的多少會影響O-D-葡萄糖巧酶的產(chǎn)生，故W膜蛋白腺含 量為lOg/L時為最佳。
[0112] (4)抑制劑濃度對阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基中菌落生長率W及顯色效果的影響
[0113] 膽鹽表面活性劑類抑菌劑，是一類與鋼鹽、膽酸和甘氨酸的鋼鹽W及少量去氧膽 酸鋼的混合物，其可W抑制大多數(shù)革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌，在加入膽鹽的培養(yǎng) 基中，雖然抑制了其他雜菌而加強了對阪崎腸桿菌的選擇性，但同時對阪崎腸桿菌的生長 有一定的影響，延緩或部分抑制其生長。同時，抑制劑量的選擇，還需要考慮其對阪崎腸桿 菌產(chǎn)生a-D-葡萄糖巧酶的影響。實驗證明，本發(fā)明實施例1中每1000 ml培養(yǎng)基含有脫氧膽酸 鋼0.4g和硫代硫酸鋼0.4g，效果最佳。
[0114] (5)不同組溶劑對阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基顯色效果的影響
[01巧]5-漠-4-氯-3-嗎I噪-a-D-葡萄糖巧不能完全溶于水，故選用水、乙醇、甲醇和N，N-二甲基酷胺為助溶劑，實驗證明不同濃度的助溶劑對阪崎腸桿菌產(chǎn)生Q-D-葡萄糖巧酶有影 響，本發(fā)明優(yōu)選用順-二甲基酷胺為助溶劑，且阪崎腸桿菌在其為組溶劑制成的培養(yǎng)基上生 長良好。
[0116]應(yīng)說明的是，W上實施例僅用W說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳 實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可W對本發(fā)明的技術(shù) 方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā) 明的權(quán)利要求范圍當中。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于:包括， 蛋白胨10~25g/L、牛肉浸出粉2~10g/L、NaCl 3~10g/L、細菌瓊脂粉15~20g/L、第一 抑制劑0.2~1. Og/L、第二抑制劑0.1~1. Og/L、葡萄糖苷酶顯色底物0. lg/L~0.3g/L、助溶 劑lml~10ml。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于:所述蛋白胨 為細菌學(xué)蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨及示蛋白胨的一種或幾種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于:所述蛋 白胨為胰蛋白胨，且每l〇〇〇ml培養(yǎng)基含有胰蛋白胨10g。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于:所述第一抑 制劑為十二烷基磺酸鈉、脫氧膽酸鈉或三號膽鹽中的一種或幾種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于:所述第 一抑制劑為脫氧膽酸鈉，且每l〇〇〇ml培養(yǎng)基含有脫氧膽酸鈉0.4g。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于:所述第二抑 制劑為檸檬酸鈉、硫代硫酸鈉、結(jié)晶紫或新生霉素中的一種或幾種。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于:所述第 二抑制劑為硫代硫酸鈉，且每l〇〇〇ml培養(yǎng)基含有硫代硫酸鈉0.4g。8. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或6任一所述的用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在 于:所述葡萄糖苷酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷，且每1000ml培養(yǎng)基含有 5_溴-4-氯-3-吲哚-a-D-葡萄糖苷0.13g。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于:所述助溶劑 為水、乙醇、甲醇和N，N-二甲基甲酰胺的一種或幾種。10. 根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的用于檢測阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于:所述助 溶劑為N，N-二甲基甲酰胺，且每1000ml培養(yǎng)基含有N，N-二甲基甲酰胺3ml。
【文檔編號】C12Q1/10GK105861623SQ201610262341
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月25日
【發(fā)明人】于瑞莉, 陳帥, 陳臣, 陳鵬飛, 茆偉偉
【申請人】無錫市賽微生物技術(shù)有限公司