一種基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于末端延伸、金納米粒子和氧化還原酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法。首先在金電極表面修飾一層巰基修飾的捕獲探針分子用于捕獲目標DNA分子，目標DNA分子被捕獲探針捕獲之后，信號探針修飾的金納米粒子與目標DNA分子的另一端堿基互補配對修飾到電極表面，然后在末端延伸酶的催化作用下將生物素標記的脫氧核糖核苷酸延伸到信號探針的3’端，延伸過程中引入的生物素與親和素標記的辣根過氧化物酶特異性結合，辣根過氧化物酶被修飾到電極表面，通過檢測辣根過氧化物酶催化電解液產(chǎn)生的電化學信號的變化來實現(xiàn)對目標DNA分子的高靈敏度、高特異性檢測，可用于分子識別、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測及食品安全等領域中DNA樣品的檢測。
【專利說明】
一種基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于電化學生物傳感器研究領域，涉及一種基于末端延伸、金納米粒子和酶催三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法。
【背景技術】
[0002]DNA檢測在分子識別、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等方面得到了廣泛應用。而實際樣本中所需要檢測的DNA的濃度往往很低，設計和研究具有高靈敏度和選擇性的傳感器就成為了研究的重點。為了提高DNA檢測的靈敏度，各種信號放大策略也應運而生，其中包括核酸擴增信號放大策略，納米材料信號放大策略和酶催化信號放大策略等。
[0003]目前常用的核酸擴增技術了有聚合酶鏈式反應、滾環(huán)復制擴增和一些其他的等溫核酸擴增技術。但是聚合酶鏈式反應技術需要嚴格控制溫度的變化，而且需要比價復雜的反應儀器，成本較高；而滾環(huán)復制擴增過程也需要加入反應模版，從而增加了反應體系的復雜程度，也提高了成本。為了避免這些問題，一種新的核酸擴增技術表面誘導末端延伸技術應運而生，這種在末端延伸酶的催化作用下無需模版在核酸鏈的3’端延伸核酸長鏈的放大技術得到了廣泛的應用。納米材料因為其特有的尺寸性質，在信號放大策略中得到廣泛應用。金納米粒子有高的表面體積比、制備工藝較成熟、穩(wěn)定性好、生物相容性好，易于功能化(特別是可以通過金-硫鍵將DNA修飾在金納米粒子表面)等優(yōu)點，在DNA的檢測中作為信號放大材料得到廣泛應用。酶的催化作用能夠在引入一個酶分子的情況下催化多個底物的反應而使信號得到放大，也在信號放大策略中扮演著不可忽視的角色。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了尚靈敏和尚選擇性地檢測痕量的DNA片段，包括完全互補、單個堿基錯配、兩個堿基錯配、三個堿基錯配、完全非互補序列和血清樣本中的DNA片段，提供一種基于末端延伸放大、金納米粒子和酶催化三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法。
[0005]實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術解決方案為:一種基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，包括如下步驟:
[0006]步驟一、Au-DNA溶液的制備:在金納米粒子溶液中緩慢加入5’端被標記的巰基標記信號探針溶液，反應后陳化，然后離心、洗滌、離心、重懸；
[0007]步驟二、電化學傳感器的制備:(a)金電極的清洗:以NaBH4S液浸泡后打磨，然后超聲清洗；(b)自清潔表面:室溫下在金電極表面自組裝3’端標記巰基的捕獲探針溶液，然后用HS- (CH2) n-EG2-0H室溫下浸泡封閉，得到自清潔表面；(c) Au-DNA的修飾:目標DNA滴加到自清潔表面反應I小時后，滴加Au-DNA溶液；(d)末端延伸:在末端延伸酶的作用下，在步驟(c)修飾到金電極表面的信號探針的3’端延伸生物素標記的核酸長鏈，加入親和素標記的辣根過氧化物酶反應15min，通過生物素-親和素相互作用引入辣根過氧化物酶制得電化學傳感器；
[0008]步驟三、電化學信號檢測:將制備完成的電化學傳感器放在三電極體系中以循環(huán)伏安法和時間電流曲線法進行檢測，得到電化學信號。
[0009]步驟一中采用的重懸溶劑為PBST溶液，其中金納米粒子的粒徑為30nm，其溶液濃度為lnmol/L ;巰基標記信號探針的溶液濃度為3.3 μ mol/L。
[0010]步驟二(b)中捕獲探針的濃度為0.5 μ mol/L,自組裝時間大于4小時；HS- (CH2) n-EG2-0H濃度為0.5mmol/L，浸泡時間大于4小時。
