一種基于氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。具體是采用在氧化亞銅母液中原位還原氯化鈀，合成氧化亞銅摻雜鈀的納米復(fù)合物，制備一種檢測前列腺抗原的電化學(xué)免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]目前ELISA、RIA、熒光偏振免疫測定、免疫發(fā)光技術(shù)、自動化免疫分析等多種方法應(yīng)用于檢測PSA。其中，電化學(xué)免疫檢測具有高靈敏性、高選擇性、分析快速和操作簡便等優(yōu)點，它利用抗原與抗體之間特異性結(jié)合的免疫學(xué)方法與電化學(xué)技術(shù)檢測相結(jié)合。在電化學(xué)檢測中，標記物起著關(guān)鍵作用，因此各種各樣的標記物應(yīng)運而生。尋找一種步驟簡單、條件溫和，產(chǎn)物易得，電化學(xué)響應(yīng)信號強的標記物尤為重要，本發(fā)明合成了一種氧化亞銅摻雜鈀納米粒子復(fù)合物，制備了一種氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記抗體的電化學(xué)免疫傳感器，實現(xiàn)了對前列腺抗原的檢測。
[0003]本發(fā)明利用氧化亞銅和鈀納米粒子對過氧化氫進行電化學(xué)催化的性能，將氧化亞銅與鈀納米粒子相結(jié)合，得到氧化亞銅摻雜鈀的納米復(fù)合物，并且制備了氧化亞銅摻雜不同量的鈀納米復(fù)合物，并尋找最佳摻雜量，合成步驟是在制備氧化亞銅納米粒子的基礎(chǔ)之上，原位一步還原氯化鈀，得到了氧化亞銅摻雜鈀的納米復(fù)合物，該方法步驟簡單、條件溫和，產(chǎn)物易得。該方法解決了單獨使用氧化亞銅和鈀納米粒子催化過氧化氫電信號小的問題。使用氧化亞銅摻雜鈀的納米復(fù)合物標記前列腺抗體，利用氧化亞銅和鈀納米粒子的協(xié)同作用，增強了催化過氧化氫還原的電化學(xué)催化性能。在檢測前列腺過程中產(chǎn)生了逐步放大的電化學(xué)信號，有效地增強了電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度。該方法成本低、靈敏度高、特異性好、檢測速度快等優(yōu)點，而且制備過程簡單易得，克服了目前前列腺抗原檢測方法的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是基于氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記的免疫傳感器，構(gòu)建了一種無酶、快速且超靈敏的夾心型電化學(xué)免疫傳感器。
[0005]本發(fā)明的目的之二是將該夾心型電化學(xué)免疫傳感器應(yīng)用于前列腺抗原的檢測。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
I.氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記的免疫傳感器的制備方法:
(1)依次用1.0、0.3、0.05pm的氧化鋁粉末對直徑為4 mm的玻碳電極拋光，分別在超純水和無水乙醇中超聲清洗，氮氣吹干；
(2)將5?15uL、金納米粒子溶液滴到電極表面，室溫下晾干；
(3)待電極近干時，將6nL、濃度為I?3 ug/mL的前列腺特異捕獲抗體滴加至修飾電極表面，于4 V冰箱中孵化I小時，用超純水清洗干凈； (4)滴加6yL、質(zhì)量分數(shù)為1.0?3.0%的牛血清白蛋白溶液于電極表面，封閉非特異性活性位點，于4 0C冰箱中晾干，用超純水清洗干凈；
(5)滴加6yL、10—5 ng/mL?100 ng/mL的一系列不同濃度的前列腺特異性抗原標準溶液，4 0C冰箱中晾干，用超純水清洗干凈；
(6)滴加6nUl?3 mg/mL的氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記的檢測抗體溶液，置于4°C冰箱中晾干，即制得一種基于氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記的免疫傳感器。
[0007]2.氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記的檢測抗體溶液的制備方法
(1)氧化亞銅摻雜鈀納米粒子的制備
在燒杯中，將0.100?0.300 g乙酸銅溶于20?60 mL超純水中，磁力攪拌，得到澄清的溶液;4.0?12.0 mL、0.1 mol/L的N2H4.H2O溶液快速加入到劇烈攪拌下的上述混合物，顏色立即從藍色變到亮黃色;所得混合物繼續(xù)攪拌30分鐘，離心，分別用超純水和無水乙醇洗幾次，并在60 °C烘箱中干燥4小時;加入0.5?4.0 mL、0.05 mol/L的氯化鈀溶液，磁力攪拌30分鐘，離心洗滌；
(2)氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記檢測抗體溶液的制備
將制備的I mL、濃度為I?3 mg/mL氧化亞銅/鈀納米粒子溶液與I 1^、濃度為0.5?