[0011]步驟二(c)中Au-DNA溶液的濃度為0.5nmol/L，修飾時間為I小時。
[0012]步驟二(d)中末端延伸酶的濃度為1U，生物素標記的核苷酸(底物)為生物素標記的腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，濃度為5.7 μπιοΙ/L，延伸時間為I小時。
[0013]步驟三中的電化學檢測體系為三電極體系，工作電極為金電極，參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為鉑絲電極，其中，電解液為3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺溶液，循環(huán)伏安法高電位為0.7V，低電位為0V，掃描速度為0.lV/s ;時間電流曲線法的掃描電位為0.1V，掃描時間為100s。
[0014]步驟一和二中所述DNA序列如下:所述的5’端被標記的巰基標記信號探針序列為:5’-GAA ACC CTA TGT ATG CTC-SH-3’;所述的3’端標記巰基的捕獲探針序列為:5’-SH_TTTT TTT TTT GTA TGA ATT ATA ATC AAA-3’ ；所述的目標DNA序列如下:完全互補序列GAG CAT ACA TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGA TTA TAA TTC ATA C、單個堿基錯配序列5’-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATA C-3’、兩個堿基錯配序列 5，-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TAT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATA C-3，、三個堿基錯配序列 5’ -GAG CAT GCA TAG GGT TTC TAT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATAC-3’或完全非互補序列 5，-ATCATC GAT ATC GTT CGA TAT CGT TAT CGA TTA TCG TTA TCATCG A-3，。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下特點:
[0016]1、檢測靈敏度高:本發(fā)明對DNA的檢測下限低于10fM，在現(xiàn)有的DNA檢測傳感器中處于較高的靈敏度水平。
[0017]2、檢測的范圍寬:本發(fā)明對DNA的檢測范圍寬度大于8個數(shù)量級，在現(xiàn)有的DNA傳感器中處于較寬的檢測寬度。
[0018]3、檢測體系簡單:本發(fā)明使用的檢測方法為簡單的電化學檢測，對樣本的顏色沒有要求，靈敏度高，并且易于簡單化和微型化。
[0019]4、實際應用性強:本發(fā)明的DNA傳感器在模擬的血清樣本中仍然具有較高的檢測信號，說明本傳感器在實際樣本中的應用性強，有很高的臨床診斷方面應用前景。
【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法的過程示意圖。
[0021]圖2是本發(fā)明實施例1中的Au-DNA制備結果，圖a為修飾信號探針前的吸光度曲線，b為修飾信號探針后的吸光度曲線。
[0022]圖3是本發(fā)明實施例2-4中的條件優(yōu)化結果圖(其中A為實施例2，B為實施例3，C為實施例4) ο
[0023]圖4是本發(fā)明實施例5中的對不同濃度目標DNA的電流圖。
[0024]圖5是本發(fā)明實施例6中的對完全互補及對照DNA片段檢測電流對比圖。
[0025]圖6是本發(fā)明實施例7中在緩沖溶液和血清中目標DNA檢測電流對比圖。
【具體實施方式】
[0026]下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，其目的是為了更好理解本發(fā)明的內容，但所舉的實施例并不限制本發(fā)明的保護范圍:
[0027]如附圖1中所示的步驟，搭建基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測體系，并進行電化學檢測。
[0028](I)電化學傳感器檢測DNA體系的建立
[0029]a、金電極清洗:l)NaBH4S液浸泡(往NaBH 4固體中先加入一定體積的無水乙醇，再加入等體積的雙蒸水，混勻后將電極浸泡在其中，浸泡15min，用雙蒸水沖洗掉NaBH4S液)2)打磨(在磨布上倒上一定量的Al2O3粉末，然后加上少量水，將電極垂直在磨布上打磨3min，用超純水沖洗干凈)3)超聲清洗(先用乙醇超聲清洗4_5min，再用雙蒸水超聲清洗4-5min，用雙蒸水沖洗)4)電化學掃描(以0.5mol/L的H2SO4為電解液，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極，對金工作電極進行電化學掃描。先進行慢掃，然后加2V電壓電解5s，再加-0.35V電壓電解10s，而后快速掃描2次，清洗電極并且換H2SO4后慢掃I次，觀察掃描的循環(huán)伏安圖，若最后一次慢掃得到的兩條曲線完全重合，并且氧化峰有四個，還原電流是最低電流的40倍，則判斷電極清洗干凈)清洗干凈的電極用N2吹干，沒有洗干凈的電極則需要重復清洗步驟。
[0030]b、自清潔表面制備:1)以5XPBS稀釋5’端巰基標記的捕獲探針至所需濃度得到組裝液，在清洗干凈并用N2吹干的電極表面滴加3 μ L組裝液，使組裝液覆蓋在金電極表面，確保組裝液與金電極表面完全接觸，且液滴中不含有氣泡，在電極上加蓋1.5ml離心管以減少反應過程中組裝液的蒸發(fā)且避免雜質進入組裝液，在室溫下反應4h以上。2)以無水乙醇稀釋HS-(CH2) n-EG2-0H至所需濃度，分裝在2ml離心管中，100 μ L/管，將組裝好的電極用PBS溶液沖洗10s，并用N2吹干，然后將電極表面浸泡在制備好的封閉液中，確保電極表面與封閉液完全接觸沒有氣泡，用密封膜纏好離心管與電極，減少封閉液的蒸發(fā)，室溫下反應4h以上。
[0031]c、目標DNA雜交:以5XPBS稀釋目標DNA片段至所需濃度得到雜交液，將HS-(CH2)n-EG2-0H處理后的電極用PBS沖洗10s，且用N2吹干，然后將稀釋的雜交液滴加3 μ L在干燥的電極表面，在電極上加蓋1.5ml離心管，在反應過程中減少組裝液的蒸發(fā)且避免雜質進入組裝液，在室溫下反應lh。
[0032]d、信號探針的修飾:將雜交后的電極用PBS溶液沖洗10s，并且用N2吹干，吹干后的電極表面滴加3 yL Au-DNA溶液，加蓋1.5ml離心管后，室溫下反應lh。
[0033]e、末端延伸:將雜交后的電極用PBS溶液沖洗10s，并且用N2吹干，吹干后的電極表面滴加3 μ L末端延伸液(末端延伸酶的濃度為1U，底物為濃度5.7 μ mol/L的生物素標記腺嘌呤脫氧核糖核苷酸)，加蓋1.5ml離心管后，室溫下反應lh。確保延伸液與金電極表面完全接觸。
[0034]f、辣根過氧化物酶標記:將延伸后的電極用PBS溶液沖洗，并且用N2吹干，吹干后的電極表面滴加3 μ L生物素標記辣根過氧化物酶溶液，加蓋1.5ml離心管后，室溫下反應15min。
[0035](2)電化學信號的檢測
[0036]將標記好辣根過氧化物酶的電極用PBS溶液沖洗，以市售3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺溶液為電解液，用三電極體系進行檢測，參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為鉑電極。循環(huán)伏安圖的高電位為0.7V，低電位為0V，掃描速度為0.lV/s ;時間電流曲線的實驗電位為
0.1V，試驗時間為10s0
[0037]實施例1:Au_DNA的制備及其結果
[0038]采用本發(fā)明所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，制備Au-DNA操作如下:將100mL的金納米粒子溶液離心濃縮至300 μ L，其終濃度約為lnmol/L ;緩慢加入20 μ L濃度為50 μ mol/L的5’端巰基標記的信號探針溶液，其終濃度為3.3 μ mol/L ；以350rpm轉速振蕩反應16小時后加入等體積0.02mol/L PBS (PH =
7,0.2mol/L NaCl)，陳化 40 小時;以 1000rpm 轉速離心 15 分鐘，加入 0.01mol/L PBS (PH=7，0.lmol/L NaCl)，以 1000rpm 轉速離心 15 分鐘，分別以 PBS (0.01M, 0.25M NaCl, PH =7)、PBST (0.01M, 0.25M NaCl, 0.1 % 吐溫，PH = 7)、PBSB (0.01M, 0.25M NaCl，I %小牛血清白蛋白，PH = 7)重懸，制得Au-DNA溶液。對制備的Au-DNA溶液進行紫外檢測，考察其粒徑，其結果如圖2所示，a為修飾巰基標記信號探針前的吸光度曲線，b為修飾巰基標記信號探針后的吸光度曲線，表明在修飾信號探針前后金納米粒子的粒徑?jīng)]有發(fā)生很大的變化，也即在修飾過程中很好地控制了團聚現(xiàn)象；對制備的Au-DNA溶液進行穩(wěn)定性考察，在加入2倍體積的飽和氯化鈉之后，沒有修飾的金納米粒子溶液由紅色變?yōu)樽仙?，而Au-DNA溶液保持紅色不變，說明Au-DNA溶液在高鹽溶液中有更好的穩(wěn)定性，也說明了 Au-DNA溶液的制備是成功的。
[0039]實施例2:不同的組裝密度對電化學信號檢測結果的影響。
[0040]采用本發(fā)明所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，以完全互補DNA序列作為目標片段，所有操作步驟都如上所述，其中封閉液HS- (CH2) n-EG2-0H的濃度為0.5mmol/L，目標DNA的濃度為I μ mol/L,組裝密度依次為10、