1.5yg/mL的檢測抗體混合，震蕩12小時，滴加0.5?1.5 mL質(zhì)量分數(shù)為1.0?3.0%的牛血清白蛋白溶液，繼續(xù)震蕩12小時，離心，用pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液洗滌，得到氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記的檢測抗體孵化物，將其分散于I mL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，制得氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記的檢測抗體溶液，于4 °C冰箱中儲存?zhèn)溆谩?br>[0008]3.前列腺抗原的檢測步驟
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，鉑絲電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，所制備的修飾電極為工作電極，在1 m L、P H為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；
(2)選擇計時電流法對前列腺抗原進行檢測，將輸入電壓設(shè)置為-0.4V，取樣間隔設(shè)置為0.1秒，運行時間設(shè)置為200秒；
(3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50秒向磷酸鹽緩沖溶液中注入10此濃度為5mol/L的過氧化氫溶液，然后記錄電流隨時間的變化，繪制工作曲線；
(4)將待測樣品溶液代替前列腺抗原標準溶液進行檢測。
[0009]本發(fā)明的有益成果
(I)氧化亞銅摻雜鈀納米粒子合成步驟建立在制備氧化亞銅納米粒子的基礎(chǔ)上，原位一步還原氯化鈀，得到了氧化亞銅摻雜鈀的納米復(fù)合物，并探究最佳摻雜量，該方法步驟簡單、條件溫和，產(chǎn)物易得。
[0010](2)本發(fā)明利用氧化亞銅和鈀納米粒子對過氧化氫進行電化學(xué)催化的性能，將氧化亞銅與鈀納米粒子相結(jié)合，得到氧化亞銅摻雜鈀的納米復(fù)合物，該方法解決了單獨使用氧化亞銅和鈀納米粒子催化過氧化氫電信號小的問題。使用氧化亞銅摻雜鈀的納米粒子復(fù)合物標記前列腺抗體，利用氧化亞銅和鈀納米粒子的協(xié)同作用，增強了催化過氧化氫還原的電化學(xué)催化性能。
[0011](3)本發(fā)明將制備的夾心型電化學(xué)免疫傳感器用于前列腺抗原的檢測，檢測限低，線性范圍寬，可以實現(xiàn)簡單、快速、靈敏和特異性檢測。本發(fā)明對前列腺抗原檢測線性范圍為10-5?100 ng/mL，檢測限達到2 fg/mL。
【具體實施方式】
[0012]實施例1一種氧化亞銅摻雜鈀納米粒子作為標記物的免疫傳感器的制備方法
(1)依次用1.0、0.3、0.05pm的氧化鋁粉末對直徑為4 mm的玻碳電極拋光，分別在超純水和無水乙醇中超聲清洗，氮氣吹干；
(2)將5nL、金納米粒子溶液滴到電極表面，室溫下晾干；
(3)待電極近干時，將6uL、濃度為I yg/mL的前列腺特異抗體滴加至修飾電極表面，于4 0C冰箱中孵化I小時，用超純水清洗干凈；
(4)滴加6nL、質(zhì)量分數(shù)為1.0%的牛血清白蛋白溶液于電極表面，封閉非特異性活性位點，于4 0C冰箱中晾干，用超純水清洗干凈；
(5)滴加6yL、10—5 ng/mL?100 ng/mL的一系列不同濃度的前列腺特異性抗原標準溶液，4 0C冰箱中晾干，用超純水清洗干凈；
(6)滴加6汕、1mg/mL的氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記的檢測抗體溶液，置于4 °(:冰箱中晾干，儲存?zhèn)溆谩?br>[0013]實施例2—種氧化亞銅摻雜鈀納米粒子作為標記物的免疫傳感器的制備方法
(1)依次用1.0、0.3、0.05pm的氧化鋁粉末對直徑為4 mm的玻碳電極拋光，分別在超純水和無水乙醇中超聲清洗，氮氣吹干；
(2)將10nL、金納米粒子溶液滴到電極表面，室溫下晾干；
(3)待電極近干時，將6uL、濃度為2 yg/mL的前列腺特異抗體滴加至修飾電極表面，于4 0C冰箱中孵化I小時，用超純水清洗干凈；
(4)滴加6nL、質(zhì)量分數(shù)為2.0%的牛血清白蛋白溶液于電極表面，封閉非特異性活性位點，于4 0C冰箱中晾干，用超純水清洗干凈；
(5)滴加6yL、10—5 ng/mL?100 ng/mL的一系列不同濃度的前列腺特異性抗原標準溶液，4 0C冰箱中晾干，用超純水清洗干凈；
(6)滴加6汕、2mg/mL的氧化亞銅摻雜鈀納米粒子標記的檢測抗體溶液，置于4 °(:冰箱中晾干，儲存?zhèn)溆谩?br>[0014]實施例3—種氧化亞銅摻雜鈀納米粒子作為標記物的免疫傳感器的制備方法
(1)依次用1.0、0.3、0.05pm氧化鋁粉末對直徑為4 mm的玻碳電極拋光，分別在超純水和無水乙醇中超聲清洗，氮氣吹干；
(2)將15nL、金納米粒子溶液滴到電極表面，室溫下晾干；
(3)待電極近干時，將6uL、濃度為3 yg/mL的前列腺特異抗體滴加至修飾電極表面，于4 0C冰箱中孵化I小時，用超純水清洗干凈；
(4)滴加6nL、質(zhì)量分數(shù)為3.0%的牛血清白蛋白溶液于電極表面，封閉非特異性活性位點，于4 0C冰箱中晾干，用超純水清洗干凈；
(5)滴加6yL、10—5 ng/mL?100 ng/mL的一系列不同