5、1、0.5、0.2、0.1 ymol/L，分析不同的組裝密度對檢測電化學信號的影響，其分析結果如附圖3(A)所示，在0.5 μ mol/L之前，隨著組裝密度的降低信噪比增強，在0.5 μ mol/L之后，隨著組裝密度的降低信噪比減弱，因此組裝密度的較優(yōu)條件為0.5 ymol/L。
[0041]實施例3:不同的HS-(CH2) n-EG2-0H封閉濃度對電化學檢測結果的影響。
[0042]采用本發(fā)明所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，以完全互補DNA序列作為目標片段，所有操作步驟都如上所述實施例2所述，其中組裝密度為0.5 μ mol/L,目標DNA的濃度為I μ mol/L,封閉液HS- (CH2) n-EG2_0H的濃度依次為2、1.5, U0.5,0.1、0mmol/L分析不同的HS-(CH2) n-EG2_0H濃度對檢測電化學信號的影響，其分析結果如附圖3(B)所示，在0.5mmol/L之前，隨著HS-(CH2)n-EG2-0H濃度的降低信噪比增強，在0.5mmol/L之后，隨著HS- (CH2) n-EG2_0H濃度的降低信噪比減弱，因此HS-(CH2) n-EG2-0H 濃度的較優(yōu)條件為 0.5mmol/L。
[0043]實施例4:不同Au-DNA分散液對電化學檢測結果的影響。
[0044]采用本發(fā)明所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，以完全互補DNA序列作為目標片段，所有操作步驟都如上所述實施例2所述，其中組裝密度為0.5ymol/L，HS-(CH2)n-EG2-0H封閉濃度為0.5mmol/L，目標DNA的濃度為I μ mol/L, Au-DNA分散液依次為:PBS、PBSB, PBST,分析不同的分散液對檢測電化學信號的影響，其分析結果如附圖3 (C)所示，當Au-DNA的分散液為PBST時的本底濃度較小，信噪比最好，因此Au-DNA的較優(yōu)分散條件為PBST。
[0045]實施例5:基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法對不同濃度目標DNA片段的檢測特性。
[0046]采用本發(fā)明所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，以完全互補DNA序列作為目標片段，所有操作步驟都如上所述實施例2所述，其中組裝密度為0.5 yM，HS-(CH2)n-EG2-0H封閉濃度為0.5mmol/L，Au-DNA分散液為PBST，待測目標 DNA 的濃度依次為:1 μ mol/L、100nmol/L、10nmol/L、lnmol/L、100pmol/L、1pmol/L、lpmOl/L、100fmOl/L、10fmOl/L，分析不同濃度待測DNA片段的電化學信號響應特性，分析結果如圖4所示，在該檢測范圍內，電化學信號隨DNA片段濃度的增加呈指數(shù)關系，檢測限低于10fmol/Lo
[0047]實施例6:基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法對互補及對照DNA片段的電化學信號對比。
[0048]采用本發(fā)明所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，所有操作步驟都如上所述實施例2所述，其中組裝密度為0.5 μ mol/L,HS- (CH2) n-EG2-0H封閉濃度為0.5mmol/L, Au-DNA分散液為PBST，待測目標DNA的濃度為lnmol/L,目標DNA片段依次為a完全互補、b單個堿基錯配、c兩個堿基錯配、d三個堿基錯配和e非互補序列，分析電化學傳感器的特異性，分析結果如圖5所示，由圖可知，本發(fā)明的電化學傳感器檢測DNA的方法能夠區(qū)分單個堿基的錯配，有高的特異性。
[0049]實施例7:基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法對緩沖液及血清中DNA片段的電化學信號對比。
[0050]采用本發(fā)明所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，以完全互補DNA序列作為目標片段，所有操作步驟都如上所述實施例2所述，其中組裝密度為0.5 μ mol/L, HS- (CH2) n-EG2_0H封閉濃度為0.5mmol/L，Au-DNA分散液為PBST,待測目標DNA的濃度為lnmol/L，目標DNA的分散液為PBS緩沖溶液和血清，分析電化學傳感器對血清中目標DNA的檢測效果，分析結果如圖6所示，，雖然檢測的電流信號沒有緩沖液中那么好，但仍能夠很好地檢出血清中的目標DNA，顯示了很好的實際運用前景。
【主權項】
1.一種基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一、Au-DNA溶液的制備:在金納米粒子溶液中緩慢加入5’端被標記的巰基標記信號探針溶液，反應后陳化，然后離心、洗滌、離心、重懸； 步驟二、電化學傳感器的制備:(a)金電極的清洗=WNaBH4溶液浸泡后打磨，然后超聲清洗；(b)自清潔表面:室溫下在金電極表面自組裝3’端標記巰基的捕獲探針溶液，然后用HS- (CH2) n-EG2-0H室溫下浸泡封閉，得到自清潔表面；(c )Au_DNA的修飾:目標DNA滴加到自清潔表面反應I小時后，滴加Au-DNA溶液；(d)末端延伸:在末端延伸酶的作用下，在步驟(c)修飾到金電極表面的信號探針的3’端延伸生物素標記的核酸長鏈，加入親和素標記的辣根過氧化物酶反應15min，通過生物素-親和素相互作用引入辣根過氧化物酶制得電化學傳感器； 步驟三、電化學信號檢測:將制備完成的電化學傳感器放在三電極體系中以循環(huán)伏安法和時間電流曲線法進行檢測，得到電化學信號。2.如權利要求1所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，其特征在于，步驟一中采用的重懸溶劑為PBST溶液，其中金納米粒子的粒徑為30 nm，其溶液濃度為I nmol/L ;5’端被標記的巰基標記信號探針溶液濃度為3.3 ymol/L03.如權利要求1所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，其特征在于，步驟二(b)中捕獲探針的濃度為0.5 μ mol/L，自組裝時間大于4小時；HS-(CH2) n-EG2-0H濃度為0.5 mmol/L，浸泡時間大于4小時。4.如權利要求1所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，其特征在于，步驟二(c)中Au-DNA溶液的濃度為0.5 nmol/L,修飾時間為I小時。5.如權利要求1所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，其特征在于，步驟二(d)中末端延伸酶的濃度為I U，生物素標記的核苷酸為生物素標記的腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，濃度為5.7 μ mol/L,延伸時間為I小時。6.如權利要求1所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，其特征在于，步驟三中的電化學檢測體系為三電極體系，工作電極為金電極，參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為鉑絲電極，其中，電解液為3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺溶液，循環(huán)伏安法高電位為0.7 V，低電位為O V，掃描速度為0.1 V/s ;時間電流曲線法的掃描電位為0.1 V，掃描時間為100 S07.如權利要求1所述的基于末端延伸、金納米粒子和酶三級放大電化學傳感器檢測DNA的方法，其特征在于，步驟一和步驟二中所述DNA序列如下:5’端被標記的巰基標記信號探針序列為:5’ -GAA ACC CTA TGT ATG CTC-SH-3’ ；3’端標記巰基的捕獲探針序列為:5’ -SH-T TTT TTT TTT GTA TGA ATT ATA ATC AAA-3’ ；目標 DNA 序列如下:完全互補序列GAG CAT ACA TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGA TTA TAA TTC ATA C、單個堿基錯配序列5’-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATA C-3’、兩個堿基錯配序列 5，-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TAT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATA C-3，、三個堿基錯配序列 5’ -GAG CAT GCA TAG GGT TTC TAT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATAC-3’或完全非互補序列 5，-ATCATC GAT ATC GTT CGA TAT CGT TAT CGA TTA TCG TTA TCATCG A-3，。
【文檔編號】G01N33/68GK105842453SQ201510015158
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月12日
【發(fā)明人】萬瑩, 王鵬娟, 蘇巖, 楊樹林
【申請人】南京理工大學